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ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS
Práctica 7
1.V Introducción
La técnica ELISA (ensayos de inmunoabsorbencia ligada a enzimas) se basa en la detección
de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reacción marcada enzimáticamente cuyo producto, puede ser
medido espectrofotométricamente. La cantidad de antígeno se determina comparando la
curva estándar generada con cantidades conocidas del antígeno.
Ventajas: versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y
consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida
y la fracción libre, es fácil de adaptar a analizadores automáticos. Este se caracteriza por ser
un método cuantitativamente exacto por la medición de la velocidad de la reacción y la
duración de la reacción en un instante fijo único
Desventajas: para adaptarlo a analizadores automáticos se necesitan de reactivos muy
purificas, lo que aumenta el costo de las pruebas.
2.V Objetivos
-V Conozca los principios en los que se basa la prueba de ELISA
-V Se familiarice con el equipo utilizado para la elaboración del la prueba de ELISA.
-V Conozca la importancia de este tipo de pruebas y su aplicación en el ámbito de la
medicina.
3.V Antecedentes
Dispositivos Empleados En ELISA
Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a las
actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad de
absorción de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente claros para poder realizar las
medidas de densidad óptica en instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de
placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se están desarrollando
dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los
sistemas de ´screeningµ masivo de los sistemas robotizados (HTS, High throughput system).
Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno
de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con
capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera
continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura
de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para
determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados.
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2.V Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o
antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran
afinidad por proteínas.
3.V Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a
la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA
directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti
primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de
la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo
primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de
antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente
a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.
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4.V Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las
moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato
enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante
espectrofotometría.
Aplicaciones:
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se
precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección
viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
4.V Materiales
-V Alcohol al 70%
-V Algodón
-V Beaker con cloro al 5%
-V Cloro al 5%
-V Kit de reactivos para ELISA
5.V Procedimiento
-V Agregar 100 uL (4 gotas) de control positivo, control negativo y suero del paciente en
los pozos siguientes:
JV Control positivo A1 y B1
JV Control negativo C1 y D1
JV Muestra de paciente E1 y F1
-V Agregar 100 uL (4 gotas) de reactivo de conjugado en todos los pozos (A1 al F1)
-V Incubar durante 20 minutos
-V Lavar tres veces cada pozo con solución buffer de lavado
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-V Agregar 100 uL (4 gotas) de reactivo de cromógeno (sustrato)
-V Incubar durante 20 minutos
-V Interpretación:
JV Positivo: cambio de color amarillo
JV Negativo: cambio de color a azul
8.V Cuestionario
Indique cual es la función de los siguientes pasos en la prueba de ELISA
-V Incubación inicial de la muestra en el pocillo
-V Lavados
-V Adición del conjugado
-V Adición del cromógeno
8.3 Defina que es una prueba de ELISA de primera, segunda, tercera y cuarta generación
9.V Bibliografía
-V Parslow t, Stites d et al. Inmunología básica y clínica 10 Ed. 2002. Editorial El manual
moderno México. P.917 (Pág. 254 ² 257).
-V HSV IgG (Prueba de ELISA para detección de anticuerpos IgG anti-Herpes simplex 1
en suero humano) Disponible en http://www.biokitdemaracaibo.com/tecnicas/elisa/el-
hsv1g.pdf. Fecha de consulta septiembre de 2009.