Universidad Autónoma de Coahuila

Facultad de Medicina U.T.

Biología Celular y molecular

Titular. Javier Moran.

Investigación de la PCR

Laura Alicia Pérezfigueroa Olivas.

1° “B”

Torreón Coahuila, a 16 de mayo de 2008

 Introducción.
PCR
Hace más de 30 años, la introducción de la tecnología de DNA
recombinante como una herramienta para las ciencias biológicas
revolucionó el estudio de la vida. La reproducción molecular permitió el
estudio de los genes individuales de organismos vivos; sin embargo esta
técnica era dependiente en la obtención de una cantidad relativamente
grande de DNA pura. Esto dependió de la réplica de la DNA de
plásmidos o de otros vectores durante la división de célula de
microorganismos. Los investigadores lo encontraron extremadamente
laborioso y difícil de obtener una DNA específica en cantidad de la masa
de los genes presentes en una muestra biológica. La tecnología de DNA
recombinante hizo posible el primer análisis molecular y la diagnosis
prenatal de varias enfermedades humanas. La DNA fetal obtenida por el
muestreo del amniocentesis se podía analizar por la digestión de la
enzima de la restricción, el electroforesis, la transferencia meridional y
el hibridación a un gene reproducido o a las puntas de prueba del
oligonucleótido. Sin embargo, el borrar meridional permitió solamente
traz rudimentario de genes en individuos sin relación. En 1971, un
artículo publicado por Kleppe et al. en Journal of Molecular Biology
describió por primera vez un método que usaba enzimas para replicar
una secuencia pequeña de ADN con primers in vitro.8 Sin embargo, este
temprano ejemplo del principio básico de la PCR no recibió mucha
atención, y la invención de la reacción en cadena de la polimerasa en
1983 es generalmente atribuida a Kary Mullis ganó el Premio Nobel por
su trabajo en PCR.
Algo muy a tener en cuenta en la PCR es que la ADN polimerasa
que se use sea capaz de soportar las altas temperaturas de >90ºC
necesarias para la separación de las dos hebras de ADN de la doble
hélice tras cada ciclo de replicación. Las ADN polimerasas que se
utilizaron originariamente para los experimentos in vitro previos a la PCR
no eran capaces de soportar estas altas temperaturas, por lo que los
primeros procedimientos para replicar el ADN eran muy ineficientes,
largos y requerían grandes cantidades de ADN polimerasa.
El descubrimiento en 1976 de la Taq polimerasa, una polimerasa
de ADN extraída de la bacteria termófila Thermus aquaticus que habita
medios de muy alta temperatura (50-80ºC), eliminó los grandes
inconvenientes del método de la PCR. Esta ADN polimerasa es estable a
altas temperaturas, permaneciendo activa hasta después de la
desnaturalización del ADN, eliminando la necesidad de añadir a la
reacción nueva polimerasa tras cada ciclo. Este descubrimiento permitió
automatizar el proceso, antes tan tedioso, acoplándolo al uso del
termociclador.
Al mismo tiempo que desarrollaba la PCR en 1983, Mullis trabajaba
en Emeryville, California (EE UU), para una de las primeras empresas
biotecnológicas, Cetus Corporation, donde era responsable de sintetizar
cadenas cortas de ADN. Mullis afirma que concibió la idea para la PCR
una noche mientras cruzaba la Autopista de la Costa Pacífica (EE UU) en
su coche.9 Estaba imaginando una nueva forma de analizar mutaciones
en el ADN cuando se percató de que, en lugar de eso, había inventado
un método para amplificar regiones específicas de ADN mediente ciclos
de duplicación repetidos usando ADN polimerasas. Mullis atribuye la
invención de esta técnica a los efectos de la droga psicodélica y
alucinógena LSD
En la revista Scientific American, Mullis resumió el procedimiento:
"Comenzando con una única molécula del material genético ADN, la PCR
puede generar 100 billones de moléculas iguales en una tarde. La
reacción es fácil de hacer, no requiere más que un tubo de pruebas,
unos pocos reactivos simples y una fuente de calor."Fue premiado con el
Premio Nobel de Química en 1993 por su invención, y siete años
después, él y sus colegas del Cetus llevaron a la práctica su propuesta.
Sin embargo, han aparecido controversias y diferentes versiones sobre
las contribuciones intelectuales y prácticas de otros científicos al trabajo
de Mullis, y sobre si él fue el inventor único del principio de la PCR.

