ARTICULOS TECNICOS

Resumen
Las bacterias filamentosas Actinomice-
tos Gram positivos (GALO) y Microth-
Episodios periódicos
rix parvicella son responsables de la es-
pumación en los fangos activos de las
EDAR. La clasificación de estos micro-
de espumación con implicación
de filamentos Gram negativos.
organismos se realiza según Eikelboom
(2000) y Jenkins et al. (2003) por mor-
fotipos, los cuales muestran, a veces,
una alta diversidad de especies usando
sondas específicas.
Un proceso periódico de espumación
en la EDAR del municipio de Torres-
El morfotipo 0581: un desconocido
Torres (Valencia) con dominancia del
morfotipo 0581, ha permitido compro-
bar la identidad, tanto óptica como filo-
Por: Andrés Zornoza(*); Eva Rodríguez(**); Laura Isac(**); José Luis Alonso(***);
genética, de dicho morfotipo. Al con-
Natividad Fernández(**); Francisco Zorrilla(****); Vicente Fajardo(****)
trario de lo que pueda parecer debido a (*)
su similitud morfológica con Microth- EDAR Quart-Benager (Valencia)
rix parvicella, el morfotipo 0581 se en- Entidad Pública de Saneamiento de la Generalidad Valenciana (Epsar)
cuentra filogenéticamente relacionado E-mail: azetazeta@hotmail.com
con el phyllum Chloroflexi y no con el Web: es.geocities.com/mndmicroscopico
(**) Asociación Científica Grupo Bioindicación Sevilla (GBS)
phyllum Actinobacteria, al que perte-
nece Microthrix parvicella. E-mail: g.b.s@lycos.es
Web: www.grupobioindicacionsevilla.com
Palabras clave: (***) Universidad Politécnica de Valencia
Ciudad Politécnica de la Innovación
Instituto del Agua y Medio Ambiente (I.I.M.A.A.)
Grupo de Química y Microbiología
E-mail: jalonso@ihdr.upv.es
(****) General Valenciana del Agua, S.A. (Egevasa)
Edificio Torres del Turia
C/ Santa Amalia, 2 , 2º Entresuelo, Pta. K - 46009 Valencia
Abstract
E-mail: egevasa@egevasa.es - Web: www.egevasa.es
Periodical episodes of foaming
involving gram-negative filaments.
Morphotype 0581: an unknown.
The gram-positive filamentous bacteria
Actinomycetes (GALO) and Microth- 1. Introducción superficie del tanque (Madoni et al.,
rix parvicella are responsible for foa-

ming in active sludge in waste water
treatment plants. According to Eikel-
boom (2000) and Jenkins et al. (2003),
these micro-organisms are classified by
morphotypes, which sometimes show a
large diversity of species when specific
probes are used.
A study of the periodical foaming pro-
cess in the waste water treatment plant
in the municipality of Torres-Torres, in
275 / AGOSTO / 2006
L
os microorganismos fila-
mentosos son miembros jun-
to con protozoos y metazoos
de la microfauna de las plantas de
tratamiento de aguas residuales por
fangos activos, desempeñando un
papel esencial en la formación del
flóculo (Madoni et al., 2000). Co-
múnmente, la proliferación excesiva
2000). Este efecto genera la separa-
ción de la masa de fango hacia la su-
perficie, dando lugar a un ecosistema
que tiende a evolucionar de forma di-
ferente al resto, con características
fisicoquímicas distintas.
Estas espumas son generadas por
determinadas bacterias filamento-
sas, usualmente Gram positivas con

the province of Valencia, Spain, with a
predominance of morphotype 0581,
has made it possible to ascertain both
the optical and phylogenetic identity of
this morphotype. Contrary to what
might have been expected in view of its
morphological similarity to Microthrix
parvicella, morphotype 0581 is phylo-
genetically related to the phyllum
Chloroflexi and not to the phyllum Ac-
tinobacteria, to which Microthrix par-
vicella belongs.
2 del flóculo, formando espumas en la
de bacterias filamentosas genera
problemas de explotación y causa se-
rios problemas de separación en el
clarificador. Estos problemas pue-
den ser clasificados en dos grandes
grupos, que pueden aparecer de for-
ma separada o conjunta: esponja-
miento o bulking y espumación o fo-
aming. En este último caso, los agre-
gados de bacterias filamentosas se
unen con burbujas de gas y partículas
alto contenido en Guanina/Citosina
(Seviour, 1999) que, por las caracte-
rísticas de su pared celular, pueden
absorber compuestos de baja solu-
bilidad (Martins et al., 2004) y fuer-
temente hidrofóbicos. Dentro de las
bacterias filamentosas con mayor
capacidad para formar espumas es-
tán: Microthrix parvicella, GALO,
PTLO, T 0092, T 0675, T 0041 y
bacterias cocales (Jenkins et al.,
2003).

