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ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-

PADRÃO PARA ANALLISES BIOQUÍMICAS

GRUPO 1

2002
GRUPO 1

ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS- PADRÃO PARA


ANÁLISES BIOQUÍMICAS

Luiz Edson

LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2002
SUMÁRIO

1 introdução..............................................................................................................................1
OBJETIVO..............................................................................................................................2
2 referencial teórico..................................................................................................................4
2. Carboidratos:.......................................................................................................................7
3. Proteínas:...........................................................................................................................11
material e métodos................................................................................................................16
Procedimento para obtenção da curva padrão de aminoácidos (aa) a partir de uma solução de
glicina (0,1µ mol/mL):..........................................................................................................16
3 resultados e discussão..........................................................................................................22
1- Curva Padrão Para Açúcares Redutores Pelo Método Do Ácido Dinitrosalicílico ..........23
Gráfico1: repetição 1 .................................................................24
Gráfico 2 : repetição 2...........................................................................................................24
Gráfico 3 : repetição 3...........................................................................................................25
Gráfico 4 : repetição 4...........................................................................................................25
2- Curva Padrão Para Aminoácidos (α-NH2) Pelo Método da Ninhidrina............................26
Gráfico 1 : repetição 1 .............................................................27
Gráfico 3 : repetição 3 ..........................................................................................................28
Gráfico 4 : repetição 4...........................................................................................................28
3- Curva Padrão Para Proteína Pelo Método de Bradford ...................................................29
Gráfico 1 : repetição 1 ...........................................................30
Gráfico 2 : repetição 2...........................................................................................................30
..............................................................................................................................................30
Gráfico 3 : repetição 3 ..........................................................................................................31
Gráfico 4 : repetição 4...........................................................................................................31
4- Curva Padrão Para Açúcares Totais Pelo Método da Antrona .........................................32
Gráfico 1 : repetição 1 ..........33
Gráfico 2 : repetição 2...........................................................................................................33
Gráfico 3 : repetição 3...........................................................................................................34
Gráfico 4 : repetição 4...........................................................................................................34
ReferênciaS bibliográficaS....................................................................................................36
1 INTRODUÇÃO

Todos tecidos vivos, animais e vegetais, são constituídos por


substancias químicas que podem ser classificadas em duas categorias:
macromoléculas e micromoléculas de acordo com deu peso molecular. A
categoria das macromoléculas inclui as proteínas, os ácidos nucléicos e os
polissacarídeos. Já a categoria das micromoléculas inclui os aminoácidos,
lipídeos e ácidos orgânicos.
Estas substâncias podem variar quantitativamente, refletindo
alterações de estado metabólico da planta. E estas variações podem ser
detectadas, sendo está uma ferramenta para estudo de plantas em
diferentes condições como estresse hídrico, níveis de luz, etc.
Para a detecção e quantificação destas substancias, são usados
métodos baseados na fotometria, o qual mede o resultado das reações
químicas específicas, as quais produzem coloração ou turvação do meio
de reação.
Os métodos fotométricos são analíticos, pois realizam medidas
absolutas ou comparativa da energia radiante transmitida, emitida ou
absorvida pelas soluções.
As curvas padrão serão obtidas com o uso de soluções de
concentrações conhecidas, submetidas às reações colorimétricas
específicas, lendo-se a absorbância em espectrofotômetro. As curvas
serão utilizadas para determinar a concentração de uma substancia
específica em amostras de tecido vegetal.

1
OBJETIVO

As aulas práticas de Laboratório de Bioquímica e Metabolismo de Plantas


visam mostrar aos alunos desta disciplina os experimentos que os ajudem
a compreender os princípios básicos e fundamentais da química, dentro da
programação do curso. Para cada assunto da prática há parte teórica, que
resumidamente dá ao aluno algumas informações sobre a teoria e parte
prática, contendo o roteiro das atividades.
Antes de cada aula o aluno deve estar preparado(ter lido a teoria)
para melhor compreender as explicações do professor sobre os objetivos
da aula.
Outros objetivos:
- Familiarizar-se com os reagentes e métodos necessários
para a elaboração das curvas padrão;
- Familiarizar-se com os métodos de Antrona, DNS,
Bradford e Ninhidirna, os quais são de uso rotineiro no
laboratório de bioquímica e metabolismo e podem ser
posteriormente empregados em avaliações bioquímicas em
nossas dissertações;
- Entender os cálculos de concentração e volume necessários
para o preparo dos reagentes;
- Treinar o uso de pipetas e vidrarias necessárias para as
reações;
- Treinar o uso do espectrofotômetro;
- Entender e interpretar os resultados experimentais;

2
- Elaborar as curvas padrão a partir das medições realizadas
e verificar o grau de ajuste das mesmas.

