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Der Einfluss von DHEA auf die ROS-Produktion in einer

humanen, neuronalen Zelllinie

Bachelorarbeit
zur Erlangung des akademischen Grades
Bachelor of Science

angefertigt am

Zentrum für Human- und Molekularbiologie (ZHMB)


der Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät und der Medizinischen Fakultät

Universität des Saarlandes

vorgelegt von
Ben Michels

Saarbrücken, Oktober 2020


Die experimentellen Arbeiten im Rahmen der vorliegenden Bachelorarbeit wurden am Lehrstuhl
Zoologie & Neurophysiologie der Universität des Saarlandes durchgeführt.

Erstgutachter/in: Prof. Dr. Uli Müller


Zweitgutachter/in: Dr. Barbara Walch-Rückheim
Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG ...................................................................................................................... 5

1.1. ROS - REAKTIVE SAUERSTOFFSPEZIES ............................................................................. 5


1.1.1. EIGENSCHAFTEN UND EFFEKTE DER ROS.......................................................................... 5
1.1.2. ROS-QUELLEN .................................................................................................................. 6
1.1.3. ZELLULÄRE SCHUTZMECHANISMEN GEGEN ROS .............................................................. 7
1.1.4. OXIDATIVER STRESS IM NERVENSYSTEM .......................................................................... 9
1.1.5. ROS UND NEURODEGENERATIVE KRANKHEITEN ............................................................... 9

1.2. DHEA UND DAS NERVENSYSTEM ..................................................................................... 12


1.2.1. EIGENSCHAFTEN UND FUNKTIONEN VON NEUROSTEROIDEN ........................................... 12
1.2.2. DHEA - DEHYDROEPIANDROSTERON .............................................................................. 13

1.3. ZIELSETZUNG .................................................................................................................... 16

2. MATERIAL UND METHODEN ..................................................................................... 17

2.1. MATERIAL ......................................................................................................................... 17


2.1.1. VERBRAUCHSMATERIALIEN ............................................................................................. 17
2.1.2. GERÄTE ........................................................................................................................... 17
2.1.3. CHEMIKALIEN.................................................................................................................. 17
2.1.4. PUFFER, LÖSUNGEN UND MEDIEN ................................................................................... 18
2.1.5. ZELLLINIEN ..................................................................................................................... 19

2.2. METHODEN........................................................................................................................ 20
2.2.1. DIE SH-SY5Y-ZELLEN UND IHR ÜBERFÜHREN IN DURCHFLUSSKAMMERN .................... 20
2.2.2. STIMULATION DER ZELLEN MIT DHEA ........................................................................... 21
2.2.3. DER NACHWEIS VON ROS AUF ZELLULÄREM NIVEAU .................................................... 22
2.2.4. CELLROX-MESSUNG; DAS ARBEITEN MIT DEN DURCHFLUSSKAMMERN UND DER
ALLGEMEINE VERSUCHSABLAUF ............................................................................................... 22

2.2.5. AUSWERTEN DER AUFNAHMEN ....................................................................................... 25


2.2.6. ERSTELLEN DER IM ERGEBNIS-TEIL GEZEIGTEN GRAPHEN .............................................. 28
3. ERGEBNISSE .................................................................................................................... 31

3.1. DIE ROS-SIGNALE DER SOMATA ..................................................................................... 31

3.2. DIE ROS-SIGNALE DER BUTTONS .................................................................................... 38

3.3. VERGLEICH DER ROS-SIGNALE IN DEN SOMATA UND DEN BUTTONS ............................ 42

4. DISKUSSION ..................................................................................................................... 43

4.1. DIE ROS-KONZENTRATION IM SOMA STEIGT MIT DAUER DES GLUKOSEENTZUGS ...... 43

4.2. DIE DAUER DES GLUKOSEENTZUGS BEEINFLUSST DIE DURCH DHEA VERURSACHTEN
EFFEKTE................................................................................................................................... 44

4.3. IN DEN BUTTONS WIRKT SICH DHEA ANDERS AUF DIE ROS-KONZENTRATION AUS ALS
IM SOMA ................................................................................................................................... 46

5. ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................... 48

6. LITERATUR ...................................................................................................................... 49

7. ANHANG ............................................................................................................................ 66

7.1. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................................. 66

7.2. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................... 68

7.3. STATISTISCHE AUSWERTUNG ........................................................................................... 71

7.4. DANKSAGUNG .................................................................................................................... 72


1. Einleitung

1.1. ROS - Reaktive Sauerstoffspezies


1.1.1. Eigenschaften und Effekte der ROS
Der Begriff „Reaktive Sauerstoffspezies“ (ROS, reactive oxygen species) bezeichnet eine sehr
heterogene Gruppe von Molekülen, wobei allen gemein ist, dass sie ungepaarte
Valenzelektronen oder instabile Verbindungen vorweisen, die ihre hohe Reaktionsfreudigkeit
verursachen. So wechselwirken sie mit fast allen Arten biologischer Moleküle, darunter
Proteine (O’Flaherty und Matsushita-Fournier, 2017), Lipide (Ames et al., 1993) und
Nukleinsäuren (Wagner et al., 1994). Auch wenn ROS eine wichtige Rolle bei physiologischen
Vorgängen des Menschen spielen (Dröge, 2002), so können sie, sollten sie über längere Zeit in
einer erhöhten Konzentration vorliegen, unumkehrbare Veränderungen an wichtigen
Molekülen und Zellstrukturen verursachen oder sogar deren komplette Zerstörung zur Folge
haben. Selbst das Erbgut ist nicht vor den ROS sicher; in manchen Fällen kann die DNA-
Oxidation zu einer veränderten Genexpression (Cerutti, 1994) und die somit ausgelöste
Aktivierung von Onkogenen zur Karzinogenese führen (Loft und Poulsen, 1996). Unter den
Nukleotiden ist vor allem Guanin sehr anfällig für Reaktionen mit ROS, wobei u. a. sowohl 8-
Hydroxyguanin als auch 8-Hydroxy-2-Deoxyguanin entstehen (Dizdaroglu, 1994; Valavanidis
et al., 2009). In Abb. 1 sind die Strukturen diverser ROS zum Vergleich dargestellt.

Abbildung 1: eine Übersicht der molekularen Struktur diverser ROS. (Überarbeitet nach BioTek, 2015)

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Unter den ROS findet man neben diversen Radikalen (z. B. Hydroxyl, •OH) auch neutrale
Moleküle (z. B. Wasserstoffperoxid, H2O2) und Ionen (z. B. Superoxid-Anion, •O2–) (Nathan
und Ding, 2010). Die Eigenschaften der einzelnen ROS unterscheiden sich voneinander. Das
Superoxid z. B. ist sehr kurzlebig und nicht dazu in der Lage, Membranen zu überqueren,
weshalb die räumliche Reichweite seiner Effekte relativ eingeschränkt bleibt.
Wasserstoffperoxid hingegen ist langlebiger und wird über die Blutbahn transportiert, wodurch
dieses sogar Schäden an Organen und Geweben anrichten kann, die relativ weit von dessen
eigentlicher Produktionsquelle entfernt sind. Das Gleichgewicht zwischen einem
angemessenen, bzw. tolerablen ROS-Niveau und Oxidativem Stress ist sehr empfindlich.
Normalerweise besitzen Zellen mehrere Schutzmechanismen, die diese Balance
aufrechterhalten sollen. Versagen diese Vorkehrungen aber, kann es passieren, dass die ROS-
Konzentration zu stark ansteigt, entweder weil zu schnell zu viele ROS gebildet oder diese nicht
schnell genug abgebaut werden. In einem solchen Fall spricht man von Oxidativem Stress (Sies,
1985).

1.1.2. ROS-Quellen
Dass 90 % der gesamten in einer Zelle produzierten ROS auf die von Mitochondrien vermittelte
oxidative Phosphorylierung bei der ATP-Synthese zurückgeführt werden können, legt nahe,
dass diese Organellen deren Hauptquelle darstellen (Balaban et al., 2005). Nichtsdestotrotz
deuten Studien daraufhin, dass bloß 0,15 % der die Elektronentransportkette (ETK)
durchlaufenden Elektronen diese „verlassen“ und zur ROS-Bildung beitragen (St-Pierre et al.,
2002). Obwohl die ETK u. a. vier größere Enzymkomplexe umfasst, scheint es so, als ob die
Komplexe I (NADH-Dehydrogenase) und III (Cytochrom-c-Reduktase) für den Großteil der
ROS verantwortlich wären (Dawson et al., 1993).
Des Weiteren stellen auch die NADPH-Oxidasen eine wichtige ROS-Quelle dar. Bei diesen
handelt es sich um membrangebundene Enzymkomplexe, die Elektronen über Membranen
transportieren, wobei O2 durch die Übertragung eines Elektrons zu Superoxid reduziert wird
(Cross und Segal, 2004). Alle NOX-Isoenzyme, von denen es beim Menschen mehrere gibt und
die sich durch ihr Gewebevorkommen und genauen Aufbau unterscheiden, bestehen aus sechs
Transmembrandomänen und besitzen einen cytoplasmatischen N-Terminus. Am C-terminalen
Ende befinden sich die Bindestellen für NADPH und FAD (Magnani et al., 2017). Des Weiteren
besitzen die NOX vier Histidin-Reste, die paarweise eine Häm-Bindestellen (also insgesamt
zwei) formen (Touyz et al., 2011). Abb. 2 zeigt den typischen Aufbau einer NOX.

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Abbildung 2: Schema einer typischen NOX. Zu sehen sind die sechs Transmembrandomänen mit dem NADPH,
dem FAD und den beiden Häm-Gruppen. Auf der äußeren Membranseite wird Sauerstoff zu Superoxid umgesetzt,
was schließlich zur Wasserstoffperoxid-Produktion beiträgt. (Überarbeitet nach Barnes und Gorin, 2011)

Nach erfolgter Aktivierung werden die Elektronen des NADH zuerst auf das FAD und
anschließend auf die zwei Häm-Gruppen der N-terminalen Domäne übertragen, bevor zwei als
finale Elektronenakzeptoren dienende O2-Moleküle zu Superoxid-Anionen reduziert werden
(Doussière et al., 1996). Die NADPH-Oxidasen sind unter anderem in der Zelldifferenzierung
(Bekhite et al., 2016; Xu et al., 2016) und der Apoptose (Bai et al., 2019; Coyoy et al., 2008)
involviert. Wie wichtig diese Transporter sind, zeigt sich an der Schwere der Krankheiten, die
durch deren Fehlfunktionen ausgelöst werden. Unter jenen findet man die Chronische
Granulomatose (engl. Chronic granulomatous disease, kurz CGD), eine Erbkrankheit des
Immunsystems, die sich durch schlimme Verläufe häufig wiederkehrender Infektionen,
unkontrollierte Entzündungsreaktionen und diverse Autoimmunkrankheiten auszeichnet
(Rawat et al., 2016).

1.1.3. Zelluläre Schutzmechanismen gegen ROS


Säugerzellen besitzen zwei gegen ROS gerichtete Schutzsysteme: kleine Moleküle mit
antioxidativer Wirkung und antioxidative Enzyme (Kohen et al., 1997). Unter den
Antioxidantien findet man Stoffe wie Glutathion und die Vitamine A, C und E (Radi et al.,
2014; Uttara et al., 2009). Es gibt zahlreiche antioxidative Enzyme, denen eine Rolle bei der
ROS-Beseitigung zukommt, wobei Superoxiddismutasen (SOD, Fukai et al., 1999), Katalasen
(Freeman et al., 1983) und Glutathionperoxidasen (GPx, Duthie et al., 1989) wohl die
wichtigsten darstellen. In Abb. 3 sind die von diesen Enzymen katalysierten Reaktionen
zusammengefasst.

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Abbildung 3: Die ROS eliminierenden Enzyme. Dargestellt sind die stark vereinfachten Reaktionen der
Superoxiddismutase (SOD), Katalase und Glutathionperoxidase, die zur ROS-Beseitigung beitragen.
(Überarbeitet nach Redza-Dutordoir und Averill-Bates, 2016)

SOD beseitigen Superoxid, indem sie jenes zu H2O2 dismutieren (Hsu et al., 1996). Beim
Menschen konnten bisher drei Isoenzyme nachgewiesen werden, die sich durch ihre
metallischen Kofaktoren und zelluläre Lokalisierung unterscheiden. SOD1 ist im Zytoplasma,
dem Zellkern und dem mitochondrialen Intermembranraum, SOD2 in der mitochondrialen
Matrix und dem Zytoplasma, und SOD3 vor allem in der extrazellulären Matrix und Flüssigkeit
zu finden. Während SOD1 und SOD3 Kupfer und Zink als Kofaktor benutzen, greift SOD2 auf
Mangan zurück (Chang et al., 1988; Marklund, 1984; Oury et al., 1996; Weisinger und
Fridovich, 1973). Katalasen setzen Wasserstoffperoxid zu H2O und O2 um, wobei sie entweder
Mangan oder Eisen als Kofaktor verwenden (Kim et al., 2015). Sie kommen im Zytoplasma
(Gandhi und Abramov, 2012), in Peroxisomen (Tolbert und Essner, 1981) und in geringen
Mengen in Mitochondrien (Stanley et al., 2011) vor. GPx erfüllen die gleiche Aufgabe wie die
Katalasen; auch sie stellen aus H2O2 Wasser her und wirken so der ROS-Produktion und dem
Oxidativem Stress entgegen (Song und Zou, 2015). Jedoch wird dabei, im Gegensatz zu den
Katalasen, kein Sauerstoff gebildet.