TECNOLOGIA DEL AGUA


2. Identificación de
bacterias filamentosas
Evidentemente, la identificación
correcta del filamento generador de
la alteración es primordial en el pro-
ceso de explotación de la EDAR. El
sistema de identificación/denomi-
nación para las bacterias filamento-
sas más frecuentes en fangos acti-
vos fue publicado por Eikelboom en
1975. Posteriormente Eikelboom y
van Buijsen (1983) y Jenkins et al.
(1996), desarrollaron unas claves de
identificación dicotómicas en fun-
ción de una serie de características
morfológicas y una reactiva a las
tinciones clásicas, quedando la no-
menclatura, pues, en forma de un
código de cuatro cifras precedido
por la denominación ‘tipo’ y en al-
gunos casos el género.
La versión mas actualizada de es-
ta clave de identificación, Jenkins et
al. (2003), es una modificación de la
aportada por Eikelboom y van Buij-
sen (1983), en la que se recogen las
23 bacterias filamentosas que con
mayor frecuencia se encuentran en
los fangos activos. De hecho, la ma-
yoría de los estudios se realiza con
las técnicas convencionales de ca-
racterización por fenotipos (Se-
viour, 1999). No obstante, el uso de
estas claves de identificación no es-
tá exento de riesgo, ya que la morfo-
logía así como las respuestas a las
diferentes tinciones de estas bacte-
rias pueden cambiar en virtud de va-
riaciones en factores ambientales.
En sistemas industriales de fangos
activos, incluso, pueden encontrar-
se morfotipos de bacterias filamen-
tosas distintos a los habituales (Se-
viour, 1999).
La identificación y el papel
bioindicador de los microorganis-
mos filamentosos han sido temas de
estudio durante décadas. Sin embar-
go, debido a la complejidad de las
comunidades microbianas, las téc-
nicas de identificación y, en conse-
cuencia, la bioindicación, se en-
cuentran limitadas por los métodos
clásicos. El empleo en los últimos
años de técnicas moleculares que
estudian la composición de lípidos
ARTICULOS TECNICOS
de la pared, secuencias e hibrida-
ción de ácidos nucleicos (Seviour y
Blackall, 1999, Lacko et al., 1999),
aplicados al estudio de las bacterias
filamentosas, están determinando la
verdadera relación evolutiva entre
estas bacterias. Dichos estudios per-
miten situarlas en el árbol filogené-
tico y conocer su fisiología gracias
al aislamiento de cultivos puros. Sin
embargo, en la actualidad, sólo una
minoría de filamentos se ha identifi-
cado usando estudios filogenéticos.
La hibridación in situ con sondas
de ARN ribosómico marcadas con
fluorocromos (FISH) permite iden-
tificar, mediante microscopía de
fluorescencia, los microorganismos
en muestras en su medio natural
(Bjornssom et al., 2002). Esta técni-
ca se basa en la hibridación directa
de la bacteria a identificar con una
sonda complementaria de una re-
gión del 16S o 23S ARN ribosómi-
co, que previamente se ha diseñado
para que sea específica de la bacte-
ria que se va identificar.
En la relación de organismos fila-
mentosos recogida en el manual de
Jenkins et al. (2003) se resumen dife-
rentes estudios, detallando el orden
de aparición y abundancia de los fila-
mentos en distintas plantas de trata-
miento del mundo. Tal y como se ob-
serva en la Tabla 1, a excepción de
los hongos, cuya presencia no es
muy común en fangos activos, los fi-
lamentos que ocupan los 10 primeros
puestos son: GALO, Tipo 1701, Tipo
021N, Tipo 0041, Thiothrix sp., Sp-
haerotilus natans, Microthrix parvi-
cella, Tipo 0092, Haliscomenobac-
ter hydrossis y Tipo 0675.
En la EDAR del municipio de
Torres-Torres (Valencia) se produ-
cen de forma periódica episodios de
foaming. En el periodo de estudio
(marzo, abril y mayo 2005) se pre-
sentó como filamento dominante el
morfotipo 0581, el morfotipo 0092
como secundario y Microthrix par-
vicella de forma ocasional, tanto en
las espumas generadas como en el
licor mezcla. Esta situación nos ha
permitido comprobar cómo este ti-
po filamentoso, el Tipo 0581, uno
de los filamentos con menor grado
de incidencia en los episodios de
bulking y foaming del estudio pre-
sentado por Jenkins et al., 2003 (Ta-
bla 1) y en la bibliografía, en gene-
ral, puede generar procesos de espu-
mación típicos de bacterias Gram
positivas y ser, además, dominante.
Por su parte, Microthrix parvice-
lla es uno de los organismos con ma-
yor grado de ocurrencia en fangos
activos (Jenkins et al., 2003) y está
implicado en severos problemas de
separación sólido/líquido y foaming
(Rossetti et al., 2005), con la particu-
laridad de presentar una gran simili-
tud morfológica con el Tipo 0581. A
nivel óptico, la diferencia entre am-
bos filamentos se reduce a la res-
puesta ofrecida a la tinción Gram,
positiva para Microthrix parvicella
y negativa para el morfotipo 0581.
Todas estas observaciones, uni-
das al hecho de que algunos fila-
mentos pueden cambiar morfológi-
camente según las condiciones am-
bientales (Martins et al., 2004), nos
hicieron plantear la posibilidad de
que el filamento identificado como
Tipo 0581 se tratase, en realidad, de
Microthrix parvicella. En concreto,
muchos actinomicetos, entre ellos
Microthrix parvicella, se fragmen-
tan en su ciclo vital, lo que hace que
parezcan otros organismos bajo
condiciones ambientales distintas
(Seviour y Blackal, 1999).
La revisión taxonómica de ambas
bacterias nos permite comprobar
que el Tipo 0581 está actualmente en
estudio, con ubicación desconocida
(Seviour, 1999). Es decir, con la de-
nominación Tipo 0581 nos encon-
tramos ante un ‘puzzle’ todavía por
275 / AGOSTO / 2006
resolver (Rossetti et al. 2005). En
cuanto a Microthrix parvicella, gra-
cias a los estudios con técnicas de se-
cuenciación, se han aislado e identi-
ficado varias cepas como posibles
candidatas y se han desarrollado las
siguientes sondas FISH para su de-
tección e identificación directa en
muestras de espumas: MPA60,
MPA223, MPA645, MPA650,
CompMPA650.1, CompMPA650.2
(Erhart et al., 1997). 3
TECNOLOGIA DEL AGUA
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Tabla 1