La PCR fue desarrollada por Kary B. Mullis en 1983, y ha

revolucionado la aplicación de la genética molecular, lo que provocó que
fuese proclamada por la revista Science como el mayor hallazgo
científico del año 1989. La PCR es una técnica in vitro usada para
amplificar enzimáticamente una región específica del ADN, con el
empleo de cebadores específicos complementarios a dicha secuencia
(López, 1999). La estrategia para secuenciar un genoma completo
conlleva a la fabricación de librerías genéticas. El proceso se facilita
cuando se quiere aislar un gen y se conocen al menos algunas partes de
él (por ejemplo la secuencia amino o carboxilo de la proteína para la que
codifica), lo cual reduce el número de copias de segmentos de ADN que
deben ser amplificados utilizando la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR del inglés). Esta reacción fue utilizada por primera vez
por Kary Mullis en 1983. El ADN amplificado puede ser clonado
directamente o usado en una gran variedad de procedimientos analíticos
(ej. southern blot)
El PCR es en si un técnica muy simple: dos oligonucleotidos son
sintetizados cada uno como secuencia complementaria de una hebra
opuesta (secuencia de un segmento en cada una de las hebras) del ADN
blanco en posiciones que estén mas allá de aquellas donde termina el
segmento a ser amplificado. Los oligonucleotidos sirven como cebadores
con sus extremos 3' orientados en direcciones opuestas.
El ADN aislado que contiene el segmento a ser amplificado es
calentado levemente para ser desnaturalizado (separado en hebras
sencillas), después se enfría en presencia de grandes cantidades de los
oligonucleotidos sintéticos, lo que permite que por hibridización, se
encuentren las secuencias complementarias. En este momento se
agregan los cuatro desoxiribonucleotidos trifosfato y el segmento
hibridizado sirve como cebador para iniciar la amplificación. El proceso
de calentamiento y enfriamiento se lleva a cabo unas 25-30 veces en
algunas horas en un aparato que lo hace automáticamente, hasta que el
fragmento puede ser analizado o clonado.
Los segmentos son amplificados utilizando una ADN polimerasa
resistente a los cambios de temperatura como la TaqI polimerasa
(aislada de una bacteria hipertermófila). Si se diseñan con cuidado los
cebadores de tal forma que contengan sitios de corte para
endonucleasas, se puede facilitar mucho la clonación del ADN
amplificado.

