INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY

PRACTICA # 5 CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

LAB. Microbiología
Integrantes: Blanco J, Hernández G, Chávez M. Lunes
Equipo# 5
28/02/11

RESUMEN

La cuantificación de microorganismos es un factor determinante en la

calidad de un proceso. Por lo general se desea dar a conocer el grado de
inocuidad de una muestra, sin embargo el conteo de microorganismos
también muestra el grado de avance de un proceso biotecnológico;
aislamiento de microorganismos, diferenciación, etc. o inclusive muestra
el diagnóstico de alguna enfermedad en la medicina. Las técnicas varían
de acuerdo a la industria. La presente práctica aborda el tema con
muestras de leche y directamente de bacterias (Enterobacter
aerogenes) de un medio de cultivo (EMB). Se lleva a cabo el método de
diluciónes, en donde la muestra diferentes concentraciones es
inoculada en un medio enriquecido (AN), se incuba 24 hrs. A 35-37°C y
se realiza el recuento. La cuantificación se hace usando la cámara de
jagger, la cual cuenta con 64 cuadros, lente óptico y luz. El método de
recuento es en forma de “Z”; 14 conteos de cuadros lisos. Se llevaron a
cabo las siguientes diluciones de Enterobacter aerogenes: 10-3,10-5,10-
6
,10-7,10-8 en donde existen en promedio 8.94x107 UFC, además se
hicieron diluciones de leche con cantidades aproximadamente similares,
aunque para estos casos no se obtuvieron resultados numéricos debido
a cuestiones de procedimiento. En conclusión, de acuerdo a la dilución
las colonias que aparecen varían, entre más diluida esté la muestra,
menor número de colonias se observaran en la caja petri, sin embargo
se multiplica por el factor de dilución para obtener el numero de UFC
(unidades formadoras de colonias) presentes en la placa. Hace sentido
que una muestra pura de bacteria presente un mayor número de UFC
que una muestra de leche, puesto que la leche además de los
microorganismos tiene nutrientes, agua, etc. Cada UFC se toma en
cuenta como una célula viable.

Palabras clave: bacterias, cámara de jagger, colonias, conteo, dilución,

Enterobacter aerogenes, inocuidad, leche, UFC.