3
2 REFERENCIAL TEÓRICO

1. Aminoácidos:

Os aminoácidos apresentam em sua cadeia um grupamento


carboxil e um grupamento amino ligados ao mesmo carbono (carbono
α ). Neste carbono estão ligadas as cadeias laterais, as quais
proporcionam as diferenças entre um aminoácido e outro. Todos os
aminoácidos, com exceção da glicina, apresentam ligados a seu carbono α
grupamentos distintos. As cadeias laterais ou grupamentos R diferem em
estrutura, tamanho e carga elétrica, portanto, lhes conferem características
diferentes influenciando em sua solubilidade na água e reatividade
química. Essas características também conferem propriedades diferentes à
molécula protéica que integram. Podem ser agrupados em aminoácidos
básicos, ácidos ou neutros (Nelson & Cox, 2000).
Além dos vinte aminoácidos padrões, existem alguns formados a
partir de modificações deles, os quais podem fazer parte de estruturas
celulares como a parede celular ou alguns tipos de tecido, exemplos: 4-
hidroxiprolina, derivado da prolina e 5-hidroxiglicina, derivado da glicina
(Nelson & Cox, 2000).
Os aminoácidos são moléculas anfóteras, isso quer dizer que eles
podem agir como tampões em soluções, porém cada aminoácido difere
em sua propriedade ácido-base, possuindo pK1 (– COOH), pK2 (– NH3+) e
pKR (grupo R) distintos (Nelson & Cox, 2000).

4
A união de aminoácidos forma os polipeptídeos com peso
molecular abaixo de 10.000 daltons e as proteínas. Esta união ocorre por
desidratação, formando a ligação peptídica entre o grupo amino de um
aminoácido e o grupo carboxil de outro.
A ionização de polipeptídeos depende de seus grupos α-amino e α-
carboxil livre em cada extremidade e do número de seus grupos R
ionizáveis.
Métodos de quantificação de aminoácidos
A análise quantitativa de aminoácidos é importante para a
determinação da estrutura das proteínas e dos complexos peptídicos
similares, que são elementares para a determinação química de amostras
de moléculas orgânicas (Spackamn, Stein e Moore, 1958).
A quantificação de aminoácidos é determinada pelo método da
Ninidrina (Hidrato de tricetohidrindeno):
A ninhidrina (Figura 1) ocasiona a reação de desaminação
oxidativa dos aminoácidos, produzindo amônia (NH3) e a redução da
ninhidrina a hidrindantina. Esta reage com a amônia liberada, formando
um complexo azul, com absorção máxima em luz de comprimento de
onda de 570 nm. A intensidade da cor azul produzida em condições
padronizadas serve de base para um teste quantitativo para aminoácidos,
podendo detectar até 1µ g de aminoácido. Outras aminas além dos
aminoácidos, também reagem com a ninhidrina, formando uma cor azul,
mas sem ocorrer liberação de CO2, a qual é indicativa de um aminoácido.
A amônia (NH3) e peptídeos também reagem, porém, mais lentamente
que os α -aminoácidos. A prolina e a 4-hidroxiprolina produzem um
complexo de cor amarela quando reagem com a ninhidrina.

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Figura 1. Molécula de Ninidrina

O método da fluorescamina também é utilizado. A fluorescamina


é um reagente mais sensível que a ninhidrina, sendo capaz de detectar
nanogramas de aminoácidos. Semelhante a ninhidrina, a fluorescamina
forma um complexo com outras aminas que não aminoácidos (Murray,
1994).
Outros métodos utilizados para determinação de aminoácidos
específicos são:
Reação de Pauly: O ácido sulfônico reage com o aminoácido histidina
produzindo um composto de coloração vermelha;
Reação de Sakuguchi: O α -naftil e Hipoclorito de Sódio reagem com a
arginina, produzindo um composto avermelhado;
Reação de Folin-Ciocalteau e Millon: Específica para o aminoácido
tirosina;
Reação de Holkins-Call: Específica para o aminoácido triptofano;
Reação do Nitroprusiato: Específica para o aminoácido cisteína (Oliveira,
1992).