Con esta técnica se han podido amplificar segmentos de ADN de

40,000 años de antigüedad como momias humanas y animales extintos
como el mamut, lo que ha dado origen a la arqueología molecular y a la
paleontología molecular. Se utiliza mucho esta técnica para rastrear el
origen de los virus humanos y en estudios forenses (southern blot).
Esta técnica brinda innumerables ventajas, las cuales han
permitido su empleo en diversas investigaciones, como son su
capacidad de multiplicar la porción del ADN buscada en el orden de 106-
9copias lo que le confieren su altísima sensibilidad; la utilización de
cebadores que reconocen una secuencia única elegida, propia de cada
microorganismo, le confieren su gran especificidad; su rapidez
comparada con algunas técnicas tradicionales, es otra ventaja para
destacar; la característica de detectar "presencia de ADN" en vez de
"viabilidad de microorganismos" permite su utilización con una gran
variedad de muestras. Al mismo tiempo a pesar de sus grandes ventajas
podemos ver que existe gran probabilidad de obtener resultados falsos
positivos por contaminación con productos de amplificaciones anteriores
(amplicones) lo que hace necesario realizar una cuidadosa evaluación de
sus resultados y además se debe destacar la falta de estandarización de
las técnicas home made (Técnicas moleculares en la práctica diaria,
1999), aunque recientemente la mayoría de los laboratorios que
emplean este procedimiento realizan su estandarización con el propósito
de obtener resultados confiables.
La PCR está revolucionando el diagnóstico de numerosas
enfermedades infecciosas, particularmente aquellas causadas por
organismos difíciles de cultivar y además se ha convertido en una
herramienta esencial a emplear en diversos procedimientos comunes
como el clonaje de fragmentos específicos de ADN, para la detección e
identificación de genes en el diagnóstico y la medicina forense,
detección de mutaciones, diagnóstico de enfermedades hereditarias o
determinación del sexo del feto previamente a su implantación en
procesos de fecundación in vitro y en investigaciones relacionadas con
marcadores de paternidad (Najar y Mirdamadi, 2005).
 Un ensayo estandarizado es un método que brinda
constantemente el mismo resultado para una muestra dada cuando se
ha repetido varias veces y realizado por diversos analistas, en diferentes
laboratorios (Practical Molecular Biology, 2003; Manual OIE, 2004).
Para estandarizar un ensayoanalítico, primeramente es necesario
demostrar y comprobar si el método es útil o no para el fin que fue
diseñado, utilizando para ello material de referencia, que permita
obtener resultados confiables (Binder, 1997c; Manual OIE, 2004).
El desarrollo y estandarización de un sistemade PCR incluye
optimizar toda una serie de parámetros críticos de los cuales depende
este método y determinar parámetros imprescindibles que permita
plantear que el sistema diseñado es confiable (Binder, 1997h; Practical
Molecular Biology, 2003).

• Selección de las concentraciones óptimas de reactivos,

parámetros del protocolo y equipamiento
La típica reacción de amplificación incluye la secuencia blanco, la
enzima ADN polimerasa, dos oligonucleótidos, desoxinucleótidos
trifosfatos (dNTPs), cloruro de magnesio (MgCl2), el buffer de reacción y
aditivos opcionales, que todos son mezclados y colocados en un
termociclador automático que realiza los ciclos en los tiempos y
temperaturas programadas de forma exacta (Henegariu, 2000b;
Promega Technical Bulletin, 2005). Todos estos parámetros son
necesarios optimizar para lograr un correcto funcionamiento del
sistema.

• ADN molde
La correcta amplificación de la región de interés es dependiente
de la cantidad y calidad del ADN molde. Los reactivos que se emplean
normalmente para purificar los ácidos nucleicos (sales, guanidinio,
proteasas, duodecil sulfato de sodio (SDS) y solventes orgánicos) son
inhibidores potentes de las ADN polimerasas (Promega Technical
Bulletin, 2005).
Existen una serie de reglas sencillas para que el ADN molde no sea
un problema en la reacción: (1) se debe garantizar su integridad, es
decir no puede estar fragmentado en trozos más pequeños del que se
desea amplificar, (2) la muestra no debe llevar agentes quelantes
(EDTA) que reducen la concentración de iones Mg2+ en la solución
(Barbeyrac y col., 1996) y (3) no debe haber determinados factores
sanguíneos, fenol, detergentes que pueden inhibir la actividad de la
polimerasa (Practical Molecular Biology, 2003).
Si se desea amplificar un gen de simple copia se emplean
cantidades entre los 100 y 500 ng. En el caso de la amplificación de
genes repetidos se puede reducir la cantidad a emplear entre los 10 y
50 ng. El mínimo oscila entre 10 y 100 ng y el máximo entre 400 y 500
ng.
Polimerasas de PCR