Organismo Filamentoso USAa Países Alemaniac,e Sudáfricad Australiaf Dinamarcag Italiah República
Bajosb,e Checai
Nocardioformes y actinomycetes 1 ? ? 6 3 - 2 6
Tipo 1701 2 5 8 8 12 - 9 13
Tipo 021N 3 2 1 - 1 3 6 7
Tipo 0041 4 6 3 6 2 2 3 5
Thiothrix spp. 5 19 - 9 13 - 7 8
Sphaerotilus natans 6 7 4 - 14 - - -
Microthrix parvicella 7 1 2 2 1 1 1 1
Tipo 0092 8 4 - 1 4 3 4 3
Haliscomenobacter hydrossis 9 3 6 9 5 - - 11
Tipo 0675 10 - - 4 2 - 3 11
Tipo 0803 11 9 10 7 9 - - 4
Nostocoida limicola I, II y III 12 11 7 8 5 - 5 2
Tipo 1851 13 12 - 3 8 6 - -
Tipo 0961 14 10 9 - 10 - 8 9
Tipo 0581 15 8 - 9 - - - -
Beggiatoa spp. 16 18 - - 15 - - -
Hongos 17 15 - - - - - -
Tipo 0914 18 - - 5 7 5 10 10
a Richard et al. (1982) y Strom y Jenkins (1984): 525 muestras de 270 plantas.
b Eikelboom (1977): 1100 muestras de 200 plantas.
c Wagner (1982): 3500 muestras de 315 plantas.
d Blackbeard et al. (1986a y 1986b): 111 plantas que incluyen 26 plantas de eliminación biológica de nutrientes (BNR); licor mezcla con bulking y sin bulking.
e No se incluyen las nocardioformes.
f Seviour et al. (1994): 38 plantas de eliminación biológica de fósforo (EBPR).
g Kristenesen et al. (1994): 40 plantas.
h Rossetti et al. (1994): 40 plantas.
i Wanner et al. (1998): 86 muestras de 86 plantas.

Tabla 1. Abundancia de organismos filamentosos. Fuente: Jenkins et al., 2003.

Por lo tanto, partimos de la base como Tipo 0581, para lo que se ha por la Empresa General Valenciana
que el nombre vernáculo de Mi- realizado un análisis de la decanta- del Agua (Egevasa) desde el año
275 / AGOSTO / 2006

crothrix parvicella, probablemente, bilidad del fango, un estudio con 1992.

se pueda dividir taxonómicamente microscopía óptica y la caracteriza- Esta planta está diseñada para
mediante el empleo de sondas espe- ción filogenética con FISH de dicha tratar 625 m 3/día de caudal medio
cíficas, las cuales permitirán discer- bacteria dominante. con una carga de 300 mg/l de sóli-
nir claramente si nos encontramos dos en suspensión totales y una
con especies distintas o variedades 3. Material y métodos DBO 5 de 300 mg O 2/l. La línea de
de la misma. De hecho, Seviour El muestreo se ha realizado en la agua consta de un pretratamiento
(1999) define este grupo como filo- EDAR situada en el municipio de que comprende un desbaste y un ta-
genéticamente diverso. Torres-Torres, titularidad de la En- mizado, un reactor biológico circu-
En resumen, el objetivo de este tidad Pública de Saneamiento de lar de mezcla completa (650 m 3)
estudio es dilucidar la auténtica Aguas Residuales de la Generali- con dos aireadores sumergidos y un
4 identidad del filamento identificado dad Valenciana (Epsar) y explotada decantador secundario. La línea de

TECNOLOGIA DEL AGUA

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fangos consta de un secado de fan-
gos realizado en eras de secado.
Con el fin de determinar el inter-
valo de carga másica a la cual opera
la planta depuradora, se estableció
un periodo de muestreo comprendi-
do entre los días 19-24 de abril
2005, encontrándose la temperatura
ambiental en torno a 25 °C. Para ello
se habilitó un equipo tomamuestras
automático después del pretrata-
miento y justo antes de la entrada
del influente al reactor biológico.
La toma de agua se programó para la
recogida de muestras cada 30 minu-
tos con las que se confeccionó una
muestra compuesta a partes iguales.
Los análisis físico-químicos se rea-
lizaron según los Métodos Normali-
zados (APHA, AWWA, WPCF).
Las muestras de licor mezcla se
tomaron justo a la salida del reactor
biológico y las de emulsión (nata) se
recogieron en la superficie del de-
cantador secundario. Simultánea-
mente se realizaron mediciones ho-
rarias del oxígeno disuelto en distin-
tas partes del reactor.
El tratamiento preliminar de las
muestras del reactor para la obser-
vación microscópica y su conserva-
ción se realizaron según el protoco-
lo establecido en Rodríguez et al.
(2004). El estudio de las muestras
del reactor y de las espumas se ha
realizado siguiendo el protocolo de
GBS (Rodríguez et al., 2004). La
identificación de bacterias filamen-
tosas se hizo según a los manuales
de Jenkins et al. (1996, 2003) y Se-
viour y Blackall (1999).
La observación óptica se ha reali-
zado con un microscopio Zeiss mo-
delo Axiostar con objetivos de
100x, 200x, 400x y 1.000x, dotado
de equipo para microfotografía.
Debido a la abundancia de fila-
mentos presentes en el reactor hu-
bo que practicar una V30 diluida en
la proporción 1:3 (Stöbbe et al.,
1964; Jenkins et al., 2003). Es por
ello que el índice volumétrico de
fangos se expresa en su forma di-
luida (IVFD).
Con la técnica FISH se han utili-
zado sondas específicas marcadas
con fluorocromos, para la detección
de bacterias filamentosas en las
muestras del reactor y de las espu-
mas (Tabla 2). Esta técnica es más
fiable para la identificación de bac-
terias filamentosas que las técnicas
convencionales, al basarse en se-
cuencias de nucleótidos específicas
de las bacterias o grupos de bacte-
rias que se quieren identificar. Las
hibridaciones se han realizado a
46 °C durante 1,5-3 h según el pro-
tocolo de Manz et al. (1992).

