FORMULAÇÃO, DETERMINAÇÃO DA DOSE LETAL (DL50) E

ENSAIO ECOTOXICOLÓGICO DO BIOINSETICIDA BTI

G. A. A. FISCHER1, P. VENTURA1, M. da SILVA1 e O. SOUZA1

1
Universidade da Região de Joinville - UNIVILLE
e-mail: osouza@univille.br

RESUMO – O bioinseticida Bti é comercializado em larga escala, com diferentes

formulações, para o controle de várias espécies de mosquitos, entre os quais os do gênero
Aedes e Simulium. Neste trabalho foram avaliados os efeitos do uso de diferentes aditivos
de formulação sobre a potencialidade biocida do produto (DL50), e sobre a sua toxidez ao
meio ambiente onde deverá ser aplicado (CEC). Os aditivos testados foram lecitina de soja,
cafeína, éster de sorbitol e dióxido de zinco. A quantificação do efeito de cada variável
sobre DL50 e CEC foi realizada através do planejamento fatorial 24. Resultados
preliminares mostraram efeito significativo (p<0,05) para lecitina e cafeína sobre a DL50
(DL50,mín = 0,58mg/L). Em termos de CEC, análises realizadas apenas para os produtos
comerciais Vectobac e Teknar e para o produto fermentado não-formulado, foi observado
CEC de 0,1 g/L para os dois primeiros e 1,0 g/L para o último.

PALAVRAS-CHAVE: bioinseticida, DL50, ecotoxicidade, formulação.

