UNIVERSIDAD DE ORIENTE

NÚCLEO BOLÍVAR
UNIDAD DE ESTUDIOS BÁSICOS
ÁREA DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE BIOANÁLISIS

PRÁCTICA Nº 1

MEDICIONES DE MUESTREO EN EL SPECTRONIC 20

INTRODUCCIÓN
Un ESPECTROFOTÓMETRO es un instrumento que permite comparar la radiación
absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto,
y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
El espectrofotómetro se caracteriza por manejar un haz de radiación electromagnética
(REM), comúnmente denominado luz, separándolo para facilitar la identificación y
cuantificación de su energía. Este haz de luz monocromática (de una longitud de onda
particular) pasa a través de la muestra y se mide la cantidad de luz absorbida por dicha
muestra. Esto permite:
a) Informar sobre la naturaleza de la sustancia de la muestra. Esto se logra midiendo la
Absorbancia a distintas longitudes de onda y graficar estos valores en función de la
longitud de onda, formando un espectrograma. Como cada sustancia tiene propiedades
espectrales únicas, distintas sustancias producen distintos espectrogramas. Esto se debe a
que cada sustancia tiene un arreglo de átomos tridimensional particular que hace que cada
sustancia tenga características únicas.
b) Cuantificar la cantidad de sustancia que interesa está presente en la muestra. La
concentración es proporcional a la Absorbancia, según la Ley de Lambert-Beer: a mayor
cantidad de moléculas presentes en la muestra, mayor será la cantidad de energía absorbida
por sus electrones.
Hoy en día existen numerosos espectrofotómetros comerciales, pero el que se va a manejar
en las prácticas es el Spectronic 20. Este instrumento debe su popularidad, en particular
como herramienta de enseñanza a sus muy adecuadas características de funcionamiento.
El Spectronic 20 emplea una fuente de luz de filamento de tungsteno, la cual funciona
mediante una fuente de alimentación estabilizada que proporciona una radiación de
intensidad constante. Después de la difracción en una sencilla red de difracción, la
radiación pasa a través de la cubeta de muestra o de referencia hacia el fototubo. La señal
eléctrica del detector amplificada, acciona un medidor con una escala calibrada en
transmitancia y absorbancia.
El instrumento está dotado de un obstructor consistente en una placa que se coloca de
forma automática entre el haz y el detector, siempre que la cubeta se retira del portacubetas,
entonces se realiza el ajuste del 0% de T. El dispositivo de control de la luz consiste en una
ranura en forma de V que puede moverse hacia adentro y hacia fuera del haz, para así
colocar el medidor al 100% de T.
El intervalo del Spectronic 20 va de 340 a 625 nm y su anchura de banda es de 20 nm.
ACTIVIDAD PRÁCTICA
Manejo del Spectronic 20:
Para medir la A o el %T de muestras en el espectrofotómetro SPECTRONIC 20 proceda
de la siguiente manera:

a.- Encienda el SPECTRONIC 20 haciendo girar el interruptor de encendido (botón

situado en el lado izquierdo del aparato) botón (a) en sentido de las manecillas del reloj.
Permita que el espectrofotómetro se caliente al menos 15 minutos antes de utilizarse con el
objeto de estabilizar la fuente y el detector, se activará la luz roja de encendido (b).

b.- Después del periodo de calentamiento, seleccione la longitud de onda deseada con el
botón de control de longitudes de onda, botón (c).

c.- Ajuste la escala del instrumento a 0% de T con el control de cero ( botón (a) en el lado
izquierdo del aparato). Asegúrese que el compartimiento de muestra esté vacío y cerrado.

d.- Llene una celda limpia con agua (u otra solución blanco, en este caso HCl 1%) y
límpiela con una toallita para quitar las gotas, polvo e impresiones digitales. Coloque la
muestra en el compartimiento de muestra (d) y haga coincidir la guía marcada en la celda
con la guía marcada en el compartimiento de la muestra. Presione firmemente la celda en el
compartimiento de muestra y cierre la tapa. Ajuste la escala del instrumento a 100% T con
el control de Transmitancia/Absorbancia (botón (e) del lado derecho del instrumento).
Retire la celda del compartimiento y deseche su contenido.

e.- Enjuague dos veces la celda con pequeños volúmenes de la solución a ser medida y
luego llénela con dicha solución, séquela con una toallita e introdúzcala en el
compartimiento de muestra (d). Alinée las guías y cierre la tapa. Lea el valor apropiado
(%T ó A) en la escala del aparato.

f.- Retire la celda del compartimiento de muestra y repita los pasos “d” y “e” para
cualquier solución restante.

g.- Cuando se halla realizado todas las mediciones apague el aparato girando el interruptor
de encendido (a) en sentido contrario de las manecillas del reloj.