Introducción
El número de microorganismos
presentes en una muestra, se
puede determinar de distintas
maneras. En esta practicas se
utiliza la técnica de aislamiento
en placa que esta compuesta por
diluciones seriadas y siembra en
placas (30-300 bacterias/placa)
de tal manera que se contará el
número de células viables. Cabe
destacar que existen dos
métodos de siembra para
determinar el número de células
viables; método de siembra por
extensión, en donde la muestra
se extiende sobre la superficie
del agar y las colonias se
desarrollan en la superficie; y el
método de siembra por vertido
en placa, donde primero se pone
la muestra en la caja Petri, y
después se le agrega el medio de
cultivo lo que resulta en células
de superficie y células incluidas
en el medio. Si se quiere hacer
un conteo total de células se
toma en cuenta la medida del
número de células; Directo
mediante microscopio (cámaras
de recuento de Newbaver) y el
Contador electrónico de
partículas (contador de Coulter).
También se utiliza la medida de
la masa celular; Turbidimetría
(densidad óptica) donde se
utiliza un colorímetro, siendo
éste el método más utilizado,
también se cuantifica por Peso
seco (Sanz, 2010).
La densidad óptica es un aspecto
de gran importancia en los
métodos turbidimétricos (los
cuales cuantifican
microorganismos vivos y podrían estar presentes en un
muertos, siendo la principal
desventaja frente al método de
recuento en placa). La turbidez
puede medirse mediante un
espectrofotómetro, un
instrumento que hace pasar la
luz a través de suspensiones
celulares y detecta la cantidad
de luz emergente no dispersada.
Las lecturas se expresan en
unidades de densidad óptica
(OD) a una longitud de onda
determinada. La densidad óptica
es proporcional al número de
células (Michael & Martinko,
2009).
La limitacion principal del
recuento microscopico directo de
poblaciones bacterianas viene
impuesta por la necesidad de
utilizar suspensiones celulares
relativamente concentradas
(Stanier & Ingraham, 2005). Se
pueden cuantificar los
microorganismos que crecen
bajo ciertas condiciones físico-
químicas contrastándolos con
aquellos que crecen en
diferentes condiciones. Esta
herramienta de selectividad es
de particular interés en el área
de biotecnología, no obstante las
técnicas de aislamiento de
microorganismos son usadas en
otras áreas como la
investigación.
La presente práctica tiene como
objetivo principal contar colonias
bacterianas usando el método de
conteo por caja, comprender el
uso de las diluciones así como
obtener conocimiento sobre el
número de organismos que
líquido claro y un liquído turbio.
Ademas se entiende el concepto
de UFC (Unidades Formadoras de
Colonias) y la manera de
calcularas.
Metodología
Con el objetivo de poder realizar
la cuantificación de
microorganismos de un medio
mediante el método de conteo
por cajas y obtener conocimiento
sobre el número de organismos
que podrían estar presentes en
un líquido claro y en un líquido
turbio es importante comprender
la importancia del uso de la
técnica de las diluciones, así
como aprender el correcto uso y
manejo de las micropipetas.
La presente metodología se
dividirá en dos sesiones, de las
cuáles la primera será destinada
a la preparación del medio de
cultivo para dejarlas incubar
durante 24 horas y la siguiente
sesión es únicamente para
realizar el conteo por caja y
estimar la cantidad de
microorganismos presentes.
Primera sesión
Se prepara una solución de
fosfato diluido al 5%, a base de
fosfato monobásico y agua
destilada para usarla en las
diferentes disoluciones. A demás
se preparan 120 mL de agar
nutritivo, que se usarán en las
cajas de Petri para inocular las
bacterias proporcionadas con
anterioridad por la profesora;
posteriormente se procede a
lavar y secar 7 tubos de ensayo
en donde se colocan 9.9 mL del
fosfato diluido en dos tubos de
ensayo y, 9 mL en 4 tubos de
ensayo y 10 mL en el tubo
restante para hacer la disolución
base. En este punto se envuelve
todo el material con papel doble,
se coloca una torunda al matraz
del agar nutritivo preparado y se
esteriliza en la autoclave a 121ºC
durante 15 minutos. Después de
haber esterilizado todo el
material, se procede a realizar la
técnica de las diluciones, lo que
nos permitirá hacer diferentes
inóculos a diferentes
concentraciones. Este
procedimiento es dentro de una
campana de flujo laminar para
evitar contaminaciones.
Primeramente, se toma una o
dos muestra de las bacterias con
el asa de transferencia y se
colocan en un tubo de ensayo
con 10 mL de fosfato diluido. De
esta solución se toma 1 mL con
una micropipeta y una punta
estéril de 1000mL=1mL y se
coloca en un tubo de ensayo con
9 mL de fosfato diluido
mezclando hasta que se vez una
turbidez notable obteniendo así
una dilución con un factor de
disolución 1[10]-1. Ahora, de
este tubo de ensayo, por medio
de una micropipeta y una punta
estéril de 100 mL, se pasan
100mL a otro tubo de ensayo con
9.9 mL de fosfato para obtener
un dilución de 1[10]-3. De la
misma manera se preparan
diluciones con concentraciones
1[10]-5, 1[10]-6, 1[10]-7 y 1[10]-
8, en los tubos de ensayo con 9.9
mL, 9 mL, 9 mL y 9 mL
respectivamente. Ya teniendo
diferentes concentraciones de la
bacteria se procede a realizar la
inoculación en el medio
preparado. Se coloca 1 mL de la
dilución preparada con
concentración de 1[10]-3 en una
caja Petri e inmediatamente se
vierten aproximadamente 20-24
mL del medio de cultivo
preparado (agar nutritivo) sobre
la gota de la dilución. Con
movimientos suaves en forma de
ocho, se mueve la caja para
homogenizar la mezcla y
finalmente se deja gelificar, se
envuelve en plástico, se marca
con el número de equipo y
concentración y se invierte para
dejarlas a incubar durante 24-48
horas a 37ºC que es la
temperatura ideal para
Enterobacterias. Se repite lo
anterior para las concentraciones
de 1[10]-5, 1[10]-6, 1[10]-7 y
1[10]-8. Teniendo así finalmente,
5 cajas Petri con diferentes
concentraciones de bacterias
que serán contadas
posteriormente.
Alternativamente, se prepara
una disolución de 1mL leche
bronca/entera (leche de ordeña)
en 9 mL de fosfato diluido para
tener una muestra con
concentración 1[10]-1, se inocula
de la misma manera con agar
nutritivo en una caja de Petri y se
deja incubar a 35ºC durante 24-
48 horas.
Segunda sesión
Después de dejar incubar
durante 24-48 horas, se procede
a contar los microorganismos
que crecieron usando la cámara
de jagger, la cual cuenta con 64
cuadros, lente óptico y luz. Para
las cajas Petri que tienen un
número de colonias fácilmente
cuantificable se cuentan
directamente, sin embargo para
las cajas Petri con una gran
cantidad de colonias, se utiliza la
técnica de recuento en forma de
“Z” (Figura 1).
El método consiste en
seleccionar 14 cuadros lisos
contenidos en 3 líneas rectas en
forma de Z de la cámara de
jagger para contar el número de
colonias por cuadro y hacer un
promedio de las colonias en esos
cuadros. Posteriormente, se
multiplica por 64 ya que es el
número de cuadros totales que
abarca la caja de Petri.
Finalmente se obtiene el número
total de colonias por caja de Petri
y se multiplica por el inverso del
factor de disolución que se utilizó
en cada inóculo, para así obtener
las unidades formadoras de
colonias en cada caja Petri. Es
importante mencionar, que si
una colonia se encontraba en
una línea que divide a dos
cuadros, esta colonia se descarta
del conteo.
Ejemplo de conteo:
Para 10-5 (4 colonias)(64)(105)
= 2.56 x 107 UFC
 sólo cuenta los microorganismos
viables ignorando los desechos, a
comparación de esta última
técnica que no hace caso omiso
a los residuos en la solución.

