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RECIFE
2007
Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes 2
APRESENTAÇÃO
O objetivo deste manual é tornar o aluno consciente da importância das aulas práticas
para a sua formação profissional, procurando envolvê-lo de forma mais efetiva, através da
aplicação de questionários sobre cada aula prática executada.
As fichas de estudo trazem informações que ajudam o aluno a entender a relação
existente entre a prática realizada e o tema teórico correspondente. Além das aulas práticas, o
manual contem um texto sobre o tema de aula teórica: “Integração e regulação do
metabolismo”. Este tema é abrangente e será apresentado ao aluno na forma de painel
dirigido. O manual ainda contem textos com exemplos clínicos e temas sobre algumas
doenças relacionadas com o metabolismo celular, que serão apresentados pelos alunos na
forma de seminários.
Considerando que o Curso Farmacêutico é um curso essencialmente prático e que a
Bioquímica é uma disciplina bastante árida em seu conteúdo, esperamos que os alunos
possam, com este manual, compreender melhor os assuntos das aulas teóricas através da
execução das práticas e da apresentação dos seminários sobre temas relacionados. Isso torna-
se imperioso, uma vez que a Bioquímica é uma disciplina fundamental na formação do
Farmacêutico.
Nesta edição estamos introduzindo algumas modificações na metodologia das práticas
e algumas correções no texto.
ÍNDICE
APRESENTAÇÃO .......................................................................................... 2
PAINEL DIRIGIDO
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................ 34
Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes 4
OBJETIVOS
INTRODUÇÃO
FUNDAMENTO DA PRÁTICA
PROCESSO
Identificar sete tubos de ensaio: Branco (B) e mais seis tubos enumerados de 1 a 6 e
seguir a orientação abaixo:
1- Incubar todos os tubos em banho-maria (BM) a 37°C por 5 minutos (esta é a reação
enzimática).
2- Adicionar a cada tubo 1,0 mL da solução oxidante (hidróxido de sódio 2,8 mM e
hipoclorito de sódio 121 mM), misturar e levar ao BM a 37°C por 5 minutos..
3- Ler as absorções ópticas em 600 nm, utilizando o branco para ajustar o zero do
espectrofotômetro.
OBSERVAÇÃO
A urease (268 U/ml) está dissolvida com tampão fosfato 10 mM, pH 6,9; salicilato de
sódio 31,2 mM e nitroprussiato de sódio 1,68 mM.
OBJETIVOS
INTRODUÇÃO
FUNDAMENTO DA PRÁTICA
PROCESSO
Identificar sete tubos de ensaio: Branco (B) e mais seis tubos enumerados de 1 a 6 e
seguir a orientação abaixo:
1- Incubar todos os tubos em banho-maria (BM) a 37°C por 5 minutos (esta é a reação
enzimática).
2- Adicionar a cada tubo 1,0 mL da solução oxidante (hidróxido de sódio 2,8 mM e
hipoclorito de sódio 121 mM), misturar e levar ao BM a 37°C por 5 minutos..
3- Ler as absorções ópticas em 600 nm, utilizando o branco para ajustar o zero do
espectrofotômetro.
OBJETIVOS
INTRODUÇÃO
PROCESSO
3- Transferir alíquotas de 0,2 mL (em duplicata) dos tubos 0, 5 e 10 para tubos de centrífuga,
previamente identificados (0a e 0b, 5a e5b, 10a e 10b), contendo 1,8 mL de ácido
tricloroacético (TCA), a 10%. Deixar os tubos em repouso por 10 min, agitando-os
11 Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes
Solução padrão de glicose - 100mg de glicose em 100 mL de solução. Para a dosagem diluir
a solução padrão 1:10 com água destilada.
Dosagem de glicose - Identificar nove tubos (B, P1, P2, 0a, 0b, 5a, 5b, 10a e 10b) - Branco,
Padrões e Testes.
Transferir 1 mL de cada sobrenadante límpido para os respectivos tubos de ensaio
previamente identificados.