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1.1.4. Oxidativer Stress im Nervensystem
Natürlich hinterlässt Oxidativer Stress nicht bloß im Nervensystem seine Spuren, sondern kann
auch in anderen Geweben katastrophale Folgen haben. Nichtsdestotrotz steht jenes und
besonders das Gehirn im Mittelpunkt dieser Arbeit. Aus diesem Grund werden auch vor allem
die Umstände beleuchtet, die innerhalb der Neuronen zu einer erhöhten ROS-Produktion
beitragen.
Abgesehen vom großen O2-Bedarf des Gehirns gibt es noch zwei weitere wichtige Gründe,
weshalb das gesamte Nervensystem sehr anfällig gegenüber Oxidativem Stress ist. Einerseits
besitzen Neurone eine relative große Menge mehrfach ungesättigter Fettsäuren (engl.
polyunsaturated fatty acids, kurz PUFAs), die mit freien Radikalen, vor allem mit •OH,
reagieren. Die Lipidperoxidation, bei der Wasser freigesetzt wird, führt unter Umständen zu
einer unkontrollierten Kettenreaktion zwischen weiteren PUFAs innerhalb einer Membran, was
deren physiologischen Eigenschaften und Funktionen im negativen Sinne beeinflussen kann
(Halliwell, 1989). Ein weiterer von der Lipidperoxidation verursachter Effekt ist die Bildung
reaktiver Aldehyde, wie z. B. Malondialdehyd (Sampey et al., 2003) und 4-Hydroxynonenal
(Esterbauer et al., 1991). Diese Stoffe können, zusätzlich zu den ROS, mit der DNA und
anderen in den Neuronen vorhandenen Molekülen reagieren und diverse
Strukturveränderungen bewirken (Doorn und Petersen, 2002). Andererseits sind die ROS-
Schutzsysteme des Gehirns nicht so effektiv wie die anderer Organe und Gewebe. So zeigt es
nur eine schwache Katalase-Aktivität und wartet zudem mit einer vergleichsweiße geringen
Menge von SOD und GPx auf (Halliwell, 1989).

1.1.5. ROS und neurodegenerative Krankheiten


Im Laufe der letzten Jahrzehnte wurde klar, dass eine erhöhte ROS-Konzentration, bzw.
erhöhter Oxidativer Stress im Nervensystem höchstwahrscheinlich mit der Entstehung und dem
Voranschreiten mehrerer neurodegenerativer Krankheiten in Verbindung steht. Unter diesen
findet man Alzheimer (Markesbery und Carney, 1999), Parkinson (Jenner und Olanow, 1996)
und ALS (Cookson et al., 1999). So unterschiedlich diese Leiden auch sein mögen, so haben
sie gemein, dass sie sich durch einen langsamen, jedoch progressiven Verlust von Neuronen
auszeichnen (Kim et al., 2015) und bei Patienten oftmals erhöhte Konzentrationen bestimmter
ROS-Produkte nachgewiesen werden können. Teilweise werden bereits durch ROS
herbeigeführte Lipidperoxidationsprodukte (Chia et al., 1984) und Modifizierungen an DNA-
Molekülen (Ferrante et al., 1997) und Proteinen (Mariani et al., 2005) als Biomarker für
ebenjene Erkrankungen angesehen.
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Die vor allem bei Menschen höheren Alters auftretende Alzheimer-Krankheit äußert sich
physiologisch durch gehäufte Ansammlungen extrazellulärer seniler Plaques, die sich aus
fibrillärem Beta-Amyloid-Peptid zusammensetzen, und das Vorhandensein aus
hyperphosphorylierten Tau-Proteinen bestehender, intrazellulärer Neurofibrillen-Knäuel im
Gehirn (Mattson, 2004). Der dadurch entstehende, voranschreitende Verlust einfachster
motorischer Funktionen und der progressive Abbau des Gedächtnisses führt schließlich zum
Tod. Vermutet wird, dass es einen Zusammenhang zwischen Oxidativem Stress im Gehirn und
einer ineffizienten Glukoseverarbeitung gibt (Cunnane et al., 2011). Interessanterweise konnten
einige Studien oxidative Veränderungen an wichtigen für die Glykolyse benötigten Enzymen
wie der Aldolase (Reed et al., 2009) und der Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
(Boyd-Kimball et al., 2005) nachweisen. Des Weiteren erbrachten Untersuchungen, dass auch
bei Alzheimer-Patienten erhöhte Konzentrationen der üblichen ROS-Produkte vorliegen (Smith
et al., 1991, Lovell et al., 1995; Nunomura et al., 2001).
Nach Alzheimer handelt es sich bei Parkinson um die zweithäufigste neurodegenerative
Krankheit (Islam, 2017), wobei sich ein voranschreitender Verlust dopaminerger Neuronen in
der Substantia nigra im Gehirn bemerkbar macht (Niedzielska et al., 2015) und ihr
Hauptmerkmal das Entstehen unlöslicher Einschlüsse innerhalb der betroffenen Zellen ist.
Diese Einschlüsse, die Lewy-Körperchen, bestehen größtenteils aus Alpha-Synuclein
(Schapira, 2011). Patienten zeigen eine Vielzahl von Symptomen, die sich auf ihre Motorik
auswirken: (u. a.) Bradykinese, Haltungsinstabilität und Muskelzittern unter Ruhe (Leverenz et
al., 2009). Auch hierbei liegt die Vermutung nahe, dass Oxidativer Stress die Quelle dieser
Beschwerden darstellt. Gestützt wird dies durch die Tatsache, dass bei Parkinson-Patienten
oftmals weniger aktive GPx und eine verminderte Glutathion-Menge in der Substantia nigra
vorliegen, dem Teil des Gehirns, in dem auch die Lewy-Körperchen zu finden sind (Surendran
und Rajasankar, 2010). Wie bereits weiter oben erwähnt, stellen die GPx und das Glutathion
wichtige Komponenten beim Abbau von ROS dar.
Über die Entstehungshintergründe von ALS (Amyotrophe Lateralsklerose), die häufigste
Motorneuronen-Krankheit, ist nicht viel bekannt und Oxidativer Stress ist nur eine von
mehreren Hypothesen (Singh et al., 2019). ALS zeichnet sich durch ein Absterben oberer (im
Cortex gelegener) und unterer (im Gehirnstamm und im Rückenmark gelegener)
Motorneuronen aus (Cozzolino und Carri, 2012; Rowland und Shneider, 2001) und führt nach
wenigen Jahren, meistens durch Ersticken, zum Tod. Mehrere Anhaltspunkte könnten auf eine
Involvierung der ROS hindeuten. So ergaben bei Patienten entnommene Gewebeproben durch
Oxidation geschädigte Proteine, Lipide und DNA (Liu et al, 1999). Außerdem weisen ca. 20 %

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der an der familiären ALS-Form Leidenden bestimmte Mutationen im für das SOD1-Protein
kodierenden Gen (Van Es et al., 2010) und oft Ansammlungen fehlgefalteter Exemplare jenes
Proteins auf (Barber und Shaw, 2010).

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1.2. DHEA und das Nervensystem
1.2.1. Eigenschaften und Funktionen von Neurosteroiden
Obwohl sich die Begriffe „Neurosteroide“ und „neuroaktive Steroide“ ähneln und in der
Fachliteratur oft als Synonyme verwendet werden, unterscheiden sie sich in ihrer eigentlichen
Bedeutung; während „Neurosteroide“ alle im zentralen Nervensystem synthetisierten Steroide
umfassen, zählen zu den „neuroaktiven Steroiden“ alle Steroide, die unabhängig vom Organ
oder Gewebe ihrer Synthese einen Einfluss auf Neuronen ausüben (Dubrovsky, 2005). Der
Einfachheit halber und um Verwirrung vorzubeugen, werden im weiteren Verlauf der
vorliegenden Arbeit beide Gruppen als Neurosteroide bezeichnet. Neurosteroide, sowohl
natürlich vorkommende als auch synthetisch hergestellte, sind Substanzen, die Neuronen
beeinflussen, indem sie mit diversen membrangebundenen Neurotransmitter-Rezeptoren
wechselwirken (Paul und Purdy, 1992). Dies wird bei GABA-A- (Agís-Balboa et al., 2006)
NMDA- (Tangui, 1981), σ1- (Su et al., 1988), Acetylcholin- (Bertrand et al., 1991) und Glycin-
Rezeptoren (Fodor et al., 2006) beobachtet. Alleine für den GABA-A-Rezeptor wurden bisher
3 oder 4 verschiedene Neurosteroid-Bindestellen ausfindig gemacht (Hosie et al., 2007; Chen
et al., 2019). Anhand ihrer molekularen Grundstruktur können die Neurosteroide und ihre
sulfierten Formen einer von fünf großen Kategorien zugeordnet werden: den Pregnanen (z. B.
Pregnanolon), den Pregnenen (z. B. Pregnenolon-Sulfat), den Androstanen (z. B.
Androstanediol), den Progesteronen (z. B. Allopregnanolon) oder den Desoxycorticosteronen
(z. B. THDOC, Tetrahydrodesoxycorticosteron) (Ratner et al., 2019). Trotz ihres teilweise
unterschiedlichen Aufbaus haben die Neurosteroide, so wie alle anderen Steroide auch, gemein,
dass sie von Cholesterin abgeleitet werden (Mellon und Griffin, 2002). Dass es im Gehirn eine
von den anderen Steroidhormonen herstellenden Organen unabhängige de novo-Synthese von
Neurosteroiden gibt, ist schon seit den 1980er bekannt (Compagnone und Mellon, 2000). Wie
vielfältig und unterschiedlich die Neurosteroid-Synthese durch die im zentralen Nervensystem
anzutreffenden Zellen wirklich ist, wurde erst in den darauffolgenden Jahrzehnten entdeckt. So
konnten u. a. bisher die Pregnenolon-Synthese in Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen,
die Progesteron-Synthese in Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen, die Testosteron-
Synthese in Astrozyten und Mikroglia und die Östrogen-Synthese in Mikroglia und Neuronen
nachgewiesen werden. (Yilmaz, 2019).
Angesichts dieser mannigfaltigen Diversität, sowohl die Struktur der Neurosteroide als auch
ihre Expression betreffend, ist es nicht verwunderlich, dass diese Substanzen in
unterschiedlichen Prozessen im menschlichen Körper involviert sind. Während sie eine Rolle

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bei der synaptischen Plastizität (Chen et al., 2010) und der Gedächtnisbildung (Vallée et al.,
2001) zu spielen scheinen, so werden pathologische Konzentrationen der Neurosteroide mit
diversen neuropsychiatrischen Krankheiten, wie z. B. Schizophrenie (Marx et al., 2006),
Depressionen (Longone et al., 2008) und Angstzuständen (Heydari und Le Mellédo, 2002), in
Verbindung gebracht. Einem Neurosteroid, dem zu den Androstanen gezählten
Dehydroepiandrosteron (kurz DHEA), wird der Großteil der Aufmerksamkeit dieser Arbeit
zuteil.

1.2.2. DHEA - Dehydroepiandrosteron


DHEA stellt eine wichtige Vorstufe vieler Steroidhormone dar. So lassen sich bei den Männern
ca. 50 % und den prämenopausalen Frauen sogar 75 % auf dieses Steroid zurückführen. (Labrie,
1991). Männer zeigen für gewöhnlich eine höhere DHEA-Konzentration im Blut auf als Frauen
(Quinn et al, 2006). Der Großteil des DHEA wird im Cortex der Nebennieren (Parker, 1999)
und den Gonaden (Compagnone et al., 1995) gebildet. Bisher konnte auch in anderen Zellen
die DHEA-Synthese nachgewiesen werden, u. a. den Neuronen und den Gliazellen (Baulieu
und Robel, 1998).
Wie bei allen Steroidhormonen beginnt die Synthese von DHEA bei Cholesterol, das von StAR
(Steroidogenic acute regulatory protein) zur inneren Mitochondrienmembran transportiert
wird. Für das Umwandeln von Cholesterol zu Pregnenolon ist das mitochondriale Enzym
CYP11A1 (auch P450scc genannt, von side chain cleavage) verantwortlich, wobei es für jedes
Cholesterol-Molekül drei von NADPH stammende Elektronen verbraucht. Ein Flavoprotein,
die Ferredoxinreduktase, überträgt dabei die Elektronen von NADPH auf ein Eisenschwefel-
Protein, das Ferredoxin, bevor diese zum CYP11A1 gelangen. Auch der nächste Schritt wird
von NADPH angetrieben. Das in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER)
befindliche Enzym CYP17A1 (auch P450 17A1 genannt) kann Pregnenolon zu DHEA
umsetzen. Zuvor jedoch muss das POR (P450-Oxidoreduktase)-Enzym die vom NADPH
stammenden Elektronen auf das CYP17A1 übertragen haben (Auchus, 2004; Miller, 2002). Die
einzelnen Strukturveränderungen im Laufe der DHEA-Synthese sind in Abb. 4 übersichtlich
dargestellt. An der typischen Steroid-Grundstruktur finden keine Veränderungen satt.

