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DEUTSCHE NORM Februar 2021

DIN EN ISO 21285


D
ICS 13.080.30

Bodenbeschaffenheit –
Hemmung der Reproduktion von Raubmilben (Hypoaspis aculeifer) durch
Bodenverunreinigungen (ISO 21285:2019);
Deutsche Fassung EN ISO 21285:2020
Soil quality –
Inhibition of reproduction of the soil mite (Hypoaspis aculeifer) by soil contaminants
(ISO 21285:2019);
German version EN ISO 21285:2020
Qualité du sol –
Inhibition de la reproduction de l’acarien prédateur (Hypoaspis aculeifer) par des
contaminants du sol (ISO 21285:2019);
Version allemande EN ISO 21285:2020

Gesamtumfang 33 Seiten

DIN-Normenausschuss Wasserwesen (NAW)


DIN EN ISO 21285:2021-02

Nationales Vorwort
Der Text von ISO 21285:2019 wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 190 „Soil quality“ der
Internationalen Organisation für Normung (ISO) erarbeitet und als EN ISO 21285:2020 durch das
Technische Komitee CEN/TC 444 „Prüfverfahren für die umweltbezogene Charakterisierung fester Matrices“
übernommen, dessen Sekretariat von NEN (Niederlande) gehalten wird.

Das zuständige deutsche Normungsgremium ist der Unterausschuss NA 119-01-02-04 UA „Biologische


Verfahren“ im DIN-Normenausschuss Wasserwesen (NAW).

Für die in diesem Dokument zitierten internationalen Dokumente wird im Folgenden auf die
entsprechenden deutschen Dokumente hingewiesen:

ISO 11260 siehe DIN EN ISO 11260


ISO 11267:2014 siehe DIN EN ISO 11267:2014-07
ISO 11268-2 siehe DIN EN ISO 11268-2
ISO 11277 siehe DIN ISO 11277
ISO 15799 siehe DIN ISO 15799
ISO 17616 siehe DIN ISO 17616
ISO 18400-206 siehe DIN ISO 18400-206
Aktuelle Informationen zu diesem Dokument können über die Internetseiten von DIN (www.din.de) durch
eine Suche nach der Dokumentennummer aufgerufen werden.

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DIN EN ISO 21285:2021-02

Nationaler Anhang NA
(informativ)

Literaturhinweise

DIN EN ISO 11260, Bodenbeschaffenheit — Bestimmung der effektiven Kationenaustauschkapazität und der
Basensättigung unter Verwendung von Bariumchloridlösung

DIN EN ISO 11267:2014-07, Bodenbeschaffenheit — Hemmung der Reproduktion von Collembolen (Folsomia
candida) durch Verunreinigungen (ISO 11267:2014); Deutsche Fassung EN ISO 11267:2014

DIN EN ISO 11268-2, Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwürmer — Teil 2:
Bestimmung der Wirkung auf die Reproduktionsleistung von Eisenia fetida/Eisenia andrei

DIN ISO 11277, Bodenbeschaffenheit — Bestimmung der Partikelgrößenverteilung in Mineralböden —


Verfahren mittels Siebung und Sedimentation

DIN ISO 15799, Bodenbeschaffenheit — Anleitung zur ökotoxikologischen Charakterisierung von Böden und
Bodenmaterialien

DIN ISO 17616, Bodenbeschaffenheit — Anleitung für die Auswahl und Beurteilung von Biotestverfahren zur
ökotoxikologischen Charakterisierung von Böden und Bodenmaterialien

DIN ISO 18400-206, Bodenbeschaffenheit — Probenahme — Teil 206: Entnahme, Behandlung und Lagerung
von Boden für die Beurteilung von biologischen funktionalen und strukturellen Endpunkten im Labor
(ISO 18400-206:2018)

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DIN EN ISO 21285:2021-02

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EUROPÄISCHE NORM EN ISO 21285
EUROPEAN STANDARD
NORME EUROPÉENNE April 2020

ICS 13.080.30

Deutsche Fassung

Bodenbeschaffenheit —
Hemmung der Reproduktion von Raubmilben
(Hypoaspis aculeifer) durch Bodenverunreinigungen
(ISO 21285:2019)
Soil quality — Qualité du sol —
Inhibition of reproduction of the soil mite Inhibition de la reproduction de l'acarien prédateur
(Hypoaspis aculeifer) by soil contaminants (Hypoaspis aculeifer) par des contaminants du sol
(ISO 21285:2019) (ISO 21285:2019)

Diese Europäische Norm wurde vom CEN am 13. April 2020 angenommen.

Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschäftsordnung zu erfüllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter
denen dieser Europäischen Norm ohne jede Änderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand
befindliche Listen dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim CEN-CENELEC-Management-
Zentrum oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhältlich.

Diese Europäische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Französisch). Eine Fassung in einer anderen
Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch Übersetzung in seine Landessprache gemacht und dem
Management-Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen.

CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, Estland, Finnland,
Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen,
Österreich, Polen, Portugal, der Republik Nordmazedonien, Rumänien, Schweden, der Schweiz, Serbien, der Slowakei, Slowenien,
Spanien, der Tschechischen Republik, der Türkei, Ungarn, dem Vereinigten Königreich und Zypern.

EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG


EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION
COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION

CEN-CENELEC Management-Zentrum: Rue de la Science 23, B-1040 Brüssel


DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

Inhalt
Seite

Europäisches Vorwort .......................................................................................................................................................... 4


Vorwort ...................................................................................................................................................................................... 5
Einleitung .................................................................................................................................................................................. 6
1 Anwendungsbereich............................................................................................................................................... 7
2 Normative Verweisungen ..................................................................................................................................... 7
3 Begriffe ........................................................................................................................................................................ 8
4 Kurzbeschreibung ................................................................................................................................................. 10
5 Reagenzien und Materialien..............................................................................................................................10
5.1 Biologische Materialien....................................................................................................................................... 10
5.2 Prüfmischung.......................................................................................................................................................... 10
5.3 Referenzsubstanz .................................................................................................................................................. 12
6 Geräte......................................................................................................................................................................... 13
7 Durchführung.......................................................................................................................................................... 13
7.1 Prüfaufbau................................................................................................................................................................ 13
7.1.1 Allgemeines ............................................................................................................................................................. 13
7.1.2 Prüfung zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs (Vorprüfung)..................................................13
7.1.3 Hauptprüfung.......................................................................................................................................................... 14
7.1.4 Grenzwertprüfung................................................................................................................................................. 14
7.2 Herstellung der Prüfmischungen ....................................................................................................................15
7.2.1 Prüfung des verunreinigten Bodens...............................................................................................................15
7.2.2 Prüfung von dem Prüfsubstrat zugegebenen Substanzen......................................................................15
7.2.3 Vorbereitung der Kontrollgefäße....................................................................................................................16
7.3 Zugabe des biologischen Materials .................................................................................................................16
7.4 Prüfbedingungen und Messungen...................................................................................................................16
7.5 Füttern der Milben ................................................................................................................................................ 17
7.6 Bestimmung der überlebenden Prädatormilben ......................................................................................17
8 Berechnung und Angabe der Ergebnisse ......................................................................................................17
8.1 Berechnung.............................................................................................................................................................. 17
8.2 Angabe der Ergebnisse ........................................................................................................................................17
9 Gültigkeit der Prüfung ......................................................................................................................................... 18
10 Statistische Analyse .............................................................................................................................................. 18
10.1 Allgemeines ............................................................................................................................................................. 18
10.2 Einzel-Konzentrationsprüfungen....................................................................................................................18
10.3 Mehrfach-Konzentrationsprüfungen .............................................................................................................19
10.3.1 Prüfung zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs..............................................................................19
10.3.2 Hauptprüfung.......................................................................................................................................................... 19
11 Prüfbericht............................................................................................................................................................... 20
Anhang A (informativ) Verfahren zur Haltung und Zucht von Prädatormilben ..........................................22
Anhang B (normativ) Bestimmung der Wasserhaltekapazität ..........................................................................24
Anhang C (informativ) Anleitung zur Einstellung des pH-Werts des künstlichen Bodens.......................25

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DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

Anhang D (informativ) Extraktion und Auszählen von Prädatormilben........................................................ 26


Anhang E (informativ) Grundlegende Informationen über die Biologie von Hypoaspis
(Geolaelaps) aculeifer........................................................................................................................................... 27
Literaturhinweise................................................................................................................................................................. 28

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DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

Europäisches Vorwort
Der Text von ISO 21285:2019 wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 190 „Soil quality“ der
Internationalen Organisation für Normung (ISO) erarbeitet und als EN ISO 21285:2020 durch das
Technische Komitee CEN/TC 444 „Prüfverfahren für die umweltbezogene Charakterisierung fester Matrices“
übernommen, dessen Sekretariat von NEN gehalten wird.

Diese Europäische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Veröffentlichung
eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis Oktober 2020, und etwaige entgegenstehende
nationale Normen müssen bis Oktober 2020 zurückgezogen werden.

Es wird auf die Möglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berühren
können. CEN ist nicht dafür verantwortlich, einige oder alle diesbezüglichen Patentrechte zu identifizieren.

Entsprechend der CEN-CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden


Länder gehalten, diese Europäische Norm zu übernehmen: Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, die
Republik Nordmazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien,
Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal, Rumänien,
Schweden, Schweiz, Serbien, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Türkei, Ungarn,
Vereinigtes Königreich und Zypern.

Anerkennungsnotiz

Der Text von ISO 21285:2019 wurde von CEN als EN ISO 21285:2020 ohne irgendeine Abänderung
genehmigt.

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DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

Vorwort
ISO (die Internationale Organisation für Normung) ist eine weltweite Vereinigung nationaler Normungs-
institute (ISO-Mitgliedsorganisationen). Die Erstellung von Internationalen Normen wird üblicherweise von
Technischen Komitees von ISO durchgeführt. Jede Mitgliedsorganisation, die Interesse an einem Thema hat,
für welches ein Technisches Komitee gegründet wurde, hat das Recht, in diesem Komitee vertreten zu sein.
Internationale staatliche und nichtstaatliche Organisationen, die in engem Kontakt mit ISO stehen, nehmen
ebenfalls an der Arbeit teil. ISO arbeitet bei allen elektrotechnischen Normungsthemen eng mit der
Internationalen Elektrotechnischen Kommission (IEC) zusammen.

Die Verfahren, die bei der Entwicklung dieses Dokuments angewendet wurden und die für die weitere Pflege
vorgesehen sind, werden in den ISO/IEC-Direktiven, Teil 1 beschrieben. Es sollten insbesondere die
unterschiedlichen Annahmekriterien für die verschiedenen ISO-Dokumentenarten beachtet werden. Dieses
Dokument wurde in Übereinstimmung mit den Gestaltungsregeln der ISO/IEC-Direktiven, Teil 2 erarbeitet
(siehe www.iso.org/directives).

Es wird auf die Möglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berühren
können. ISO ist nicht dafür verantwortlich, einige oder alle diesbezüglichen Patentrechte zu identifizieren.
Details zu allen während der Entwicklung des Dokuments identifizierten Patentrechten finden sich in der
Einleitung und/oder in der ISO-Liste der erhaltenen Patenterklärungen (siehe www.iso.org/patents).

Jeder in diesem Dokument verwendete Handelsname dient nur zur Unterrichtung der Anwender und
bedeutet keine Anerkennung.

Für eine Erläuterung des freiwilligen Charakters von Normen, der Bedeutung ISO-spezifischer Begriffe und
Ausdrücke in Bezug auf Konformitätsbewertungen sowie Informationen darüber, wie ISO die Grundsätze der
Welthandelsorganisation (WTO, en: World Trade Organization) hinsichtlich technischer Handelshemmnisse
(TBT, en: Technical Barriers to Trade) berücksichtigt, siehe www.iso.org/iso/foreword.html.