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2. Carboidratos:

Os carboidratos podem ser classificados como poliidroxialdeídos


ou poliidroxicetonas, ou ainda que por hidrólise produza-se esses
compostos.
Existem três grupos de carboidratos de acordo com o número de
monômeros componentes da molécula.
Os monossacarídeos são os açúcares simples, que não podem ser
hidrolisados em unidades menores; neste grupo incluem-se as pentoses e
hexoses, sendo a glicose provavelmente o monossacarídeo mais
conhecido.
Os oligossacarídeos são polímeros hidrolisáveis de
monossacarídeos, contendo de duas a seis moléculas de açucares simples
ligados entre si; um exemplo é a sacarose, formada por uma molécula de
glicose e uma de frutose.
Em geral, os mono- e oligossacarídeos são compostos cristalinos,
solúveis em água e com sabor adocicado.
Os polissacarídeos são grandes moléculas que podem apresentar
cadeias ramificadas complexas ou lineares, geralmente são insolúveis em
água e não apresentam sabor; podem ser formados por um só monômero
ou por uma combinação de dois ou mais monossacarídeos.
Os monossacarídeos apresentam reações de enolização quando
tratados com álcali diluído durante várias horas. No caso da glicose, a
mistura resultante contém frutose e manose. Se por sua vez a frutose for
submetida ao mesmo tratamento, resultará em uma mistura de manose e

7
glicose, pois nessas condições os monossacarídeos são instáveis, sofrendo
oxidação, degradação e polimerização.
Os monossacarídeos são estáveis quando tratados em soluções de
ácidos minerais diluídos, mesmo sob aquecimento; entretanto, as aldoses
sofrem desidratação quando são aquecidas em presença de ácidos
minerais fortes, formando furfural no caso das pentoses ou
hidroximetilfurfural no caso das hexoses.
Esta reação constitui a base de alguns testes qualitativos de
açúcares, pois os furfurais reagem com determinados compostos
aromáticos, formando produtos coloridos característicos (Conn e Stump,
1993).

2.1. Açúcares solúveis totais:

Esta classe inclui vários monossacarídeos e oligossacarídeos


metabolicamente ativos, entre os quais já foram citados: glicose, frutose e
sacarose.
A determinação quantitativa desses açúcares é feita pelo método
da antrona. Esse composto é um hidroxiantraceno, trata-se de uma
substância estável, sólida, incolor, com ponto de fusão a 154 C e peso

8
molecular de 194,23. A reação é realizada em meio fortemente ácido,
onde há hidrólise dos dissacarídeos e formação de furfurais, os quais
reagem com a antrona formando um produto de coloração azul-
esverdeada, que é quantificada colorimetricamente.
No presente trabalho dosou-se os açúcares solúveis totais pelo
método proposto por Yemm e Willis (1954).

Figura 3. Reação da antrona com ácido sulfúrico e depois com o açúcar solúvel.

2.2. Açúcares Redutores:

Os açúcares redutores participam de diversas rotas metabólicas


nas plantas, tais como a rota das pentoses, o ciclo de Krebs e a glicólise.

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A quantificação de monossacarídeos pode dar uma indicação indireta da
capacidade fotossintética da planta.
Esses açúcares tem caráter redutor devido à presença de um grupo
aldeído ou cetona livre na molécula. Eles são capazes de reduzir diversos
íons metálicos e a partir dessa propriedade foram desenvolvidos vários
métodos de identificação e quantificação desses açucares. A seguir
apresenta-se alguns desses métodos:
• Reação de Benedict: O reagente contém íons de cobre na forma
oxidada (Cu 2+), os quais são mantidos em solução formando um
complexo alcalino de citrato. Em presença de açucares redutores o
cobre é reduzido formando um precipitado de coloração amarela
ou vermelha (Cu2O). O açúcar por sua vez é oxidado, quebrado e
polimerizado na solução alcalina (Conn e Stumph, 1993);
• Outras reações de redução: redução da ferricianida, reação com
ácido para-hidroxibenzóico hidrazida (PHABAH) e 3,4
dinitrobenzóico, reação com trifenil tetrazolium, método do ácido
cítrico, do fenolsulfúrico, do ferro reduzido e azul de metileno;
• Método de Somogy e Nelson: é baseado na reação de um
composto contendo cobre em meio alcalino, sendo a reação
quantificada por colorimetria;