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Abbildung 4: Schema der DHEA-Synthese. Man beachte, dass die typische Steroid-Grundstruktur unverändert
bleibt. (Siehe die Abbildungsquellen im Anhang für die einzelnen Molekülstrukturen)

DHEA scheint einen Einfluss auf viele unterschiedliche physiologische Funktionen, wie z. B.
das Immunsystem (Oberbeck et al., 2001) und das pubertäre Wachstum (Zemel und Katz,
1986), zu haben. Vor allem im Nervensystem spielt es bei diversen Prozessen eine Rolle.
Sowohl die Neurogenese (Karishma und Herbert, 2002) als auch das Wachstum und Überleben
der Neuronen (Compagnone und Mellon, 1998) scheinen von diesem Hormon moduliert zu
werden. Ob dies auf dessen neuroprotektive Wirkung (Cardounel et al., 1999; Kaasik et al.,
2001; Kimonides et al., 1998) zurückgeführt werden kann, ist noch nicht mit Sicherheit
gewusst.
Die DHEA-Produktion unterliegt starken Schwankungen im Laufe des Lebens. Bei ein- bis
sechsjährigen Kindern ist die DHEA-Konzentration recht niedrig (De Peretti und Forest, 1978),
bevor sie mit sieben oder acht Jahren beachtlich steigt, was auf eine erhöhte Synthese seitens
der Zona reticularis der Nebennieren zurückgeführt werden kann. Dieser Anstieg wird im
englischsprachigen Raum „Adrenarche“ genannt (Labrie et al., 1998). Das Höchstlevel wird im
Alter von 20 bis 30 Jahren erreicht (Rainey et al., 2002), bevor die DHEA-Produktion, und
somit auch seine Konzentration, kontinuierlich fällt, was, in Anspielung auf die Menopause, als
„Adrenopause“ bezeichnet wird. Studien ergaben, dass Menschen, die 80 Jahre alt oder noch
älter sind, nur noch 10 bis 20 % der DHEA-Konzentration junger Menschen zeigen (Parker,
1999).
Auch innerhalb des menschlichen Körpers und zwischen den einzelnen Geweben lassen sich
unterschiedliche DHEA-Konzentrationen ausmachen. Obwohl die Cerebrospinalflüssigkeit nur
5 % der im Plasma vorliegenden DHEA-Konzentration besitzt (Guazzo et al., 1996), ist die des
Gehirns 6,5-mal höher als jene (Lacroix et al., 1987).
Mehrere Papers bringen die abnehmende DHEA-Konzentration mit neurodegenerativen
Krankheiten in Verbindung, die typischerweise bei älteren Menschen auftreten (Baulieu, 1996;
Berr et al., 1996; Legrain et al., 1995). Diese Annahme scheint durch diverse Studien gestützt
zu werden. Viele Alzheimer-Patienten zeigen im Vergleich zu gleichaltrigen Individuen ohne
Alzheimer-Symptome eine niedrigere DHEA-Konzentration im Blut auf (Näsman et al., 1991;

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Sunderland et al., 1989). Auch bei an ALS erkrankten Personen konnten ähnliche
Beobachtungen gemacht werden (Eisen et al., 1995). Bei Tierversuchen linderte DHEA den
Krankheitszustand und die Symptome. So verbesserten sich anschließend an eine DHEA-
Behandlung die kognitive Leistung bei Mäusen eines Alzheimer-Modells (Farr et al., 2004) und
die Beschwerden bei Affen mit Parkinson-ähnlichen Symptomen gingen zurück (Bélanger et
al., 2003).

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1.3. Zielsetzung
Die Hinweise, dass Oxidativer Stress und ein erhöhtes ROS-Level innerhalb des
Nervensystems diverse neurodegenerativen Krankheiten verursachen oder zumindest deren
Voranschreiten begünstigen, verdichten sich zusehends. Interessanterweise fällt der ausführlich
dokumentierte Rückgang der DHEA-Konzentration im fortgeschrittenen Alter mit dem
Auftreten dieser Leiden zusammen. Deshalb stellt sich die Frage, ob eine stark verminderte
DHEA-Produktion dazu führt, dass die Neuronen nicht mehr ausreichend vor den Effekten der
ROS geschützt werden, und ob dies den Weg für etwaige durch oxidativen Stress bedingte,
neurodegenerative Krankheiten wie Parkinson, Alzheimer und ALS ebnet. Da man bei der
freizugänglichen Fachliteratur nahezu keine Arbeiten zum direkten Einfluss von DHEA auf die
ROS-Freisetzung findet, wird bei dieser Arbeit die Auswirkung einer kurzzeitigen DHEA-
Behandlung auf die ROS-Produktion untersucht.
Um die ROS-Bildung beobachten zu können, wurde auf eine menschliche, neuronale Zelllinie
zurückgegriffen und ein ROS-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff verwendet. Die Zunahme der
ROS-Konzentration in den Zellen erhöhte die Fluoreszenzintensität, was mit Hilfe eines
Fluoreszenzmikroskops und einer Kamera dokumentiert wurde. Den Zellen wurde für eine
bestimmte Zeit die Glukose im Ringer entzogen, um den Oxidativen Stress zu erhöhen und
somit die ROS-Konzentration anzuheben. Letzteres wurde sowohl mit DHEA-behandelten
Zellen als auch mit Kontrollzellen durchgeführt. Dies ermöglichte es, die Wirkung von DHEA
auf die ROS-Produktion in neuronalen Zellen unter verschiedenen Stressbedingungen zu
analysieren.

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2. Material und Methoden

2.1. Material
2.1.1. Verbrauchsmaterialien
Verbrauchsmaterialien Hersteller

Durchflusskammern AG Müller (Saarbrücken)

Falcons (15 ml, 50 ml) Greiner Bio-One (Frickenhausen)

Objektträger ThermoFisher Scientific (Braunschweig)

Pipettenspitzen (10 μl, 100 μl 200 μl, 1000 μl) Sarstedt (Nümbrecht)

Reaktionsgefäße (1,5 ml) Sarstedt (Nümbrecht)

2.1.2. Geräte
Geräte Hersteller

Brutschrank Typ A Melag (Berlin)

Einkanalpipetten (10 μl, 100 μl, 200 μl, 1000 μl) Brand (Wertheim)

Fluoreszenzmikroskop Leica (Wetzlar)

Mikroskop-Kamera Retiga R6 Atik Cameras (Norwich, UK)

Wärmebad Fischer Scientific (Schwerte)

Zeitmesser Roth (Karlsruhe)

2.1.3. Chemikalien
Chemikalien Hersteller

CellROX Deep Red Life Technologies (Darmstadt)

CaCl2 x 2 H2O ZChL, UdS (Saarbrücken)

DHEA Acros Organics (New Jersey, USA)

DMSO ZChl, UdS (Saarbrücken)

Glukose AppliChem (Darmstadt)


17
H2O dest. ZChL, UdS (Saarbrücken)

KCl AppliChem (Darmstadt)

KH2PO4 Sigma Aldrich (München)

Na2HPO4 x 2 H2O ZChL, UdS (Saarbrücken)

NaCl AppliChem (Darmstadt)

2.1.4. Puffer, Lösungen und Medien


Puffer/Lösungen/Medien Zusammensetzung

DHEA-Arbeitslösung („Stimulationslösung“) DHEA-Stammlösung auf 6 µM verdünnt (siehe Kap.


2.2.2)

DMSO-Arbeitslösung („Kontrolllösung“) verdünnte DMSO-Stammlösung (siehe Kap. 2.2.2)

CellROX Deep Red-Stammlösung 2,5 mM CellROX Deep Red

Farbstofflösung 5 µl CellROX Deep Red-Stammlösung in


700 µl Hank's - oder Hank's + (final 18 µM)

Hank's-Puffer 8 mg NaCl
400 mg KCl
800 mg MgCl2 x 6 H2O
900 mg Na2HPO4 x 2 H2O
125 mg KH2PO4

„Hank's -“ (Hank's-Puffer ohne Glukose) 150 ml Hank's-Puffer


150 µl CaCl2 (final 1,26 mM)

„Hank's +“ (Hank's-Puffer mit Glukose) 150 ml Hank's-Puffer


150 µl CaCl2 (final 1,26 mM)
1,2 ml Glukose (final 8 mM)

Zellkulturmedium 86,3 % DMEM


10 % FCS
1 % Pen/Strep
1 % NEAA
1 % Pyruvat (2 mM)
0,5 % Glucose (final 8,25 mM)
0,5 % Gentamycin
0,001 % Biotin
0,1 % Vitamin B12

18
2.1.5. Zelllinien
Zelllinie Hersteller
SH-SY5Y Sigma Aldrich (München)

19
2.2. Methoden
2.2.1. Die SH-SY5Y-Zellen und ihr Überführen in Durchflusskammern
Die bei dieser Arbeit verwendeten Zellen gehören zur SH-SY5Y-Zelllinie. Letztere stammt von
den SK-N-SH-Zellen ab, welche 1970 aus einem metastasierten Neuroblastom eines
vierjährigen Mädchens isoliert und anschließend kultiviert wurden (Biedler et al., 1978). Auch
wenn es sich bei diesen Zellen um Krebszellen handelt und deshalb nicht alle Ergebnisse mit
völliger Sicherheit auf gesunde menschliche Neuronen übertragen werden können, so sind sie
denen doch ähnlich genug, dass man sie von anderen Säugern (z. B. Mäusen) abstammenden
neuronalen Zelllinien vorzieht. Die Zellen zeigen zwei Phänotypen, die undifferenzierten oder
reifen Zellen zugeordnet werden. Die undifferenzierten Zellen sind Neuroblasten-artig und
besitzen einen nicht-polarisierten Zellkörper und nur relativ wenige Fortsätze. Reife hingegen
bilden vermehrt Axon- und Dendriten-ähnliche Strukturen aus und verlieren einen Großteil
ihres Proliferationsvermögens (Kovalevich und Langford, 2013). Ein weiteres
Unterscheidungsmerkmal sind neuronale Marker, von denen die in frühen
Differenzierungsstadien befindlichen Zellen nur sehr geringe Mengen exprimieren (Lopes et
al., 2010). SH-SY5Y-Zellen eignen sich gut, um diverse menschliche Krankheiten zu
simulieren und zu erforschen. So finden sie u. a. in der Parkinson- (Korecka et al., 2013; Krishna
et al., 2014), Alzheimer- (Omar et al., 2018) und ALS-Forschung (Sala et al., 2019)
Anwendung. Die Zellen wurden in einem auf DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)
basierenden Zellmedium herangezüchtet, dessen genaue Zusammensetzung dem Materialteil
(2.1) zu entnehmen ist. Die Zellen wurden von der Kultur in Durchflusskammern (je 15.000
Zellen/Kammer) überführt, die auf Deckgläschen befestigt waren.
Die Zellen in den Doppelkammern wurden dann für 24 Stunden bei 37° Celsius, einem CO2-
Gehalt von 5 % und einer 75 %-igen Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Durchflusskammern
bestehen aus Silikon und zeichnen sich dadurch aus, dass sie zwei Kammern besitzen, in die
das Zellmedium mitsamt den Zellen gegeben werden kann und die auf beiden Seiten mit jeweils
einer runden Öffnung versehen sind. Letztere ermöglichen es, die Zellkammern über Schläuche
und Pumpen mit bestimmten Substanzen zu spülen. In Abb. 5 ist eine solche an Schläuchen
angeschlossene Durchflusskammer zu sehen.

20
Abbildung 5: Doppelkammer mit Zellen und den zum Spülen verwendeten Schläuchen. Das „frische“ Spülmedium
floss von rechts durch die beiden Einzelkammern hindurch und wurde über die linken Schläuche abgesaugt und in
den Flüssigkeitsabfall entsorgt. Zwischen den beiden Kammern bestand kein physischer Kontakt, was durch die
unterschiedlichen Pfeilfarben verdeutlicht werden soll. (Eigene Abbildung)

Nachdem die Zellen eines Versuchstages am Mikroskop untersucht worden waren, wurden die
Durchflusskammern sanft von den Objektträgern gelöst, mit destilliertem Wasser gespült und
in letzterem gewaschen.

2.2.2. Stimulation der Zellen mit DHEA


Der Großteil aller DHEA-Stimulationen und anschließender Inkubationen erfolgte im Hank's-
Medium (mit oder ohne Glukose), dessen genaue Zusammensetzung im Materialteil aufgelistet
ist. Die beim Hersteller erhältliche DHEA-Stammlösung betrug 50 mM (in DMSO). Durch
passendes 1:8300-faches Verdünnen (zuerst zweimal 1:10 in 50 %-igem DMSO, dann einmal
1:83 in destilliertem Wasser) ergab sich eine DHEA-Lösung von 6 µM. Um eine
Kontrolllösung (also ohne DHEA) mit demselben DMSO-Anteil herzustellen, wurde DMSO
entsprechend den obigen Angaben verdünnt. Beide Arbeitslösungen wurden bis zum Benutzen
in Reaktionsgefäßen in der Tiefkühltruhe aufbewahrt. An den jeweiligen Versuchstagen wurde
eine passende Menge der Arbeitslösungen entnommen und bei Raumtemperatur aufgetaut. Um
eine finale DHEA-Konzentration von 60 nM im Zellkulturmedium zu erreichen, wurde die
Arbeitslösung (6 µM = 6000 nM) 1:100 im Zellmedium (z. B. 2 µl Arbeitslösung in 200 µl
Zellmedium) verdünnt. Auch die DMSO-Arbeitslösung wurde 1:100 im Zellmedium verdünnt.
Während des gesamten Versuches wurden die Arbeitslösungen bei 37°C gelagert.