Dieses Dokument wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 190, Soil quality, Unterkomitee SC 4, Biological
characterization, erarbeitet.

Rückmeldungen oder Fragen zu diesem Dokument sollten an das jeweilige nationale Normungsinstitut des
Anwenders gerichtet werden. Eine vollständige Auflistung dieser Institute ist unter
www.iso.org/members.html zu finden.

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DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

Einleitung
Ökotoxikologische Prüfsysteme werden angewendet, um Informationen über die Wirkungen von
Verunreinigungen im Boden zu erhalten, und sie sind zur Ergänzung der herkömmlichen chemischen
Analysen (siehe ISO 15799 und ISO 17616) vorgesehen. ISO 15799 enthält eine Aufstellung und eine kurze
Charakterisierung der empfohlenen und genormten Prüfsysteme und ISO 17616 gibt eine Anleitung für die
Auswahl und Beurteilung von Biotestverfahren. Aquatische Prüfsysteme mit Bodeneluat werden
angewendet, um Informationen über den Anteil der Verunreinigungen zu erhalten, die möglicherweise über
den Wasserweg (Rückhaltefunktion von Böden) das Grundwasser erreichen, wogegen terrestrische Prüf-
systeme zur Bewertung der Lebensraumfunktion der Böden angewendet werden.

Milben (Acari) sind eine weltweite und heterogene Gruppe der Arthropoden, die zur Klasse der Arachniden
mit über 40 000 verzeichneten Arten gehören, unterteilt in zwei große Überordnungen (Acariformes und
Parasitiformes). Aufgrund ihrer relativ geringen Größe (wenige µm bis hin zu wenigen cm) besiedeln sie
besondere ökologische Nischen auf Pflanzen und in Böden (siehe Literaturhinweis [13]).

Unter den bodenbewohnenden Milben wird die Rolle der Prädation beispielsweise durch Hypoaspis sp.
(Laelapidae) sichergestellt. Da sie chemischer Verunreinigung ausgesetzt sind, werden Milben bereits in der
umweltbezogenen Risikoanalyse von Pestiziden als nicht-Zielorganismen berücksichtigt (siehe
Literaturhinwis [10]). Tatsächlich sind, unter den für die aktiven Substanzen von Pestiziden erforderlichen
Daten, die Auswirkungen auf Raubmilben bereits bewertet, d. h. für den Pflanzenbewohner Typhlodromus
pyri (Phytoseiidae) und den Bodenbewohner Hypoaspis aculeifer (Laelapidae) (siehe Literaturhinweis [6]).

Die ersten Autoren, die H. aculeifer als Testorganismus in ökotoxikologische Studien [23] [17] einführten,
schlugen später im Europäischen Projekt SECOFASE (en: Sublethal Effects of Chemicals on Fauna in the Soil
Ecosystem) ein Prüfsystem mit zwei Spezies vor, darunter die Collembolenart Folsomia fimetaria als
Beutetier. Vor dem Hintergrund der Entwicklung einer ökotoxikologischen Prüfung für die Bewertung von
Pflanzenschutzmitteln auf nicht-Ziel-Arthropoden (siehe Literaturhinweise [5] [6]), wurde des Weiteren ein
Protokoll zu bodenbewohnenden Milben unter Verwendung von H. aculeifer vorgeschlagen. In jüngerer
Vergangenheit wurde für diese Spezies ein Standard-Prüfprotokoll zur Bewertung von Chemikalien von der
OECD im Jahr 2008 entwickelt und im Jahr 2016 überarbeitet. Die Ergebnisse des damit verbundenen
internationalen Ringversuchs wurden veröffentlicht in Literaturhinweis [25] .

Unter den Milben ist der Prädator Hypoaspis aculeifer die im Labor am meisten untersuchte Spezies. Es
wurde festgestellt, dass der Reproduktionsendpunkt im Allgemeinen empfindlicher als Mortalität und
Vermeidung ist. Im Vergleich zu anderen Boden-Mesofauna-Wirbellosen wurde festgestellt, dass Milben im
Allgemeinen weniger empfindlich oder gleich empfindlich verglichen mit anderen Prüfspezies sind, in
Abhängigkeit von den untersuchten Endpunkten und Chemikalien. Unter Berücksichtigung von
Semi-Feldstudien wurde H. aculeifer als Top-Prädator verwendet, wohingegen andere Boden-Wirbellosen,
vor allem Springschwänze in die Gruppe der Beweider eingeordnet wurden. In diesen Studien zeigten sich
Milben als relativ tolerant gegenüber anthropogener Verunreinigung. Diese Angaben wurden ebenfalls von
Felduntersuchungen bestätigt. Allerdings wird die Anwendbarkeit der Laborprüfverfahren zur Bewertung
von Umweltproben (kontaminierte Böden, Abfälle usw.) mit Milben betont, da zum heutigen Tag eine
begrenzte Anzahl von Studien verfügbar ist.

Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren, das auf der Bestimmung der letalen und subletalen Wirkungen
der verunreinigten Böden gegenüber adulten Prädatormilben der Art Hypoaspis aculeifer basiert. Diese
Spezies gilt als für Prädator-Boden-Arthropoden repräsentativ. Hintergrundinformationen zur Ökologie
dieser Milben und deren Verwendung in ökotoxikologischen Prüfungen sind im Literaturhinweis [14]
verfügbar.

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DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

1 Anwendungsbereich
Dieses Dokument legt ein chronisches Verfahren zur Bewertung der Lebensraumfunktion von Böden und
zur Bestimmung der Wirkungen von Bodenverunreinigungen und Substanzen auf die Reproduktion von
Hypoaspis aculeifer — hauptsächlich — bei Aufnahme durch die Nahrung fest. Diese Methode ist anwendbar
für Böden und Bodenmaterialien unbekannter Beschaffenheit, z. B. von verunreinigten Standorten, beauf-
schlagten Böden, Böden nach der Sanierung, industriellen, landwirtschaftlichen oder anderen betroffenen
Standorten und Abfallmaterialien (z. B. Baggergut, kommunaler Schlamm aus einer Kläranlage, Kompost-
material oder Stalldung, speziell solche für eine mögliche Landdeponie). Die Reproduktion (= Anzahl der
Juvenilen) ist der gemessene Parameter des Tests. Die Prüfung gibt die Bioverfügbarkeit einer Mischung von
Kontaminanten in natürlichen Böden (Böden von verunreinigten Standorten) für eine Art wieder, die eine
trophische Ebene repräsentiert, die nicht von anderen ISO-Standards abgedeckt ist. Diese Prüfung soll nicht
die Reproduktionsprüfung von Regenwürmern (ISO 11268-2) oder Collembolen (ISO 11267) ersetzen, da
diese Spezies nicht nur zu einer anderen trophischen Gruppe, sondern auch zu einer anderen taxonomischen
Gruppe (= Milben; d. h. Arachniden) als die üblicherweise verwendeten gehört.

Die Wirkungen der Substanzen werden mit einem Standardboden, vorzugsweise mit einem festgelegten
künstlichen Bodensubstrat, bewertet. Bei verunreinigten Böden werden die Wirkungen im zu prüfenden
Boden und in einem Kontrollboden bestimmt. Abhängig von der Zielsetzung der Untersuchung sind die
Kontrolle und das zur Verdünnung verwendete Substrat (Verdünnungsreihen des verunreinigten Bodens)
entweder ein mit dem zu prüfenden Boden vergleichbarer, nicht verunreinigter Boden (Referenzboden)
oder ein Standardboden (z. B. künstlicher Boden).

Dieses Dokument gibt Informationen, wie dieses Verfahren zur Prüfung von Proben (Böden oder
Substanzen) unter gemäßigten Bedingungen anzuwenden ist.

Dieses Dokument gilt nicht für Substanzen, deren Luft-/Boden-Verteilungskoeffizient größer eins ist oder für
Substanzen mit einem Dampfdruck von über 300 Pa bei 25 °C.

ANMERKUNG Es kann nicht sichergestellt werden, dass die Prüfsubstanz während der gesamten Versuchsdauer
stabil bleibt. Im Prüfverfahren wird die Persistenz der Prüfsubstanz nicht überwacht.

2 Normative Verweisungen
Die folgenden Dokumente werden im Text in solcher Weise in Bezug genommen, dass einige Teile davon
oder ihr gesamter Inhalt Anforderungen des vorliegenden Dokuments darstellen. Bei datierten
Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte
Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschließlich aller Änderungen).

ISO 10390, Soil quality — Determination of pH

ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)

ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level using
barium chloride solution

ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation

ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method

ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Guidance on the collection, handling and storage of soil
for the assessment of biological functional and structural endpoints in the laboratory

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DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

3 Begriffe
Für die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe.

ISO und IEC stellen terminologische Datenbanken für die Verwendung in der Normung unter den folgenden
Adressen bereit:

— ISO Online Browsing Platform: verfügbar unter https://www.iso.org/obp

— IEC Electropedia: verfügbar unter http://www.electropedia.org/

3.1
Verunreinigung
Substanz oder Mittel, die bzw. das im Boden als ein Ergebnis menschlicher Tätigkeit vorhanden ist

3.2
Wirkungskonzentration für eine Wirkung von x %
ECx
Konzentration (Masseanteil) einer Probe, die x % einer Wirkung an einem gegebenen Endpunkt innerhalb
einer gegebenen Kontaktzeit im Vergleich zur Kontrolle verursacht

BEISPIEL Eine EC50 ist eine Konzentration, die eine Wirkung auf 50 % der exponierten Population an einem
Endpunkt der Prüfung über eine festgelegte Kontaktzeit verursacht.

Anmerkung 1 zum Begriff: Die ECx wird als ein Prozentwert des zu prüfenden Bodens (Trockenmasse) je Boden-
mischung (Trockenmasse) angegeben. Wenn Substanzen geprüft werden, wird die ECx als die Masse der Prüfsubstanz je
Trockenmasse des Bodens in Milligramm je Kilogramm angegeben.

3.3
Wirkungsrate
ERx
Rate eines zu prüfenden Bodens, die x % einer Wirkung an einem gegebenen Endpunkt innerhalb einer
gegebenen Kontaktzeit im Vergleich zur Kontrolle verursacht

3.4
Grenzwertprüfung
Prüfung mit einer Konzentration, die jeweils aus mindestens vier Wiederholungen, dem zu prüfenden Boden
ohne jegliche Verdünnung oder der höchsten Konzentration der Prüfsubstanz, die in den Kontrollboden und
die Kontrolle gemischt wird, besteht

3.5
geringste Konzentration, bei der eine Wirkung zu beobachten ist
LOEC, en: lowest observed effect concentration
niedrigste Konzentration einer Prüfsubstanz, die eine statistisch signifikante Wirkung zeigt
(Wahrscheinlichkeit p < 0,05)

Anmerkung 1 zum Begriff: In dieser Prüfung wird die LOEC als Masse der Prüfsubstanz je Trockenmasse des zu
prüfenden Bodens angegeben. Alle Prüfkonzentrationen über der LOEC sollten üblicherweise eine Wirkung zeigen, die
sich statistisch von der Kontrolle unterscheidet.

3.6
geringste Rate, bei der eine Wirkung zu beobachten ist
LOER, en: lowest oberserved effect rate
niedrigste Rate eines zu prüfenden Bodens in einem Kontrollboden, bei der eine statistisch signifikante
Wirkung beobachtet wird

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DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

3.7
höchste Konzentration ohne statistisch signifikante Wirkung
NOEC, en: no observed effect concentration
höchste Konzentration einer Prüfsubstanz, die gleich unterhalb der LOEC (3.5) liegt, bei der keine Wirkung
beobachtet wird

Anmerkung 1 zum Begriff: In dieser Prüfung zeigt die der NOEC entsprechende Konzentration keine statistisch
signifikante Wirkung (Wahrscheinlichkeit p < 0,05) über eine festgelegte Kontaktzeit im Vergleich zur Kontrolle.