Eligiendo la polimerasa derecha de la DNA es determinado por las

punterías del experimento. Hay una cantidad extensa de anzymes
comercialmente disponibles a elegir de ese diferencia en su processivity,
estabilidad termal y fidelidad. La enzima más común usada es
polimerasa de la DNA de Taq también conocida tan comercialmente
como, polimerasa® de la DNA de AmpliTaq.
• Polimerasas utilizadas en PCR:
Polimerasa de la DNA De AmpliTaq
La polimerasa de la DNA de AmpliTaq es una enzima recombinant
altamente caracterizada para PCR. Producido en E. coli del gene de la
polimerasa de la DNA de Taq, así asegurando gran pureza. Se provee y
se utiliza comúnmente como 5 uμL solución en glicerol protegido del
50% (v/v).
Properities Físico: La enzima es una proteína del kDa 94 con una
actividad’de la polimerización’ 5 -3 que sea la más eficiente de la gama–
de 70° 80°C. Es increíblemente termoestable, con un período en 95°C de
35–40 minutos. En términos de completar un ciclo termal, el período es
aproximadamente 100 ciclos. Los productos de PCR que usan esta
enzima tendrán solas proyecciones bajas en los 3’ extremos de cada
filamento polimerizado (esto se puede explotar para el uso con vectores
de la reproducción de T/A).
Bio Reacciones: La polimerasa de la DNA requiere el ion del
magnesio como cofactor y cataliza la reacción de la extensión de una
plantilla preparada en 72°C. Los cuatro dNTPs se utilizan para ampliar la
cartilla y therby para copiar la secuencia de la blanco. Los nucleotides
también modificados se pueden incorporar en productos de PCR.
Actividades: Esta enzima tiene a bifurcacio'n-como el dependiente
de la estructura, polimerización realzada, actividad’del nuclease’ 5 -3. La
actividad que posee la permite que el ti degrada las cartillas enes
sentido descendiente e indicó que las blancos del circuka se deben
linearizar antes de la amplificación. También esta actividad del nuclease
se ha empleado en una técnica de señal-generacio'n fluorescente para
la cuantificación de PCR. Esta enzima no tiene un exonuclease
inherente’3’ -5 ni actividad el corregir, sino produce amplicons de la alta
producción para la mayoría de los usos.
Polimerasa Del Oro De AmpliTaq
Esta enzima es una polimerasa químicamente modificada de la
DNA de AmpliTaq, las subsistencias reversibles de la modificación la
enzima inactiva en la temperatura ambiente. El pH de alta temperatura
y bajo promueve la revocación, restaurando la actividad enzimática.
Estas condiciones ocurren en un PCR Tris-protegido en 92°–95°C (el Tris-
tris-Cl formulado a pH 8.3 en 25°C cae debajo de pH 7.0 90°C
antedicho). El oro de AmpliTaq se formula para realizar igual que 5 uμL
polimerasa de la DNA de AmpliTaq. Por lo tanto, un comienzo caliente se
puede agregar a la mayoría del PCRs optimizado con la polimerasa de la
DNA de AmpliTaq substituyendo el oro de AmpliTaq y agregando
10minuto, 95°C, pre-PCR, paso de la activación.
Los mismos resultados se pueden alcanzar sin el paso de la
activación de pre-PCR agregando 10 adicionales o más ciclos de PCR.
Bajo estas condiciones, la enzima se activa incremental durante los
pasos de la desnaturalización de PCR.