21
2.2.3. Der Nachweis von ROS auf zellulärem Niveau
Um die Bildung von ROS nachweisen zu können, werden oft bestimmte Fluoreszenz-Farbstoffe
verwendet. Einer davon ist das CellROX Deep Red, welches für das Superoxid-Anion und das
Hydroxyl-Radikal spezifisch ist (Celeghini et al., 2019) und von ThermoFisher hergestellt wird.
Je höher die Konzentration dieser ROS ist, umso stärker ist die Fluoreszenzintensität von
CellROX Deep Red. Diese Zunahme erklärt sich dadurch, dass das CellROX Deep Red oxidiert
wird und eine molekulare Umlagerung erfährt, wodurch sich seine spektralen Eigenschaften
verändern. In Abb. 6 sind das Anregungs- und Emissionsspektrum von CellROX Deep Red
dargestellt, wobei die Maxima sehr deutlich zu erkennen sind.

Abbildung 6: Anregungs- und Emissionsspektrum von CellROX Deep Red. Die durchgängige Linie stellt das
Anregungs- und die gestrichelte das Emissionsspektrum dar. Bestrahlt man die untersuchte Probe mit einer
Wellenlänge von 640 nm (dem Anregungsmaximum), so nimmt die Fluoreszenzintensität bei 665 nm (dem
Emissionsmaximum) zu. (Überarbeitet nach Life Technologies, 2013)

2.2.4. CellROX-Messung; das Arbeiten mit den Durchflusskammern


und der allgemeine Versuchsablauf
Im folgenden Abschnitt und in Abb. 7 wird auf den allgemeinen Versuchsablauf eingegangen.
Dieser war für jede Behandlung unterschiedlich, da man die benötigten Bedingungen (mit/ohne
DHEA-Stimulation und die Dauer des Glukoseentzugs) beachten musste. Im Ergebnisteil (siehe
3.0.) wird für jede Behandlung erwähnt, wie die einzelnen Schritte angepasst werden mussten,
um dies zu bewerkstelligen. Die gepaarten Einzelkammern einer Durchflusskammer
unterscheiden sich entweder in der verabreichten Arbeitslösung (DHEA oder DMSO) oder der
Dauer des Glukoseentzug (0, 1 oder 30 Minuten).

22
Insgesamt wurden somit sechs verschiedene Behandlungskombinationen untersucht;

1) DHEA- oder DMSO-Zugabe, 1 min keine Glukose, Zugabe und Inkubation in DMEM
2) DHEA- oder DMSO-Zugabe, 1 min keine Glukose, Zugabe und Inkubation in Hank's
3) DHEA- oder DMSO-Zugabe, 30 min keine Glukose, Zugabe und Inkubation in Hank's
4) DHEA-Zugabe, 0 oder 1 min keine Glukose, Zugabe und Inkubation in Hank's
5) DMSO-Zugabe, 0 oder 1 min keine Glukose, Zugabe und Inkubation in Hank's
6) DMSO-Zugabe, 1 oder 30 min keine Glukose, Zugabe und Inkubation in Hank's

Wie in Abb. 7 zu sehen ist, wurde zuerst das DMEM der SH-SY5Y-Zellen abgenommen und
verworfen. Im nächsten Schritt wurde einer Einzelkammer DHEA (60 nM, Stimulation) und
der anderen DMSO (Kontrolle) hinzugegeben. Dann wurden die Doppelkammern 30 Minuten
im Brutschrank (37°C) inkubiert. Nach beendeter Inkubation wurde die Durchflusskammer auf
dem Objekttisch des Mikrokops befestigt und an die Schläuche angeschlossen. Daraufhin
wurden beide Kammern eine Minute lang mit „Hank's -“ (Hank's ohne Glukose) und danach
eine Minute lang mit „Hank's +“ (Hank's mit Glukose), beides im Wasserbad auf ca. 37°C
erhitzt, gespült. Bevor mit der Messung angefangen wurde, wurden den Zellen jeder Kammer
70 µl Farbstofflösung (18 µM CellROX Deep Red) verabreicht.

Abbildung 7: Schematischer Versuchsablauf der CellROX-Messung. Zuerst wurde das DMEM der
Durchflusskammer verworfen und einer Einzelkammer Stimulations- und der anderen Kontrolllösung verabreicht.
Anschließend erfolgt die 30-minütige Inkubation bei 37°C im Brutschrank. Nach dem Platzieren der
Doppelkammer unter dem Mikroskop und dem Anschließen der Pumpe wurden die Kammern zuerst 1 Minute
lang mit „Hank's -“ und dann 1 Minute lange mit „Hank's +“ gespült. Abschließend wurde die Farbstofflösung zu
jeder der beiden Kammern gegeben und sofort mit den Aufnahmen der Fluoreszenzsignale der Zellen begonnen.
(Eigene Abbildung)

23
Zum Anfertigen der Aufnahmen bei 400-facher Vergrößerung wurde ein
Fluoreszenzmikroskop, die daran angeschlossene Kamera und die Software „Ocular“
verwendet. Zuerst wurde bei völlig geöffneter Mikroskopblende nach einer geeigneten Stelle
(mittlere Dichte von Zellen, freie Flächen zur Bestimmung des Hintergrundsignales) für eine
Aufnahme gesucht. Wenn eine passende Stelle gefunden wurde, wurde auf die Zellen
fokussiert, die Blende geschlossen und auf Fluoreszenzbeleuchtung (640 nm) umgeschaltet. Da
bereits im Voraus auf die Zellen fokussiert worden war, mussten in den meisten Fällen nur noch
kleinere Schärfeadjustierungen vorgenommen werden. Wenn die Axon- und Dendriten-
ähnlichen Strukturen deutlich und scharf zu sehen waren, wurde eine Aufnahme gemacht
(„Snap to folder“) und in einem vorher angelegten Ordner gespeichert. Sobald von einer
Kammer eine Aufnahme vorlag, wurde der Objekttisch verschoben und das Objektiv auf die
andere Kammer ausgerichtet. Anschließend wurden dieselben oben beschriebenen Schritte
(Zellen bei geöffneter Blende suchen bis Speichern der Aufnahme) ausgeführt, bevor man sich
wieder der ersten Kammer zuwandte, usw. Die Aufnahmen sollten innerhalb von sechs Minuten
(360 Sekunden) nach der Zugabe der Farbstofflösung abgeschlossen werden, da in den meisten
Fällen die CellROX Deep Red-Signale dann ihre Sättigung erreichten (siehe 3.2.). Um später
die Steigungen der Signale auswerten zu können, musste die Zuordnung der angefertigten
Aufnahmen gewährleistet werden. Dazu wurde im Programm die Funktion „Autoname“
ausgewählt, wodurch der Name und die Uhrzeit des Erstellens (z. B. 08h 28m 38s) jeder
Aufnahme in ihrem Dateinamen gespeichert wurden. Zusätzlich wurde die entsprechende
Behandlung (Stimulation „s“ oder Kontrolle „k“) am Ende des Namens vermerkt.

24
2.2.5. Auswerten der Aufnahmen
Zum Auswerten der angefertigten Aufnahmen wurde das Programm „ImageJ“ benutzt. Um dies
zu vereinfachen, bzw. schneller durchführen zu können, wurden im Voraus Macros mit den
dafür benötigten Einstellungen angefertigt. Dazu musste man unter „Plugins“ → „Macros“ auf
„Records“ klicken, die korrekten Befehle in der richtigen Reihenfolge ausführen, den Ablauf
durch „Create“ bestätigen und das somit erstellte Macro unter „File“ → „Save As“ speichern.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Macros, eins für die Soma- und ein anderes
für die Button-Betrachtung, verwendet, welche in Abb. 8 und Abb. 9 dargestellt sind.

Abbildung 8: ImageJ-Macro für die Soma-Betrachtung. (Eigene Abbildung)

Abbildung 9: ImageJ-Macro für die Button-Betrachtung. (Eigene Abbildung)

Für die Soma-Betrachtung wurden andere Einstellungen gewählt als für die Analyse der
„Buttons“, was aus dem Vergleich der Abbildungen 8 und 9 hervorgeht. Warum die für die
Buttons verwendeten Einstellungen von denen der Soma-Betrachtung abwichen und wie die
durch jenes Macro erhaltenen Daten ausgewertet wurden, wird im Ergebnisteil (siehe 3.2.)
erklärt. Nachfolgend wird bloß auf das Soma-Macro und die Verarbeitung der damit erhaltenen
Werte eingegangen. Zum Verwenden eines Macros musste dieses erst installiert werden. Dies
geschah, indem es unter „Plugins“ → „Macros“ → „Install“ geöffnet wurde. Nach erfolgreicher
Installation war es unter „Plugins“ → „Macros“ zu finden und musste angeklickt werden. In
Abb. 10 (A-E) sind die von den nacheinander ausgewählten Einstellungen herrührenden
Veränderungen an einer Aufnahme zu sehen, wobei Abb. 10A die völlig unbearbeitete
Aufnahme zeigt.

25
A B

C D

E F

Abbildung 10: Effekte der einzelnen, nacheinander ausgewählten Einstellungen des Soma-Macros. (A)
Unbearbeitete fluoreszenzmikroskopische Aufnahme bei einer 400-fachen Vergrößerung. (B) Nach der
zweifachen Auswahl des „Gaussian Blur (2.00)“. Die Aufnahme erscheint nun verschwommener. (C) Nach
Festlegung von „Moments“ als Treshold. (D) Nach Festlegung von 400-Inf Quadratpixel als Fläche der zu
analysierenden Bereiche. Der Vergleich mit C zeigt, dass nicht alle vormals rot markierten Bereiche analysiert
wurden, sondern bloß Areale mit Flächen von mehr als 400 Quadratpixel. Jene wurden mit einer Nummer
versehen. (E) Nach der Festlegung von fünf Hintergrundflächen (140-144). (F) Aufgehellte Version der ansonsten
unbearbeiteten Aufnahme. Der Vergleich mit C-E zeigt, dass nur die Zellkörper, nicht jedoch die Dendriten- und
Axon-ähnlichen Strukturen analysiert wurden. (Eigene Abbildung)

26
Nach Durchlaufen des Soma-Macros wurden die unter „Results“ angezeigten Ergebnisse
gelöscht. Danach erfolgte die Festlegung von fünf als Hintergrund fungierenden Bereichen
(Abb. 10E). Dies wurde bewerkstelligt, indem man im Befehlsbalken die „*Oval* Selection“
auswählte und die gewünschten Abschnitte in der Abbildung umkreiste. Nach jedem
Umkreisen einer Hintergrundfläche wurde mit Taste „T“ im „ROI-Manager“ die Auswahl
bestätigt. Durch Klicken von „Measure“ im „ROI-Manager“ wurden unter „Results“ die
nummerierten Flächen und ihr mittlerer Grauwert, einschließlich der fünf Hintergrund-Areale,
angezeigt, welche in eine Excel-Datei kopiert wurden. Vergleicht man die Abbildungen 10C,
D und E mit 10F, einer nachträglich aufgehellten Version der ansonsten unbearbeiteten
Aufnahme, so fällt auf, dass das Macro die Axon-und Dendriten-ähnlichen Strukturen zwar
teilweise erkannte (sie gehören zu den rot gefärbten Regionen), sie jedoch in den meisten Fällen
nicht analysierte (sie sind nicht mit einer Nummer versehen), da ihre Flächen nicht den
vorgegebenen Maßen entsprachen. Unter „Results“ erhielt man für jeden Bereich, der der
ausgewählten Größe entsprach, sowohl die genaue in Quadratpixel ausgedrückte Oberfläche
(„Area“) als auch den dazugehörigen durchschnittlichen Grauwert („Mean“), was in Abb. 11
exemplarisch wiedergegeben wird. In jener Abbildung wird der Unterschied zwischen dem
mittleren Grauwert der Zell- und Hintergrundflächen deutlich.