Nota: Para leer correctamente la escala, haga coincidir la aguja con su imagen en el espejo.
VERIFICACIÓN DE LA CALIBRACIÓN DE LAS LONGITUDES DE ONDA
El envejecimiento de los componentes, los cambios de temperatura y el estrés mecánico
que soportan los equipos, deteriora poco a poco sus funciones. Cuando esto sucede, los
ensayos y las medidas comienzan a perder confianza y se resienten tanto el diseño como la
calidad del producto. Es, por tanto, conveniente calibrar o en su defecto, verificar los
espectrofotómetros periódicamente a fin de asegurar que diversos parámetros
instrumentales, como la escala de longitudes de onda se mantengan en valores tolerables.
La correcta calibración del equipo proporciona la seguridad de que los servicios que se
ofrecen reúnen las especificaciones requeridas. Cada vez son más numerosas las razones
que llevan a calibrar los equipos de medida, con el fin de:
• Mantener y verificar el buen funcionamiento del equipo
• Responder a los requisitos establecidos en las normas de calidad
• Garantizar la fiabilidad y reproducibilidad de las medidas.
En la calibración del SPECTRONIC 20, la sustancia que se va a utilizar es una solución
de cloruro de cobalto.
¿Por qué se usa una solución de Cloruro de Cobalto?
Los cristales cloruro de cobalto pueden variar su coloración “en comunicación” con el
grado de humedad del medio ambiente. Esto implica que los ligandos o grupos
directamente enlazados al cobalto serán diferentes.
Esto podría expresarse a través del equilibrio:

2[Co(H2O)4Cl2]⋅2H2O → Co[CoCl4] + 12 H2O

ROSADO AZUL

Los colores se explican por las transiciones de los electrones d del cobalto, el campo
cristalino octaédrico es mayor que el tetraédrico, esto significa que la absorción de energía
para el salto energético del primero es a menores longitudes de onda y el segundo a
mayores longitudes de onda. Esto la hace una buena sustancia para calibrar el Spectronic,
debido a que por su coloración se pueden estabilizar diferentes longitudes de onda.
De esta forma, es más cómodo saber que se está en la longitud de onda correcta establecida
para esta sustancia (mínimo de Transmitancia /máximo de Absorbancia tiene lugar entre los
505 y 515 nm), gracias a su propiedad de actuar como un cromógeno capaz de reaccionar
ante diferentes bandas del espectro.

ACTIVIDAD PRÁCTICA
Bajo condiciones normales de operación, el espectrofotómetro SPECTRONIC 20 debe
mantener precisa e indefinidamente su longitud de onda. Si el instrumento es objeto de
golpes fuertes u otro abuso, su comportamiento en la determinación de las longitudes de
onda puede ser verificado mediante una solución de Cobalto, para ello:

a.- En un balón aforado de un litro, coloque 200 ml de agua destilada, adicione, con mucha
precaución, 10 ml de ácido clorhídrico concentrado (HCl), complete con agua destilada
hasta la línea de aforo, así obtendrá una solución de Ácido Clorhídrico al 1 %.
b.- En un balón aforado de 1 litro, coloque de 22 a 23 gramos de Cloruro de Cobalto
(CoCl2), disuelva con la solución de Ácido Clorhídrico al 1 % y luego lleve hasta la línea
de aforo con la misma solución.