PCR-TR
PCR en tiempo real (PCR-TR) es un tipo de PCR cuantitativo que
mida la cantidad de DNA o de mRNA en una muestra, de una población
de células (cultura del tejido fino o de célula), o iguala recientemente de
una célula. El tiempo real se utiliza comúnmente para determinar la
expresión del mRNA de un gene, y su expresión nivela (número de la
copia del mRNA) durante ciertas condiciones (tales como tratar las
células con una droga). PCR en tiempo real se puede utilizar para
comparar muestras normales (del control) a las muestras de la
enfermedad, dando una idea en cuanto a los cambios de la expresión
que ocurren con patogenesia. PCR en tiempo real debido a su
sensibilidad también se utiliza en la detección de patógeno en la sangre
tal como virus.
El desarrollo de PCR cuantitativo en tiempo real ha eliminado la
variabilidad asociada tradicionalmente a PCR cuantitativo, así el permitir
cuantificación rutinaria y confiable de los productos de PCR. Ésta técnica
tiene distinas ventajas, cada tipo express es de la célula un sistema de
moléculas del mRNA, conocido como transcriptome. En respuesta a
estímulos, las células pueden para arriba-regular o abajo-regular
factores tales como enzimas de la proteína dentro de la célula regulando
los niveles del mRNA de estos factores. los niveles del mRNA no se
correlacionan siempre con los niveles de la proteína así que una cierta
precaución es necesaria, no obstante los niveles del mRNA corresponden
generalmente libremente a los niveles de la proteína. Medir los niveles
del mRNA de ciertos factores dentro de una célula que usa el PCR en
tiempo real es un método que dará pistas las cantidades de estos
factores o proteínas.
Tradicionalmente, los niveles del mRNA dentro de la célula fueron
medidos usando borrar norteño. Esta técnica se mira como oro-estandar
en la medida de los niveles del gene expression/mRNA mientras que
utiliza la punta de prueba radiactiva para etiquetar el RNA, que entonces
se cuantifica usando un centelleo contrario dando lecturas muy exactas.
El borrar norteño aunque muy es exacto tenía varias desventajas
incluyendo el uso de la radiactividad. El borrar norteño requirió la
medida exacta del mRNA y el RNA total de las células extrajo para
comparar muestras. Esto era un problema porque aunque los métodos
de detección eran muy exactos, el error se podría introducir en borrar
norteño (o el RNA dot/slot que borra) con diferencias en niveles totales
de RNA/mRNA entre las muestras (tratamientos de la célula del IE,
diversos tejidos finos, diversos animales, etc.). También requirió las
cantidades relativamente grandes de RNA que requirieron una gran
cantidad de células. Recientemente, la cuantificación del gene del mRNA
o los métodos en tiempo real del pcr se ha mejorado y es más fáciles de
realizarse y no requiere el uso de la radiactividad. Los investigadores
tienen a menudo solamente acceso a las cantidades pequeñas de
células especialmente en los campos de la investigación de la célula de
vástago y de la investigación de la célula primaria, y el pcr en tiempo
real ha permitido cuantificar niveles del mRNA de uniforme muy una
pequeña cantidad de células y últimamente incluso células. Sin
embargo, esta sensibilidad extrema de los métodos en tiempo real del
pcr hace vital proteger sus muestras contra la contaminación, que
conduciría a los resultados falsos. Los métodos y los sistemas en tiempo
real actuales del pcr también no requieren la medida de las
concentraciones del mRNA o de la muestra de la DNA antes de que se
conduzca el pcr en tiempo real.
Higuchi et al.1,2 iniciaron el análisis de la cinética de PCR
construyendo un sistema que detecta productos de PCR como
acumulan. Este “sistema” en tiempo real incluye el bromuro de ethidium
del intercalator en cada reacción de la amplificación,
un cycler termal adaptado para irradiar las muestras con la luz
ultravioleta, y detección de la fluorescencia que resulta
con una cámara fotográfica refrescada controlada por ordenador del
CCD. La amplificación produce cantidades de aumento de double-
stranded
DNA, que ata el bromuro de ethidium, dando por resultado un aumento
en fluorescencia. Trazando el aumento en fluorescencia
contra número del ciclo, el sistema produce los diagramas de la
amplificación que proporcionan un cuadro más completo del
PCR procesan que la acumulación de prueba del producto después de un
número fijo de ciclos.

PCR ANIDADA (NESTED)

Es una variante de la PCR convencional que comprende dos
rondas de amplificación con distintos pares de iniciadores o primers en
cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad de detección. Primero
se realiza una reacción con los iniciadores externos para amplificar una
región de ADN mas extensa, que contiene el segmento diana. Después,
con este producto de amplificación, se ejecuta una segunda PCR con los
iniciadores internos para amplificar la región específica.