Notas de la metodología.

A demás de la preparación para

Figura 1. Recuento en “Z” Enterobacter aerogenes y la
muestra de disolución de leche
Metodología alterna bronca a 10-1, se repitió en dos
ocasiones (una durante la
Existen diversos métodos para el practica y una fuera de ella) la
conteo microbiano: conteo en metodología para leche entera a
placa, conteo directo al diferentes disoluciones.
microscopio, conteo por turbidez,
entre otros. El conteo directo se Resultados.
realiza utilizando muestras
filtradas en membranas o A continuación se presentan los
cámaras de conteo como las de resultados obtenidos en el
Hawkley y Petroff-Hausser. Se conteo a cuatro diferentes juegos
cuenta el número de bacterias de placas. Estos cuatros juegos
presentes por cuadro, y a partir se obtuvieron del equipo dos,
de este dato se aproxima al total platos con Enterobacter
de microorganismos por unidad aerogenes; dos juegos con la
de volumen . Se trata de un metodología con leche bronca y
conteo para obtener una un ultimo juego constituido por
aproximación, sin embargo no es un plato, de una alumna de
muy exacto. preparatoria.
Table 1. Conteo para Enterobacter
Otro método de conteo es por aerogenes
turbidez, el cual funciona por la
turbidimetría, la cual mide la Concentra UFC//Resulta
reducción de la transmisión de la ción dos
luz debido a partículas de una Incontable
suspensión y cuantifica la luz 10-3 > 300
residual transmitida. Se utilizan colonias
espectrofotómetros los cuales 2.56 x 107
dependiendo de la naturaleza de 10-5
UFC
la sustancia devuelve un valor de
1.92 x 108
longitud de onda, con el cual se 10-6
UFC
puede calcular la cantidad de
microorganismos por volumen de 10-7 4 x 107 UFC
la solución. Sin embargo, es 10-8 1 x 108 UFC
importante mencionar que se
usa el conteo por placa ya que
En este juego de placas los 1.15 x 1012
resultados eran claramente 10-9
UFC
observables, pequeñas colonias 10-10 Contaminada
claramente separadas.