Adicionar a cada tubo:
TUBO SOLUÇÃO TESTES ÁGUA REAGENTE DA
PADRÃO (0a, 0b, 5a, 5b, DESTILADA ORTO-TOLUIDINA
DILUÍDA 10a e 10b)
Padrões 1 mL - - 3,5 mL
Testes - 1 mL - 3,5 mL
Branco - - 1 mL 3,5 mL
CONCLUSÕES:
Fundamento - Duas enzimas estão envolvidas neste processo: glicose oxidase, que age sobre
a glicose e gera ácido glicônico e peróxido de hidrogênio. E peroxidase, que utiliza o
peróxido de hidrogênio como agente oxidante para transformar 4-aminoantipirina e fenol em
Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes 12
Dosagem de glicose - Identificar nove tubos (B, P1, P2, 0a, 0b, 5a, 5b, 10a e 10b) - Branco,
Padrões e Testes.
Transferir alíquotas de 0,05 mL para os respectivos tubos de ensaio previamente
identificados:
CONCLUSÕES:
13 Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes
OBJETIVOS
INTRODUÇÃO
As radiações - Raios gama e raios-X são exemplos de radiações ionizantes. Quando uma
molécula colide com essas radiações absorve energia e pode emitir elétrons com alto nível
energético.
O material celular está fundamentalmente distribuído em uma fase aquosa. A
transferência da energia para a molécula de água excita os elétrons constituintes e gera uma
molécula de água excitada (com um excedente de energia, comparada com sua energia
normal). A conseqüência mais provável deste evento é uma ionização, como segue:
(1) H2O → H2O+ + e-
(2) H2O+ + H2O → H2O+ + OH.
15 Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes
ambas as espécies (H2O+ e OH.) têm um elétron desemparelhado, são radicais livres e por isso
são espécies extremamente reativas. Outras espécies reativas podem ser geradas.
O elétron da reação (1) - elétron hidratado - pode reagir com oxigênio presente na
célula e gerar ânion superóxido. Admite-se que cerca de 10-5 segundo é o tempo decorrido
entre a ação inicial dos radicais sobre os constituintes em uma solução e a formação de
produtos. Vale ressaltar, no entanto, que essas espécies reativas têm um tempo de ação muito
curto. Elétrons produzidos na reação (1) perdem sua energia para as espécies químicas do
meio, em uma escala de tempo da ordem de 10-13 a 10-11 segundo.
Quando uma molécula absorve um fóton de luz ultravioleta, cuja energia é inferior à
sua energia de ionização, ela deverá se excitar. Se a energia armazenada for suficiente, pode
haver ruptura de ligações e produção de radicais livres por diversos mecanismos.
Os tecidos mais suscetíveis ao efeito dessas radiações são a pele e sobretudo os olhos,
devido à sua exposição direta e à intensidade de seu metabolismo. De forma geral, os radicais
livres exercem vários efeitos citotóxicos, envolvendo, virtualmente todos os componentes
celulares. São capazes de promover eventual destruição de estruturas e tecidos, causando
doenças genéticas, genético ambientais e ambientais, a exemplo da arteriosclerose,
hipertensão, câncer, osteoartrite, entre outras, além da liberação de uma variedade de produtos
de degradação como cetonas, álcoois, aldeídos e ésteres, propagando-se pela circulação. As
membranas biológicas de um modo geral, oferecem um rico meio para o ataque peroxidativo
que interfere na integridade das células.
Malondialdeído (MDA), formado a partir da quebra de ácidos graxos poliinsaturados,
é identificado como o principal produto da peroxidação de lipídeos e serve como índice
determinante da extensão da reação peroxidativa. O MDA reage com o ácido tiobarbitúrico
(TBA) produzindo um pigmento de cor avermelhada que absorve em comprimento de onda
de 535 nm. O pigmento formado é resultado da condensação de 2 moles de TBA com 1 mol
de MDA. Esta reação não é específica para quantificar MDA, uma vez que existem outras
substâncias que reagem com o TBA (TBARS), mas vem sendo amplamente utilizada para
avaliar o grau de peroxidação de lipídeos.