Para verificar el funcionamiento con la solución de Cobalto

a.- Encienda el instrumento, deje que se caliente durante unos 15 minutos.
b.- Seleccione la longitud de onda de 500 nm.
c.- Con el compartimiento vacío y cerrado ajuste con el control cero hasta leer cero en la
escala.
d.-Introduzca la celda llena con HCl 1% en el compartimiento de muestra y utilice el
control de Transmitancia/ Absorbancia para llevar el instrumento a 100 % T.
e.- Cure la celda con la solución de Cloruro de Cobalto.
f.- Introduzca la celda llena con la solución de Cloruro de Cobalto en el compartimiento de
muestra.
g.- Lea el % T en la escala del instrumento.

Repita los pasos desde “c” hasta “e” a λ 505, 510, 515, y 520 nm. El instrumento estará
convenientemente calibrado, cuando el mínimo de Transmitancia (máximo de Absorbancia)
tenga lugar entre los 505 y 515 nm. Los valores específicos de Transmitancia
(Absorbancia) no son importantes.
Para hacer la conversión de % T a A se emplea la siguiente expresión, correspondiente a la
Ley de Beer:
A = 2 – log10% T

Longitud de
%T A
onda, nm
500
505
510
515
520

Con estos datos, construya una gráfica de Absorbancia vs longitud de onda. (papel
milimetrado)

DETERMINACIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA ANALÍTICA

Para la determinación de la longitud de onda analítica es necesario conocer el espectro de
absorción de la sustancia, toda vez que aquella corresponde, regularmente, a la banda del
espectro donde se produce el máximo de absorción (Absorbancia), por lo que en esta parte
de la práctica Ud. determinará el espectro de absorción del K2Cr2O7 y luego procederá a
escoger la longitud de onda analítica.
Para la obtención del espectro Ud. deberá preparar un litro de una solución de K2Cr2O7 de
concentración 10-3 M, aproximadamente, en medio ácido (HCl 1 M) y medir la
Absorbancia de la misma a intervalos de 5 nm entre los 400 y 500 nm. Al finalizar
construya la gráfica (espectro) correspondiente (Absorbancia vs longitud de onda).
 DETERMINACIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA ANALÍTICA PARA EL K2Cr2O7
λ, nm %T A λ, nm %T A
400 455
405 460
410 465
415 470
420 475
425 480
430 485
435 490
440 495
445 500
450

Una vez obtenido el espectro y determinada la longitud de onda analítica Ud. deberá
preparar una serie de patrones (4) de K2Cr2O7 en medio ácido (HCl 1 M). Medir su
Absorbancia y calcular la concentración de la solución problema entregada por el
instructor.
Para determinar la concentración de una muestra problema, debe construir una curva de
calibración (A vs C) con las soluciones patrones, que es una línea recta que pasa por el
origen. Una vez obtenida la lectura de la muestra, se busca el valor de la Absorbancia en la
curva y se traza una línea hasta cortar la recta y, de aquí se prolonga hacia el eje de las
concentraciones para conseguir la concentración correspondiente a esta lectura.

Hay que advertir que una respuesta lineal no se obtiene en todo el rango de concentraciones
posibles, sino dentro de un conjunto de valores que dependen de numerosos factores,
dependientes del método de medición. En tal sentido, el método de los mínimos cuadrados
es capaz de determinar la recta que mejor describe a una serie de puntos experimentales,
además de tener un criterio para conocer lo parecido o diferentes que son esos puntos
respecto de la Ley de Beer.

Ecuación de la recta
Y = ax + b a = corte con el eje y
b = pendiente de la recta
De acuerdo con los datos de la experiencia, la ecuación de la recta viene dada por:

A = aC + b A = Absorbancia
C = Concentración (mg/dl)

Métodos de los mínimos cuadrados

a = n Σxy - ΣxΣy b = Σy(Σx2) - ΣxΣxy

nΣx2 - (Σx)2 n(Σx2) – (Σx)2

n = número de patrones

REFERENCIAS

Skoog, D. y Leary, J. (1994). Análisis Instrumental. Cuarta Edición. Editorial

McGRAW-HILL. España.

Skoog, D. y West, D. (1983). Fundamentos de Química Analítica. Segunda Edición.

Editorial Reverté. Impreso en Venezuela.

Espectofotómetro. Disponible:
www.frlp.utn.edu.ar/grupos/aepeq/equipos.pps. Consultado: 26-02-2007