Abbildung 11: Ausschnitte der unter Results angezeigten Flächen und Grauwerte nach Durchlaufen des Soma-
Macros, der Auswahl der Hintergrund-Bereiche und Messen. Für jeden der ausgewählten Bereiche werden die
dazugehörige Fläche („Area“) und der mittlere Grauwert („Mean“) angezeigt. Man beachte den Unterschied
zwischen den Zellflächen (1 bis 141) und den fünf Hintergrundflächen (142-146) unterhalb der gestrichelten,
grünen Linie. (Eigene Abbildung)

27
2.2.6. Erstellen der im Ergebnis-Teil gezeigten Graphen
Für einen Versuchstag, bzw. für alle Durchflusskammern derselben Behandlungskombination
(siehe 2.2.4) wurde eine Excel-Datei erstellt, in die für jede Aufnahme einer Kammer die Fläche
und der Grauwert der gemessenen Zell- und der fünf Hintergrund-Bereiche eingetragen wurden.
Für jede Aufnahme wurde der Mittelwert der Zellflächen berechnet und vom Mittelwert des
Hintergrunds subtrahiert, womit für jeden Zeitpunkt eine Grauwert-Differenz berechnet wurde.
Bei der Zugabe der Farbstofflösung (0 Sekunden) hoben sich die Zellen nicht vom Hintergrund
ab, so dass die Grauwert-Differenz beim Zeitpunkt 0 s gleich 0 war. Abb. 12 zeigt den
beispielhaften Verlauf der Grauwert-Differenz einer Kammer. Bei dieser betrug der mittlere
Grauwert der Zellen bei 71 s 176 und der mittlere Grauwert des Hintergrunds 151, was einer
Grauwert-Differenz von 25 (176-151) entsprach. Bei den anderen Zeitpunkten wurde identisch
vorgegangen, wodurch folgende Werte errechnet wurden; 81 (251-170) bei 179 s, 95 (269-174)
bei 268 s und 131 (298-167) bei 330 s. Mit den Grauwert-Differenzen zu den verschiedenen
Aufnahmezeitpunkten wurde die Steigung erstellt (z. B. 0,391 in Abb. 12).

140
Grauwert-Differenz (einheitslos)

120 y = 0,391 x

100

80

60

40

20

0
0 50 100 150 200 250 300 350
Zeit seit Farbstoff-Zugabe (in s)

Abbildung 12: Verlauf der Grauwert-Differenz einer exemplarischen Messung. Auf der X-Achse ist die Zeit seit
Zugabe des Farbstoffs in Sekunden angegeben und auf der Y-Achse die einheitslose Grauwert-Differenz. In
diesem Fall betrug die Steigung der Ausgleichsgeraden ca. 0,391. (Eigene Abbildung)

Sobald für eine bestimmte Behandlungskombination die mittleren Steigungen aller Kammern
vorlagen, wurden diese paarweise verrechnet und dargestellt. Bei dieser paarweisen Darstellung
wurde das Verhältnis der Steigungen in jeder Doppelkammer betrachtet, der absolute
Steigungswert jedoch zuerst nicht berücksichtigt.

28
Die Berechnung wird am folgenden Beispiel erklärt;

Doppelkammer X:
DHEA-Behandlung Steigung = 2,44
Kontroll-Behandlung Steigung = 1,07

die gepaarten Verhältnisse sind:


DHEA-Behandlung 2,44/(2,44 + 1,07) = 0,695
Kontroll-Behandlung 1,07/(2,44 + 1,07) = 0,305

Aus den Werten aller Versuche dieser Behandlungskombination wurden dann jeweils der
Mittelwert und die Standardabweichung für die beiden Behandlungen ermittelt. Diese Werte
zeigten dann das Verhältnis der Steigungen für eine Behandlung an und umgingen somit das
Problem der Messung eines nicht-ratiometrischen Fluoreszenzfarbstoffes. Da CellROX Deep
Red kein ratiometrisch messbarer Fluoreszenzfarbstoff ist, unterlagen die absoluten Messwerte
zwischen den Versuchsansätzen Schwankungen (z. B. Unterschiede in der Konzentration des
Farbstoffes innerhalb der Zellen). Die Verhältnisse der Mittelwerte zweier Versuchsansätze
(verschiedene Tage) mit identischen Behandlungen stimmten jedoch sehr gut überein;

Tag 1: Behandlung A = 4,5; Behandlung B = 6,0 (Verhältnis B/A = 1,33)


Tag 2: Behandlung A= 2,2; Behandlung B = 3,1 (Verhältnis B/A = 1,41)

Um die Steigungswerte auch absolut miteinander vergleichen zu können, wurden die


Behandlungen der Doppelkammern so gewählt, dass in verschiedenen Ansätzen die
Behandlung einer Kammer identisch war. In diesem Fall wurden für jede Behandlung die
absoluten Steigungswerte gemittelt.

Mittelwert aller Doppelkammern von Versuchsreihe A:


Kammer 1; 1 min ohne Glukose + Kontrollbehandlung (Steigung = 1,5)
Kammer 2; 30 min ohne Glukose + Kontrollbehandlung (Steigung = 2,4)

Mittelwert aller Doppelkammern von Versuchsreihe B:


Kammer 1; 1 min ohne Glukose + Kontrollbehandlung (Steigung = 4,2)
Kammer 2; 0 min ohne Glukose + Kontrollbehandlung (Steigung = 1,2)

29
Die identische Behandlungsgruppe (hier 1 min ohne Glukose + Kontrollbehandlung) wurde
jeweils als Bezugsgröße verwendet. Mit der Festlegung „0 min ohne Glucose +
Kontrollbehandlung“ = 1,00 ergaben sich für die gezeigten drei Behandlungen (eine
Überlappung) folgende Mittelwerte:

„0 min ohne Glukose + Kontrollbehandlung“ = 1,0


„1 min ohne Glukose + Kontrollbehandlung“ = 3,5
„30 min ohne Glukose + Kontrollbehandlung“ = 5,5

Die überlappenden Behandlungen (mindestens n = 10) wurden so gewählt, dass letztendlich


alle sechs Behandlungsgruppen (0, 1, 30 min, jeweils ± DHEA) kombiniert wurden und nach
obigem Beispiel verrechnet werden konnten.

30
3. Ergebnisse

3.1. Die ROS-Signale der Somata


In der ersten Messreihe (Abb. 13) fanden die DHEA-Stimulation, bzw. die Zugabe der
Kontrolllösung und die anschließende 30-minütige Inkubation im Medium (DMEM) statt,
worin auch der einzige Unterschied zu allen anderen Messungen lag. Nach der Inkubation ±
DHEA wurden die Zellen 1 Minute lang mit Glukose-freiem Hank's („Hank's -“) gespült (Abb.
13A). Da alle ROS-Messungen in Hank's mit Glukose durchgeführt wurden, wurde vor dem
Start der ROS-Messungen 1 Minute lang mit Glukose beinhaltendem Hank's („Hank's +“, 8
mM) gespült.

1,00
B
0,90
Grauwert-Steigung (normiert)

0,80
0,70 p = 0,0002

0,60

0,50

0,40
0,30

0,20

0,10

0,00
DHEA (n = 23) Kontrolle (n = 23)

Abbildung 13: Stimulationsschema (A) und relative ROS-Signale nach Kontroll- oder DHEA-Stimulation in
DMEM bei einem anschließenden 1-minütigen Glukoseentzug. (B) Dargestellt sind die Mittelwerte und
Standardabweichungen der normierten Grauwert-Steigung. Diese Werte entsprechen dem gemessenen relativen
ROS-Signal in den Somata. Die Anzahl der gemessenen Kammern „n“ steht neben den jeweiligen Behandlungen.
Ein ungepaarter T-Test ergab ein p von 0,0002. (Eigene Abbildung)

Wie in Abb. 13B zu sehen ist, liegt die für die DHEA-Behandlung ermittelte Grauwert-Steigung
(0,595) über der Kontrolle (0,405), wobei der Unterschied zwischen beiden signifikant ist (p =
0,0002).
31
Anschließend stellte sich die Frage, ob sich etwas an diesem Ergebnis verändern würde, wenn
die Zellen mit Medium behandelt würden, das sich von der Zusammensetzung stark vom
DMEM unterscheidet, aber einen ähnlichen Glukosegehalt aufweist. Deshalb wurde bei der
darauffolgenden Behandlung Hank's + statt DMEM zur Inkubation verwendet. Vergleicht man
die Stimulationsschemen (Abb. 13A und 14A), so sieht man, dass sich nur die Lösungen
während der Kontroll- und DHEA-Stimulation der Zellen unterscheiden. Die hierfür
ermittelten, normierten Grauwert-Steigungen sind in Abb. 14B zusammengefasst.

1,00
B
0,90
Grauwert-Steigung (normiert)

0,80
0,70 p = 1,88 10-6

0,60
0,50
0,40

0,30
0,20
0,10

0,00
DHEA (n = 15) Kontrolle (n = 15)

Abbildung 14: Stimulationsschema (A) und relative ROS-Signale nach Kontroll- oder DHEA-Stimulation in
Hank's + bei einem anschließenden 1-minütigen Glukoseentzug. (B) Dargestellt sind die Mittelwerte und
Standardabweichungen der normierten Grauwert-Steigung. Diese Werte entsprechen dem gemessenen relativen
ROS-Signal in den Somata. Die Anzahl der gemessenen Kammern „n“ steht neben den jeweiligen Behandlungen.
Ein ungepaarter T-Test ergab ein p von 1,88 10-6. (Eigene Abbildung)

Vergleicht man die Ergebnisse in Abb. 13B und 14B, so stellt man fest, dass auch hier die
DHEA-Stimulation eine größere Grauwert-Steigung aufweist als die Kontrolle, wobei der
Unterschied bei der Hank's-Inkubation etwas größer ist (0,661 für DHEA und 0,339 für die
Kontrolle). Auch dieses Ergebnis ist signifikant (p von 1,88 10-6). Da diese Resultate recht
ähnlich sind, wurde beschlossen, fortan alle Behandlungen in Hank's durchzuführen.

32
Als nächstes sollte untersucht werden, welchen Einfluss ein verlängerter Glukoseentzug auf die
ROS-Produktion der Zellen hat. Dazu wurden die Zellen 30 Minuten lang mit Hank's - inkubiert
und vor der ROS-Messung 2 Minuten lang mit Hank's + gespült (Abb. 15A).

1,00
B
0,90
Grauwert-Steigung (normiert)

0,80
0,70 p = 0,002
0,60
0,50

0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
DHEA (n = 21) Kontrolle (n = 21)

Abbildung 15: Stimulationsschema (A) und relative ROS-Signale nach Kontroll- oder DHEA-Stimulation in
Hank's - bei einem anschließenden 30-minütigen Glukoseentzug. (B) Dargestellt sind die Mittelwerte und
Standardabweichungen der normierten Grauwert-Steigung. Diese Werte entsprechen dem gemessenen relativen
ROS-Signal in den Somata. Die Anzahl der gemessenen Kammern „n“ steht neben den jeweiligen Behandlungen.
Ein ungepaarter T-Test ergab ein p von 0,002. (Eigene Abbildung)

Vergleicht man die Ergebnisse des 30-minütigen Glukoseentzugs (Abb. 15B) mit denen der 1-
minütigen Glukoseentzüge (Abb. 13B und 14B), so lässt sich eine Veränderung feststellen.
Während bei ersteren die Grauwert-Steigung nach DHEA-Behandlung über den Werten der
Kontrolle liegt, ergibt sich beim 30-minütigen Entzug für die Kontrollzellen ein Steigungswert
von 0,570, der deutlich über der mittleren Steigung der mit DHEA behandelten Zellen (0,430)
liegt. Mit einem p von 0,002 ist dieses Ergebnis signifikant.

33
Bei der vierten Behandlungskombination (Abb. 16) wurde den Zellen einer der Kammern
überhaupt keine Glukose entzogen (0 min), um zu schauen, welchen Einfluss die DHEA- und
Kontrollbehandlung dann ausüben würden. Den Zellen in den jeweils benachbarten Kammern
wurde nach der Behandlung für 1 Minute Glukose entzogen (Abb. 16A).

1,00
B
0,90
Grauwert-Steigung (normiert)

0,80
0,70 p = 3,9 10-12
0,60
0,50
0,40
0,30

0,20
0,10

0,00
0 min Entzug (n = 10) 1 min Entzug (n = 10)

Abbildung 16: Stimulationsschema (A) und relative ROS-Signale nach DHEA-Stimulation in Hank's + bei einem
anschließenden 0- oder 1-minütigen Glukoseentzug. (B) Dargestellt sind die Mittelwerte und
Standardabweichungen der normierten Grauwert-Steigung. Diese Werte entsprechen dem gemessenen relativen
ROS-Signal in den Somata. Die Anzahl der gemessenen Kammern „n“ steht neben den jeweiligen Behandlungen.
Ein ungepaarter T-Test ergab ein p von 3,9 10-12. (Eigene Abbildung)

Wie in Abb. 16B zu erkennen ist, liegt die Grauwert-Steigung nach einer DHEA-Behandlung
beim 1-minütigen Entzug (0,861) weit über der jener Zellen, denen keine Glukose entzogen
wurde (0,139). Mit einem p von 3,9 10-12 ist dies ein signifikanter Unterschied.

34
Anschließend wurden nochmal dieselben Entzugsdauern miteinander gekoppelt, wobei zu
keiner der beiden Kammern DHEA gegeben wurde (siehe Abb. 17A).