Los resultados para leche son un

Table 2. Conteo Leche bronca, caso donde mas que resultados
Michelle, Estudiante de para reportar, se obtienen
preparatoria. resultados que ayudan a
entender las metodologías y
Concentra UFC//Resulta circunstancias que se viven en el
ción dos laboratorio de clase. Para las
2.88 x 104 tablas 4 y 5 no se obtienen
10-1 resultados concretos ya que la
UFC
apariencia de las cajas, aunque
tenían pequeñas colonias, no se
Caja con una dispersión y podían definir como cajas
apariencia similar al caso de significativas por áreas donde
Enterobacter. había manchones que
aparentaban contaminación.

Discusión.

Los resultados presentados en el

Table 3. Conteo para leche entera,
apartado anterior tienen una
lunes 21 de Febrero.
cierta congruencia entre el
Concentra UFC//Resulta contraste obtenido para el caso
ción dos donde la inoculación es una
bacteria, y para el caso donde se
Mal
toma una solución que no se
10-4 homogenizad
sabe lo que pudiese contener.
a
10-5 Poco medio Los resultado para la bacteria,
10-6 1 x 106 UFC Enterobacter aerogenes, son la
10-7 Contaminada combinación de factores como
10-8 1 x 108 UFC tipo de agar, tiempo de
incubación y lo mas importante,
que las muestra fue tomada
Table 4. Conteo para leche entera, directamente de una caja Petri
23 de Febrero. donde el microorganismo ya
estaba previamente inoculado y
Concentra UFC//Resulta en una posible fase estacionaria.
ción dos De acuerdo a Micheal Madigan, si
10-4 1.5 x 107 UFC tomásemos una muestra de un
10-6 Contaminada microorganismo en esta fase y le
proporcionáramos los
10-8 Contaminada
requerimientos necesarios, el
microorganismo podría volver a
iniciar un ciclo de crecimiento.
Esto pudo haber sido lo que
facilito un conteo mas limpio en
la caja.
Para los resultados de la leche
hay que hacer un análisis mas
extenso ya que se obtuvieron
resultados de tres diferentes
conjuntos y no se reportaron
datos similares. En un principio
hay que considerar ciertas cosas
que se presentaron en las
muestras de las tablas 3 y 4. De
acuerdo a un reporte de la
facultad de química, de la
Universidad Nacional Autónoma
de México, se debe de considerar
como una sola colonia a:
• “Cadenas o pequeños
grupos no separadas
claramente entre sí, que
parecen ser causadas por
la desintegración de un
cúmulo de bacterias.”
• “Colonias extendidas como
película entre el fondo de
la caja y el agar y que se
diferencian claramente de
otras.”
• “Colonias como película en
las orillas de la caja, sobre
la superficie del agar.”
En el conteo que se llevo a cabo
el dia 23 de febrero, estos casos
se presentaron en algunos cajas
petri. Otro apartado del mismo
articulo señala que se debe
considerar crecimiento extendido
cuando las colonias “abarcan
más del 50 % de la superficie de
la caja, con o sin inhibición de
crecimiento; en ese caso, y/o
cuando la inhibición exceda el 25
% de la superficie de la caja, se
considera que las placas no son
representativas y por lo tanto no
se toman en cuenta.” (Camacho,
et. al., 2009). Es por estas
razones que algunas cajas fueron
desechadas como contaminadas,
aún cuando se podian observar y
hacer un conteo de colonias.
¿Qué pudo causar un crecimiento
extendido? Tomando como
referencia un reporte realizado
por la Universidad Nacional
Agraria de la Habana, Cuba
donde se analizaban 211
muestras de leche entera, los
tiempos de incubacion
empezaban desde las 6 horas
hasta las 12 horas despues de
haber hecho la inoculacion. En
nuestra practica se permitio una
incubacion de 20 a las 24 horas ,
esto pudo ser un factor de un
crecimiento extendido o
simplemente de un crecimiento
que volviera innsignificativa las
muestras.
Aparte de una posible
metodologia incorrecta, en
cuanto a incubacion se refiere, el
factor humano pudo ser otro
margen de error. Por ejemplo la
practica del lunes 21 en la
disulocion de 10-8 se tuvo una
sola colonia y en la practica del
dia 23 se tuvo una mayor
cantidad, este mismo caso se
repite con la disolución de 10-4.
Por otro lado comparando los
resultados del conteo realiazado
a la caja de la alumna de
preparatoria con los resultados
de los dos juegos realizados
durante la practica, los datos
parecen no tener sentidos al
obtener para una disolución de organismos/ml puede haber
10-1, 2.88 x 104 UFC y para la
en la muestra original?
disolución 10-4, del día miércoles
27 un resultado de 1.5 x 107 UFC, (demuestre cálculos).
lo que no es congruente ya que
el valor del UFC debería ser Para sacar la cantidad
proporcional al valor de la
disolución. aproximada de UFC en la
muestra original de Enterobacter
Por ultimo también se puede
considerar el volumen utilizado. aerogenes, se calcula un
En el caso de la muestra de promedio de los resultados
Michelle la caja Petri representa
una cuarta parte obtenidos en cada dilución:
aproximadamente de las cajas
utilizadas durante la practica.
Esto podría haber influenciado en
la cantidad de contaminación,
Para 10-3 incontable >300
entre los distintos medios.
colonias
Conclusiones.
Para 10-5 (4 colonias)(64)(105)
Se puede concluir que el método = 2.56 x 107 UFC
de conteo en placa, aunque tiene
sus desventajas, aporta una Para 10-6 (3 colonias)(64)(106)
información mas precisa ya que = 1.92 x 108 UFC
solo considera los organismos
vivos durante el experimento. Para 10-7  (4 colonias en todo
También se puede considerar el medio)(107) = 4 x 107 UFC
que para el uso de esta técnica
es mejor tener ya una Para 10-8  (1 colonia en todo el
preselección del microorganismo medio)(108) = 1 x 108 UFC
de interés. También se pueden
obtener conclusiones acerca de Total= Promedio de los UFC =
la limpieza del área de trabajo
utilizada para evitar la 8.94 x 107 UFC/mL y ya que la
contaminación de las muestras.
uestra fue tomada de una
disolución de 10 mL de fosfato
diluido, se tendria un total de
Preguntas 8.94 x 108 microorganismos.