Tabla 2

Sonda Secuencia (5´-3´) Especificidad % F1 Referencia

EUB 338 I GCTGCCTCCCGTAGGAGT Bacteria 20 Amann (1990)
EUB 338 II GCAGCCACCCGTAGGTGT Planctomycetes 20 Daims et al. (1999)
EUB 338 III GCTGCCACCCGTAGGTGT Verrucomicrobia 20 Daims et al. (1999)
ALF1b CGTTCG(C/T)TCTGAGCCAG α Proteobacteria 20 Manz et al. (1992)
BET42a GCCTTCCCACTTCGTTT β Proteobacteria 35 Manz et al. (1992)
GAM42a GCCTTCCCACATCGTTT γ Proteobacteria 35 Manz et al. (1992)
HGC69a TATAGTTACCACCGCCGT Actinobacteria 25 Roller et al. (1994)
LGC354A TGGAAGATTCCCTACTGC Firmicutes 35 Meier et al. (1999)
LGC354B CGGAAGATTCCCTACTGC Firmicutes 35 Meier et al. (1999)
LGC354C CCGAAGATTCCCTACTGC Firmicutes 35 Meier et al. (1999)
CF319 TGGTCCGTGTCTCAGTAC Bacteroidetes 35 Manz et al. (1992)
GNSB941 AAACCACACGCTCCGCT Chloroflexi 35 Gich et al. (2001)
275 / AGOSTO / 2006

CFX1223 CCATTGTAGCGTGTGTGTMG Chloroflexi 35 Björnsson et al. (2002)

TM7905 CCGTCAATTCCTTTATGTTTTA TM7 20 Hugenholz et al. (2000)
MPA645 CCGGACTCTAGTCAGAGC Microthrix parvicella2 20 Erhart et al. (1997)
MPA223 GCCGCGAGACCCTCCTAG Microthrix parvicella 20 Erhart et al. (1997)
MPA60 GGATGGCCGCGTTCGACT Microthrix parvicella 20 Erhart et al. (1997)
1 Concentración óptima de formamida.

2 Microthrix parvicella.

Tabla 2. Sondas utilizadas para identificar el Tipo 0581. 5

TECNOLOGIA DEL AGUA

 ARTICULOS
A B
Figura 1. Ensayos correspondientes a la muestra de estudio. A: Ensayo de la V30 sin diluir y diluido (a la derecha). B: Levantamiento de la manta de fango, generando
la típica “Probeta partida”. C: Capa emulsionada en superficie.
3.1. Antecedentes
bibliográficos: descripción
del morfotipo 0581 a nivel
óptico
Jenkins et al. (2003): Filamento
curvado y enrollado situado dentro
del flóculo o libre en el espacio in-
terflocular. La longitud del tricoma
se encuentra típicamente entre 100
y 200 µm de longitud y 0,5-0,8 µm
de ancho. No se aprecian las células
a lo largo del filamento. No presenta
ni septos visibles, ni vaina, ni creci-
miento adherido. No presenta ni ra-
mificaciones ni movilidad.
Reactiva a tinciones: Gram nega-
tivo y Neisser negativo.
Clave de identificación: Locali-
zación dentro del flóculo y reacción
Gram negativa. El filamento puede
ser confundido con Microthrix par-
vicella, pero la reacción fuertemen-
te positiva de este otro filamento lo
275 / AGOSTO / 2006
diferencia de la reacción Gram ne-
gativa, propia del morfotipo 0581.
Eikelboom (2000): No modifica
sustancialmente las claves identifi-
cativas de este filamento respecto a
su primera edición (1983), salvo el
diámetro celular que lo sitúa entre
los rangos de 0,3-0,4 µm y la longi-
tud del filamento, que presenta va-
lores inferiores a 200 µm. Esta cir-
cunstancia sugiere la posibilidad de
6 que Microthrix parvicella y T 0581
TECNOLOGIA DEL AGUA
TECNICOS
pudieran tratarse de distintas formas
de crecimiento de la misma especie.
Microthrix parvicella, descrita
por primera vez por Pasveer en
1969, se incluye en el phyllum Acti-
nobacteria (Rossetti et al., 2005),
con características especiales, sien-
do uno de los filamentos más polé-
micos de la lista de Eikelboom. La
distinta morfología presentada por
esta bacteria, según los sustratos
utilizados, hace pensar que existen
variantes, definidas por Eikelboom
como “distintos ecotipos” que en re-
alidad se corresponden con la mis-
ma especie. En muchos casos, este
polimorfismo guarda relación con
la adaptabilidad de la especie (Mar-
galef, 1998).
Por otra parte, algunos autores
encuentran codominancia entre Mi-
crothrix parvicella y el Tipo 0092
(Madoni et al., 2000), así como dis-
tintos ecotipos de Microthrix parvi-
cella en función de la temperatura.
Esta última presenta un óptimo de
crecimiento a 25 °C (Seviour y
Blackal, 1999), con crecimiento en
forma alargada (200-500 µm) que,
durante el verano, se fragmenta y
queda en forma de filamentos cortos
(20-200 µ m) (Hawany y Tanakoo,
1998; Rossetti et al., 2005). La fre-
cuencia de las distintas formas fila-
mentosas es función de las condi-
C
ciones ambientales, algunas de las
cuales cambian en el curso del año
(Margalef, 1998). Esta última cir-
cunstancia nos hizo pensar que Mi-
crothrix parvicella y T 0581 podrí-
an pertenecer al mismo grupo filo-
genético y que ambas podrían en-
contrarse íntimamente ligadas al Ti-
po 0092 en función de sus caracte-
rísticas ecológicas.
4. Resultados y discusión
Para poder determinar las carac-
terísticas de las bacterias es necesa-
rio establecer la decantabilidad del
fango, conocer los parámetros ope-
racionales de la EDAR, proceder al
análisis óptico del fango y realizar
su estudio filogenético.
4.1. Análisis de
decantabilidad
Debido a la longitud y forma de
crecimiento similares en Microthrix
parvicella y el Tipo 0581, es lógico
pensar que el análisis macroscópico
realizado sobre el conocido ensayo
de la V30 sea también muy parecido
en cuanto a la velocidad de decanta-
ción, aspecto algodonoso del licor,
emulsión en superficie y elevación
de la masa de fango. Ambas formas
de crecimiento filamentoso produ-
cen valores de IVF elevados y emul-
siones (natas), por lo que podría con-
 ARTICULOS TECNICOS