DOSAGEM DE TBARS
PROCESSO:
Adicionar a todos os tubos 2,0 mL da solução reagente, agitar e levar ao banho fervente por
15 min.
Esfriar os tubos em água corrente e fazer a leitura da absorção óptica em 535nm.
Calcular a concentração (μM) de TBARS em cada experimento, considerando que:
OBJETIVOS
INTRODUÇÃO
PROCESSO
CONCLUSÕES:
Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes 18
HIDRÓLISE DE PROTEÍNAS
OBJETIVOS
1- Identificar os aminoácidos como unidade fundamental das proteínas
2- Acompanhar a hidrólise de proteínas por aquecimento em meio ácido.
INTRODUÇÃO
FUNDAMENTO DA PRÁTICA
PROCESSO
A- Preparação da solução de ovoalbumina (solução A):
DOSAGEM DE URÉIA
OBJETIVOS
INTRODUÇÃO
FUNDAMENTO DA PRÁTICA
Utilizaremos a reação de Berthelot para quantificar a amônia formada por ação da
urease sobre a uréia, presente no soro sangüíneo. Cada molécula de amônia reage com duas
moléculas do derivado fenólico (salicilato) na presença de hipoclorito de sódio, em meio
alcalino, para formar indofenol, composto de cor azul. A intensidade de cor da reação é
proporcional à concentração de amônia.
PROCESSO
Em um tubo de ensaio diluir 0,1 mL de soro com 0,9 mL de solução salina.
Marcar cinco tubos de ensaio: Branco, Padrão(2) e Teste(2) e adicionar a cada um:
1- Incubar todos os tubos em banho-maria (BM) a 37°C por 5 minutos (esta é a reação
enzimática).
2- Adicionar a cada tubo 1,0 mL da solução oxidante (hidróxido de sódio 2,8 mM e
hipoclorito de sódio 121 mM), misturar e levar ao BM a 37°C por 5 minutos..
21 Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes
3- Ler as absorções ópticas em 600 nm, utilizando o branco para ajustar o zero do
espectrofotômetro.
CÁLCULO
IMPORTÂNCIA CLÍNICA
ESTUDOS DIRIGIDOS
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01- O que são radicais livres e qual a ação dessas espécies químicas no organismo vivo?
02- Fale sobre três fontes geradoras de radicais livres no organismo vivo.
23 Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes
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Hidrólise de Proteínas
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PAINEL DIRIGIDO
INTEGRAÇÃO E REGULAÇÃO METABÓLICA
A Figura 1 mostra que há, na célula, um ciclo energético em que o ATP serve como
elo de transporte de energia química, favorecendo uma união entre o catabolismo e o
anabolismo. Um outro elo importante entre estes dois processos metabólicos é o NADPH, que
transporta energia na forma de força redutora. Com isso é possível entender que a estratégia
do metabolismo é formar ATP, poder redutor e unidades fundamentais para os processos de
biossíntese.
No metabolismo celular existe um intrincado sistema de regulação, de tal forma que a
liberação de energia nos processos catabólicos é controlada pelas necessidades celulares de
energia na forma de ATP e de NADPH, e não pela simples disponibilidade dos nutrientes.
A regulação do metabolismo ocorre de várias formas:
ou pode gerar 3-hidroxi-3-metil glutaril CoA, precursor para a via de síntese do colesterol
como também dos corpos cetônicos. Um outro destino do acetil CoA é a sua utilização para a
síntese de ácidos graxos. O acetil CoA serve como elo de integração entre o metabolismo dos
carboidratos, dos lipídeos e das proteínas e a integração destas vias metabólicas com o ciclo
do ácido cítrico.