3.8
höchste Rate ohne statistisch signifikante Wirkung
NOER, en: no observed effect rate
geringste Rate eines zu prüfenden Bodens, die gleich unterhalb der LOER (3.6) liegt, die keine statistisch
signifikante Wirkung (Wahrscheinlichkeit p < 0,05) über eine festgelegte Kontaktzeit im Vergleich zur
Kontrolle zeigt

3.9
Referenzboden
nicht verunreinigter Boden, der vergleichbare pedologische Eigenschaften (Nährstoffkonzentrationen,
pH-Wert, Gehalt an organischem Kohlenstoff und Gefüge) wie der zu prüfende Boden aufweist

3.10
Standardboden
Freilandboden oder künstlicher Boden, dessen wesentliche Eigenschaften (pH-Wert, Gefüge, Gehalt an
organischer Substanz) innerhalb eines bekannten Bereichs liegen

BEISPIEL Eurosoils, künstlicher Boden, LUFA-Standardboden Typ 2.2.

Anmerkung 1 zum Begriff: Die Eigenschaften des Standardbodens können von denen des zu prüfenden Bodens
abweichen.

3.11
Kontrollboden
Referenz oder Standardboden, der als Kontrolle und als Medium für die Herstellung der Verdünnungsreihen
mit den zu prüfenden Böden oder einer Referenzsubstanz verwendet wird, der die Validitätskriterien erfüllt

Anmerkung 1 zum Begriff: Bevor ein natürlicher Boden für eine Hauptprüfung verwendet wird, ist es ratsam,
nachzuweisen, dass dieser für eine Prüfung geeignet ist und die Prüfvaliditätskriterien erfüllt.

3.12
Prüfmischung
Mischung von verunreinigtem Boden oder der Prüfsubstanz (z. B. Chemikalie, Bio-Feststoffe, Abfall) mit dem
Kontrollboden

3.13
Prüfmischungs-Verhältnis
Verhältnis zwischen dem zu prüfenden Boden und dem Kontrollboden in einer Prüfmischung

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DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

4 Kurzbeschreibung
Weibliche adulte Tiere werden dem zu prüfenden Boden ausgesetzt und die gemessenen Wirkungen auf die
Fortpflanzung mit denen von Weibchen verglichen, die einem Kontrollboden ausgesetzt wurden. Dabei
werden, falls zutreffend, die Wirkungen durch Kontakt mit einer Verdünnungsreihe von verunreinigtem
Boden und Kontrollboden oder gegenüber einem Konzentrationsbereich einer in einen Kontrollboden
gemischten Prüfsubstanz bestimmt. Die Prüfmischungen werden zu Prüfbeginn hergestellt und innerhalb
des Prüfzeitraumes nicht erneuert. Die Prüfung wird mit 10 weiblichen adulten Tieren pro Prüfgefäß
begonnen. Männchen werden nicht in die Prüfung einbezogen, da die Erfahrung gezeigt hat, dass sich
Weibchen umgehend oder kurz nach dem Schlüpfen aus der deutonymphen Phase verpaaren, wenn
Männchen anwesend sind. Da die Weibchen etwa 7 Tage nach Erreichen der adulten Phase in die Prüfung
eingebracht werden, gelten die Weibchen als bereits verpaart (Anhang A und Anhang E). Die Prüfung läuft
bis die ersten Nachkommen die deutonymphe Phase erreicht haben. Bei 20 °C endet die Expositionszeit an
Tag 14 nach Einbringung der Weibchen (Tag 0), gefolgt von zwei Tagen der Extraktion. Die Anzahl der
überlebenden Weibchen und die Anzahl der juvenilen Tiere je Prüfgefäß werden ermittelt. Die
Reproduktionsleistung der den Prüfmischungen ausgesetzten Milben wird mit der der Kontrollen
verglichen, um die Konzentrationen zu bestimmen, die keine Wirkungen auf die Mortalität und
Reproduktion (NOER/NOEC) hervorrufen und die Konzentration aus x % Reduzierung der aus den Eiern
geschlüpften juvenilen Tiere wird verglichen mit der Kontrolle (ERx/ECx), abhängig von der experimentellen
Auslegung (siehe 7.1.3).

Besteht keine Vorkenntnis über die voraussichtlich wirksame Verdünnung/Konzentration des zu prüfenden
Bodens oder der Prüfsubstanz, ist es zweckmäßig, den Versuch in zwei Schritten durchzuführen:

— Eine Prüfung zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs der Reproduktion wird durchgeführt, um eine
Angabe zur wirksamen Verdünnung/Konzentration zu erhalten, und der Verdünnung/Konzentration
die keine Mortalität (NOER/NOEC) ergibt. Anschließend können die für die Hauptprüfung zu
verwendenden Verdünnungen/Konzentrationen ausgewählt werden;
— die Hauptprüfung in Bezug auf die Reproduktion zur Bestimmung der subletalen Wirkungen (der
Verdünnungen) des verunreinigten Bodens oder der Konzentration einer Substanz, die nach
gleichmäßigem Einmischen in den Standardboden zu keinen signifikanten Wirkungen auf die Anzahl der
aus den Eiern geschlüpften Nachkommen im Vergleich zur Kontrolle (NOER/NOEC) zeigt sowie der
niedrigsten wirksamen Konzentration (LOER/LOEC).
Die Verwendung eines Referenzbodens ist eine erforderliche Bedingung, um den aktuellen Status der
Prüfpopulation nachzuweisen und Fehlinterpretation der Ergebnisse zu vermeiden.

5 Reagenzien und Materialien


5.1 Biologische Materialien
Testorganismus in dieser Prüfung ist Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer. Um die Prüfung zu beginnen, sind
weibliche adulte Tiere (7 Tage bis 14 Tage nachdem sie adult wurden; 28 Tage bis 35 Tage nach Beginn der
Eiablage in der Synchronisierung) erforderlich. Die Milben müssen aus einer synchronisierten Kohorte
ausgewählt werden (siehe Anhang E).

5.2 Prüfmischung
5.2.1 Freilandboden oder Abfall. Die Freilandböden für die Prüfung sind durch ein Sieb mit einer
Maschenweite von 4 mm zu geben, um grobkörnige Anteile zu entfernen, sowie gründlich durchzumischen.
Falls notwendig, darf der Boden vor dem Sieben ohne Erwärmung luftgetrocknet werden. Die Lagerung der
zu prüfenden Böden sollte so kurz wie möglich sein. Der Boden muss nach ISO 18400-206 in Behältern
gelagert werden, die die Verluste der Bodenverunreinigungen durch Sorption in die Behälterwände gering
halten. Wurden die Böden oder Prüfmischungen gelagert, dann sollten sie unmittelbar vor der Verwendung
ein zweites Mal gemischt werden. Der pH-Wert des Bodens sollte nicht geändert werden, da dies die
Bioverfügbarkeit der Bodenverunreinigungen beeinflussen kann.

10
DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

Für die Auswertung der Prüfergebnisse müssen die folgenden Eigenschaften für jede von einer Freiland-
fläche entnommene Bodenprobe bestimmt werden:

a) pH-Wert nach ISO 10390;

b) Körnung (Sand, Lehm, Schluff, Ton) nach ISO 11277;

c) Wassergehalt nach ISO 11465;

d) Wasserhaltekapazität nach Anhang B;

e) Kationenaustauschkapazität nach ISO 11260;

f) organischer Kohlenstoff nach ISO 10694;

g) prozentualer Anteil des beim Sieben mit einer Maschenweite von 4 mm entfernten Materials.

Es ist wichtig, die Wasserhaltekapazität aller bei der Prüfung verwendeten Mischungen zu bestimmen.

5.2.2 Kontrollboden, entweder a) Referenzboden oder b) Standardboden, der die Anwesenheit von
Prädatormilben erlaubt. Kontrollboden und der Boden für die Verdünnungsreihen dürfen sich in der
gleichen Prüfung nicht unterscheiden [entweder a) oder b)].

a) Wenn Referenzböden aus nicht verunreinigten Bereichen in der Nähe eines verunreinigten Standorts
verfügbar sind, sollten diese wie die zu prüfenden Böden behandelt und charakterisiert werden. Wenn
eine toxische Verunreinigung oder ungewöhnliche Bodeneigenschaften nicht ausgeschlossen werden
können, sollten Standardkontrollböden bevorzugt werden.
b) Für die Prüfung der Wirkungen von Substanzen, die in den Boden gemischt werden, müssen
Standardböden (z. B. künstlicher Boden, LUFA-Standardboden Typ 2.2.) als Prüfsubstrat verwendet
werden. Die Eigenschaften des im Freiland entnommenen Standardbodens müssen aufgezeichnet
werden.
Das als „künstlicher Boden“ bezeichnete Substrat kann als ein Standardboden verwendet werden und besitzt
die folgende Zusammensetzung:

Massenanteile in % bezogen auf


Trockenmasse
— Fein gemahlener Sphagnum-Torf [eine Korngröße von 5%
(2 ± 1) mm ist ausreichend) ohne sichtbare Pflanzenreste

— Kaolin, mit mindestens 30 % Kaolinit 20 %

— Industrie-Quarzsand (hauptsächlich Feinsand, der zu mehr 74 %


als 50 % eine Korngröße von 0,05 mm bis 0,2 mm aufweist)

Um einen pH-Wert auf 6,0 ± 0,5 einzustellen, sind etwa 0,3 % bis 1,0 % Calciumcarbonat (CaCO3,
pulverisiert, analysenrein) notwendig.

ANMERKUNG 1 Unter Berücksichtigung der Eigenschaften hochunpolarer (log Kow > 2) oder ionisierender
Substanzen hat sich erwiesen, dass 5 % Torf die gewünschte Struktur des künstlichen Bodens aufrechterhalten.

ANMERKUNG 2 Es wurde bewiesen, dass Hypoaspis aculeifer die Validitätskriterien selbst bei Reproduktion erfüllen
kann, wenn die Prüfung in Feldböden mit geringerem Gehalt an organischem Kohlenstoff (z. B. 2,7 %) erfolgt, und es
liegen Erfahrungswerte vor, dass dies in künstlichem Boden mit 5 % Torf erreicht werden kann. Deshalb ist es vor
Verwendung eines derartigen Bodens in einer Hauptprüfung nicht notwendig, die Eignung des künstlichen Bodens für
die Prüfung nachzuweisen, um die Einhaltung der Validitätskriterien zu ermöglichen, sofern nicht die Torfgehalte
geringer sind als die vorstehend genannten.

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DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

Der künstliche Boden ist mindestens drei Tage vor Prüfbeginn herzustellen, in dem die vorstehend
aufgeführten trockenen Bestandteile in einem großen Labormischer durchmischt werden. Ein Teil des
erforderlichen deionisierten Wassers ist während des fortgesetzten Mischens hinzuzufügen. Das für das
Einbringen der Prüfsubstanz erforderliche Wasser sollte berücksichtigt werden. Die erforderliche Menge an
Calciumcarbonat kann sich abhängig von den Eigenschaften der einzelnen Charge des Sphagnum-Torfes
ändern und sollte unmittelbar vor der Prüfung durch Messung von Teilproben bestimmt werden (siehe
Anhang C). Der gemischte künstliche Boden ist bei Raumtemperatur für mindestens zwei Tage zu lagern, um
den Säuregehalt ins Gleichgewicht zu bringen. Zur Bestimmung des pH-Wertes und der maximalen
Wasserhaltekapazität ist der trockene künstliche Boden durch Zugabe von deionisiertem Wasser für einen
oder zwei Tage vor der Prüfung anzufeuchten, bis die Hälfte des erforderlichen Wasseranteils von 40 % bis
60 % der maximalen Wasserhaltekapazität erreicht ist.