todo cuando se practica una dilu-

A B
Figura 2. Aspecto del tratamiento secundario en la planta estudiada. A: Primeros estadios de formación de
natas en el clarificador. B: Acumulación de natas en el reactor biológico.
siderarse un doble efecto bulking-
foaming. En la Figura 1A se mues-
tra en la probeta de la izquierda el
ensayo de la V30 sin diluir y en la de
la derecha diluido (correspondiendo
un IVFD 1:3) (Stobbe et al., 1964).
La forma curva del filamento,
con gran tendencia a enrollarse,
produce el entrelazado de los flócu-
los y por tanto una velocidad de de-
cantación lenta. Grandes porciones
de licor mezcla se elevan debido a la
acumulación de microburbujas en
dicha “estructura”, aspecto que pue-
de apreciarse visualmente en la su-
perficie del clarificador secundario
y que en el lenguaje de la explota-
ción de estaciones depuradoras se
denomina como “trozos de fango
elevado”, sin tratarse de la emulsión
propiamente dicha. Este hecho se
puede apreciar en la Figura 1, sobre
ción para realizar el ensayo de la
V30 o cuando el nivel de sólidos en
suspensión del licor mezcla
(SSLM) es bajo. Este aspecto es co-
nocido como “probeta partida”. No
obstante, los efectos del foaming se
dejan ver en la parte superior de la
probeta en forma de una capa emul-
sionada con aspecto céreo que, a
simple vista, aparece como una
multitud de burbujas de aire junto
con fango.
En la Figura 2A se muestra la si-
tuación del clarificador en los mo-
mentos en los que se están forman-
do las primeras “natas”, las cuales
inicialmente tienen forma de “esca-
mas”, con multitud de burbujas, que
salen de la zona central del decanta-
dor para ocupar toda la superficie.
En este tipo de episodios, según el
grado de avance del foaming, puede
llegarse a colapsar toda la superficie
del reactor biológico (Figura 2B)
con el aspecto típico de “chocolate
espeso”.

275 / AGOSTO / 2006

Figura 3. Reacciones a las tinciones de los filamentos encontrados en las muestras estudiadas (1.000x). A. T 0581: 1. Muestra en vivo. 2. Neisser negativa. 3.
Respuesta Gram negativa de T0581, junto con reactiva Gram positiva de Microthrix parvicella; B. Microthrix parvicella: 1. Muestra en vivo. 2. Reacción gránulo
Neisser positiva. 3. Tinción Gram positiva; C. Tipo 0092: 1. Muestra en vivo. 2. Clásica tinción Neisser positiva, color púrpura. 3. Tinción Gram con reactiva negativa. 7

TECNOLOGIA DEL AGUA

 ARTICULOS TECNICOS

A B

Figura 4. Disgregación flocular por dos bacterias de características morfológicas similares (100x). A: Tipo Figura 6. Diámetros celulares de Microthrix
0581 (muestra estudiada); B: Microthrix .parvicella. parvicella (introducida artificialmente) y el Tipo
0581 (1.000x) en muestra in vivo.

En la Figura 7 se pueden obser-

A B
Figura 5. Forma en bucles típica de Microthrix parvicella, presente en ambas bacterias (400x). A: Tipo 0581
( muestra de estudio); B: Microthrix parvicella.
4.2. Análisis óptico
En el análisis microbiológico re-
alizado a las muestras aparecen, en-
tre otros, tres tipos bacterianos: Ti-
po 0581 (dominante), Tipo 0092
(secundario) y Microthrix parvice-
lla (ocasional) (Figura 3).
El análisis detallado de las mues-
tras indica que, tal como se puede
apreciar en la Figura 4, la presencia
del Tipo 0581 a niveles altos de po-
blación puede producir una estruc-
tura flocular abierta, de forma simi-
lar a Microthrix parvicella.
La semejanza óptica de ambos fi-
lamentos en el estudio de una mues-
275 / AGOSTO / 2006
misma muestra y resaltar las dife-
rencias, se introdujo de manera arti-
ficial Microthrix parvicella (Figura
6).
El ancho celular de ambos mor-
fotipos es distinto (Figura 6). Gene-
ralmente, el Tipo 0581 es algo más
fino que Microthrix parvicella, aun-
que nos podemos encontrar con diá-
metros similares, siendo Microthrix
parvicella más fina que la mostrada
en dicha figura. Por esta razón, el
diámetro celular no sería una carac-
terística distintiva entre ambas.
var espacios vacíos en el tricoma, tí-
picos de Microthrix parvicella que,
sin embargo, han podido observarse
también en el Tipo 0581. Estos hue-
cos parecen estar asociados a condi-
ciones de estrés ambiental, ya que
en cultivos puros no aparecen. A ba-
ja concentración de oxígeno (0,4
mg/L) presentan morfología irregu-
lar y alargada sin células deforma-
das o vacías (Rossetti et al., 2005).
La Figura 8 nos permite compa-
rar la reactiva a Gram (método
Hücker modificado). Ambos mor-
fotipos tienen reacciones clara-
mente distintas, lo que haría supo-
ner que esta tinción es clave para su
distinción. Sin embargo, de manera
ocasional, se observan algunos fi-
lamentos con una reacción clara-
mente positiva a dicha tinción que
los convierten en “candidatos” a
Microthrix parvicella en la muestra
estudiada, en la que el filamento
dominante es el morfotipo 0581.
En relación con esto último, existe