1,00
B 0,90
Grauwert-Steigung (normiert)

0,80

0,70 p = 1,47 10-6


0,60

0,50
0,40
0,30

0,20

0,10

0,00
0 min Entzug (n = 11) 1 min Entzug (n = 11)

Abbildung 17: Stimulationsschema (A) und relative ROS-Signale nach Kontrollstimulation in Hank's + bei einem
anschließenden 0- oder 1-minütigen Glukoseentzug. (B) Dargestellt sind die Mittelwerte und
Standardabweichungen der normierten Grauwert-Steigung. Diese Werte entsprechen dem gemessenen relativen
ROS-Signal in den Somata. Die Anzahl der gemessenen Kammern „n“ steht neben den jeweiligen Behandlungen.
Ein ungepaarter T-Test ergab ein p von 1,47 10-6. (Eigene Abbildung)

Vergleicht man die Ergebnisse dieser Behandlungskombinationen (Abb. 16B und 17B), so fällt
auf, dass die normierten Grauwert-Steigungen bei beiden recht ähnliche Verhältnisse zwischen
dem 0- und dem 1-minütigen Entzug ergaben; auch hier liegt die Grauwert-Steigung des
längeren Entzugs (0,778 bei 1 min) weit über der von 0 min (0,222). Genau wie beim letzten
Ergebnis kann davon ausgegangen werden, dass dieses signifikant ist (p = 1,47 10-6).

35
Für die letzte Behandlungskombination wurden Kontrollzellen bei einem 1- oder 30-minütigen
Glukoseentzug in Hank's (+ oder -) gepaart (Abb. 18A). Mit dieser letzten
Behandlungskombination gab es jeweils eine überlappende, identische Behandlung (eine
Kammer) mit den bisher gezeigten Kombinationen, wodurch alle Behandlungen miteinander
verrechnet und zusammengefasst werden konnten.

1,00
B 0,90
Grauwert-Steigung (normiert)

0,80
0,70 p = 0,0018
0,60
0,50
0,40
0,30

0,20
0,10
0,00
1 min Entzug (n = 15) 30 min Entzug (n = 15)

Abbildung 18: Stimulationsschema (A) und relative ROS-Signale nach Kontrollstimulation in Hank's + oder
Hank's - bei einem anschließenden 1- oder 30-minütigen Glukoseentzug. (B) Dargestellt sind die Mittelwerte und
Standardabweichungen der normierten Grauwert-Steigung. Diese Werte entsprechen dem gemessenen relativen
ROS-Signal in den Somata. Die Anzahl der gemessenen Kammern „n“ steht neben den jeweiligen Behandlungen.
Ein ungepaarter T-Test ergab ein p von 0,0018. (Eigene Abbildung)

Wie in Abb. 18B zu erkennen ist, liegt die Steigung des längeren Glukoseentzugs (0,613 bei 30
min) über der des kürzeren (0,387 bei 1 min). Der Unterschied ist signifikant (0,0018).

36
Nachdem diese sechs Behandlungskombinationen ausgewertet worden waren, wurden sie über
die jeweils gemeinsamen Behandlungen so aneinander angepasst wie im Methodenteil
beschrieben (siehe 2.2.6) und in Abb. 19 zusammengefasst.

4.00
c
3.50
Grauwert-Steigung (normiert)

d
3.00

2.50 b
b
2.00

1.50

1.00 a a
0.50

0.00 n = 11 n = 10 n = 41 n = 25 n = 36 n = 21
0 min Entzug 1 min Entzug 30 min Entzug

Kontrolle DHEA

Abbildung 19: Zusammenfassung der ROS-Signale in den Somata. Dargestellt sind die Mittelwerte und
Standardabweichungen nach der Verrechnung der Grauwert-Steigungen der überlappenden Behandlungen. Die
Anzahl der gemessenen Kammern „n“ steht in oder neben den Balken der jeweiligen Behandlungen. ANOVA-
Analyse; Mittewerte, die mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet sind, unterscheiden sich signifikant
(p < 0,05). Siehe Tab. 1 im Anhang. (Eigene Abbildung)

Aus der Betrachtung von Abb. 19 geht hervor, dass bei der Kontrollbehandlung die Grauwert-
Steigung mit der Dauer des Glukoseentzugs zunimmt. Bei Glukoseentzug für 1 min ist der
relative Anstieg (1,1 pro min) größer als bei 30 min Glukoseentzug (0,07 pro min).
Bei der DHEA-Behandlung ist die Grauwert-Steigung beim 1-minütigen Glukoseentzug
deutlich größer als bei einem Glukoseentzug von 30 Minuten. Die Werte wurden mit einem
ANOVA-Test auf statistische Unterschiede überprüft und sind im Detail dem Anhang (Tab. 1)
zu entnehmen.

37
3.2. Die ROS-Signale der Buttons
Bei den Messungen wurde das durch Oxidation des CellROX Deep Red stammende
Fluoreszenzsignal der Somata erst nach etwa 30-60 Sekunden sichtbar. Vorher konnten jedoch
bereits Fluoreszenzsignale der Axon- und Dendriten-ähnlichen Strukturen der Zellen
ausgemacht werden. Innerhalb dieser Zellausläufe zeigten kleine, perlenketten-artig
angeordnete Areale eine erhöhte Fluoreszenzintensität (Abb. 20). Da diese Strukturen
funktionell keine Dendriten bzw. Axone darstellen, werden sie im Folgenden als „Buttons“
bezeichnet.

A B C

Abbildung 20: Beispielhafte Aufnahmen mit Buttons. Die bei einer 400-fachen Vergrößerung angefertigten
Aufnahmen wurden nachträglich aufgehellt, um die Buttons sichtbarer zu machen. Diese sind von einer
gestrichelten, gelben Linie umgeben. Bei (A) und (B) liegen die Buttons in den Fortsätzen noch recht weit
auseinander, so dass sie noch mehr oder weniger als einzelne Punkte wahrgenommen werden können. Bei (C)
hingegen erscheinen diese als fast durchgängige „Perlenkette“. (Eigene Abbildung)

Um zu klären, ob der Glukoseentzug in den Ausläufern, also in der Peripherie der Zellen,
ähnliche Effekte auf die ROS-Bildung ausübt wie im Soma, wurden alle Aufnahmen (der Soma-
Messungen) mit einem anderen Macro ausgewertet. Dieses Macro ist im Methodenteil
dargestellt (Abb. 9), weshalb an dieser Stelle bloß auf die Wahl der Einstellungen eingegangen
wird.
Damit die kleinen Button-Strukturen erfasst würden, wurde auf den Gaussian Blur Filter
verzichtet. Um die passende Mindestfläche der als Buttons zu identifizierenden
Fluoreszenzbereiche zu finden, wurden diverse Größen ausprobiert. Um genügend Abstand
zwischen der Mindestgröße der Soma- (400 Quadratpixel) und der Maximalgröße der Button-
Betrachtung zu lassen, wurde letztere auf 300 Quadratpixel festgelegt. Wie sich an diversen
Aufnahmen herausstellte, schien eine Fläche von 20-300 Quadratpixel dazu geeignet zu sein,
die Buttons vom Programm erkennen zu lassen. In Abb. 21 werden die Effekte des Soma- und
des Button-Macros miteinander verglichen.

38
A B

C D

Abbildung 21: Vergleich zwischen dem Soma- und dem Button-Macro an einer beispielhaften Aufnahme. Die
Buttons sind von der gestrichelten, gelben Linie umgeben. (A) Unbearbeitete fluoreszenzmikroskopische
Aufnahme bei einer 400-fachen Vergrößerung. (B) Zum Vergleich die aufgehellte Version der ansonsten
unbearbeiteten Aufnahme. Die Zellen und vor allem die recht dünnen Zellfortsätze sind nun deutlich zu erkennen.
(C) Verwendung des Soma-Macros. Man beachte, dass nur Areale der Somata ausgewählt und nummeriert
wurden, die Buttons jedoch wurden nicht ausgewählt oder analysiert (nicht mit einer Nummer versehen). (D) Nach
Verwendung des Button-Macros. Man beachte, dass die Buttons nun ausgewählt und analysiert wurden (mit einer
Nummer versehen), das Soma der sie umgebenden Zellen dafür nicht mehr. (Eigene Abbildung)

Auch für die Buttons wurde der mittlere Grauwert verwendet. Um Zeit zu sparen, wurde der
Befehl „Summarize“ unter „Analyze“ → „Analyze Particles“ hinzugewählt. Dadurch zeigte
ImageJ sowohl den mittleren Grauwert aller analysierten Flächen (in diesem Fall also der
Buttons) als auch die Anzahl dieser an. Letzteres war insofern wichtig, um die Aussagefähigkeit
der Daten zu überprüfen. Im Laufe der Auswertungen fiel auf, dass es einen relativ großen
Unterschied zwischen der Grauwert-Zunahme des Somas und der der Buttons gab. Bei ersteren
nahm der Grauwert während der gesamten Messung zu. Bei den Buttons stieg der Wert
innerhalb der ersten 100-200 Sekunden nach der CellROX Deep Red-Zugabe an und blieb über
den restlichen Verlauf der Messung auf etwa dem gleichen Niveau. Aus diesem Grund wurde
die Steigung der Button-Messungen zwischen dem Startpunkt und der ersten Aufnahme

39
ermittelt. In Abb. 22 ist der typische Verlauf des Soma- (orange) und Button-Grauwerts (grün)
im Laufe einer Messung dargestellt.

300
relativer Grauwert (ohne Einheit)

250

200

150

100

50

0
0 100 200 300 400 500
Zeit seit Farbstoffzugabe (in s)

Soma Buttons

Abbildung 22: Die Grauwert-Zunahme der Somata und der Buttons einer repräsentativen Aufnahme. Auf der X-
Achse ist die Zeit seit Farbstoffzugabe (in s) und auf der Y-Achse der relative Grauwert (ohne Einheit) aufgetragen.
Während der Soma-Grauwert (orange) im Laufe der gesamten Messung ansteigt, steigt der Button-Grauwert (grün)
nur bis etwa 150 s an. Zur Berechnung der Steigungen wurden jeweils nur die linearen Bereiche der Kurven
verwendet. Die relativen Grauwerte entsprechen dem gemessenen relativen ROS-Signal im Soma oder in den
Buttons (Eigene Abbildung)

Da für die Button-Betrachtung nicht neue Behandlungen ausprobiert und andere Aufnahme
angefertigt wurden als für die Soma-Betrachtung, sondern bloß dieselben Aufnahmen mit dem
Button-Macro untersucht wurden, werden an dieser Stelle nicht erneut alle
Behandlungsschemen und die Ergebnisse der einzelnen Behandlungskombinationen
aufgelistet, sondern direkt die Zusammenfassung (Abb. 23) gezeigt.

40
16.00 c
14.00
Grauwert-Steigung (normiert)
12.00

10.00
bd d
8.00
b
bd
6.00

4.00
a
2.00

0.00 n = 11 n = 11 n = 40 n = 25 n = 36 n = 21
0 min Entzug 1 min Entzug 30 min Entzug

Kontrolle DHEA

Abbildung 23: Zusammenfassung der ROS-Signale in den Buttons. Dargestellt sind die Mittelwerte und
Standardabweichungen nach der Verrechnung der Grauwert-Steigungen der überlappenden Behandlungen. Diese
Werte entsprechen den gemessenen relativen ROS-Signalen in den Buttons. Die Anzahl der gemessenen Kammern
„n“ steht in den Balken der jeweiligen Behandlungen. ANOVA-Analyse; Mittelwerte, die mit unterschiedlichen
Buchstaben gekennzeichnet sind, unterscheiden sich signifikant (p < 0,05). Siehe Tab. 2 im Anhang (Eigene
Abbildung)

Die in Abb. 23 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass die Grauwert-Steigung der


Kontrolle nicht mit der Dauer des Glukoseentzugs zunimmt. Die Werte sind bei 1 min
Glukoseentzug höher, fallen jedoch bei 30 min Glukoseentzug wieder ab. Für die drei
Entzugsdauern kann ein signifikanter Unterschied zwischen der DHEA-Behandlung und der
Kontrolle festgestellt werden und in allen Fällen liegt der DHEA-Grauwert über dem Kontroll-
Grauwert. Die Werte wurden mit einem ANOVA-Test auf statistische Unterschiede überprüft
und sind im Detail dem Anhang (Tab. 2) zu entnehmen.

41
3.3. Vergleich der ROS-Signale in den Somata und den Buttons
Zum direkten Vergleich sind in Abb. 24 die bereits gezeigten Ergebnisse der ROS-Signale in
den Somata (Abb. 19) und den Buttons (Abb. 23) zusammengefasst. Alle Steigungen wurden
auf die Grauwert-Steigung der Kontrolle des 0-minütigen Glukoseentzugs normiert.

40.00

35.00
Grauwert-Steigung (normiert)

30.00

25.00

20.00

15.00

10.00

5.00

0.00 n = 11 n = 10 n = 11 n = 11 n = 41 n = 25 n = 40 n = 25 n = 36 n = 21 n = 36 n = 21
Soma Buttons
0 min Entzug Soma1 min Entzug
Buttons Soma30 min Entzug
Buttons
Soma
Kontrolle DHEA
Buttons
Abbildung 24: Zusammenfassung der ROS-Signale in den Somata und den Buttons. Zu sehen sind die bereits in
Abb. 19 und 23 einzeln dargestellten Werte, die zum direkten Vergleich der Somata und Buttons auf die Grauwert-
Steigung der Kontrolle des 0-minütigen Entzugs in den Somata normiert wurden. Die Anzahl der gemessenen
Kammern „n“ steht unterhalb der Balken der jeweiligen Behandlungen. Die statistischen Vergleiche sind den
obigen Abbildungen zu entnehmen und im Anhang (Tabellen 1 und 2) aufgelistet (Eigene Abbildung).