Die gesamte Wasserhaltekapazität muss entsprechend Anhang B und der pH-Wert muss nach ISO 10390
bestimmt werden.

5.3 Referenzsubstanz

5.3.1 Allgemeines. Zur Qualitätssicherung des Prüfsystems sollten regelmäßig (ein- bis zweimal jährlich)
Prüfungen mit einer Referenzsubstanz durchgeführt werden.

Die NOEC und/oder die ECx einer Referenzsubstanz müssen bestimmt werden, um sicherzustellen, dass die
Laborprüfbedingungen angemessen sind und um zu bestätigen, dass sich die Empfindlichkeit der
Prüforganismen im Laufe der Zeit nicht verändert hat. Die Referenzsubstanz kann parallel zur
Toxizitätsmessung einer jeden Prüfsubstrat bei einer Konzentration geprüft werden, für die im Voraus in
einer Dosis-Wirkungsstudie belegt werden muss, dass sie zu einer Wirkung von etwa 50 % führt. In diesem
Fall sollte die Anzahl der Wiederholungen der in den Kontrollen entsprechen. Alternativ wird die
Referenzsubstanz ein- oder zweimal jährlich in einer Dosis-Wirkungs-Prüfung geprüft. Abhängig von der
gewählten Auslegung ist die Anzahl der Konzentrationen, Wiederholungen und der Faktor der
Konzentrationsabstufungen unterschiedlich (siehe 7.1.3), allerdings sollte eine Wirkung zwischen 10 % und
90 % erreicht werden (Faktor der Konzentrationsabstufung 1,8). Geeignete Referenzsubstanzen sind
Dimethoat und Borsäure, von denen eine Beeinträchtigung der Reproduktion belegt ist [25].

Die EC50 für Dimethoat, die auf der Anzahl an juvenilen Tieren basiert, sollte in den Bereich zwischen 3,0 mg
a. s. (aktive Substanz)/kg Boden (Trockenmasse) und 7,0 mg a. s. (aktive Substanz)/kg Boden (Trocken-
masse) fallen. Auf Grundlage der mit Borsäure bis dato erhaltenen Ergebnisse, sollte die EC50, die auf der
Anzahl an juvenilen Tieren basiert, in den Bereich zwischen 100 mg/kg (Trockenmasse) Boden und
300 mg/kg (Trockenmasse) Boden fallen.

5.3.2 Dimethoat (CAS 60-51-5), C5H12NO3PS2, als Rezeptur zu prüfen [z. B. Perfekthion 1 (ca. 40 %
Dimethoat)].

5.3.3 Borsäure (CAS 10043-35-3), H3BO3 (99 %)).

WARNUNG — Bei der Handhabung dieser Substanzen sollten zur Vermeidung von Ingestion oder
Hautkontakt geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.

1 Perfekthion ist ein Beispiel für ein geeignetes Produkt, das im Handel erhältlich ist. Diese Angabe dient nur zur
Unterrichtung der Anwender dieses Dokuments und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch
ISO.

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DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

6 Geräte
Übliche Laborausstattung und folgende verwenden.

6.1 Prüfgefäße aus Glas oder anderem chemisch inerten Material mit einem Fassungsvermögen von etwa
100 ml und mit einem Durchmesser von etwa 5 cm, mit Deckeln (z. B. dicht verschließbare Kunststoff- oder
Glasdeckel oder Parafilm).

6.2 Geräte zur Bestimmung der Trockenmasse des Substrats nach ISO 11465.

6.3 Großer Labormischer für die Herstellung der Prüfmischungen (5.2).

6.4 Geeignete genaue Waagen.

6.5 Geräte zur Bestimmung der pH-Werte und des Wassergehalts des Substrats.

6.6 Absaugvorrichtung zur Übertragung von Milben (siehe ISO 11267:2014, A.2).

6.7 Prüfumgebung

6.7.1 Brutschrank, regelbar auf eine Temperatur von (20 ± 2) °C.

6.7.2 Lichtquelle, die bei einem geregelten Hell/Dunkel-Zyklus von 12 Stunden : 12 Stunden und
16 Stunden : 8 Stunden eine konstante Lichtintensität von 400 lx bis 800 lx an die Substratoberfläche
abgeben kann.

6.8 Extraktionsapparat: Tullgren-Trichter oder vergleichbares Verfahren, wie beispielsweise McFadyen


(siehe Anhang D).

7 Durchführung
7.1 Prüfaufbau
7.1.1 Allgemeines

Eine Probe des unter Freilandbedingungen entnommenen Bodens kann sowohl mit einer einzelnen
Konzentration (üblicherweise 100 %) geprüft oder hinsichtlich der Toxizität in einer Prüfung mit
Mehrfachkonzentrationen bewertet werden, wobei eine Reihe von Konzentrationen (Verdünnungen) durch
Mischen abgemessener Mengen mit einem Kontrollboden (5.2.2) hergestellt wird. Werden Substanzen
geprüft, wird eine Reihe von Konzentrationen durch Mischen der Prüfsubstanzmengen mit einem
Standardboden (z. B. künstlicher Boden) hergestellt. Die Konzentrationen werden in Milligramm
Prüfsubstanz je Kilogramm getrockneten Kontrollboden (5.2.2) angegeben. Abhängig von der Kenntnis
entsprechender Wirkungsschwellen darf eine Prüfung zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs der
Hauptprüfung vorausgehen. Jede Hauptprüfung besteht aus einer Reihe von Bodenmischungen
(Prüfgliedern).

7.1.2 Prüfung zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs (Vorprüfung)

Eine Vorprüfung zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs des Mischverhältnisses, das Prädatormilben
beeinträchtigt, ist optional, z. B. 0 %, 1 %, 5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % Boden oder der Prüfsubstanz, z. B.
0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg und 1 000 mg/kg [die Konzentrationen sind dabei in Milligramm an
Prüfsubstanz je Kilogramm getrockneten Kontrollboden (5.2.2) angegeben und eine Kontrolle verwendet
10 Milben je Behälter]. Die Vorprüfung wird ohne Wiederholung durchgeführt. Die Dauer der Prüfung zur
Ermittlung des Konzentrationsbereichs beträgt 14 Tage (Expositionsdauer), gefolgt von einer Extraktions-
dauer von zwei Tagen. Nach insgesamt 16 Tagen werden die Mortalität der adulten Milben und die Anzahl
der juvenilen Tiere bestimmt. Auf Grundlage der Ergebnisse der Prüfung zur Ermittlung des
Konzentrationsbereichs wird die ER50/EC50 grob durch Berechnung des geometrischen Mittelwerts der
beiden Konzentrationen bestimmt, die 0 % und 100 % Mortalität angeben. Der Konzentrations-/
Verdünnungsbereich in der abschließenden Prüfung sollte vorzugsweise so gewählt werden, dass er

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Konzentrationen enthält, bei denen eine Anzahl juveniler Tiere beeinträchtigt wird, das Überleben der
mütterlichen Generation hingegen nicht. Dies ist allerdings möglicherweise nicht bei Substanzen möglich,
die in ähnlichen Konzentrationen letale und subletale Wirkungen hervorrufen.

Wenn keine Wirkungen beobachtet werden, selbst bei 100%ig verunreinigtem Boden oder bei
Konzentrationen von 1 000 mg/kg Prüfsubstanz zu Standardboden (Trockenmasse), kann die Vorprüfung
als eine Grenzwertprüfung gestaltet werden.

7.1.3 Hauptprüfung

Der Aufbau der Hauptprüfung hängt von den Prüfzielen ab. Üblicherweise werden die Lebensraum-
eigenschaften eines im Freiland beprobten Bodens dadurch ermittelt, dass die biologischen Auswirkungen
für den zu prüfenden Boden mit denen in einem Referenzboden, oder falls letzterer nicht verfügbar bzw. auf-
grund von Toxizität oder untypischen physikochemischen Eigenschaften nicht geeignet ist, mit den
Auswirkungen in einem Standardboden verglichen werden. Die für den Standardboden ermittelten
Ergebnisse helfen bei der Unterscheidung der von der Verunreinigung ausgehenden Wirkungen von
denjenigen, die, verursacht durch die physikochemischen Bodeneigenschaften nicht von der Verunreinigung
ausgehen. Ungeachtet dessen, ob ein Referenzboden oder Standardboden für die statistischen Vergleiche
verwendet wird, sind die Ergebnisse mit dem Standardboden zur Beurteilung der Gültigkeit und Eignung der
Prüfung [27] zu verwenden. Die Dauer der Hauptprüfung beträgt 14 Tage (Expositionsdauer), gefolgt von
einer Extraktionsdauer von zwei Tagen. Nach insgesamt 16 Tagen werden die Mortalität der adulten Milben
und die Anzahl der juvenilen Tiere bestimmt.

Ist für Charakterisierungszwecke ein Prüfaufbau erforderlich, der Verdünnungsreihen einschließt, sind drei
Konzepte möglich (die Konzentrationsabstufungen dürfen den Faktor 2 nicht überschreiten):

— Bei der Vorgehensweise mit NOER/NOEC sollten mindestens fünf Konzentrationen in einer
geometrischen Reihe verwendet werden. Für jede Behandlung werden vier Wiederholungen zuzüglich
acht Kontrollen empfohlen.
— Bei der Vorgehensweise mit ERx/ECx sollten 12 Konzentrationen oder Prüfmischungen verwendet
werden. Für jede Konzentration werden zwei Wiederholungen zuzüglich sechs Kontrollen empfohlen.
Der Faktor der Konzentrationsabstufungen kann variabel sein; kleiner bei geringeren Konzentrationen,
größer bei höheren Konzentrationen.
— Bei der gemischten Vorgehensweise sollten mindestens sechs bis acht Konzentrationen oder
Prüfmischungen in einer geometrischen Reihe verwendet werden. Für jede Behandlung werden vier
Wiederholungen zuzüglich acht Kontrollen empfohlen. Diese gemischte Vorgehensweise ermöglicht
sowohl eine NOER-/NOEC- als auch eine ERx-/ECx-Bewertung.
Um die Überprüfung des pH-Wertes und der Feuchtigkeit des Prüfsubstrates zu ermöglichen, wird die
Verwendung zusätzlicher Gefäße für jede Konzentration und für die Kontrolle empfohlen.

Jedes Prüfgefäß (Wiederholung) wird mit 20 g Trockenmasse des Prüfsubstrates gefüllt. Um die
Einwanderung der Milben zu erleichtern, sollte das Substrat im Prüfgefäß nicht verdichtet werden.

7.1.4 Grenzwertprüfung

Wenn bei der höchsten Konzentration in der Prüfung zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs (z. B.
1 000 mg/kg oder 100 %) keine Wirkungen beobachtet werden, kann die Reproduktionsprüfung als
Grenzwertprüfung mit einer Prüfkonzentration von 1 000 mg/kg oder unverdünntem Boden durchgeführt
werden. Eine Grenzwertprüfung bietet die Möglichkeit zu belegen, dass die NOEC/NOER oder EC10/ER10 für
die Reproduktion größer als die Grenzkonzentration sind, während die Anzahl der in der Prüfung
verwendeten Milben minimiert wird. Sowohl für den sanierten als auch für den Kontrollboden sollten acht
Wiederholungen durchgeführt werden.

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7.2 Herstellung der Prüfmischungen

7.2.1 Prüfung des verunreinigten Bodens

Entsprechend dem gewählten Verdünnungsbereich ist der zu prüfende Boden gründlich mit dem Referenz-
boden oder Standardboden zu durchmischen (entweder manuell oder mit einem Handmischer). Die
Homogenität der Mischung ist visuell zu überprüfen. Die Gesamtmasse des zu prüfenden Bodens und des
Referenz- oder des Standardbodens muss in jedem Prüfgefäß (6.1) 20 g (Trockenmasse) betragen. Die
Prüfmischung ist mit deionisiertem Wasser so anzufeuchten, dass 40 % bis 60 % der gesamten
Wasserhaltekapazität, bestimmt nach Anhang B, erreicht wird. In einigen Fällen, wenn z. B. Abfallmaterialien
geprüft werden, sind höhere Prozentanteile erforderlich. Der Feuchtegehalt des Bodens kann leicht
überprüft werden, indem das Substrat in der Faust zusammengedrückt wird, ist der Feuchtegehalt korrekt,
sollten kleine Wassertropfen zwischen den Fingern austreten.