tra in vivo es notable, siendo impo-

sible discernir entre ellos sin reali- A B
zar tinciones. El análisis métrico no
es, pues, una característica distinti-
va, sino simplemente orientativa.
La forma curva y enrollada típica y
que estamos acostumbrados a ob-
servar en Microthrix parvicella,
aparece en ambos morfotipos (Fi-
gura 5).
Con el fin de contrastar la morfo- Figura 7. Presencia de huecos en los filamentos estudiados. A: Tipo 0581 (muestra de estudio); B: Microthrix
8 logía de estas dos bacterias en la parvicella (.1000x).

TECNOLOGIA DEL AGUA

 ARTICULOS TECNICOS

A B
Para identificar
el Tipo 0581 se
realizan análisis
de decantabilidad
del fango
Figura 8. Comparativa de la reacción Gram en los filamentos estudiados. A: Tipo 0581 (muestra de estudio);
B: Microthrix parvicella y Tipo 0581 (1.000x).

A B C

Figura 9. Reacción a la tinción de Neisser de los dos filamentos (1.000x). A: Microthrix parvicella con gránulos fuertemente positivos y Tipo 0581 con gránulos Neisser
débilmente positivos. B: Tipo 0581 con reacción gránulo-negativo. C: Muestra control de Microthrix parvicella procedente de otra muestra distinta a la de estudio en la
que se observa la típica reacción gránulo-positiva.

la hipótesis de que se pueden gene-
rar cambios en la superficie celular
de algunas bacterias filamentosas
frente a vertidos químicos (Rosset-
ti et al, 2005), lo que se traduciría
en reacciones a tinciones anómalas
y añadiría más dificultad a la iden-
tificación de morfotipos visual-
mente idénticos. En estas mues-
tras, la determinación filogenética
aporta la clave necesaria para com-
probar si se tratan de distintos mor-
fotipos, ecotipos o especies distin-
tas con capacidad de convivir en el
mismo nicho ecológico.
En cuanto a la tinción Neisser, en
función de la actividad de los gránu-
los Neisser, hemos dividido los fila-
mentos de morfologías similares en
tres grupos:
– Filamentos del Tipo 0581, abun-
dantes, que no presentan reac-
ción gránulo-Neisser positiva.
– Filamentos que presentan reac-
ción gránulo-Neisser positiva,
aunque no muy marcados, distri-
buidos desigualmente y de forma
espaciada por todo el filamento,
asignados a “variantes” del Tipo
0581.
– Filamentos con gránulos fuerte-
mente Neisser positivos, que se
han identificado como Microth-
rix parvicella.
En la Figura 9C se puede obser-
var un filamento con una reacción
Neisser clásica de Microthrix parvi-
cella, mientras que la Figura 9A
permite observar una reacción va-
riable del morfotipo 0581 a dicha
tinción que contrasta con la de Mi-
275 / AGOSTO / 2006

crothrix parvicella. La bibliografía,

A B sin embargo, indica que el Tipo
0581 es gránulo-Neisser negativo
(Figura 9B).
El resto de tinciones, tinción de
vainas y PHB, muestran resultados
negativos en todas las ocasiones re-
alizadas (Figura 10), si bien Ros-
setti et al. (2005) indican que estas
reacciones pueden presentar varia-
Figura 10. Tinción de vainas y tinción PHB. A: Reacción negativa a la tinción de vainas del Tipo 0581. bilidad según la riqueza del medio
B: Reacción negativa a la tinción de PHB del Tipo 0581 (1.000x). Ambas procedentes de la muestra de estudio. en nutrientes y lípidos. 9

TECNOLOGIA DEL AGUA

 ARTICULOS TECNICOS

la estabilización del sistema en tres

A B fases: aire-agua-células microbia-
nas. La estabilización de la nata bio-
lógica es el resultado de la produc-
ción de materiales lipídicos, lipo-
péptidos, proteínas y carbohidratos,
los cuales tienen propiedades de
agentes tensioactivos. Por añadidu-
ra, las paredes celulares de los mi-
croorganismos formadores de foa-
ming son fuertemente hidrofóbicas.
C D El mecanismo de estabilización
de la nata podría explicarse aplican-
do un modelo sencillo de “monoca-
pa”. La mayoría de sustancias de
fuerte carácter hidrófobo antes
mencionadas presentan, al menos,
una parte compuesta por ácidos gra-
sos (saturados o insaturados) que
están formados por un grupo polar
(carboxilo) y una parte apolar (ca-
Figura 11. Aspecto típico de situaciones de foaming. A: Sustancias de carácter hidrófobo; sistema estable dena hidrocarbonada) con un núme-
aire-agua-células. B: Presencia material hidrófobo cercano al núcleo del flóculo. C: Material hidrofóbico ro elevado de átomos de carbono.
en las zonas de mayor densidad bacteriana. D: Población filamentosa en el espacio interflocular del frotis
de la muestra de nata (100x). De manera visual se observa que su
presencia comienza apreciándose
en las zonas centrales de los flócu-
Es típico observar como después de la muestra de nata, aparece una los que se presentan bien compactos
de un aumento brusco de la pobla- gran población de bacterias fila- (Figura 11B), y con una microes-
ción de Actinomicetos, los cuales mentosas (Tipo 0581) siempre ma- tructura rica en formas filamentosas
contienen ácidos micólicos (Myco- yor que en el licor mezcla. Esta si- susceptibles de albergar o sintetizar
lata), junto con una subida brusca de tuación ocurre de forma similar en estos compuestos (Figura 11C).
los niveles de oxígeno en el reactor, Microthrix parvicella, estando des- Una vez que los niveles aumentan,
puede generarse en escaso tiempo crita como LAO (acumuladora de se llega a un contacto directo molé-
una gruesa capa de emulsión pro- lípidos) (Rossetti et al., 2005). culas-licor mezcla, produciéndose
ducto del incremento de microbur- La formación de foaming produ- un efecto similar al adicionar un
bujas (Figura 11). cida por microorganismos filamen- agente tensioactivo a una disolución
En la Figura 11D se puede obser- tosos es un complejo proceso que acuosa. Es decir, las moléculas tien-
var claramente como en el espacio engloba reacciones físico-químicas den a concentrarse en la superficie
interflocular, en el frotis procedente y biológicas. El proceso termina con (interfase líquido-gas) formando