• Método do ácido dinitrosalicílico (DNS), esse método foi


desenvolvido por Sumner e colaboradores (1921-44 citados por
Miller, 1959). Utiliza-se alem do DNS, sais de Rochelle, fenóis,
bissulfito de sódio e hidróxido de sódio. A química do DNS foi
muito discutida, mas na reação ocorre a redução do ácido 3,5

10
dinitrosalicílico para 3-amino-5nitrosálico, o qual é um produto de
cor laranja, enquanto o grupo aldeído dos açucares redutores é
oxidado para carbonila.

No presente trabalho usou-se o método do DNS para dosagem dos


açúcares redutores, segundo Miller (1959).

Figura 1. Reação do DNS com o açúcar redutor.

3. Proteínas:

Existem diversos métodos para determinação de proteínas, mas


nenhum é inteiramente satisfatório, pois todos apresentam limitações.
A escolha baseia-se na natureza das proteínas e de outros

11
componentes da amostra, no tempo da reação, na precisão desejada e
na sensibilidade da análise. A seguir alguns métodos são citados:

• Método do biureto: a reação ocorre em solução alcalina em


presença de solução de sulfato de cobre diluída, ocorrendo
a formação de um composto de cor púrpura. A cor deve-se
à ligação do átomo de cobre com quatro átomos de
nitrogênio das cadeias peptídicas. Este método é simples
para medir proteínas totais, mas requer de 20 a 40 mg de
proteína e tem a desvantagem de sofrer interferência pela
presença de NH4 na amostra.

• Método de Kjeldhal (1998): baseia-se na digestão da


proteína, sob alta temperatura, com ácido sulfúrico.
Adiciona-se pequena quantidade de óxido de mercúrio
para acelerar a reação e de sulfato de potássio ou sódio
anidro para aumentar a temperatura e acelerar a reação.
Esta reação deve ser feita em capela com exaustor ligado
devido aos vapores de mercúrio. Após a completa
transformação dos compostos nitrogenados em sais de
amônio, a mistura é fortemente alcalinizada com NH4OH,
sendo que a amônia reage com um volume conhecido de
ácido bórico e é titulada com ácido clorídrico. A
quantidade calculada de N encontrada por esta titulação é
multiplicada por um fator médio de 6,25 para fornecer a
quantidade de proteína total da amostra. Segundo Oliveira
(1992), este método apresenta a desvantagem de ocorrer

12
muito erro se a quantidade de N for muito pequena e
também depende de fator de conversão médio para cada
espécie. Este método é pouco útil para estudos em
metabolismo vegetal, pois as mudanças de composição
protéica ocorre principalmente em termos qualitativos.

• Método turbidimétrico: baseia-se na precipitação de


proteínas em presença de um ácido. É o mais rápido,
demorando apenas 10 a 15 minutos. Tem a limitação de
que nem todas as proteínas se precipitam da mesma forma
em presença de ácidos e os ácidos nucléicos também
podem se precipitar nessas condições;

• Método de Folin-ciocalteal (1969): é uma modificação do


método de Lowry (1951), onde o cobre em meio alcalino
reage com as proteínas, formando um complexo (reação de
Piotrowsky ou biureto). Este complexo apresenta
aminoácidos fenólicos que reduzem o reagente de Folin,
dando uma cor azul. A intensidade da cor é máxima em pH
10 e é medida em espectrofotômetro a 660 nm após 30 a
120 minutos. A proporção de aminoácidos fenólicos é mais
ou menos constante na estrutura primária das proteínas.
Comparando-se o teor destes aminoácidos no padrão com
os existentes nas amostras pode-se calcular o teor de
proteínas nas amostras. Trata-se de um método muito
sensível, podendo analisar amostras com 5µg de proteínas,
mas a amostra não pode conter fenóis ( Pinto, 1992);

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• Método de Bradford (1976): é utilizado na determinação
do conteúdo de proteínas totais que se ligam ao corante de
um modo proporcional à concentração. O corante utilizado
é o Comassie Brilliant Blue G- 250, o qual existe em duas
formas coloridas diferentes, a vermelha e a azul. A forma
vermelha é convertida na forma azul após a ligação do
corante com a proteína. Esta coloração ocorre rapidamente
(2min.) e é estável por até uma hora. O método tem
sensibilidade para detectar até 5µg/mL de proteína;

• Método de Lowry: é o mais utilizado, entretanto muitas


substâncias tem sido descritas por interferirem na
determinação de proteínas por este método.