Am Anfang und am Ende der Prüfung ist für jede Prüfmischung (ein Gefäß je Konzentration) der pH-Wert
nach ISO 10390 zu bestimmen (wenn saure oder basische Proben geprüft werden, ist der pH-Wert nicht
einzustellen).

Die geeignet Anzahl an Wiederholungen für die Konzentration/Prüfmischung und die Kontrolle(n) nach dem
ausgewählten Ansatz (siehe 7.1.3) sind vorzubereiten.

WARNUNG — Verunreinigte Böden können unbekannte Gemische von toxischen, mutagenen oder
auf andere Art schädlichen Chemikalien oder infektiöse Mikroorganismen enthalten. Berufliche
Gesundheitsrisiken können durch Staub oder verdunstete Chemikalien sowie über Hautkontakt
während der Handhabung und Inkubation auftreten.

7.2.2 Prüfung von dem Prüfsubstrat zugegebenen Substanzen

Als Prüfsubstrat ist Standardboden (5.2.2) zu verwenden. Für jedes Prüfgefäß (6.1) muss die Masse des
verwendeten Substrates 20 g (Trockenmasse) entsprechen. Die Substanzen werden dem Prüfsubstrat
zugefügt und gründlich eingemischt.

Für die Zugabe der Prüfsubstanzen sind entweder Verfahren a), b) oder c) entsprechend anzuwenden:

a) Wasser-lösliche Substanz
— Unmittelbar vor Prüfbeginn ist die Prüfsubstanzmenge, die für die Wiederholungen einer
Konzentration in Wasser erforderlich ist, in Wasser oder in der zur Befeuchtung des
Bodensubstrates erforderlichen Menge zu lösen, dass ein endgültiger Wassergehalt von 40 % bis
60 % der maximalen Wasserhaltekapazität erreicht wird, und das Wasser ist sorgfältig mit dem
Boden zu vermischen, bevor es in die Prüfgefäße eingefüllt wird.
b) In Wasser unlösliche hingegen in organischen Lösemitteln lösliche Substanzen
— Die zum Erhalt der gewünschten Konzentration erforderliche Menge der Prüfsubstanz ist in einem
flüchtigen Lösemittel (z. B. Aceton oder Hexan) zu lösen und mit einem Anteil des erforderlichen
Quarzsandes zu vermischen. Nach Evaporation des Lösemittels durch Verbringung des Gefäßes
unter einen Dunstabzug, die verbleibende Menge Boden und Wasser hinzufügen und sorgfältig
vermischen, bevor die Mischung in die Prüfgefäße eingefüllt wird.
ANMERKUNG Wenn die Prüfsubstanz nur schwer wasserlöslich ist, kann sie mittels Ultraschalldispersion,
organischen Lösemitteln, Emulgatoren oder Dispergenzien gelöst werden. Bei Verwendung solcher Trägerstoffe sollten
alle Prüfkonzentrationen sowie eine zusätzliche Kontrolle die gleiche Mindestmenge Trägerstoff enthalten.

WARNUNG — Geeignete Vorsichtsmaßnahmen sind zu treffen, um beim Umgang mit Lösemittel-


dämpfen Gefahren durch Inhalation oder Explosion und Schäden an den Extraktionsgeräten, Pumpen
usw. zu vermeiden.

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c) In Wasser oder organischen Lösemitteln unlösliche Substanzen

— Bei einer in einem flüchtigen Lösemittel unlöslichen Substanz ist eine Mischung aus 10 g fein
gemahlenem Industrie-Quarzsand (siehe 5.2.2) und der für die gewünschte Konzentration
erforderlichen Prüfsubstanzmenge herzustellen. Diese Mischung ist dem restlichen Boden und dem
Wasser beizugeben und vor dem Einfüllen in ein Prüfgefäß sorgfältig zu vermischen.

Die zur Ermittlung der LOEC/NOEC gewählten Konzentrationen basieren auf den Ergebnissen der Prüfung
zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs. Die Konzentrationsabstufungen dürfen den Faktor 2 nicht
überschreiten.

In das Substrat eingemischte Substanzen brauchen in Konzentrationen über 1 000 mg/kg Prüfsubstratmasse
nicht geprüft zu werden.

Die Prüfung ist gleichzeitig mit allen Wiederholungen je Konzentration und der (den) Kontrolle(n)
entsprechend der ausgewählten Vorgehensweise fortzusetzen.

Am Anfang und am Ende der Prüfung ist für jede Prüfmischung (ein Gefäß je Konzentration) der pH-Wert
nach ISO 10390 zu bestimmen.

7.2.3 Vorbereitung der Kontrollgefäße

Das Kontrollgefäß enthält den Kontrollboden (5.2.2), der mit deionisiertem Wasser so angefeuchtet ist, dass
40 % bis 60 % der gesamten Wasserhaltekapazität (bestimmt nach Anhang B) erreicht werden.

Ein Kontrollgefäß ist für die Prüfung zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs und mindestens sechs
Kontrollgefäße sind für die Hauptprüfung vorzubereiten.

Die Kontrollgefäße sind ebenso wie die Prüfgefäße vorzubereiten. Erfordert die Vorbereitung der Prüfung
die Verwendung eines Lösemittels (siehe 7.2.2), sind mindestens sechs zusätzliche Kontrollgefäße mit dem
Lösemittel, jedoch ohne die Prüfsubstanz vorzubereiten. Die Gefäße sind, wie in 6.1 angegeben, abzudecken.

7.3 Zugabe des biologischen Materials


Zehn weibliche adulte Tiere in 20 g Trockenmasse künstlichen Bodens werden für jedes Kontroll- und
Behandlungsgefäß empfohlen. Die Prüforganismen sollten innerhalb von 2 Stunden nach Erstellung des
endgültigen Prüfsubstrats hinzugefügt werden (d. h. nach Aufbringung des Prüfgegenstands). In besonderen
Fällen (z. B. wenn die Alterung als ein die Toxizität bestimmender Faktor gilt) kann die Zeit zwischen der
Erstellung des endgültigen Prüfsubstrats und der Zugabe der Milben verlängert werden (für Einzelheiten zu
einer solchen Alterung siehe Literaturhinweis [11]). Allerdings muss in solchen Fällen eine wissenschaftliche
Begründung geliefert werden.

Die Milben werden dazu durch Abklopfen oder Absaugen aus den Zuchtgefäßen in die Prüfgefäße überführt.
Das lässt sich leicht mit Hilfe einer in ISO 11267:2014, A.2 beschriebenen Absaugvorrichtung ausführen. Vor
dem Einsetzen in die Prüfgefäße werden die Tiere zunächst gezählt und auf etwaige Verletzungen
untersucht, um die Kontrollmortalität zu reduzieren und um systematische Versuchsfehler zu vermeiden.

7.4 Prüfbedingungen und Messungen

Die Prüftemperatur sollte (20 ± 2) °C betragen. Die Temperatur sollte mindestens täglich aufgezeichnet und
gegebenenfalls angepasst werden. Die Prüfung wird in konstanter Lichtintensität von 400 lx bis 800 lx an
der Substratoberfläche bei einem kontrollierten Hell-Dunkel-Zyklus zwischen 12 Stunden : 12 Stunden und
16 Stunden : 8 Stunden durchgeführt. Aus Gründen der Vergleichbarkeit sind diese Bedingungen dieselben
wie in anderen ökotoxikologischen Bodenprüfungen [19].

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DIN EN ISO 21285:2021-02
EN ISO 21285:2020 (D)

Der Gasaustauch sollte durch Belüftung der Prüfgefäße mindestens zweimal wöchentlich, wenn
Schraubdeckel verwendet werden, sichergestellt werden. Wenn Gazeabdeckungen verwendet werden, sollte
besonders die Aufrechterhaltung der Bodenfeuchte beachtet werden.

Der Wassergehalt des Bodensubstrats im Prüfgefäß wird während der Prüfung durch Wägen gewahrt,
gegebenenfalls werden die Prüfgefäße regelmäßig (z. B. einmal wöchentlich) erneut gewässert. Verluste
werden bei Bedarf mit deionisiertem Wasser aufgefüllt. Der Feuchtegehalt während der Prüfung sollte um
nicht mehr als 10 % vom Anfangswert abweichen. Werden saure oder basische Substanzen geprüft, darf der
pH-Wert nicht eingestellt werden.

7.5 Füttern der Milben

Modermilben [Tyrophagus putrescentiae (Schrank, 1781)] haben sich als geeignete Nahrungsquelle bewährt.
Kleine Collembolen [z. B. juvenile Folsomia candida (Willem, 1902) oder Onychiurus fimatus [7] [22]],
Enchytraeen [z. B. Enchytraeus crypticus (Westheide and Graefe, 1992)] oder Nematoden [z. B. Turbatrix
silusiae (de Man, 1913)] können sich ebenfalls eignen. Vor der Verwendung in einer Prüfung wird die
Prüfung der Nahrung empfohlen. Der Typ und die Menge an Nahrung sollte eine angemessene Anzahl an
juvenilen Tieren sichern, um die Validitätskriterien zu erfüllen (siehe Abschnitt 9). Bei der Auswahl der
Beute sollte die Wirkungsweise des Prüfgegenstands berücksichtigt werden (z. B. kann ein Akarizid für
Nahrungsmilben ebenfalls toxisch sein, siehe unten).

Nahrung sollte ad libitum zur Verfügung gestellt werden, d. h. jedes Mal eine geringe Menge (Spatelspitze).
Auch eine Absaugvorrichtung mit geringer Saugspannung, wie in ISO 11267:2014, A.2, vorgeschlagen, oder
ein feiner Pinsel können zu diesem Zweck verwendet werden. In der Regel ist die Nahrungsversorgung zu
Beginn der Prüfung und zwei- bis dreimal wöchentlich ausreichend. Wenn der Prüfgegenstand als für das
Beutetier toxisch erscheint, sollte eine erhöhte Zufuhr und/oder eine alternative Nahrungsquelle in
Erwägung gezogen werden.

7.6 Bestimmung der überlebenden Prädatormilben

An Tag 14 werden die überlebenden Milben mittels Wärme-/Lichtentzug aus dem Boden extrahiert
(siehe Anhang D). Die Anzahl der juvenilen Tiere (d. h. Larven, Protonymphen und Deutonymphen) und die
der adulten werden am Ende der Extraktion (Tag 16 nach Beginn der Prüfung) separat gezählt. Alle adulten
Milben, die zu diesem Zeitpunkt nicht gefunden werden, werden als tot aufgezeichnet, in der Annahme, dass
solche Milben gestorben und sich vor der Bewertung zersetzt haben. Die Extraktionseffizienz muss ein- bis
zweimal je Jahr in Kontrollen mit einer bekannten Anzahl an adulten und juvenilen Tieren validiert werden.
Die Effizienz sollte durchschnittlich, kombiniert für alle Entwicklungsphasen, über 90 % liegen (siehe
Anhang D). Die Zählungen adulter und juveniler Tiere werden hinsichtlich der Effizienz nicht angepasst.

Alle beobachteten Unterschiede zwischen dem Verhalten und der Morphologie der Milben in den
Kontroll- und den behandelten Gefäßen sollten aufgezeichnet werden.