APLICACIÓN EN MEDICINA

En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como

herramienta de diagnosis(Coleman y Tsongalis, 2006):
 Permite el genotipar la especie o especies que provocan un
determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del
genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas características
de tamaño o temperatura de fusión que permitan identificarlo de
forma inequívoca. En el caso de infecciones virales que implican la
integración del genoma del patógeno en el ADN del hospedador,
como es el de la infección por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la
determinación de la carga viral existente y por tanto, del estadio de
la enfermedad.4
 La PCR también se puede usar en revisiones médicas
rutinarias, como en los servicios de donantes de sangre, para test de
rutina. A través de esta técnica se pueden detectar infecciones
peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras aún están
en el periodo de incubación. Dada la sensibilidad de los test de PCR
se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96
pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da
positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente
menores hasta que se encuentra el causante.
 El diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el
genoma es un proceso largo y complicado que puede acortarse
significativamente gracias a la PCR. Cada uno de los genes prueba se
pueden amplificar mediante sus correspondientes primers y
posteriormente secuenciar para detectar la existencia de mutaciones.
La PCR ha permitido el desarrollo de nuevas estrategias de
diagnóstico en numerosos campos de la medicina. Por ejemplo,
existen métodos de detección por PCR de agentes infecciosos
como los virus de las hepatitis B y C, del papiloma humano, de
Epstein Barr y citomegálico. En relación con el SIDA es posible
detectar regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia
humana (HIV) amplificadas por PCR a partir de sangre extraída de
pacientes seropositivos. Esta técnica puede ayudar a resolver
resultados inciertos provenientes de las pruebas habituales y ha
sido aplicada en el diagnóstico de la infección en recién nacidos de
madres seropositivas. En tales casos, el uso de la técnica PCR
evita el problema que se plantea por el hecho de que la presencia
de anticuerpos recibidos de la madre impide saber, hasta que
éstos desaparecen aproximadamente un año después del
nacimiento, si el propio organismo del niño ha generado
anticuerpos porque se encuentra infectado. Pueden detectarse
también otros microrganismos patógenos como las clamidias, la
bacteria Escherichia coli enterotoxigénica, el vibrión del cólera y
los tripanosomas.
La técnica PCR ha facilitado enormemente el diagnóstico de
enfermedades hereditarias como hemoglobinopatías (talasemias y
anemia falciforme), la fenilcetonuria, las hemofilias A y B, la
deficiencia de alfa 1 antitripsina, la distrofia muscular y la fibrosis
quística. Esta última es la más común de las enfermedades
autosómicas recesivas severas que afectan a la población blanca.
El aislamiento del gen afectado ha permitido identificar las
mutaciones que causarían esta patología. La anulación de tres
bases que provocan la ausencia del aminoácido fenilalanina N°
508 en la proteína que es producto del gen de la fibrosis quística
constituye la mutación -llamada DF508- más frecuente en
caucásicos (60% de los afectados en la población argentina), por
lo que su análisis resulta ser el primer paso destinado tanto a la
detección de portadores sanos como a la confirmación del
diagnóstico en individuos afectados y al diagnóstico prenatal. La
figura 3 muestra el ensayo de PCR utilizado para detectar la
mutación DF508: se replica un segmento del gen de la fibrosis
quística que comprende la zona que codifica para la fenilalanina
508. Los productos de la PCR son inmovilizados por duplicado en
forma de manchas en dos filtros de nitrocelulosa (dot blot). Uno de
los filtros es hibridado con una sonda (un oligonucleótido) marcada
que se corresponde con el gen normal, mientras que el otro es
hibridado con una sonda correspondiente al gen mutado. Las
hibridaciones se realizan en condiciones experimentales
destinadas a garantizar que la sonda normal sólo se apareará con
el ADN normal amplificado y que la sonda mutada sólo lo hará con
el ADN mutado amplificado. De esta manera, el análisis de las
rnanchas de hibridación reveladas en la autorradiografía permitirá
reconstruir el genotipo de los pacientes.
En enfermedades oncológicas pueden detectarse, mediante
la técnica PCR, mutaciones de oncogenes (literalmente "genes
inductores de cáncer") como en el caso del oncogén ras en
carcinomas de colon, de páncreas y en leucemias mieloides; del
"antioncogén" de retinoblastma, o del llamado cromosoma
Philadelphia. Este cromosoma aparece en pacientes con leucemia
mieloide crónica y es el resultado de la translocación de una
porción del gen bcr desde el cromosoma 22 al 9, donde se ubica
junto al oncogén c-abl. La consiguiente activación de este último,
que codifica para una enzima denominada tirosina quinasa, parece
ser el desencadenante de la enfermedad. La técnica PCR es
especialmente útil, en este caso, para detectar la presencia de
ARN mensajero híbrido bcr/abl. El ARN es analizado mediante la ya
mencionada técnica RT-PCR, con primers específicos que revelan
la presencia de mensajeros normales o híbridos. En pacientes
sometidos a quimioterapia, la gran sensibilidad del método lo hace
ideal para identificar poblaciones residuales de células cancerosas
no detectables mediante técnicas convencionales, de manera tal
que permite diagnosticar tempranamente un nuevo avance de la
enfermedad.
Se han implementado métodos que utilizan la PCR
destinados a la evaluación del riesgo de padecer trastornos
autoinmunes (perturbaciones debidas a agresiones "erróneas"
realizadas por las defensas inmunitarias a órganos del propio
paciente), tales como diabetes de tipo I, enfermedad celíaca,
pénfigo vulgaris, miastenia gravis y esclerosis múltiple.
Consideremos brevemente algunas situaciones vinculadas con los
genes del llamado complejo mayor de histocompatibilidad (HLA),
los cuales codifican para una serie de glicoproteínas de la
membrana celular que participan en la iniciación de la respuesta
inmunitaria. Cada uno de estos genes presenta numerosas
variantes (alelos) en la población. Se sabe que la presencia de
algunos de esos alelos en un individuo está asociada a la aparición
de ciertas enfermedades autoinmunes. La reciente determinación
de la secuencia de nucleótidos de varios alelos HLA permitió el
diseño de nuevas estrategias de tipificación molecular de los
genes HLA basadas en la amplificación por PCR y en la posterior
hibridación con sondas constituidas por oligonucleótidos de
secuencia específica que reconocen las variantes de alelos
llamadas de riesgo. En colaboración con M. Herrera, M. Pando, V.
Bernath y R. Gutman hemos desarrollado recientemente pruebas
de tipificación por PCR de los alelos HLA que han indicado la
existencia de susceptibilidad genética en relación con la
enfermedad celíaca y la diabetes tipo I (insulinodependiente). En
individuos blancos argentinos, determinados alelos HLA-DQ
confieren treinta veces más riesgo de padecer estas patologías y
su detección en familiares de afectados permite adoptar
conductas terapéuticas tempranas.