1) De estos resultados,
aproximadamente ¿cuántos
2) De estos resultados, 4) Si usted le agrega 0.1mL a
aproximadamente ¿cuántos 99mL de agua, ¿cuál es la
organismos/ml puede haber dilución de la muestra?
en el agua clara sin
El factor de disolución sería el
presenciar algún signo de
siguiente:
turbiedad? (demuestre
caIculos). 0.1 / ( 99+ 0.1) = 0.0090817,
que equivaldría
No sé en cual dilución fue en la
aproximadamente a 0.001, por
que se dejo de ver turbidez
lo tanto el factor de disolución
seraí igual a 10-3.

3) ¿Cuáles son dos fuentes de

error en este procedimiento?
5) Para calcular el número de
Existen diversas fuentes de error organismos en una muestra
original se usa la fórmula:
que nos llevan a hacer un mal Nùmero de organismos/ mL
conteo, un factor de error de la muestra
Siendo la muestra = número
imrpotante radican en el
de colonias (caja) * 1 /
momento de contar visualmente volúmen de muestra * 1 /
las colonias en la placa y otro dilucion
Ejemplo: Se supone que
factor de error muy considerable
contaste 120 colonias en una
es a la hora de hacer las dilucion 10-2 y el volumen de
aproximaciones y promedios la muestra es 0.1 mL ¿cuál
es el número de organismos
cuando se tratan de muchas en la muestra original?
colonias en la caja y se utilizan
El número de organismos sería:
métodos de recuento como el
que se utilizó en forma de “Z”, (120 colonias ) * (1 / 0.1 mL) (1/ 10-2) =

ya que no devuelven valores 120000 microorganismo/mL

exactos.
Bibliografía
Madigan, M., & Martinko, J.
(2009). Brock Biologia de
los microorganismos.
Madrid: Pearson Addison
Wesley.

Sanz, J. L. (2010). MÉTODOS EN

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