1. INTRODUÇÃO da bactéria Bacillus thuringiensis var.

Desde a década de 70, houve um
contínuo aumento do interesse no uso de
bioinseticidas para o controle de vários
insetos-pragas em virtude da conscientização
da sociedade sobre a preservação ambiental.
Os bioinseticidas à base de bactérias,
principalmente às do gênero Bacillus, têm
sido muito empregados no combate de pragas
agrícolas e no controle de mosquitos,
principalmente os das espécies Aedes aegypti
(Andrade e Modolo, 1991) e Simulium
pertinax (Araújo-Coutinho et al, 2003).
No início da década de 90, o
bioinseticida tornou-se conhecido
mundialmente e é utilizado como principal
produto para o controle de simulídeos. Sua
produção industrial é feita através do cultivo
israelensis em processo fermentativo
submerso. A toxidez do Bti para dípteros
ocorre devido ao cristal protéico delta-
endotoxina formado durante a fase de
esporulação da bactéria cultivada em
processos controlados. Esses cristais são
formados por protoxinas que, após a ingestão
pelas larvas do inseto, são solubilizados pelo
pH alcalino do trato intestinal, destruindo as
paredes do seu intestino e causando a morte
por inanição ou septicemia. Num estudo
realizado por Lacey (1986), foi verificado que
ao ocorrer a lise das células intestinais das
larvas do mosquito, a morte pode ocorrer em
seis minutos, quando concentrações elevadas
da toxina são empregadas, ou até em 24
horas, no caso de emprego de baixas
concentrações.
 Segundo Joung e Cótê (2000),
Bacillus thuringiensis (Bt) pode entrar na
água (córregos, rios, lagos, mares) através da
aplicação direta na superfície da água,
carregamento de outros locais pela chuva ou
fezes de animais que ingeriram a bactéria. A
qualidade da água não é diretamente afetada
pela bactéria. Para saber o grau de toxicidade
que essas substâncias causam, principalmente,
no ambiente aquático, tem sido realizados
nessas últimas décadas testes de toxicidade
com organismos de águas continentais,
estuarinas e marinhas, tanto em laboratório
como em campo (CETESB, 2007). Essa
ciência permite identificar os danos causados
nos diversos ecossistemas após a pesquisas com este tipo de bioinseticida
contaminação e também prever impactos que
venham a ocorrer no futuro (Zagatto, 2006).
Como o habitat natural do borrachudo
(Simulium pertinax) são rios e córregos de
águas limpas, a aplicação excessiva dos
bioinseticidas pode causar sérios danos ao
ambiente aquático. Devido a esta crescente
preocupação, tem sido proposta a realização
de diferentes testes ecotoxicológicos para a
determinação do grau de toxicidade de
diferentes tipos de substâncias no meio.
Vários autores, citados por Domingues e
Bertoletti (2006), sugerem para testes de
toxicidade o uso de no mínimo três espécies
de organismos, cada um deles representante
de um nível trópico dos diferentes
ecossistemas aquáticos: uma alga,
representante dos produtores, um crustáceo,
representante dos consumidores primários
e/ou secundários; e um peixe, representante
dos consumidores secundários e/ou terciários.
O baixo efeito tóxico do bioinseticida Bti
sobre os consumidores terciários já é bem
conhecido. Segundo Silva (2007), diversos
testes com invertebrados, peixes e mamíferos
tem apresentado muito pouco ou nenhum
efeito direto do bacilo sobre estes
organismos, mostrando-se um agente de
grande segurança ambiental. Porém, em
relação aos organismos produtores (algas,
vegetais, bactérias autótrofas) nenhum
trabalho avaliando o efeito do produto foi
encontrado na literatura disponível.
Na região de Joinville, SC, a
prefeitura vem realizando sistematicamente o
controle biológico do borrachudo (Simulium
pertinax) desde o final da década de 80. O
controle através de bioinseticida Bti que
atualmente é importado gera elevados custos
ao município.
Desde 2003, a Universidade da
Região de Joinville vem desenvolvendo
visando à obtenção de um produto de alta
toxicidade contra o inseto alvo e de menor
custo de aquisição para prefeitura. Nos
trabalhos anteriores foram definidos os
parâmetros cinéticos e as formas ideais de
condução do processo fermentativo bem
como estabelecidas as metodologias analíticas
para determinação da potencialidade do
produto como bioinseticida.
O objetivo deste trabalho foi avaliar
os efeitos do uso de diferentes formulações
aplicados ao extrato fermentado de Bti
(processo submerso, semicontínuo) sobre a
potencialidade do produto, expressos em
termos da dose letal (DL50) e da concentração
crítica de ecotoxicidade (CEC). Define-se aqui
a potencialidade como sendo a relação entre
CEC e DL50. Consequentemente buscou-se
com a formulação o incremento deste
parâmetro.
2. METODOLOGIA
2.1 Bioinseticidas
O bioinseticida Bti foi produzido
através de cultivo submerso realizado
anteriormente de acordo com a metodologia
proposta por Silva (2007). Este bioinseticida
foi avaliado quanto à DL50 e CEC.
O caldo fermentado contendo o bioinseticida
Bti foi centrifugado, 3800 rpm durante 30
min. (Refrigerated Centrifuge Excelsa® 4,
MOD 280R empregando rotor 12166). Com
este procedimento o volume do caldo
fermentado foi reduzido quatro vezes. O pH
foi ajustado em 5,5 com a adição de ácido
cítrico que também funciona como um agente
antioxidante. Em seguida, foram
acrescentados ao centrifugado os aditivos de
formulação.
Além do bioinseticida produzido em
cultivo submerso, foram avaliados em termos
de DL50 e CEC os produtos comerciais
Vectobac AS e Teknar HP-D.
2.2. Formulação do bioinseticida
Os aditivos avaliados foram: óxido de
zinco (1), éster de sorbitol (2), lecitina de soja
(3) e cafeína (4). 1, 2 e 3 com propriedades
dispersantes e 4 como um potencializador da
atividade larvicida. Os experimentos foram
desenvolvidos de acordo com o planejamento
fatorial 24 completo seguindo metodologia
descritas por Box et al. (1978) e Barros Neto
et al. (1996). As concentrações mínimas (-) e
máximas (+) de cada aditivo empregado nas
formulações, denominados de fatores do
projeto fatorial, foram de 1,0 e 10,0; 10,0 e
50,0; 50,0 e 100,0; 0,1 e 0,5 mg/mL,
respectivamente. Todos os produtos, após
formulação, foram submetidos a teste de
bioensaio.
2.3 Bioensaios
Os bioensaios foram realizados com
larvas de 4º ínstar inicial do mosquito Aedes
albopictus. Os ovos desse inseto foram
cedidos pelo Laboratório de Parasitologia da
UFSC. O método utilizado para os bioensaios
foi baseado no método proposto por Draft
(1999) descrito em Guideline Specifications
for Bacterial Larvicides for Public Healt Use.
Através do programa estatístico Probit
determinou-se a concentração letal do
produto para matar 50% da população larval
empregada em cada análise (DL50).
2.4. Ensaio Ecotoxicológico
Para os testes de ecotoxicidade foi
utilizado o procedimento recomendado pela
CETESB (2007). Os indivíduos jovens do
organismo-teste Daphinia similis foram
expostos a diferentes concentrações da
substância teste por um período de 48 horas.
As condições do teste foram: temperatura:
20°C; ausência de luz e alimentação;
recipiente: tubo de ensaio de vidro; quatro
réplicas com 10 organismos em cada; sem
aeração. O efeito observado foi à imobilidade
dos organismos. A CEC (concentração crítica
de ecotoxicidade) foi determinada através de
métodos estatísticos (programa Toxstat). Os
organismos utilizados nos testes foram
cultivados no laboratório de ecotoxicologia
da Univille.
Os bioinseticidas avaliados em termos
de DL50 e CEC foram os produtos comerciais
Vectobac AS e Teknar HP-D e os
bioinseticidas obtidos neste trabalho (caldo
não-concentrado, caldo concentrado, produto
formulado).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Tabela 1 apresenta o planejamento
experimental realizado com os aditivos
avaliados (1=ZnO, 2=éster, 3=lecitina,
4=cafeína) e os respectivos valores de DL50
expressos em mg/L.
 (formulação), o menor valor de DL50
Tabela 1 – Variáveis de resposta do alcançado foi da ordem de 0,74 mg/L, ou
planejamento fatorial 24 seja, 27,6 % menos eficiente no controle
Ordem 1 2 3 4 DL50 biológico do que o obtido neste trabalho.
Maldonado-Blanco et al (2003),
1 - - - - 3,31 utilizando outra cepa de B. thuringiensis
2 + - - - 2,64 israelensis, determinaram uma DL50 do
produto (0,2675 mg/L) duas vezes mais
3 - + - - 3,33
eficiente do que o produto 12. Entretanto, os
4 + + - - 3,70 autores não especificaram se o produto
5 - - + - 12,30 avaliado foi formulado ou não. Comparando
o produto 12 com os bioinseticidas
6 + - + - 17,40 comerciais Vectobac AS (DL50 = 0,019mg/L)
7 - + + - 14,00 e Teknar HP-D (DL50= 0,013mg/L) é
8 + + + - 16,70 possível observar que para atingir a mesma
potencialidade em DL50 dos produtos
9 - - - + 0,71 comerciais seria necessário empregar 30
10 + - - + 1,23 vezes mais produto em relação ao Vectobac e
44 vezes mais em relação ao Teknar. Essas
11 - + - + 0,75
diferenças indicam a necessidade de novos
12 + + - + 0,58 estudos na formulação do produto aqui
13 - - + + 2,50 desenvolvido bem como a busca de novas
cepas do microrganismo utilizado.
14 + - + + 2,00
15 - + + + 1,80 Mesmo assim, é possível quantificar os
efeitos dos aditivos avaliados sobre o
16 + + + + 2,10
parâmetro DL50. Os efeitos de cada um dos
17 0 0 0 0 0,66 aditivos bem como as suas interações com os
demais aditivos são apresentados na Figura 1.
O experimento 17 representa o ponto
médio dos experimentos.