Tabla 3

DIA CAUDAL DBO5 SSLM SSVLM V30 IVFD CARGA

ENTRADA ENTRADA REACTOR REACTOR (1:3) (1:3) MÁSICA
275 / AGOSTO / 2006

m3 mg O2/l mg/l mg/l ml/l ml/g kg DBO/kg

SSVLM.d
19-04-05 400 300 2890 2250 200 551 0,082
20-04-05 480 240 2840 2190 220 620 0,081
21-04-05 440 200 2770 2130 180 520 0,064
22-04-05 405 380 2830 2210 170 480 0,12
23-04-05 450 420 2900 2290 160 441 0,13
24-04-05 450 500 2920 2300 150 411 0,15

10 Tabla 3. Valores de carga másica obtenidos en el periodo de muestreo.

TECNOLOGIA DEL AGUA

 ARTICULOS TECNICOS

muchos de ellos en la situación an-

tes descrita y a los que se les va a fa-
cilitar una interfase líquido/gas don-
de las moléculas se podrán disponer
en monocapa. La situación final es
que los flóculos con este tipo de ma-
terial atrapan microburbujas (Figu-
ra 11A), por lo que tienden a flotar y
acumularse en la superficie. Cuando
las cantidades son importantes aca-
ba formándose una nata espesa en la
superficie del reactor y/o del clarifi-
cador secundario.

4.3. Parámetros
operacionales
Esquema reactor biológico
Las cargas másicas (CM) obteni-
das se mantienen bajas durante el
periodo de estudio (0,06-0,08 kg.
DBO/kg. MLVSS d.) y se ven incre-
mentadas a lo largo del fin de sema-
na debido, fundamentalmente, al
aumento de la carga orgánica en el
influente por el desplazamiento po-
blacional que sufre el municipio.
A continuación se presentan los
rangos de carga másica en los que
suele ser frecuente encontrar los
morfotipos principales de la mues-
0
0

0
0

0
00
30
00

.0
.3

.3
.3

.0

.3

.0
0
0
30

00
00

30

.0
.3

15
16

22
13

18

19

21
0.
1.
3.

tra de estudio (Jenkins et al., 2003):

4.

12
9.
10
6.

7.

Tipo 0581: 0,1-0,05 kg. DBO/kg

SSVLM d.
Tipo 0092: 0,15-0,05 kg DBO/kg
SSVLM d.
Microthrix parvicella: 0,2-0,05 kg
DBO/kg SSVLM d.

En la Tabla 3 podemos compro-

bar en que rango de carga másica ha
operado la EDAR durante el perio-
do de estudio y como coincide con
los rangos típicos que aparecen en la
bibliografía. No se detectó ninguna
275 / AGOSTO / 2006

variación importante de los distin-

Figura 12. Distribución de oxígeno en el reactor estudiado.
una monocapa con los grupos pola-
res interaccionando con las molécu-
las de agua y los apolares dirigidos
hacia la fase gas (disposición ener-
gética favorable). En el reactor bio-
lógico tenemos que añadir además
un factor muy importante, el siste-
ma de aireación, con millones de
microburbujas de aire colisionando
continuamente con los flóculos,
tos microorganismos presentes en
función de la CM.
Un parámetro que afecta de forma
importante a los distintos organis-
mos filamentosos es el nivel de oxí-
geno disuelto. El sistema de oxigena-
ción ocasiona zonas y momentos con
escasos niveles de oxígeno, como es
el caso de las zonas desde donde los
aireadores impulsan el aire (posición
1) frente a otras zonas con niveles 11

TECNOLOGIA DEL AGUA

 ARTICULOS TECNICOS

A B

C D

Figura 13. Hibridación con distintas sondas. A: Células de color rojo hibridadas con la sonda EUB338I marcada con TAMRA. B: Mismo campo que en A pero
la hibridación se ha realizado con las sondas GNSB941 y CFX1223 (marcadas con FAM), utilizadas para identificar bacterias del phyllum Chloroflexi, la flecha
de color blanco señala un filamento que ha hibridado con las dos sondas del phyllum Chloroflexi y no ha hibridado con la sonda EUB338I. C y D: representan
diferentes campos en los que se pueden observar células de color verde del morfotipo 0581 (flechas de color rojo).