8 Berechnung und Angabe der Ergebnisse

8.1 Berechnung

Nach einer Prüfperiode von zwei Wochen sind für jede Verdünnung oder Konzentration die prozentuale
Mortalität und die Anzahl von juvenilen Tieren zu bestimmen.

8.2 Angabe der Ergebnisse

Eine graphische Darstellung der Mittelwerte der Endpunkte, einschließlich der Standardabweichung der
gemessenen Werte in Bezug auf den zu prüfenden Boden (die zu prüfenden Böden), den Kontrollboden (die
Kontrollböden) oder das Prüfmischungsverhältnis sollte erstellt werden. Dieser Vergleich oder diese Kurve

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gibt einen Eindruck über die Qualität der Wirkungen und ihrer Größenordnungen. Das Mischungsverhältnis
ist auf der Grundlage der Bodentrockenmasse anzugeben.

Wenn Verdünnungs- oder Konzentrationsreihen hergestellt wurden, sind anzugeben:

— bei der Vorgehensweise mit ECx/ ERx der prozentuale Anteil des zu prüfenden Bodens basierend auf der
Trockenmasse oder in Milligramm je Kilogramm des getrockneten Bodensubstrates, die mittlere
prozentuale Verdünnung des verunreinigten Bodens oder die mittlere Konzentration der Prüfsubstanz,
die innerhalb der Prüfdauer die Anzahl der juvenilen Milben im Vergleich zur Kontrolle um 50 % (EC50)
reduziert; oder

— bei der Vorgehensweise mit NOEC/NOER das Bodenmischungsverhältnis gleich unterhalb der
LOEC/LOER oder die höchste geprüfte Konzentration/Rate einer Prüfsubstanz, das bzw. die verglichen
mit der Kontrolle keine statistisch signifikante letale oder andere Wirkung zeigte, z. B. Reproduktions-
leistung (p < 0,05).

9 Gültigkeit der Prüfung


Die Ergebnisse gelten als gültig, wenn

— die Mortalität der adulten Tiere in der (den) Kontrolle(n) am Ende der Prüfung 20 % nicht übersteigt;

— die Reproduktionsrate ein Minimum von 100 juvenilen Milben je Kontrollgefäß erreicht;

— der Variationskoeffizient der Reproduktionsleistung in der Kontrolle nicht höher als 30 % ist.

10 Statistische Analyse

10.1 Allgemeines

Die meisten Prüfverfahren mit subletalen Endpunkten, z. B. Reproduktion, umfassen quantitative


Wirkungen, z. B. die Zählung juveniler Milben. Quantisierte Wirkungen können ebenfalls in der gleichen
Prüfung gemessen werden, wie z. B. die Mortalität zwei Wochen nach der Exposition.

Die hier angegebene Anleitung zur statistischen Bewertung der Prüfergebnisse ist dazu gedacht, den
Untersuchenden über Probleme zu informieren, die in Folge eines ausgewählten Prüfaufbaus entstehen
können. Computerprogramme bieten keinen unbedingten Schutz gegen Regelverstöße, die zu fehlerhaften
Analysen führen können. Es wird dringend empfohlen, für weitere Informationen in spezifischen Leitlinien
nachzuschlagen (z. B. wie in Literaturhinweis [9] gegeben) oder einen Statistiker heranzuziehen.

10.2 Einzel-Konzentrationsprüfungen

Quantitative Einzel-Konzentrationsprüfungen (z. B. Auswirkungen auf die Reproduktionsleistung) haben


unterschiedliche statistische Verfahren. Bei der Probenahme an mehreren Orten mit Freiland-
wiederholungen, kann die Varianzanalyse (ANOVA, en: analysis of variance) ein erster Schritt sein, falls die
Ergebnisse geeignet sind. Wenn die Nullhypothese, dass es keinen Unterschied gibt, abgelehnt wird, dann
kann mit einer von mehreren Mehrfachvergleichsprüfungen fortgesetzt werden [9].

Ein Beispiel einer Einzel-Konzentrationsprüfung für quantitative Wirkungen kann die Zählung der juvenilen
Milben sein, als Endpunkt der Auswirkungen auf die Reproduktionsleistung nach Exposition in ein
Prüfsubstrat von unverdünntem verunreinigten Boden im Vergleich zur Anzahl der Nachkommen, die einem
Referenz- oder Standardboden ausgesetzt werden. Wurde dabei nur eine Mischung geprüft und ein Kontroll-
substrat, ohne jegliche Wiederholungen, können die Ergebnisse nicht mit statistischen Prüfungen verglichen
werden. Bei einer quantitativen Prüfung mit Wiederholungen bei dem zu prüfenden Boden (Material) und
bei dem Kontrollboden ist ein Standard-t-Test für die statistische Analyse geeignet.

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ANOVA, die multiple Vergleiche der Endpunktdaten abgeleitet für unverdünnte zu prüfende Böden sowie für
Wiederholungen von Freilandböden von mehr als einem Probenahmeort einschließt, wird üblicherweise für
die statistische Interpretation der Signifikanz der Ergebnisse aus Bodentoxizitätsprüfungen angewendet.
Dies ist eine Vorgehensweise mit Hypothesenprüfung und unterliegt nennenswerten Schwächen [9]. Die
parametrischen Analysen (z. B. ANOVA und multiple Vergleiche) für diese Daten gehen davon aus, dass die
Daten normal verteilt sind, dass die Prüfglieder unabhängig sind, und dass die Varianz zwischen den
verschiedenen Prüfgliedern homogen ist. Diese Annahmen sind zu prüfen. Wenn die Daten die Annahmen
bestätigen, darf mit der Analyse fortgefahren werden. Falls nicht, dürfen die Daten transformiert und erneut
überprüft werden. Da parametrische Prüfungen angesichts von moderaten Abweichungen von der
Normalität und Varianzgleichheit einigermaßen stabil sind, sollte die parametrische Analyse durchgeführt
werden, auch wenn nach der Transformation [9] moderate Nichtkonformität auftritt. Wenn die
ursprünglichen oder transformierten Daten beide Prüfungen zur Verteilung der Daten nicht erfüllen, dann
muss die Analyse mit nicht parametrischen Verfahren durchgeführt werden.

10.3 Mehrfach-Konzentrationsprüfungen

10.3.1 Prüfung zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs

Wird eine eindeutige Dosis-Wirkungs-Beziehung beobachtet, können die ERx/ECx-Werte mit


Regressionsverfahren, ähnlich wie die logistische Regressionsfunktion oder die Probit-Analyse, abgeschätzt
werden. In anderen Fällen sollte der Wirkungsbereich durch Fachkenntnis bestimmt werden.

10.3.2 Hauptprüfung

Eine Punktschätzung (Vorgehensweise mit ERx/ECx) ist als der beste quantitative Endpunkt zu empfehlen.
Das ist im Vergleich mit der Kontrolle üblicherweise ein spezifischer Grad der Leistungsverminderung.
Lineare und nicht lineare Regressionsverfahren werden weitgehend für statistische Analysen eingesetzt. Die
Anwender sollten in der Lage sein, die Entscheidungen bei der Auswahl geeigneter mathematischer Modelle
zu verstehen.

Die Hypothesenprüfung (Vorgehensweise mit NOEC) wird üblicherweise zur Identifizierung der
Verdünnungen (Konzentrationen) mit signifikanten Wirkungen im Vergleich zur Kontrolle angewendet. Da
dieses Verfahren viele Schwächen aufweist, ist es nicht zu empfehlen.

In Fällen, bei denen verschiedene Verdünnungen (Konzentrationen) von jeder Probe von im Freiland
entnommenem Boden mit negativem Kontrollboden geprüft wird, werden die Daten deshalb mit der
Vorgehensweise mit ERx/ECx analysiert, oder mit der Vorgehensweise mit NOEC.

— Vorgehensweise mit ERx/ECx (Wirkungskonzentration).

Die Vorgehensweise mit ERx/ECx kann nur verwendet werden, wenn eine klare
Dosis-Wirkungsbeziehung festgestellt wurde. Wenn möglich, sollte R2 0,7 oder höher sein und die
Prüfmischungen sollten 20 % bis 80 % Wirkungen umfassen. Werden diese Anforderungen nicht erfüllt,
ist Expertenwissen für die Interpretation der Prüfergebnisse erforderlich.

Zur Berechnung eines ERx/ECx-Wertes werden die Mittelwerte in einer Regressionsanalyse verwendet,
nachdem eine geeignete Dosis-Wirkungs-Funktion (z. B. Probit- oder logistische Funktion) gefunden
wurde. Eine gewünschte ERx/ECx wird durch Einsatz eines Wertes entsprechend x % der
Kontrollmittelwerte in die durch die Regressionsanalyse erhaltene Gleichung ermittelt. Da die
EC50-Werte verglichen mit geringeren Wirkungskonzentrationen (z. B. ER20/EC20) kleinere
Vertrauensgrenzen haben, ist eine Bestimmung der ER50/EC50-Werte zu empfehlen.

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— Vorgehensweise mit NOEC (höchste Konzentration ohne statistisch signifikante Wirkung).

Zuerst muss eine statistische Analyse der Homogenität der Varianzen ausgeführt werden, z. B. mit
einem Cochran-Test. Bei homogenen Daten sollte eine geeignete statistische Analyse, z. B. eine
„Einweg-Varianzanalyse (ANOVA)“, gefolgt von einem einseitigen Dunnett-Test ( = 0,05), durchgeführt
werden. Wenn die Anforderung an die Homogenität nicht erfüllt ist, ist es empfehlenswert, zu
beurteilen, ob eine geeignete Transformation der Daten das Problem lösen kann. Anderenfalls können
nichtparametrische Verfahren, z. B. der U-Test nach Mann und Whitney oder der U-Test nach
Bonferroni, durchgeführt werden.

Wurde eine Grenzwertprüfung durchgeführt und die Voraussetzungen (Normalität, Homogenität) der
parametrischen Prüfverfahren erfüllt, darf der Student-t-Test, ansonsten der t-Test (Welch-t-Test) mit
ungleichen Varianzen oder ein nichtparametrischer Test, wie z. B. der U-Test nach Mann und Whitney
durchgeführt werden.

In jedem Fall müssen die Ergebnisse der statistischen Bewertung biologisch interpretiert werden.

11 Prüfbericht
Im Prüfbericht sind folgende Informationen anzugeben:

a) eine Verweisung auf dieses Dokument, d. h. ISO 21285;

b) die in 8.2 angegebenen Ergebnisse;

c) die ausführliche Beschreibung des Prüfsubstrates und Angaben zu physikalischen und chemischen
Eigenschaften, wenn es für die Interpretation des Prüfergebnisses hilfreich ist; ebenso werden
detaillierte Informationen über die verwendeten Böden benötigt:

— die Herkunft des Freilandbodens, der als Kontroll- und Verdünnungsboden verwendet wird (falls
zutreffend);

— bei der Prüfung von Bodenmaterial: eine Tabelle mit den Ergebnissen chemischer Analysen des
geprüften Bodens (z.B. einschließlich Corg, Schwermetallgehalt), falls vorhanden;

d) die vollständige Beschreibung des verwendeten biologischen Materials (Arten, Alter, Anzucht-
bedingungen, Bezugsquelle);

e) das Herstellungsverfahren des Prüfsubstrates, zusammen mit einer Angabe der Trägerstoffe, die für die
schwer/nicht wasserlösliche Substanz verwendet wurden;

f) die mit der Referenzsubstanz erhaltenen Ergebnisse;

g) Einzelheiten zu den Bedingungen der Prüfumgebung;

h) eine Tabelle, die die für jede Konzentration und für die Kontrolle(n) ermittelte prozentuale Mortalität
der adulten Tiere angibt;

i) Anzahl der toten oder verschwundenen adulten Tiere und die Anzahl der Nachkommen je Prüfgefäß am
Ende der Prüfung;

j) abhängig von der gewählten statistischen Vorgehensweise die niedrigste Konzentration, die signifikante
Wirkungen anzeigt (LOEC), die höchste Konzentration ohne beobachtete Wirkungen (NOEC), EC10 und
EC50 für die Hemmung der Reproduktion und das für die Berechnung angewendete Verfahren
(optional);

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k) eine Beschreibung pathologischer oder weiterer Symptome oder ausgeprägter Verhaltensänderungen,


die bei den Prüforganismen je Prüfgefäß beobachtet wurden;

l) Wassergehalt, pH-Wert und Kationenaustauschkapazität (CEC)-Kennzeichnung des zu prüfenden


Bodens und des Kontrollbodens zu Beginn und am Ende der Prüfung bei jeder Konzentration;

m) Angabe aller nicht in diesem Dokument aufgeführten Verfahrensschritte sowie alle Faktoren, die die
Ergebnisse beeinflusst haben könnten.