Conforme pode ser observado na

Tabela 1, entre as formulações obtidas neste
trabalho o de maior grau de toxidez contra
larvas do mosquito Aedes albopictus foi o
produto 12. A concentração do produto
necessária para matar 50% das larvas do
inseto alvo até 24 horas após a sua aplicação
foi de 0,58 mg/L. Este valor foi representado
pela formulação com concentrações máximas
de 1, 2 e 4 e mínimas de 3. Em trabalho
realizado por Silva (2007) sob as mesmas
condições de condução de processo e meio
de cultivo, porém sem acabamento
(centrifugação) e sem uso de aditivos
 Figura 1 – Quantificação dos efeitos dos aditivos sobre a dose letal (DL50).

De acordo com a Figura 1, pode-se

observar a influência da adição de 3 e 4 sobre
a dose letal (DL50) apresentada nos
experimentos. Além destes efeitos ainda
existe o efeito de segunda ordem destes
aditivos.

Portanto ao interpretar a Figura 1 vê-se

que 4 tem um efeito negativo sobre DL50 , ou
seja, quanto mais cafeína adicionada ao
produto formulado menor será o seu valor;
conseqüentemente, mais eficiente será o
produto no controle biológico. Para 3 este
efeito teve comportamento contrário, ou seja,
quanto mais lecitina de soja adicionada ao
produto formulado, menos eficiente será o
produto. Os demais aditivos não revelam
efeitos significativos sobre a DL50. Com
relação às interações entre os fatores, apenas
a interação 3-4(lecitina-cafeína) apresentaram
efeito significativo (p<0,05) para DL50.
A superfície de resposta dos efeitos da
lecitina (fator 3) e da cafeína (fator 4) estão
apresentadas na Figura 2.
Figura 2 – Superfície de resposta do efeito dos aditivos cafeína (4) e lecitina de soja (3) sobre a
dose letal (DL50).