mas elevados (posición 2), tal y co-
mo puede apreciarse en la Figura 12.
La posición 3 corresponde al punto
de muestreo del licor mezcla.
Esta situación de intermitencia
en el oxígeno podría ser similar a la
que se produce en el régimen de
puestas en marcha y paradas en los
sistemas de aireación por turbinas y
en los que es muy común el creci-
275 / AGOSTO / 2006
de la depuradora de Torres-Torres
con la técnica FISH se han utilizado
sondas de diferentes phyllum para
poder ubicar filogenéticamente el
morfotipo 0581, dominante en estas
muestras. El morfotipo 0581 no ha
hibridado con las siguientes sondas
que se utilizan para caracterizar
bacterias a nivel de phyllum: Prote-
obacteria, Actinobacteria, Firmicu-
sondas GNSB941 y CFX1223 (Fi-
gura 13B). Se ha obtenido una señal
positiva en las células que constitu-
yen este morfotipo con las sondas
del phyllum Chloroflexi (Figuras
13B, C y D). Bacterias filamentosas
del phyllum Chloroflexi se han des-
crito como abundantes en procesos
de tratamiento de aguas residuales
con eliminación de nutrientes

miento de las formas de Microthrix
parvicella, más competitiva en es-
tas situaciones de alternancia, y en
las cuales también podría serlo la
forma Tipo 0581.
4.3. Estudio filogenético
El morfotipo 0581 se ha encon-
trado como dominante en el 10% de
depuradoras con problemas de es-
pumas en Alemania (Lemmer et al.,
12 2004). En las muestras analizadas
tes, Planctomycetes, Verrumicro-
bia, Bacteroidetes y TM7. Björns-
son et al. (2002) encuentran también
algunos filamentos que hibridan
con la sondas del phyllum Chloro-
flexi y que no dan señal con las son-
das EUB338 mix (I, II y III). En las
muestras de Torres-Torres se han
detectado morfotipos filamentosos
que no hibridan con las sondas
EUB338 I, II y III (Figura 13A) y
que, sin embargo, hibridan con las
(Björnsson et al., 2002).
Con la técnica FISH en las mues-
tras de Torres-Torres se ha detecta-
do señal de hibridación en algunas
células/filamentos del morfotipo
Microthrix parvicella. Las células
hibridadas daban una señal débil
(Figuras 14A y 14B). Este resulta-
do correspondería a un bajo conte-
nido en ribosomas en las células que
constituyen el filamento de Mi-
crothrix parvicella.

TECNOLOGIA DEL AGUA

 ARTICULOS
Figura 14. Microthrix parvicella hibridado con sondas MPA645, MPA223 y MPA60, utilizadas para identificar este morfotipo. Las figuras A y B representan diferentes
campos en los que se pueden observar células de Microthrix parvicella de color rojo (flechas de color blanco) (fluorocromo TAMRA utilizado para marcar las tres sondas).
5. Conclusiones
Es evidente la necesidad de utili-
zar técnicas moleculares para avan-
zar en la identificación de los distin-
tos morfotipos descritos por Eikel-
boom. El FISH se plantea como una
opción muy interesante al no nece-
sitar cultivos puros, aunque sí domi-
nancia del organismo en el fango ac-
tivo. Tiene, además, la ventaja de
utilizar la propia muestra y ser repe-
titivo. Sin embargo, para poder apli-
car esta técnica es necesario que la
célula esté activa, porque en situa-
ciones de estrés el contenido en ri-
bosomas de la célula podría situarse
por debajo del límite de detección
de la señal de hibridación.
Los futuros estudios deben ir en-
caminados, por una parte, a desen-
trañar la filogenia de las distintas
bacterias implicadas en las altera-
ciones de fangos activos, ya que este
dato es fundamental para conocer el
porqué del fenómeno. Por otra parte,
se necesita obtener sistemas de apli-
cación FISH en planta, de forma que
los operadores puedan realizar iden-
tificaciones certeras y por lo tanto
obtener información de la ecología
de una determinada bacteria, así co-
mo tomar las decisiones oportunas.
A pesar de las características
morfológicas de este organismo, si-
milares a Microthrix parvicella, la
técnica de FISH ha podido poner de
manifiesto que el morfotipo 0581
estaría incluido dentro del phyllum
Chloroflexi, no guardando relación
TECNICOS
A B
con los Actinomicetos, clásicos for-
madores de natas, que se incluyen
en el phyllum Actinobacteria.
Corroboramos que tanto la tin-
ción de Neisser como PHB no son
diferenciadoras de ambas bacterias,
aunque sí que se ha podido compro-
bar que el Tipo 0581 puede presen-
tar respuesta negativa y respuesta
débilmente positiva a gránulos
Neisser, distinta a la de Microthrix
parvicella que es mucho más inten-
sa. Algunas formas filamentosas de
este morfotipo pueden presentar re-
acciones anómalas a ambas tincio-
nes debido a deficiencias nutricio-
nales o vertidos, que no permitirían
tomar una decisión clara en su iden-
tificación. Por el contrario, la tin-
ción Gram sí permite diferenciar al
Tipo 0581.
Sería conveniente realizar un es-
tudio a nivel nacional y un segui-
miento de esta bacteria para compro-
bar si su grado de influencia es real-
mente tan bajo o si por el contrario ha
pasado desapercibida al ser confun-
dida con Microthrix parvicella.
A pesar de las escasas citas bi-
bliográficas, este filamento hemos
podido comprobar que es capaz de
generar situaciones con doble efec-
to bulking-foaming, por lo que debe
presentar capacidades competitivas
respecto al resto de bacterias que
comparten el mismo ecosistema.
En este episodio, coincidiendo
con la bibliografía, el trinomio Tipo
0581, M.p y Tipo 0092 ha estado
asociado a bajas cargas másicas y a
alternancia de oxígeno, lo que pare-
ce indicar que comparten estas mis-
mas necesidades y pueden competir
en el mismo nicho. Fluctuaciones en
las condiciones ambientales, no de-
tectables por el operador, permitiría
el desarrollo aventajado de una de
estas bacterias, sin que las otras lle-
garan a desaparecer.
6. Agradecimientos
Queremos dejar constancia de
nuestro agradecimiento a cada una
de las empresas y centros a los que
pertenecemos, especialmente a
Egevasa, Epsar y Emasesa, por su
apoyo y respaldo a nuestro trabajo.
También agradecemos su colabora-
ción a Rebeca Castresana de Mi-
guel, durante la toma de muestras y
en la obtención de parámetros fisi-
coquímicos.
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