O método de Bradford é simples e mais sensível do que o


de Lowry, no qual o desenvolvimento da cor é menos estável
para a precipitação de proteínas com ácidos (Peterson, 1979
citado por Pinto, 1982).

Comparando os métodos, Bradford (1976) verificou que o


método de Lowry indicava menos proteína e a parte linear da
curva para Lowry incluía uma faixa mais estreita de
concentrações. Além disso, há um espalhamento maior dos
pontos, o que dificulta o estabelecimento de uma curva padrão
para o Lowry.

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Neste trabalho utilizou-se o método de Bradford para
determinação da curva padrão de proteína.

15
MATERIAL E MÉTODOS

Determinação De Aminoácidos (α -NH2) Pelo Método Da


Ninhidrina:

Preparo dos Reagentes:


A) Tampão citrato de sódio 0,2 M – pH 5,0
B) Reagente ninhidrina 5% dissolvida em Metil Celosolve (2,5g de ninhidrina em
50mL de Metil Celosolve)
C) KCN (2% em Metil Celosolve) – 2mL de KCN 0,01M (65mg KCN/ 100mL
de água destilada) em 100mL de Metil Celosolve
D) Etanol 60% (v/v)
Observação: quando guardados separadamente e de modo adequado podem ser
armazenados por até 30 dias.
Procedimento para obtenção da curva padrão de aminoácidos (aa) a
partir de uma solução de glicina (0,1µ mol/mL):
- pode ser utilizado outro aminoácido ou outra mistura de aminoácidos, desde
que nesta concentração final***.
Após a adição do padrão de aminoácidos e dos reagentes A, B e C, agitar e levar
ao banho-maria à 100ºC por 20 minutos para desenvolver a coloração.
Posteriormente, completar com etanol 60% (1,3 mL) e agitar novamente (o volume
final da reação é de 4,0mL).

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Tabela 1. Procedimento para obtenção da curva padrão de aminoácidos
GLY
(0,1µ mol/mL) Água Reagentes A+B+C Etanol 60%
Tubos (mL) (mL) µ mol de aa (mL)** (mL)***
01 0,0 1,0 0,00 1,7 1,3
02 0,2 0,8 0,02 1,7 1,3
03 0,4 0,6 0,04 1,7 1,3
04 0,6 0,4 0,06 1,7 1,3
05 0,8 0,2 0,06 1,7 1,3
06 1,0 0,0 0,10 1,7 1,3
** 0,5 mL de A + 0,2mL de B + 1,0mL de C

Fazer a leitura a 570nm após o resfriamento.


Para quantificar os aminoácidos em tecidos vegetais seguir o procedimento de
extração mais indicado para cada tecido e posteriormente usar até 1,0mL de extrato
(máximo), adicionando os reagentes e seguir as recomendações como estão indicadas
na tabela 1.

17
Determinação De Proteínas Pelo Método De Bradford (Comassie Blue G-250):

Preparo do reagente:
Dissolver 100 mg de Comassie blue G-250 em 50 mL de etanol
95%. A esta solução adicionar 100 mL de ácido fosfórico 85%. A
solução resultante é diluída para 1 litro com água. As concentrações
finais são: 0,01% de Comassie, 8,5% de ácido fosfórico e 4,7% de etanol
(Deixar 12 horas agitando em overnight).
Atenção:
 ácido fosfórico tem que ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol, nunca
o contrário.
 reagente de Comassie deve ser filtrado antes de ser usado.

Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas a partir de


uma solução de Soro Albumina Bovina (BSA) (1mg/mL ou 10µ g/0,1mL):

Tabela 2. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas


BSA (1mg/mL) Água PROTEÍNA COMASSIE
Tubos (mL) (mL) µ g/0,1mL (mL)
01 0,00 0,10 0 5,0
02 0,02 0,08 20 5,0
03 0,04 0,06 40 5,0
04 0,06 0,04 60 5,0
05 0,08 0,02 80 5,0
06 0,10 0,00 100 5,0
Observação: para minimizar os erros de pipetagem pode-se preparar soluções de 20,
40, 60, 80 e 100µ g de BSA/0,1mL e retirar uma alíquota de 0,1mL de cada uma e
adicionar os 5,0 mL do reagente Comassie Blue.

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A quantificação de proteínas em extratos vegetais pode ser feita usando-se volumes
iguais do extrato e de TCA (10%) resultando em uma concentração final de TCA
igual a 5%.
Este extrato deve ser centrifugado e o precipitado ressuspendido com NaOH
0,1N. Posteriormente, retirar uma alíquota de 0,1mL da proteína ressuspendida,
adicionar 5mL do reagente de Comassie, agitar e fazer a leitura a 595nm.

Determinação De Açúcares Redutores Pelo Método Do Ácido


Dinitrosalicílico (DNS)
Preparo dos reagentes:
A – DNS (Dissolver 2,5g de ácido dinitrosalicílico (DNS) e
adicionar 50mL de NaOH 2N (utilizar um bequer de 500 mL).
B - Dissolver 75g de Tartarato duplo de Sódio e Potássio (Sal de Rochelle), adicionar
125mL de água e agitar sob aquecimento até a dissolução total
Posteriormente, adicionar o reagente B sobre o A, misturando-o sob
aquecimento até dissolver completamente. Depois de resfriada, completar o volume
da solução para 250mL.

Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares redutores


(AR) a partir de uma solução de glicose (10mM):
- pode ser utilizada uma mistura de frutose e glicose desde que dêem a mesma
concentração final.

Tabela 3. Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares redutores


Glicose (10mM) Água DNS (A+B)
Tubos (mL) (mL) µ moles de AR (mL)
01 0,0 1,5 0,0 1,0
02 0,2 1,3 2,0 1,0
03 0,4 1,1 4,0 1,0
04 0,6 0,9 6,0 1,0

19
Após adicionar o reagente de DNS, agitar a mistura e levar os tubos para
banho-maria à 100ºC por 5 minutos. Deixar esfriar a temperatura ambiente e
completar o volume para 10mL com água destilada ou não (conforme o caso). Fazer a
leitura a 540nm.
Para quantificar os AR de um extrato de tecidos convenientemente preparado,
pode-se usar até 1,5 mL de alíquota e adicionar o reagente de DNS e posteriormente
seguir as mesmas recomendações para a obtenção da curva padrão.

20
Determinação De Açúcares Solúveis Totais Pelo Método Da Antrona:

Preparo do reagente:
Pesar 40mg de Antrona, colocar em um bequer e adicionar 1,0mL de água
destilada e depois 20mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4). Este reagente deve
ser preparado na hora do uso.
Antes de colocar a antrona, manter os tubos de ensaio em gelo.

Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares solúveis totais


(AST) a partir de uma solução de glicose (60µ g/mL ou 0,333 mM de glicose):

Tabela 4. Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares solúveis totais


Glicose (60mg/mL) Água ANTRONA
Tubos (mL) (mL) µ g/mL de AST (mL)
01 0,0 1,0 0,0 2,0
02 0,1 0,9 6,0 2,0
03 0,2 0,8 12,0 2,0
04 0,4 0,6 24,0 2,0
05 0,6 0,4 36,0 2,0
06 0,8 0,2 48,0 2,0
07 1,0 0,0 60,0 2,0

Primeiro adicionar a solução de glicose e depois o reagente Antrona. Agitar os


tubos e levá-los ao banho-maria à 100ºC por 3 minutos. Resfriar à temperatura
ambiente ou no gelo e fazer a leitura a 620nm.
Para quantificação de AST em extrato de tecidos vegetais pode-se usar
alíquotas de até 1,0mL.

21
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para se estudar o teor das biomoléculas (aminoácidos, proteínas,


açúcares redutores e açúcares solúveis totais) dos tecidos vegetais
necessita-se de uma curva padrão. Esta, por possuir quantidades
conhecidas da molécula em questão, permite estimar a quantidade dela
no tecido vegetal.
Cada ponto das curvas padrões foi obtido com uma concentração
conhecida da substância desejada, ou seja, para aminoácidos usou-se
glicina, para proteínas, soro albumina bovina (BSA) e para açúcares
redutores e solúveis, glicose. Sendo que cada componente do grupo
realizou duas pipetagens, totalizando oito repetições por ponto.