A integração das diversas funções dos órgãos é um processo muito complexo, uma vez
que os padrões metabólicos de cérebro, músculo, tecido adiposo, trato digestivo e fígado são
muito diferentes. Para um perfeito entendimento destas inter-relações há necessidade, além da
abordagem bioquímica, de uma abordagem fisiológica. Neste texto abordaremos somente
alguns aspectos bioquímicos significativos.
A distribuição das reservas energéticas nos diversos tecidos (Tabela 1) mostra como
esses tecidos diferem no uso dos alimentos para satisfazer as suas necessidades energéticas:
Cérebro – Não tem reservas energéticas e, por isso, necessita de um
suprimento contínuo de glicose. Ele consome cerca de 120 g diariamente, o que representa
cerca de 60% do consumo de glicose pelo organismo inteiro em repouso. Durante a inanição,
o cérebro utiliza os corpos cetônicos (acetoacetato e β -hidroxibutirato), gerados pelo fígado,
como fonte de energia, substituindo parcialmente a glicose. Essa mudança no uso de
combustível de glicose para corpos cetônicos tem por objetivo minimizar a degradação de
proteínas durante a inanição. Os ácidos graxos não servem como alimento para o cérebro, por
não atravessarem a barreira hematoencefálica, mas os corpos cetônicos, derivados dos ácidos
graxos, podem ser utilizados como fonte de energia pelo cérebro.
Músculo – Difere do cérebro por ter grande reserva de glicogênio e além de
glicose utiliza ácidos graxos e corpos cetônicos como fontes de energia. O músculo, como o
cérebro, não tem a enzima glicose-6-fosfatase, por isso não pode exportar glicose, que é seu
alimento preferido para surtos de atividade. A velocidade da glicólise no músculo esquelético
em contração ativa, excede aquela do ciclo do ácido cítrico. Muito do piruvato formado nesse
processo é reduzido a lactato, que flui para o fígado onde é transformado em glicose. A
alanina, como o lactato, podem ser transformada em glicose pelo fígado. No músculo em
repouso os ácidos graxos são a principal fonte de energia, enquanto os corpos cetônicos
podem também servir de alimento para o músculo cardíaco.
Tecido adiposo – Tem como função armazenar triacilgliceróis – produto da
esterificação dos ácido graxos, sintetizados no fígado, com glicerol. O glicerol 3-fosfato,
intermediário nessa reação de esterificação, é um produto da degradação da glicose na via
glicolítica. Como os adipócitos não podem fosforilar o glicerol, necessitam de glicose para a
Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes 28
porque seu efeito glicogenolítico é mais acentuado no músculo do que no fígado. Na presença
desses hormônios a captação de glicose pelos músculos é inibida e os ácidos graxos, liberados
do tecido adiposo, são utilizados como fonte de energia. A epinefrina também estimula a
secreção de glucagon e inibe a secreção de insulina. Assim, as catecolaminas aumentam a
liberação de glicose hepática no sangue e diminuem a utilização de glicose pelo músculo.
A Figura 4 mostra um panorama da integração metabólica entre diversos tecidos. O
transporte dos diversos compostos entre os órgãos é geralmente assumida pelo sangue. Os
lipídeos, a princípio constituintes dos quilomícrons, são removidos do intestino pelo sistema
linfático, enquanto glicose passa das células epteliais intestinais para o fígado através da veia
porta. Ainda no intestino ocorre o metabolismo parcial dos aminoácidos, antes de serem
liberados no sistema porta.
As alterações metabólicas durante o primeiro dia de jejum são como aquelas após o
jejum de uma noite. Com a redução nos níveis de carboidratos, aumenta a secreção de
glucagon, estimulando a mobilização de triacilgliceróis do tecido adiposo e a gliconeogênese
pelo fígado. A captação de glicose pelo músculo é reduzida com os baixos níveis de insulina
circulante, enquanto os ácidos graxos entram livremente e a β -oxidação destes compostos no
31 Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes
músculo geram aumento na concentração de acetil CoA e de citrato, inibindo a via glicolítica
e impedindo a conversão de piruvato em acetil CoA.. Após várias semanas de inanição, os
corpos cetônicos tornam-se o principal combustível para o cérebro, reduzindo a utilização de
glicose e garantindo a preservação das proteínas do músculo (Tabela 3).
máxima, quando o esforço físico requer cerca de 60% do consumo máximo de oxigênio.