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Anhang A
(informativ)

Verfahren zur Haltung und Zucht von Prädatormilben

A.1 Haltung von Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer


Die Kulturen können in Kunststoff- oder Glasgefäßen, gefüllt mit einer Gipsboden-/Holzkohlepulver-
mischung (9 : 1) gehalten werden. Der Gips kann bei Bedarf durch Zugabe einiger Tropfen destilliertem oder
deionisiertem Wasser feuchtgehalten werden. Die optimalen Haltungstemperaturen liegen zwischen
(20 ± 2) °C, Übergänge zwischen hell und dunkel sind für diese Spezies nicht relevant. Beutetiere können
Typrophagus putrescentiae oder Caloglyphus sp.-Milben sein (mit Nahrungsmilben sollte vorsichtig
umgegangen werden, da sie beim Menschen Allergien hervorrufen können), Nematoden, Enchytraeen und
Collembolen sind ebenfalls als Beutetiere geeignet. Deren Herkunft sollte aufgezeichnet werden. Die
Population kann mit einem einzigen Weibchen begonnen werden, da sich Männchen in unbefruchteten Eiern
entwickeln. Generationen sind weitestgehend überlappend. Ein Weibchen kann mindestens 100 Tage leben
und kann während seiner Lebensdauer etwa 100 Eier legen. Eine maximale Eiablage wird zwischen Tag 10
und Tag 40 (nach Erreichen der adulten Phase) erreicht und beträgt bis zu 2,2 Eier je Weibchen je Tag. Die
Dauer der Entwicklung vom Ei zum adulten Weibchen beträgt bei 20 °C etwa 20 Tage. Im Voraus sollte mehr
als eine Kultur aufrechterhalten und gehalten werden.

A.2 Haltung von Typrophagus putrescentiae


Die Milben werden in einem Glasgefäß, gefüllt mit feinem Bierhefepulver, gehalten, welches in einem
Kunststoffbehälter, gefüllt mit KNO3-Lösung, platziert wird, um ein Entkommen zu verhindern. Die
Nahrungsmilben werden auf der Oberseite dieses Pulvers platziert. Anschließend werden sie vorsichtig mit
dem Pulver, das zweimal wöchentlich ausgetauscht werden muss, mit einem Spatel vermischt.

A.3 Synchronisation der Kulturen


In der Prüfung verwendete Proben sollten ein ähnliches Alter aufweisen (etwa 7 Tage nach Erreichen der
adulten Phase). Bei einer Haltungstemperatur von 20 °C wird dies erreicht, indem

— Weibchen in ein sauberes Haltungsgefäß umgesetzt werden und ausreichend Nahrung zugegeben wird;

— zwei bis drei Tage nach der Eiablage die Weibchen entfernt werden;

— die adulten Weibchen zwischen Tag 28 und Tag 35, nachdem die adulten Weibchen in die sauberen
Haltungsgefäße gesetzt wurden, zur Prüfung herangezogen werden.

Adulte Weibchen lassen sich leicht von Männchen und anderen Entwicklungsphasen durch ihre größere
Größe, die aufgeblähte Form und ihren braunen Rückenpanzer unterscheiden (Männchen sind schmaler und
flach), juvenile Tiere sind weiß bis cremefarben. Die Entwicklung der Milben verläuft bei 20 °C etwa nach
folgendem Muster: Ei 5 Tage, Larve 2 Tage, Protonymph 5 Tage, Deutonymph 7 Tage, Zeitraum vor der
Eiablage eines Weibchens 2 Tage. Anschließend sind die Milben adult.

Die adulten Testorganismen werden zwischen dem 28. Tag und dem 35. Tag, nachdem die Elternweibchen
mit der Eiablage begonnen haben (d. h. zwischen dem 7. Tag und dem 14. Tag nach der Eiablage werden sie
adult) aus der synchronisierten Kultur entnommen und in die Prüfgefäße verbracht. Dies gewährleistet, dass
die Testtiere bereits den Zeitraum vor der Eiablage durchlaufen haben und sich mit Männchen, die ebenfalls
im Prüfgefäß vorhanden sind, verpaart haben. Beobachtungen in Laborkulturen lassen darauf schließen,
dass sich Weibchen umgehend, oder direkt nachdem sie in die adulte Phase eingetreten sind, verpaaren,

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wenn Männchen vorhanden sind (Ruf, Vanninnen, persönliche Beobachtung). Die Dauer von sieben Tagen
wird gewählt, um die Integration in die Laborroutine zu vereinfachen und eine individuelle
Entwicklungsvariabilität unter den Milben aufzufangen. Die Eiablage sollte mit mindestens der gleichen
Anzahl an Weibchen begonnen werden, wie der, die letztendlich für die Prüfung benötigt wird. Wenn
beispielsweise 400 Weibchen in der Prüfung benötigt werden, sollten mindestens 400 Weibchen für die
Eiablage für zwei bis drei Tage vorhanden sein. Der Ausgangspunkt für die synchronisierte Population sollte
mindestens 1 200 Eier sein (Geschlechterverhältnis etwa 0,5, Mortalität etwa 0,2). Um Kannibalismus
vorzubeugen, ist es eher praktikabel, nicht mehr als 20 bis 30 eierlegende Weibchen in einem Gefäß zu
halten.

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Anhang B
(normativ)

Bestimmung der Wasserhaltekapazität

B.1 Allgemeines
Das folgende Verfahren hat sich für Laborproben der zu prüfenden Böden und der Standardböden als
geeignet erwiesen.

B.2 Geräte
B.2.1 Glaszylinder, etwa 20 mm bis 50 mm Durchmesser und mindestens 100 mm Länge.

B.2.2 Wasserbad, bei Raumtemperatur.

B.2.3 Filterpapier.

B.2.4 Trockenschrank, auf (105 ± 5) °C eingestellt.

B.2.5 Waage mit einer Wägegenauigkeit von ±0,1 g.

B.3 Durchführung
Der Boden des Zylinders ist mit Filterpapier zu verschließen und nach Befüllen mit dem Kontroll- oder
Prüfsubstrat bis zu einer Höhe von 5 cm bis 7 cm in einem Gestell ins Wasserbad zu stellen. Der Zylinder ist
allmählich in das Wasser einzutauchen, bis der Wasserstand oberhalb der Bodenoberfläche ist, aber
unterhalb der oberen Kante des Zylinders. Die Substratprobe ist für etwa 3 Stunde im Wasser zu belassen.

Da nicht alles Wasser durch Kapillarkräfte im Substrat gehalten werden kann, sollte der Zylinder mit der
Probe zur Entwässerung für eine Dauer von 2 h auf sehr feuchten, fein gemahlenen Quarzsand gestellt
werden. Hierfür eignet sich der gleiche Quarzsand, der für das Bodensubstrat verwendet wurde.

Die Probe ist zu wägen, bei 105 °C bis zur Massekonstanz zu trocknen und erneut zu wägen.

B.4 Berechnung der Wasserhaltekapazität (wwh)


S T D
wh = × 100 (B.1)
D

Dabei ist

wwh die Wasserhaltekapazität als prozentualer Anteil der Trockenmasse, %;

ms die Masse des wassergesättigten Substrats plus der Masse des Zylinders zuzüglich der Masse des
Filterpapiers;

mT Tara (Masse des Zylinders zuzüglich der Masse des Filterpapiers);

mD Trockenmasse des Substrats.

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Anhang C
(informativ)

Anleitung zur Einstellung des pH-Werts des künstlichen Bodens

Um abschätzen zu können, wie viel CaCO3 zur Einstellung des gewünschten pH-Werts auf einen pH-Wert von
(6,0 ± 0,5) benötigt wird, ist zunächst der künstliche Boden wie in 5.2.2 beschrieben durch Vermischen von
Torf, Sand, Kaolin und Wasser herzustellen. Geringe Mengen werden genommen und mit verschiedenen
Mengen von CaCO3 vermischt, z. B. entsprechend Konzentrationen von 0,2 %, 0,4 %, 0,6 %, 0,8 % und 1,0 %
Trockenmasse. Aus diesen Mischungen wird der pH-Wert, wie in ISO 10390 beschrieben, bestimmt und die
Ergebnisse werden als Graph des pH-Wertes verglichen mit der Menge an CaCO3 dargestellt. Anhand dieses
Graphen kann die notwendige Menge an CaCO3, um einen pH-Wert von 6,0 ± 0,5 zu erhalten, geschätzt
werden.

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Anhang D
(informativ)

Extraktion und Auszählen von Prädatormilben

Nach einer Prüfperiode von zwei Wochen müssen für jede Verdünnung oder Konzentration die prozentuale
Mortalität und die Anzahl von juvenilen Tieren bestimmt werden. Für Mikroarthropoden ist die
Wärmeextraktion ein geeignetes Verfahren zur Austreibung der Tiere aus dem Boden/Substrat. Das
Verfahren basiert auf der Aktivität der Organismen, daher können nur mobile Tiere erfasst werden. Das
Prinzip der Wärmeextraktion ist es, die Bedingungen für die Organismen in der Probe schrittweise zu
verschlechtern, damit diese das Substrat verlassen und in eine Fixierflüssigkeit (z. B. Ethanol) fallen.
Wichtige Punkte sind die Dauer der Extraktion und das Gefälle von für die Organismen guten über moderate
bis hin zu schlechten Bedingungen. Da das Wachstum der Population während der Dauer der Extraktion die
Ergebnisse verfälscht, muss die Dauer der Extraktion für ökotoxikologische Prüfungen so kurz wie möglich
sein. Zusätzlich müssen Temperatur und Feuchte in der Probe immer in einem Bereich liegen, in dem sich
die Milben bewegen können. Die Erhitzung einer Bodenprobe führt zur Austrocknung des Substrats. Wenn
die Austrocknung zu schnell voranschreitet, könnten auch einige Milben austrocknen, bevor sie flüchten
können.

Daher wird folgendes Verfahren vorgeschlagen [25] [8]:

— Apparat: Tullgren-Trichter oder vergleichbare Verfahren, wie bspw. McFadyen (Erwärmung von oben,
Probe wird über einem Trichter positioniert);

— Schritte der Erwärmung: 25 °C für 12 Stunden, 35°C für 12 Stunden, 45°C für 24 Stunden (insgesamt
48 Stunden). Die Temperatur sollte im Substrat gemessen werden;

— Fixierflüssigkeit: 70 % Ethanol.

Von den für den Test verwendeten Testgefäßen wird der Deckel abgenommen und ein Stück Gewebe oder
Stoff um die Öffnung gewickelt. Der Stoff sollte eine Maschenweite von 1,0 mm bis 1,5 mm aufweisen. Der
Stoff ist mit einem Gummiband zu befestigen. Das Testgefäß vorsichtig auf den Kopf drehen und im
Extraktionsapparat positionieren. Der Stoff verhindert, dass Substrat in die Fixierflüssigkeit rieselt,
ermöglicht den Milben jedoch, die Probe zu verlassen. Mit den Schritten der Erwärmung beginnen, wenn alle
Testgefäße eingesetzt sind. Die Extraktion nach 48 Stunden einstellen. Die Befestigungs-Testgefäße sind zu
entfernen und die Milben mittels eines Präpariermikroskops zu zählen.