LAS FUENTES QUE APORTAN EL ADN MOLDE

La fuente de la cual procederá el ácido nucleico que se ha de
utilizar como molde depende de cada caso: en patologías
infecciosas se procesa el tejido donde se desea detectar el agente;
en patologías oncológicas se estudian biopsias del tumor; para el
diagnóstico prenatal de enfermedades hereditarias se analizan
células del líquido amniótico o vellosidades coriónicas junto con el
ADN de leucocitos de los padres; para analizar ciertas
características genéticas propias de cada individuo (por ejemplo,
determinados alelos HLA, portadores heterocigotas sanos de
enfermedades hereditarias recesivas) es útil cualquier célula con
núcleo del organismo, empleándose habitualmente sangre
periférica debido a su fácil obtención. Cabe señalar que la reacción
también se ha realizado con éxito sobre ADN parcialmente
degradado, extraído de tejidos fijados en formol e incluidos en
parafina. Esto no sólo facilita la obtención de muestras de piezas
quirúrgicas, sino que permite realizar estudios retrospectivos
sobre preparados histológicos de archivo. También es posible
extraer ADN de huesos, amplificarlo mediante la técnica PCR y
analizarlo con fines tan diversos como la identificación de
cadáveres o la determinación de los defectos genéticos que
padecían nuestros antcpasados remotos.
PROBLEMAS DE LA TÉCNICA PCR
Uno de los problemas más evidentes que presenta esta
técnica, sobre todo cuando se la utiliza cono herramienta de
diagnóstico, es la posible generación de resultados falsamente
positivos. Podría llegar a indicar, por ejemplo, la presencia de
secuencias virales en personas no infectadas. Esto es
consecuencia de la extrema sensibilidad del método. Los falsos
positivos pueden generarse por contaminación de una muestra a
partir de una única molécula de ADN proveniente de otra muestra.
Esta molécula será amplificada en la PCR y aparecerá como una
banda en el caso de electroforesis en gel o como una respuesta
positiva en una hibridación con una sonda radiactiva. La causa
más frecuente de falsos positivos es el "arrastre" de secuencias de
ADN amplificadas en reacciones previas. Tales secuencias pueden
estar presentes en los equipos de laboratorio y en los reactivos,
pudiendo esparcirse por medio de aerosoles. Frente a esto, los
expertos recomiendan la realización de controles negativos
múltiples (reacciones de amplificación con todos los reactivos,
excepto el ADN molde), además del uso de técnicas de esterilidad
y de micropipetas que eviten la generación de aerosoles como
precaución para preveni la contaminación de las muestras.