In Abb. 24 sieht man sehr deutlich, dass die für die Buttons ermittelten Grauwert-Steigungen
weit über denen des Somas liegen. Beim 0-minütigen Entzug sind die Button-Werte der
Kontrollbehandlung ca. 4,6-mal und die der DHEA-Behandlung fast 10,5-mal so groß wie in
den Somata. Nach einem Glukoseentzug von 30 Minuten ist dieser Unterschied kleiner
geworden. Nun sind bei den Buttons die Werte der DHEA-Behandlung nur noch 3,8-mal und
die der Kontrollbehandlung nur noch doppelt so groß.
Der direkte Vergleich macht zwei wesentliche Unterschiede zwischen Somata und Buttons
deutlich. In den Somata gibt es ohne Glukoseentzug (0 min Entzug) keinen Unterschied
zwischen Kontroll- und DHEA-Behandlung. In den Buttons dieser Zellen ist der Wert nach
einer DHEA-Behandlung jedoch deutlich größer als in der Kontrollbehandlung.
Bei einem Glukoseentzug von 30 min sinkt nach DHEA-Behandlung der Wert in den Somata
unter die Kontrolle, während er bei derselben Entzugsdauer in den Buttons über der Kontrolle
liegt.

42
4. Diskussion

4.1. Die ROS-Konzentration im Soma steigt mit Dauer des


Glukoseentzugs
Was die vorliegende Arbeit von allen anderen unterscheidet, ist die Tatsache, dass zum ersten
Mal der Einfluss von 60 nM DHEA auf die durch Glukoseentzug bedingte ROS-Produktion in
humanen, neuronalen Zellen untersucht wurde. Zwar gab es bereits Hinweise darauf, dass
DHEA das ROS-Level beeinflussen kann, jedoch wurden diese Arbeiten entweder an nicht-
menschlichen Modellen oder nicht-neuronalen Zellen (z. B. Ratten bei Camporez et al., 2011)
durchgeführt oder DHEA-Konzentrationen verwendet, die weit über der physiologischen
Konzentration in der Cerebrospinalflüssigkeit von 60 nM lagen (z. B. 1-100 μM bei Li et al.,
2019). Aus jenem Grund wurde sich dazu entschieden, für diese Arbeit sowohl auf menschliche
Zellen als auch auf eine DHEA-Konzentration von 60 nM zurückzugreifen.
Da mit der Entzugsdauer von Glukose und der DHEA-Behandlung die Effekte zweier
Parameter auf die ROS-Produktion in SH-SY5Y-Zellen untersucht wurden, werden zuerst die
Effekte des Glukoseentzuges in den Kontrollgruppen betrachtet und dann erst auf die Wirkung
der DHEA-Behandlung eingegangen.
Wie zu erkennen ist, nimmt die ROS-Konzentration bei der Kontrolle im Soma mit steigender
Dauer des Glukoseentzugs zu. Dass der Entzug von Glukose zu einer erhöhten ROS-Produktion
und somit zu Oxidativem Stress führt, wurde bereits für Herzmuskelzellen beschrieben
(Marambio et al., 2010). Durch Owada et al. (2013) erfolgte der Nachweis, dass dieser
Zusammenhang auch in der Leberzelllinie HepG2 besteht. Hier wurde den Leberzellen für 30
Minuten Glukose entzogen, was zu einem Anstieg der ROS-Bildung führte. Da der Knock-
down der NADPH-Oxidase NOX4 die ROS-Bildung durch Glukoseentzug verringerte, ist
anzunehmen, dass ein Hauptanteil der gesteigerten ROS-Produktion durch die Aktivierung von
NOX verursacht wird. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen erstmals,
dass ein kurzer Entzug von Glukose (1 Minute) in der neuronalen Zelllinie SH-SY5Y zu einer
starken Erhöhung der ROS-Produktion beiträgt.
Welche Prozesse oder Enzyme infolge eines Glukoseentzug dafür sorgen, dass vermehrt ROS
gebildet werden, ist nicht vollkommen sicher, jedoch werden Glutathion-Peroxidasen (GPx)
(Meng et al., 2018) und NADPH-Oxidasen (NOX) (Wang et al., 2017) als mögliche Kandidaten
in Betracht gezogen.

43
4.2. Die Dauer des Glukoseentzugs beeinflusst die durch
DHEA verursachten Effekte
Wie bereits erwähnt, sind die Erwartungen für die DHEA-Wirkung auf die ROS-Konzentration
offen, da es in der Fachliteratur keine vergleichbaren Versuche (dieselbe DHEA-Konzentration
und dieselbe Zelllinie) gibt. Aus diesem Grund kann für die Interpretation auch nicht auf andere
Arbeiten zurückgegriffen werden.
Im Soma zeigt DHEA nur bei Glukoseentzug einen Einfluss auf die ROS-Konzentration. Beim
30-minütigen Entzug ist dieser Anstieg nicht festzustellen. Dort liegt die ROS-Konzentration
bei der DHEA-Behandlung sogar leicht, jedoch signifikant unter der Kontrolle. Dies stellt einen
klaren Unterschied zum 1-minütigen Glukoseentzug dar. Gerade dieses Abfallen der ROS-
Konzentration zwischen dem 1- und dem 30-minütigen Glukoseentzug im Soma wurde bisher
bei keiner anderen Arbeit dokumentiert. Bei zukünftigen Arbeiten könnte man diese
Beobachtung aufgreifen und den SH-SY5Y-Zellen die Glukose für 5, 10, 15, 20 und 25
Minuten entziehen und beobachten, wie schnell sich die ROS-Konzentrationen der Kontrolle
und der DHEA-Behandlung annähern, bzw. wann die ROS-Konzentration des Somas bei
DHEA-Behandlung unter die der Kontrolle fällt. Dies wäre insofern interessant, da nicht
bekannt ist, ob die ROS-Konzentration bei der DHEA-Behandlung noch weiter ansteigt, bevor
sie wieder fällt, oder ob sie nach einem 1-minütigen Entzug bereits ihren Höchstwert erreicht
hat. Anhand dieses Abfallens könnte man eventuell Rückschlüsse auf die Identität der die ROS-
Konzentration beeinflussenden, von DHEA modulierten Prozesse und Enzyme schließen,
insofern sich diese merklich in ihrer Dynamik unterscheiden.
Vieira-Marques et al. (2016) konnten nachweisen, dass eine DHEA-Behandlung SH-SY5Y-
Zellen vor Glukoseentzug schützt. Dabei setzten sie die Zellen einer 12-stündigen
Vorbehandlung mit 10-12 M, 10-8 M oder 10-6 M DHEA aus, bevor sie diesen für 6, 8, 12 oder
24 Stunden die Glukose entzogen und das Zellsterben dokumentierten. Sie gingen davon aus,
dass ein vermindertes Zellsterben unter DHEA-Behandlung mit einer durch diese bedingten
neuroprotekiven Wirkung gleichzusetzen sei. So konnten sie für einen 6-stündigen Entzug für
alle DHEA-Konzentrationen und beim 8-stündigen bloß für 10-8 M DHEA ein signifikant
niedrigeres Zellsterben als bei der Kontrolle feststellen. Bei einem Glukoseentzug von 12 oder
24 Stunden war keine der getesteten DHEA-Konzentrationen mehr dazu in der Lage, das
Zellsterben einzudämmen. Obwohl die Autoren jener Arbeit keinen direkten Zusammenhang
zwischen DHEA und einer Auswirkung auf die ROS-Produktion sahen, so ist diese doch von

44
Interesse, da die bei der vorliegenden Arbeit verwendete DHEA-Konzentration von 60 nM (=
6,0 10-8 M) zwischen die von ihnen getesteten 10-8 M und 10-6 M fallen würde.
Eine Erklärung für das verminderte Zellsterben ist, dass DHEA dazu führt, dass schneller, bzw.
verstärkter zelluläre Mechanismen, welche als Gegenmaßnahmen dienen sollen, als Antwort
auf den metabolischen Stress in Gang gesetzt werden. Demnach könnte man spekulieren, dass
die in dieser Arbeit beobachtete, geringere Erhöhung der ROS-Konzentration nach DHEA-
Behandlung und 30-minütigem Glukoseentzug für das reduzierte Zellsterben verantwortlich
war.
Es gibt noch andere Arbeiten, die sich direkt mit dem Zusammenhang zwischen DHEA und
ROS auseinandersetzen, jedoch wurden diese an anderen humanen Zelltypen oder nicht-
menschlichen Modellorganismen durchgeführt, wodurch es fraglich ist, ob deren Resultate auf
den vorliegenden Versuch übertragen werden können. Bastianetto et al. (1999) behandelten aus
verstorbenen Alzheimer-Patienten entnommene Hippocampus-Zellen zuerst 24 Stunden lang
mit einer unphysiologisch hohen Konzentrationen von 10-100 μM DHEA, bevor sie diese für
3 Stunden 50-150 μM H2O2 aussetzten. Anschließend zeigten sie, dass es zu einer verminderten
Lipidperoxidation kam und weniger Zellen starben. Auch hier scheint sich DHEA positiv auf
die zelluläre Reaktion angesichts erhöhter ROS-Level ausgewirkt zu haben. Insgesamt lässt
sich zusammen mit den recht wenigen Arbeiten, die bisher über dieses Thema verfasst wurden,
also sagen, dass DHEA allem Anschein nach eine wichtige Rolle bei der neuronalen Antwort
auf einen durch Glukosemangel verursachten ROS-Anstieg spielt, wobei zum ersten Mal
gezeigt wurde, dass die Zellen nicht mehrere Stunden oder Tage vor dem Eintreten eines
mehrstündigen Glukoseentzugs mit DHEA behandelt werden müssen, um große Unterschiede
zwischen der intrazellulären ROS-Konzentration der DHEA-Zellen und der Kontrollzellen
feststellen zu können, sondern dass eine 30-minütige DHEA-Inkubation, also eine recht kurze
Behandlung, und ein Glukoseentzug von 1 bis 30 Minuten ausreichen, um erste deutliche
Effekte herbeizuführen.

45
4.3. In den Buttons wirkt sich DHEA anders auf die ROS-
Konzentration aus als im Soma
Bereits beim 0-minütigen Entzug zeigt sich bei der ROS-Produktion in den Buttons ein anderes
Bild als im Soma. Auch ohne Glukoseentzug liegt die ROS-Konzentration der DHEA-
Behandlung über der Kontrolle. Somit scheint es so, als ob DHEA in den Buttons andere
Prozesse beeinflussen würde als im Soma, die schließlich zu einer Erhöhung der ROS-
Konzentration führen. Ähnlich wie im Soma liegt auch bei den Buttons beim 1-minütigen
Entzug die ROS-Konzentration der DHEA-Behandlung weit über der Kontrolle. Demnach
muss das DHEA dort ebenfalls die ROS-Produktion infolge einer kurzen metabolischen
Stresssituation fördern. Möglicherweise wirken ROS als Signalmoleküle, die protektive
Prozesse in Gang setzen. Von großer Wichtigkeit ist die Tatsache, dass bei den Buttons die
DHEA-Behandlung nach einem 30-minütigen Entzug nicht zu einem Abfallen der ROS-
Konzentration geführt hat, sondern zu einem signifikanten Anstieg. Dies deutet daraufhin, dass
(zumindest nach einem 30-minütigen Glukoseentzug) im Soma andere Prozesse ablaufen, bzw.
andere Prozesse von DHEA beeinflusst werden als in den Buttons. Eine mögliche Erklärung
dafür könnte sein, dass dies mit der unterschiedlichen Pufferkapazität beider Kompartimente
zu tun hat. Im Vergleich zu den sehr kleinen Volumina der Buttons besitzt das Soma ein weitaus
größeres Volumen und damit mehr ROS-inaktivierende Enzyme. Dadurch kann ROS im Soma
schneller verteilt und inaktiviert werden, womit die ROS-Konzentration dort weniger schnell
zunimmt.
In den Buttons würde dieselbe Menge von ROS zu einem schnelleren Anstieg der ROS-
Konzentration führen, da dort ein weitaus kleineres Volumen vorliegt und weniger ROS-
inaktivierende Enzyme vorhanden sind. Eine andere Erklärung könnten zwischen Soma und
Buttons abweichende ROS-Schutzmechanismen sein. Jedoch gibt es in der Fachliteratur keine
Anhaltspunkte dafür.

46
Insgesamt kann gesagt werden, dass im Rahmen dieser Arbeit recht interessante Erkenntnisse
gewonnen wurden. Unter anderem fand man heraus, dass:

1. eine kurze DHEA-Behandlung (30 min) ausreicht, um deutliche Unterschiede bei der
ROS-Konzentration zwischen der Kontrolle und der DHEA-Stimulation
herbeizuführen,
2. man den Zellen die Glukose nicht für mehrere Stunden entziehen muss, um die besagten
Effekte feststellen zu können,
3. es bei der DHEA-Behandlung zu einem rasanten ROS-Anstieg innerhalb der ersten
Minute des Glukoseentzugs kommt, und
4. sich DHEA nach einem 30-minütigen Entzug anders auf die ROS-Konzentration im
Soma auswirkt als in den Buttons/Zellfortsätzen.