Die Extraktionseffizienz des gewählten Verfahrens muss mindestens ein- bis zweimal jährlich mit Gefäßen
belegt werden, die eine bekannte Anzahl von juvenilen und adulten Milben in einem unbehandelten
Prüfsubstrat enthalten. Die Effizienz sollte im Durchschnitt 90 % für adulte Milben betragen, während
dieser Wert bei juvenilen Milben auf 75 % gesenkt wird (Huguier et al. 2016).

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Anhang E
(informativ)

Grundlegende Informationen über die Biologie von Hypoaspis


(Geolaelaps) aculeifer

Hypoaspis aculeifer gehört zur Familie der Lealapidae, Ordnung Mesostigmata, Unterklasse Acari (Milben),
Klasse der Arachniden, Phylum der Arthropoden. Sie leben in allen Arten von Böden und ernähren sich von
anderen Milben, Nematoden, Enchytraeen und Collembolen [18]. Bei Nahrungsknappheit wechseln sie zu
Kannibalismus [21]. Prädatormilben sind in Idiosoma und Gnathosoma unterteilt. Eine klare Abgrenzung
zwischen Vorderkörper (Kopf) und Hinterleib (Abdomen) fehlt. Das Gnathosoma (Kopfpanzer) enthält die
Fresswerkzeuge, wie Kiefertaster und Kieferklauen. Die Kieferklauen sind dreigeteilt und mit Zähnen
verschiedener Formen ausgestattet. Neben der Ingestion verwenden die Männchen ihre Kieferklauen
hauptsächlich dafür, die Spermatophoren auf die Weibchen zu übertragen. Ein Rückenpanzer bedeckt das
Idiosoma nahezu vollständig. Ein Großteil des weiblichen Idiosoma ist mit den Reproduktionsorganen
besetzt, die insbesondere kurz vor der Eiablage besonders ausgeprägt sind. Ventral finden sich zwei Panzer,
der Brust- und der Genitalpanzer. An allen Beinen finden sich Borsten und Stacheln. Die Borsten werden zur
Verankerung verwendet, wenn sich die Milbe im Boden oder auf der Bodenoberfläche bewegt. Das erste
Beinpaar wird hauptsächlich als Fühler genutzt. Das zweite Beinpaar wird nicht nur zur Bewegung, sondern
auch zum Umklammern der Beute genutzt. Die Stacheln des vierten Beinpaares können sowohl als Schutz als
auch als „Bewegungsantrieb“ genutzt werden [22]. Männchen sind zwischen 0,55 mm und 0,65 mm lang und
haben eine Masse von 10 µg bis 15 µg. Weibchen sind zwischen 0,8 mm und 0,9 mm lang und haben eine
Masse von 50 µg bis 60 µg [22].

Bei 23 °C werden die Milben geschlechtsreif, die Weibchen nach 16 Tagen und die Männchen nach 18 Tagen.
Die Weibchen übernehmen die Spermien über das Solenostom, von wo aus diese dann ins Ovar transportiert
werden. Im Ovar reifen die Spermien und werden eingelagert. Die Befruchtung findet erst nach der Reifung
der Spermien im Ovar statt. Die befruchteten oder unbefruchteten Eier werden von den Weibchen in
Gruppen oder einzeln abgelegt, bevorzugt in Spalten oder Löchern. Begattete Weibchen können juvenile
Tiere beiden Geschlechts tragen, wohingegen aus Eiern von unbegatteten Weibchen nur männliche juvenile
Tiere schlüpfen. Während der Entwicklung zum adulten Tier werden vier Entwicklungsphasen durchlaufen
(Ei — Larve, Larve — Protonymph, Protonymph — Deutonymph, Deutonymph — adultes Tier). Das Ei ist
milchig weiß, hyalin, elliptisch und etwa 0,37 mm lang, mit einer festen Hülle. Nach Literaturhinweis [17]
sind die Larven zwischen 0,42 mm und 0,45 mm groß. Sie haben nur drei Beinpaare. Im Kopfbereich sind
Kiefertaster und Kieferklauen entwickelt. Die Kieferklauen mit einigen kleinen Zähnchen werden verwendet,
um aus dem Ei zu schlüpfen. Nach der ersten Häutung, am 1. oder am 2. Tag nach dem Schlüpfen, sind die
Protonymphen entwickelt. Sie sind ebenfalls weiß, zwischen 0,45 mm und 0,62 mm groß [17] und haben
vier Beinpaare. An den Kieferklauen sind die Zähne vollständig vorhanden. Beginnend mit dieser Phase
fangen die Milben an zu fressen. Zu diesem Zweck wird die Cuticula der Beute mit den Kieferklauen
durchstochen und ein Sekret für die extra-intestinale Digestion in die Beute abgegeben. Der Nahrungsbrei
kann dann von der Milbe aufgesaugt werden. Die Kieferklauen können auch verwendet werden, um größere
Partikel aus Nahrungsklumpen zu reißen [22]. Nach einer weiteren Häutung sind die Deutonymphen
entwickelt. Sie sind zwischen 0,60 mm und 0,80 mm groß [17] und gelb bis hellbraun gefärbt. Beginnend
mit dieser Phase können Weibchen und Männchen unterschieden werden. Nach einer weiteren Häutung,
während der die Tiere inaktiv sind und sich der braune Panzer entwickelt (etwa nach dem 14. Tag) sind die
Milben ausgewachsen [22] [15] [16]. Ihre Lebenserwartung beträgt zwischen 48 Tagen und 100 Tagen bei
25 °C [21].

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EN ISO 21285:2020 (D)

Literaturhinweise

[1] ISO 11267:2014, Soil quality — Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil
contaminants

[2] ISO 11268-2, Soil quality-Effects of pollutants on earthworms — Part 2: Determination of effects on
reproduction of Eisenia fetida/Eisenia andrei

[3] ISO 15799, Soil quality — Guidance on the ecotoxicological characterization of soils and soil materials

[4] ISO 17616, Soil quality — Guidance on the choice and evaluation of bioassays for ecotoxicological
characterization of soils and soil materials

[5] BAKKER, F., FEIJE, R., GROVE, A., HOOGENDOORN, G., JACOBS, G., LOOSE, E., A laboratory test
protocol to evaluate effects of plant protection products on mortality and reproduction of the
predatory mite Hypoaspis aculeifer Canestrini (Acari: Laelapidae) in standard soil. J Soils Sediments.
2003, 3 pp. 73-77

[6] CANDOLFI, M.P., BAKKER, F., CAÑEZ, V., MILES, M., NEUMANN, C., PILLING, E., (1999): Sensitivity of
non-target arthropods to plant protection products: Could Typhlodromus pyri and Aphidius spp. be
used as indicator species? Chemosphere 1999, 39 pp. 1357-1370

[7] CHI, H. Die Vermehrungsrate von Hypoaspis aculeifer Canestrini (Acarina, Laelapidae) bei Ernährung
mit Onychiurus fimatus Gisin (Collenbola). Ges. allg. angew. Ent. 1981, 3 pp. 122-125

[8] DUNGER W., FIEDLER H.J. Methoden der Bodenbiologie (2. Auflage). G. Fischer, Jena, Zweite Ausgabe,
1997, 539 p

[9] EC (ENVIRONMENT CANADA) (2005): “Guidance Document on Statistical Methods for Environmental
Toxicity Tests” Method Development and Applications Section, Environment Canada, Ottawa, ON,
Report EPS 1/RM/46, 241 p

[10] [EG] Europäische Kommission. Verordnung der Kommission 283/2013 des Europäischen
Parlamentes und des Rates vom 1. März 2013 zur Erstellung der Datenanforderungen für aktive
Substanzen in Übereinstimmung mit Verordnung (EG) 1107/2009 des Europäischen Parlaments und
des Rates bezüglich der Markteinführung von Pflanzenschutzmitteln. Amtsblatt der Europäischen
Union, L. 2013, 93 pp. 1–84

[11] FAIRBROTHER, A., GLAZEBROCK, P.W., VAN STRAALEN, N.M., TARAZONA, J.V. Test methods to
determine hazards of sparingly soluble metal compounds in soils. SETAC Press, Pensacola: 2002

[12] FINNEY, D.Y. Statistical Methods in Biological Assay. Charles Griffin & Company Ltd. London, 1978

[13] HOFFMANN, D., SCHAUSBERGER, P. Plant-mediated aboveground-belowground interactions: the


spider mite perspective. Acarology. 2012, 52 pp. 17-27

[14] HUGUIER, P., MANIER, N., OWOJORI, O.J., BAUDA, P., PANDARD, P., RÖMBKE, J. The use of soil mites in
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[15] IGNATOWICZ, S. (1974). Observations on the biology and development of Hypoaspis aculeifer
Canestrini, 1885 (Acarina, Gamasides). Zoologica Poloniae 24, 11-59. (30)

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DIN EN ISO 21285:2021-02
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[16] KEVAN, D.K. MCE. SHARMA, G.D. Observations on the biology of Hypoaspis aculeifer (Canestrini,
1884), apparently new to North America (Acarina: Mesostigmata: Laelaptidae). Acarologia 1964, 6
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[17] KROGH, P.H. AXELSEN, J.A. Test on the predatory mite Hypoaspis aculeifer preying on the collembolan
Folsomia fimetaria. In: Handbook of Soil Invertebrate Toxicity Tests, (LØKKE H., VAN GESTEL C.A.M.,
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[18] LESNA, I., SABELIS, M.W. (). Diet-dependent female choice for males with “good genes” in a soil
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[19] OECD. Guideline for testing of chemicals. No 207. Earthworm acute toxicity tests. Organization for
Economic Cooperation and Development, Paris, 1984

[20] OECD (Organization for Economic Co-operation and Development) (2016): Predatory mite
(Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer) reproduction test in soil. OECD Guidelines for the testing of
chemicals 226. Paris, France

[21] RUF, A. Die Bedeutung von Arrhenotokie und Kannibalismus für die Populationsentwicklung von
Hypoaspis aculeifer (Canestrini 1883) (Acari, Gamasina). Mitt. Deut. Ges. Allg. Angew. Ent. 1989, 7
pp. 103-107

[22] RUF, A. (1993). Die morphologische Variabilität und Fortpflanzungsbiologie der Raubmilbe Hypoaspis
aculeifer (Canestrini 1883) (Mesostigmata, Dermanyssidae). Dissertation, Universität Bremen

[23] SCHLOSSER, H.J., RIEPERT, F. Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien und
Bodenraubmilben (Gamasida). Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in
subletaler Dosierung. Zoologische Beiträge. 1992, 34 pp. 413–433

[24] SCOTT-FORDSMAND, J.J., MARALDO, K. & VAN DEN BRINK, P.J. The toxicity of copper contaminated
soil using a gnotobiotic soil multi-species test system (SMS). Environ. Int. 2008, 34 pp. 524-530

[25] SMIT, C.E., MOSER, T., RÖMBKE, J. A new OECD test guideline for the predatory soil mite Hypoaspis
aculeifer: Results of an international ring test. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2012, 82 pp. 56-62

[26] SOUTHWOOD, T.R.E. Ecological methods. With particular reference to the study of insect populations.
Chapman & Hall, London, Zweite Ausgabe, 1991, 524 p

[27] WOLF-ROSKOSCH (1983): Chemikaliengesetz, Heft 3, Texte 27/38, Umweltbundesamt, pp. 83–109

[28] HUGUIER P., MANIER N., PANDARD, P. (2016): Evaluation of the extraction efficiency for the
Hypoaspis aculeifer reproduction test in the context of soil quality assessment. Ecotoxicology 25:
1867–1872

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