Após a leitura no espectrofotômetro, montou-se o gráfico de


dispersão, onde os pontos em cada concentração correspondem a média
de cada componente. Aplicou-se, então, regressão linear, sendo que a
fórmula y = ax + b serve para determinar a concentração das substâncias
extraídas de um tecido vegetal, onde y é o valor da absorbância e x é a
concentração a ser determinada. O R2 avalia a variação dos resultados
obtidos na curva. Quanto menor a variação, o resultado de R2 estará mais
próximo de 1 (resultado ideal), que pode ser alcançado se a variação for
uniforme. Sendo assim, quanto mais próximo de 1, mais precisas serão as
determinações do teor da substância no tecido vegetal.

22
Nos trabalhos realizados, cada participante do grupo era
responsável por duas repetições de cada ponto das curvas, totalizando
oito repetições por ponto. Márcio foi repetição I, Daniela repetição II,
Ednabel repetição III e Anne repetição IV.
As curvas padrões foram determinadas no Windows Exel com o
uso do gráfico de dispersão, sobre o qual aplicou-se regressão linear, cujo
modelo é y = ax + b. Como critério de qualidade de ajuste foi utilizado o
R2.

Os resultados obtidos nas atividades realizadas foram apresentados


na forma de tabelas e gráficos.

1- Curva Padrão Para Açúcares Redutores Pelo Método Do Ácido


Dinitrosalicílico

Tabela 1. Valor de absorbância de açúcares redutores (A540 nm) de cada um dos


participantes do grupo em cada ponto da curva e sua média.

TUBO Repetição I Repetição II Repetição III Repetição IV Média

01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000


0,1983
02 0,2309 0,1897 0,1788 0,1941
0,4152
03 0,3866 0,4809 0,4060 0,3873
0,5675
04 0,5795 0,5607 0,5507 0,5831

23
Gráfico1: repetição 1

y = 0,0074x - 0,0012
R2 = 0,903
0,5
0,4
0,3
abs

0,2
0,1
0
0 20 40 60
ug/m l de ast

Gráfico 2 : repetição 2
y = 0,0056x + 0,0324
0,4 R2 = 0,8533
0,3
abs

0,2

0,1

0
0 20 40 60
ug/m l de ast

24
Gráfico 3 : repetição 3

0,5 y = 0,0066x + 0,0191


R 2 = 0,8727
0,4
0,3
abs

0,2
0,1
0
0 20 40 60
ug/ml de ast

Gráfico 4 : repetição 4
0,4 y = 0,0055x - 0,0041
R2 = 0,8125
0,3
abs

0,2
0,1
0
0 10 20 30 40 50 60
u g/m l d e as t

25
Gráfico 5 : Média dos gráficos 1, 2, 3, 4

y = 0,0932x + 0,0024
0,6
R2 = 0,9982
0,4
abs

0,2

0
0 2 4 6
u m oles de ar

2- Curva Padrão Para Aminoácidos (α-NH2) Pelo Método da


Ninhidrina

Tabela 1. Valor de absorbância de aminoácidos (A570 nm) de cada um dos participantes do


grupo em cada ponto da curva e sua média.

TUBO Repetição I Repetição II Repetição III Repetição IV Média

01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000


0,1401
02 0,1609 0,1217 0,1556 0,1222
0,2203
03 0,2075 0,2138 0,2048 0,2551
0,2542
04 0,2770 0,2438 0,2529 0,2433
0,3582
05 0,3544 0,3406 0,3490 0,3890
0,4560
06 0,3953 0,3877 0,5504 0,4909