Diese Erkenntnisse sind umso relevanter, wenn man bedenkt, dass eine menschliche Zelllinie
benutzt und eine physiologische DHEA-Konzentration von 60 nM verwendet wurden. Ein
weiter Unterschied liegt in der ROS-Messung. Während verschiedene Arbeiten entweder ROS-
Produkte (z. B. Lipidperoxidations-Produkte bei Bastianetto et al., 1999) oder die Expression
von typischen ROS-Abbau-Enzymen (z. B. Thioredoxin bei Gao et al., 2005) messen und damit
versuchten, Rückschlüsse auf die ROS-Produktion zu ziehen, wurde bei dieser Arbeit aktiv die
ROS-Konzentration mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoffes (CellROX Deep Red) beobachtet.
Abschließend kann gesagt werden, dass die verwendete Methode neue Erkenntnisse zur ROS-
Produktion lieferte und die Möglichkeiten bietet, in Zukunft die Rolle von ROS bei
neuroprotektiven Prozessen und die Wirkung neuroprotektiver Substanzen wie DHEA
aufzudecken.

47
5. Zusammenfassung
Bei den Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) handelt es sich um sehr unterschiedliche
Substanzen, die mit einer Vielzahl von biologischen Molekülen und Strukturen wechselwirken
können. Im Vergleich zu anderen Organen ist das Gehirn wegen seines erhöhten
Sauerstoffbedarfs und seiner verminderter Schutzmechanismen anfällig für eine hohe ROS-
Konzentration. Seit geraumer Zeit geht man davon aus, dass oxidativer Stress das Entstehen
oder zumindest das Voranschreiten diverser neurodegenerativer Krankheiten begünstigt.
Jedoch wird ROS auch von NADPH-Oxidasen (NOX) gebildet und wirkt als Signalmolekül.
Dehydroepiandrosteron (DHEA) stellt eine wichtige Vorstufe vieler Steroidhormone dar und
ist das häufigste im Blut zirkulierende Hormon des Menschen. Neben seiner Rolle beim
neuronalen Wachstum und Überleben wird DHEA eine potenzielle neuroprotektive Wirkung
zugeschrieben. Da bei mehreren neurodegenerativen Krankheiten eine geringere DHEA-
Konzentration und eine erhöhte ROS-Konzentration beobachtet werden, wurde in dieser Arbeit
der Einfluss von DHEA auf die ROS-Produktion in einer neuronalen Zelllinie untersucht.
Erstmals konnte an einer neuronalen Zelllinie gezeigt werden, dass bei kurzzeitigem (1 Minute)
Glukoseentzug nach DHEA-Behandlung die ROS-Konzentration ansteigt, bei einem
Glukoseentzug von 30 Minuten hingegen abfällt. Da die ROS-Konzentrationen in den Buttons
der Zellfortsätze nach einer DHEA-Behandlung sowohl beim 1- als auch beim 30-minütigen
Glukoseentzug steigen, scheinen sich die Mechanismen der DHEA-Wirkung auf die ROS-
Produktion im Soma und der Peripherie der Zellen zu unterscheiden. Weil DHEA eine
neuroprotektive Wirkung ausübt, DHEA die ROS-Produktion jedoch steigert, wird postuliert,
dass eine DHEA-vermittelte ROS-Produktion schützende Prozesse fördert und ROS in diesem
Fall als Signalmolekül wirkt.

48
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65
7. Anhang

7.1. Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Englischer Begriff Deutscher Begriff

ALS Amyotrophic lateral sclerosis Amyotrophe Lateralsklerose

ATP Adenosine-triphosphat Adenosintriphosphat

CGD Chronic granulomatous disease Chronische Granulomatose

DHEA Dehydroepiandrosterone Dehydroepiandrosteron

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimetyl sulfoxide Dimetylsulfoxid

DNA Deoxyribonucleic acid Desoxyribonukleinsäure

ER Endoplasmatic reticulum Endoplasmatische Retikulum

ETK Electron transport chain Elektronentransportkette

FAD Flavin adenine dinucleotide Flavin-Adenin-Dinukleotid

FCS Fetal calf serum Fetales Kälberserum

GABA Gamma-Aminobutyric acid γ-Aminobuttersäure

GPx Glutathione peroxidase Glutathionperoxidase

NADP(H) Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Nicotinamidadenindinukleotidphosphat

66
NEAA Non Essential Amino Acids Nicht-essentielle Aminosäuren

NMDA N-Methyl-D-aspartate N-Metyl-D-Aspartat

NOX NADPH oxidase NADPH-Oxidase

PUFA Polyunsaturated fatty acid Mehrfach ungesättigte Fettsäure

ROS Reactive oxygen species Reaktive Sauerstoffspezies

SOD Superoxide dismutase Superoxiddismutase

THDOC Tetrahydrodesoxicorticosterone Tetrahydrodesoxicorticosteron

67
7.2. Abbildungsverzeichnis
Abbildung Name Quelle

Abb. 1 Eine Übersicht der molekularen Struktur diverser ROS BioTek (2015)

Abb. 2 Schema einer typischen NOX Barnes und Gorin (2011)

Abb. 3 Die ROS eliminierenden Enzyme Redza-Dutordoir und Averill-Bates


(2016)

https://bit.ly/2TjL1TK
Abb. 4 Schema der DHEA-Synthese https://bit.ly/3jgVn1e
https://bit.ly/2IZ6uzp

Abb. 5 Doppelkammer mit Zellen und den zum Spülen verwendeten Ben Michels (2020)
Schläuchen

Abb. 6 Anregungs- und Emissionsspektrum von CellROX Deep Red Life Technologies (2013)

Abb. 7 Schematischer Versuchsablauf der CellROX-Messung Ben Michels (2020)

Abb. 8 ImageJ-Macro für die Soma-Betrachtung Ben Michels (2020)

Abb. 9 ImageJ-Macro für die Button-Betrachtung Ben Michels (2020)

Abb. 10 Effekte der einzelnen, nacheinander ausgewählten Einstellungen Ben Michels (2020)
(A-F) des Soma-Macros

Abb. 11 Ausschnitte der unter Results angezeigten Flächen und Grauwerte Ben Michels (2020)
nach Durchlaufen des Soma- Macros, der Auswahl der
Hintergrund-Bereiche und Messen

68
Abb. 12 Verlauf der Grauwert-Differenz einer exemplarischen Messung Ben Michels (2020)

Abb. 13 Stimulationsschema und relative ROS-Signale nach Kontroll- oder Ben Michels (2020)
(A und B) DHEA-Stimulation in DMEM bei einem anschließenden 1-
minütigen Glukoseentzug

Abb. 14 Stimulationsschema und relative ROS-Signale nach Kontroll- oder Ben Michels (2020)
(A und B) DHEA-Stimulation in Hank's + bei einem anschließenden 1-
minütigen Glukoseentzug

Abb. 15 Stimulationsschema und relative ROS-Signale nach Kontroll- oder Ben Michels (2020)
(A und B) DHEA-Stimulation in Hank's - bei einem anschließenden 30-
minütigen Glukoseentzug

Abb. 16 Stimulationsschema und relative ROS-Signale nach DHEA- Ben Michels (2020)
(A und B) Stimulation in Hank's + bei einem anschließenden 0- oder 1-
minütigen Glukoseentzug

Abb. 17 Stimulationsschema und relative ROS-Signale nach Ben Michels (2020)


(A und B) Kontrollstimulation in Hank's + bei einem anschließenden 0- oder
1-minütigen Glukoseentzug

Abb. 18 Stimulationsschema und relative ROS-Signale nach Ben Michels (2020)


(A und B) Kontrollstimulation in Hank's + oder Hank's - bei einem
anschließenden 1- oder 30-minütigen Glukoseentzug

Abb. 19 Zusammenfassung der ROS-Signale in den Somata Ben Michels (2020)

69
Abb. 20 Beispielhafte Aufnahmen mit Buttons Ben Michels (2020)
(A-C)

Abb. 21 Vergleich zwischen dem Soma- und dem Button-Macro an einer Ben Michels (2020)
(A-D) beispielhaften Aufnahme

Abb. 22 Die Grauwert-Zunahme der Somata und der Buttons einer Ben Michels (2020)
repräsentativen Aufnahme

Abb. 23 Zusammenfassung der ROS-Signale in den Buttons Ben Michels (2020)

Abb. 24 Zusammenfassung der ROS-Signale in den Somata und den Ben Michels (2020)
Buttons

70
7.3. Statistische Auswertung
Tabelle 1: ANOVA-Analyse der diversen Behandlungen der Soma-Betrachtung. Ein „Sig“ von 0 deutet daraufhin,
dass sich die Behandlungen nicht signifikant (p > 0,05) voneinander unterscheiden. Ein „Sig“ von 1 hingegen steht
für einen signifikanten Unterschied (p < 0,05). (Tabelle 2020 von Uli Müller angefertigt)

Tabelle 2: ANOVA-Analyse der diversen Behandlungen der Button-Betrachtung. Ein „Sig“ von 0 deutet
daraufhin, dass sich die Behandlungen nicht signifikant (p > 0,05) voneinander unterscheiden. Ein „Sig“ von 1
hingegen steht für einen signifikanten Unterschied (p < 0,05). (Tabelle 2020 von Uli Müller angefertigt)

71
7.4. Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Uli Müller für die Aufnahme in die
Neurophysiologie-Arbeitsgruppe und die exzellente Betreuung im Rahmen meiner Laborarbeit
bedanken. Vielen Dank für die vielen Stunden am Fluoreszenzmikroskop, das häufige
Überlesen meiner Entwürfe und die von dir aufgebrachte Geduld, wenn ich mich manchmal
recht unbeholfen anstellte.
Auch bei den anderen Mitgliedern der Arbeitsgruppe möchte ich mich herzlichst dafür
bedanken, dass sie sich oftmals Zeit dafür nahmen, mir etwas bestimmtes im Labor zu zeigen,
oder mir auf andere Art und Weise unter die Arme griffen.
Frau Dr. Walch-Rückheim gilt mein Dank dafür, dass sie einwilligte, die Zweitgutachterin
dieser Arbeit zu werden.
Den anderen Pfadfinderleitern, Daniel, Laura und Tom, danke ich für ihr Verständnis dafür,
dass ich in den letzten drei Jahren nicht mehr so oft an Versammlungen oder Sommerlagern
teilnehmen oder diese auf die Beine stellen konnte, wie ich es gerne getan hätte. Vor allem
während der Praktika und der Bachelorarbeit mussten sie mehr oder weniger ohne meine Hilfe
auskommen. Covid-19 stellt unser organisatorisches Können auf eine harte Probe, jedoch bin
ich mir sicher, dass wir unsere Truppe am Laufen halten können, solange wir zusammenhalten.
Ein weiterer großer Dank gilt meinen Kommilitonen und Kommilitoninnen. Am Anfang des
Studiums hätte ich nicht gedacht, dass ich in ihnen einmal so gute Freunde finden würde, wie
ich es getan habe. Vor allem Felix, Lorraine und Rico möchte ich für die vielen tollen Momente
sowohl an der Uni als auch außerhalb davon danken. Vielen Dank dafür, dass ich euch zu
meinen Freunden zählen darf und ihr über meine Macken und Eigenarten hinweggesehen habt.
Meinem ältesten und besten Freund, Mathis, möchte ich für seine langjährige Freundschaft zu
mir danken. Obwohl wir an derselben Uni studieren, konnten wir bisher nur sehr wenig
gemeinsam unternehmen. Das tut mir aufrichtig leid und ich verspreche, dass ich das alles
nachholen werde.
Als letztes möchte ich mich bei meinen Eltern, Danielle und Marco, bedanken. Ohne ihre harte
Arbeit und finanzielle Unterstützung hätte ich diesem Studium auf keinen Fall nachgehen
können. Ich schätze es wirklich sehr, was sie für mich getan haben und weiterhin tun, auch
wenn sie manchmal der Meinung sind, dass sie vieles hätten besser machen können oder
müssen. Ich weiß nur, dass ich mir keine besseren Eltern wünschen könnte und ich sie von
ganzem Herzen liebe. Vielen Dank für eure Unterstützung und dafür, dass ihr stets an mich
glaubt und immer für mich da seid. Auch der Rest meiner Familie hat mich stets unterstützt.

72
Eidesstattliche Erklärung/Versicherung

Ich erkläre hiermit an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig verfasst und keine
anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Die Stellen der Arbeit,
die anderen Werken dem Wortlaut oder dem Sinn nach entnommen sind, wurden unter Angabe
der Quellen als Entlehnung kenntlich gemacht. Bei Zeichnungen, Skizzen und Plänen sowie
bildlichen und grafischen Darstellungen wurde angegeben, ob sie selbständig gefertigt, nach
eigenen Angaben durch andere ausgeführt oder übernommen worden sind.
Ich erkläre hiermit, dass die vorliegende Arbeit mit der elektronischen Version übereinstimmt.
Ich erkläre darüber hinaus mit meiner Unterschrift, dass ich

- keine im Merkblatt „Hinweise zur Vermeidung von Plagiaten“ der


Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät und des ZHMB beschriebene Form des
Plagiats begangen habe,
- alle Methoden, Daten und Arbeitsabläufe wahrheitsgetreu dokumentiert habe und
- keine Daten manipuliert habe.

Saarbrücken, den _______________________ _________________________


(Datum) (Unterschrift)