Conforme pode ser visto na Figura 2, a 0,013mg/L), para o produto fermentado

eficiência do bioinseticida aumenta com o bruto sem concentração (sem centrifugação)
aumento da cafeína, indicando a necessidade (DL50= 33,1mg/L) e para o produto
de novos testes com maiores concentrações centrifugado (DL50= 5,44mg/L). Análises do
deste aditivo na formulação. A potencialidade produto 12 (Tabela 1) com o mesmo
do uso da cafeína no combate a larvas do microrganismo-teste assim como novas
mosquito Aedes aegypti já foram análises com outros microrganismos
demonstradas em vários trabalhos (Euglena gracilis e Danio rerio) estão em
desenvolvidos por Itoyama (Itoyama et al, desenvolvimento. A Tabela 2 apresenta os
1992; 1995; 1997; 1998; 2000). Contudo, em resultados obtidos nas análises toxicológicas
nenhum dos trabalhos foi avaliado o efeito para estes produtos.
ecotoxicológico do produto no meio
ambiente.

As análises de ecotoxicidade
(determinações de CEC) realizadas neste
trabalho foram feitas apenas com o
microrganismo-teste Daphinia similis para os
produtos comerciais Vectobac AS (DL50=
0,019mg/L) e Teknar HP-D (DL50=
 Tabela 2 – Valores de CEC de diferentes
formulações de bioinseticidas.
Tipo de produto*
B1 B2 B3 B4
CEC (g/L) 0,1 0,1 1,0 0,1
* B1 - Vectobac AS; B2 - Teknar HP-D; B3 - produto
fermentado bruto sem concentração; B4 - produto
fermentado bruto centrifugado
Conforme pode ser observado na Tabela
2, dentro das condições experimentais
avaliadas, o produto menos tóxico para o
micro-crustáceo Daphinia similis foi o
produto B3 (produto fermentado bruto sem
concentração). Os produtos B1, B2 e B4
apresentaram maior toxidez. As doses letais
DL50 desses produtos para larvas de Aedes
foram menores do que os seus respectivos
valores de CEC, resultando nas relações CEC
/DL50 da ordem de 30 para o produto B3 e 18
para o B4. Para o produto comercial
Vectobac AS essa relação foi da ordem de 5
mil.
Deseja-se num bom bioinseticida, baixo
grau de ecotoxicidade (alto valor de CEC) e
alta eficiência biocida contra o inseto-alvo
(baixo valor de DL50). Portanto, quanto
maior valor na relação CEC/DL50, maior a
potencialidade do produto. A busca de
métodos capazes de aumentar a relação
CEC/DL50 dos produtos obtidos neste
trabalho se torna um desafio para a
continuidade da pesquisa.
4. CONCLUSÃO
O uso da cafeína como aditivo na
formulação do bioinseticida Bti possibilitou a
obtenção de um produto de maior eficiência
no controle biológico de larvas do mosquito
Aedes enquanto a lecitina de soja apresentou
efeito contrário. O menor valor de DL50
obtido com os produtos formulados neste
trabalho foi de 0,58 mg/L. Em comparação
com os produtos comerciais Vectobac AS e
Teknar HP-D, esta DL50 foi 30 e 44 vezes
menos eficiente no controle biológico. Os
produtos comerciais Vectobac AS e Teknar
HP-D apresentaram grau de ecotoxicidade
(CEC = 0,1 g/L) contra o microcrustáceo
Daphinia similis (microrganismo-teste do 3°
nível trófico – consumidores secundários)
100 vezes maior do que a observado com o
bioinseticida Bti bruto, não formulado. No
entanto, as suas potencialidades (DL50/CEC ≈
5000) para uso no controle biológico foram
da ordem de 200 vezes maior do que os
bioinseticidas desenvolvidos neste trabalho.
5. NOMENCLATURA
ART - açúcares redutores totais
Bti - Bacillus thuringiensis var. israelensis
CEC - concentração crítica de ecotoxicidade
DL50 – dose letal do produto para matar 50%
da população larval
DNS – ácido 3,5-dinitrosalicílico
KLa – coeficiente de transferência de massa
volumétrico ar-líquido
OD - oxigênio dissolvido
rpm – rotações por minuto
ZnO – óxido de zinco
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