Indivíduos bem treinados utilizam um percentual maior de ácidos graxos como fonte de
energia, do que indivíduos sedentários, não treinados.
A etapa (1) – etapa lenta – é catalisada pela enzima álcool desidrogenase, no citossol
enquanto a etapa (2) ocorre na matriz mitocondrial e é catalisada pela enzima aldeído
desidrogenase. Em ambas as etapas ocorre a produção de NADH. Por esta razão, as vias
metabólicas da gliconeogênese e da β -oxidação dos ácidos graxos, que têm enzimas cuja
atividade é sensível à presença de NADH, sofrem inibição durante o metabolismo do etanol.
No jejum, esta situação favorece à hipoglicemia e ao acúmulo de triacilgliceróis no fígado
33 Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes
(fígado gordo). Pode, também, haver um acúmulo de ácido láctico, gerando acidose
metabólica.
O consumo de álcool por uma pessoa subnutrida ou após exercício extenuante pode
causar hipoglicemia. Os equivalentes de NADH em excesso bloqueiam a conversão de lactato
em glicose e promovem a conversão de alanina em lactato, que acumula na corrente
sangüínea. Com a redução da glicemia ocorre queda no desempenho motor e intelectual. Altas
doses de etanol apresenta um efeito depressor, que pode levar a estupor e anestesia.
O etanol apresenta um alto conteúdo energético, produzindo cerca de 7,1 kcal/g,
quando oxidado. O acetato derivado do metabolismo do etanol pode ser transformado em
acetil-CoA, que é oxidado a CO2 e H2O, através das reações do ciclo do ácido cítrico e da
cadeia transportadora de elétrons. No fígado as mitocôndrias têm uma capacidade limitada
para oxidar o acetato, porque a ativação do acetato a acetil-CoA requer GTP. Com o aumento
nos níveis de NADH, as reações do ciclo sofrem inibição. Isto leva a uma redução nos níveis
de GTP, gerado na transformação de sucnil-CoA a succinato, e oxidação do acetil-CoA
também fica comprometida. Grande parte do acetato é exportado do fígado para o sangue e
pode ser oxidado, na forma de acetil-CoA, em outros tecidos.
Como acetato, acetaldeído pode ser exportado do fígado para a circulação sangüínea.
Este último composto reage, rapidamente, com grupos funcionais importantes, como as
proteínas das células sangüíneas e dos demais tecidos, comprometendo a sua atividade
biológica.
BIBLIOGRAFIA
02. DEVLIN, TM, Manual de Bioquímica com Correlações Clínicas. 6ª Ed., Editora Edgar
Blücher Ltda. São Paulo, 2007.
03. GARRET & GRISHAN, Biochemistry, 2a Ed. Saunders College Publishing, New York,
1999.
04. LEHNINGER, A; NELSON, DL; COX, MM, Princípios de Bioquímica, 3a Ed. Sarvier,
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05. LIMA, AO, et al., Métodos de Laboratório Aplicados à Clínica, 5a Ed. Guanabara
Koogan, Rio de Janeiro, 1977.
06. MARZZOCO, A; TORRES, BB, Bioquímica Básica. Editora Guanabara Koogan, Rio de
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08. PURVES, WK, et al, Vida a Ciência da Biologia, 6ª Ed. Artmed, Porto Alegra, 2002.
09. SMITH, EL, et al., Bioquímica Aspectos Gerais, 7a Ed. Guanabara Koogan, Rio de
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10. SMITH, EL, et al., Bioquímica Mamíferos, 7a Ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro,
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13. UCKO, DA, Química para as Ciências da Saúde: Uma Introdução à Química Geral,
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