TECNICA PCR: NUEVOS AVANCES

La PCR se ha sumado a la lista de desarrollos tecnológicos
originados en el ámbito industrial que provocaron cambios
cualitativos en las ciencias básicas. Uno de los proyectos más
ambiciosos de la biología moderna es la determinación de la
secuencia completa del genoma humano. Esto permitirá no sólo
identificar los genes responsables de numerosas enfermedades
hereditarias y trastornos metabólicos, sino descubrir nuevos genes
y sus funciones celulares relacionadas. Un paso indispensable para
concretar dicho objetivo consiste en realizar un "mapeo" del
genoma, es decir, una especie de carta geográfica que permita
ubicar los genes con cierta precisión a lo largo de los cromosomas.
La PCR se ha revelado corno una de las técnicas de apoyo
fundamental en tal empresa. Así por ejemplo. un grupo de
investigadores de la pujante compañía francesa Genethon ha
logrado diseñar recientemente corea de 1.000 pares de primers
que han permitido "mapear" aproximadamente el 90 % del
genoma humano.
En otro orden, el uso de la PCR puede llegar a cambiar
aspectos de la vida del hombre tales como la planificación del
sexo de los hijos. En forma piloto, ya se ha utilizado PCR para
determinación prenatal del sexo después de fertilización in vitro.
Con la ayuda de un micromanipulador es posible remover una
única célula de un embrión de 10 células, sin afectar el normal
desarrollo de las restantes. A partir del ADN de la célula aislada, y
en menos de 24 horas, una PCR de 60 ciclos, realizada con
primers que reconocen secuencias exclusivas del cromosoma Y
(ausente en las mujeres) permite diagnosticar el sexo del embrión,
para luego implantarlo en la madre. Este procedimiento ha sido
utilizado clínicamente para familias con riesgo de padecer
enfermedades hereditarias que se manifiestan casi
exclusivamente en los varones, con el fin de seleccionar
embriones hembra para la implantación. La extensión de este
procedimiento a familias sin antecedentes de enfermedades
hereditarias, con el simple objetivo de "elegir" el sexo del niño, es
sin duda una cuestión ética sumamente polémica.
A través de las ciencias básicas, el uso de la PCR se ha
diversificado y han surgido variantes del diseño original cuya
descripción excede los propósitos de este artículo. Quizá la prueba
más contundente de la trascendencia del invento y de su futura
expansión sea la venta de su patente por aproximadamente 300
millones de dólares a la poderosa multinacional Hoffmann-La
Roche.


BIBLIOGRAFIA

http://www.cienciahoy.org.ar/hoy23/reaccion1.htm
es.wikipedia.org/wiki/Amplificación_genética
www.espanol.pcrlinks.com/variantes/real-time_pcr.htm}
laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/pcr.html
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