26
Gráfico 1 : repetição 1

y = 5,0886x + 0,0182
0,8 R2 = 0,9207
0,6
abs

0,4
0,2
0
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
u m ol de aa

Gráfico 2: repetição 2

0,6 y = 3,8657x + 0,0254


R2 = 0,9751
0,4
abs

0,2
0
0 0,05 0,1
u m ol de aa

27
Gráfico 3 : repetição 3

0,8 y = 5,52x - 0,0127


0,6 R2 = 0,9672
abs

0,4
0,2
0
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
u m ol de aa

Gráfico 4 : repetição 4

y = 4,3843x + 0,032
0,5 R2 = 0,9417
0,4
0,3
abs

0,2
0,1
0
0 0,05 0,1
u m ol de aa

28
Gráfico 5 : Média dos gráficos 1, 2, 3, 4
y = 4 ,6 9 1 4 x + 0 ,0 0 7 1
0 ,6
R2 = 0 ,9 8
0 ,4
abs

0 ,2

0
0 0 ,0 2 0 ,0 4 0 ,0 6 0 ,0 8 0 ,1
u m ol de a a

3- Curva Padrão Para Proteína Pelo Método de Bradford

Tabela 1. Valor de absorbância de proteínas (A595 nm) de cada um dos participantes do


grupo em cada ponto da curva e sua média.

TUBO Repetição I Repetição II Repetição III Repetição IV Média

01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000


0,0401
02 0,0641 0,0397 0,0136 0,0432
0,1129
03 0,1380 0,0993 0,1114 0,1029
0,1838
04 0,2429 0,1661 0,1558 0,1705
0,2594
05 0,3145 0,2456 0,2240 0,2583
0,3363
06 0,4086 0,2961 0,3367 0,3038

29
Gráfico 1 : repetição 1
0,5 y = 0,0041x - 0,0135
0,4 R2 = 0,9941
0,3
abs

0,2
0,1
0
0 50 100
ug/0,1ml proteina

Gráfico 2 : repetição 2

0,4
y = 0,0031x - 0,016
0,3 2
R = 0,9899
abs

0,2

0,1

0
0 20 40 60 80 100
ug/0,1ml proteina

30
Gráfico 3 : repetição 3

0,4 y = 0,0033x - 0,0283


0,3 R2 = 0,9714
abs

0,2
0,1
0
0 50 100
ug/0,1ml proteina

Gráfico 4 : repetição 4

0,4
y =0,0031x - 0,0119
0,3 R2 =0,9921
abs

0,2

0,1

0
0 50 100
ug/ 0,1ml proteina

31
Gráfico 5 : Média dos gráficos 1, 2, 3, 4

0,4
y = 0,0034x - 0,0174
0,3 R 2 = 0,9919
abs

0,2
0,1
0
0 20 40 60 80 100
ug/0,1ml proteina

4- Curva Padrão Para Açúcares Totais Pelo Método da Antrona

Tabela 1. Valor de absorbância de açúcares solúveis totais (A620 nm) de cada um dos
participantes do grupo em cada ponto da curva e sua média.

TUBO Repetição I Repetição II Repetição III Repetição IV Média

01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000


0,2186
02 0,1947 0,2816 0,1795 0,2186
0,3844
03 0,3529 0,4485 0,3519 0,3844
0,5926
04 0,5682 0,6509 0,5589 0,5927
0,8227
05 0,7280 0,8495 0,8907 0,8227
0,9664
06 0,9290 0,9728 0,9974 0,9664

32
Gráfico 1 : repetição 1
y = 0,0053x + 0,0052
0,4
R2 = 0,7383
0,3
0,2
abs

0,1
0
0 20 40 60
ug/m l de as t

Gráfico 2 : repetição 2

y = 0,0074x - 0,0012
0,6 R2 = 0,903

0,4
abs

0,2
0
0 20 40 60
u g/m l de as t

33
Gráfico 3 : repetição 3

y = 0,0056x + 0,0324
0,4 R2 = 0,8533
0,3
abs

0,2

0,1

0
0 20 40 60
ug/m l de as t

Gráfico 4 : repetição 4

0,4 y = 0,0055x - 0,0041


R2 = 0,8125
0,3
0,2
abs

0,1
0
0 10 20 30 40 50 60
u g/m l d e as t

34
Gráfico 5 : Média dos gráficos 1, 2, 3, 4
0,5 y = 0,0066x + 0,0191
R2 = 0,8727
0,4
0,3
abs

0,2
0,1
0
0 20 40 60
ug/ml de ast

35
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of


microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
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MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic reagent for determination of reducing


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Relatório de Laboratório de Bioquímica e Metabolismo de Plantas. UFLA.


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36
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38