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GRUNDLAGEN DER ENZYMOLOGIE:


AKTIVITÄTS- UND SUBSTRATBESTIMMUNGEN

A. BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN

In lebenden Organismen katalysieren Enzyme chemische Stoffumwandlungen. Ein Enzym


wird durch seine katalytische Aktivität charakterisiert; d. h. durch seine Fähigkeit, die
Umsetzung eines oder mehrerer Substrate in einer spezifischen Reaktion zu definierten
Produkten zu beschleunigen. Enzyme sind im Allgemeinen Proteine. Enzymproteine weisen
eine spezifische Struktur auf, d. h. eine spezifische Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur
sowie, falls das Enzym aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt ist, eine bestimmte
Quartärstruktur. Die Anordnung der Atome in einer definierten Struktur wird durch den pH
der Lösung, Temperatur, Ionenstärke etc. beeinflusst. Deshalb haben diese Faktoren einen
entscheidenden Einfluss auf die katalytische Aktivität eines Enzyms.

Mit Hilfe enzymatisch katalysierter Reaktionen kann zum einen die Menge eines Enzyms,
zum anderen die Konzentration von Substraten bestimmt werden. Beides wird klinisch zur
Diagnose und Charakterisierung von Stoffwechselerkrankungen angewandt.

Bestimmung der katalytischen Aktivität

Zur Bestimmung der Aktivität eines Enzyms wird die Menge an verbrauchtem Substrat pro
Zeit oder die Menge an entstehendem Produkt pro Zeit gemessen. Die Aktivität eines
Enzyms wird in der Regel bei maximaler Geschwindigkeit, d. h. im Bereich der Substrat-
sättigung, bei optimalen Cosubstrat- und Effektorkonzentrationen, bei optimalem pH und bei
einer willkürlich festgesetzten Temperatur (meist 37°C) bestimmt.

Die Einheit der Aktivität, "Unit" (abgekürzt U), ist definiert als Umsatz von 1 µmol Substrat
pro Minute.

1 U = 1 µmol x min-1

Eine andere weniger gebräuchliche Einheit ist das Katal (kat):

1 kat = 1 mol x sec-1; 1 nkat = 1 nmol x sec-1 (n = nano = 10-9)

Im klinisch-chemischen Labor ist es üblich, die Aktivität pro Volumen zu bestimmen und in
der Einheit U/l anzugeben. Auch die Normalwerte werden meistens in U/l angegeben.
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Die Einheit U/l ist gleich 1 µmol x l-1 x min-1. Bei der Aktivität pro Volumen handelt es sich
also um die Änderung einer Konzentration (µmol/l) pro Zeit (min) oder um die Reaktions-
geschwindigkeit. Entsprechend werden Aktivitäten pro Volumen durch Bestimmungen der
Anfangsgeschwindigkeit der katalysierten Reaktion gemessen. Dabei misst man entweder
die Abnahme der Konzentration eines Substrates (-d[S]/dt) oder die Zunahme der Konzen-
tration eines Produktes (d[P]/dt) unter genau definierten Testbedingungen (pH, Ionenstärke,
Temperatur).

Als spezifische Enzymaktivität bezeichnet man die Aktivität bezogen auf eine definierte
Menge Enzymprotein: U/mg = µmol x min-1 x mg-1 oder kat/kg = µkat/mg

Bestimmung von Substratkonzentrationen

Aufgrund der hohen Spezifität eines Enzyms für das Substrat kann dessen Konzentration
mittels eines Enzyms auch in einem Gemisch bestimmt werden. In diesem Fall arbeitet man
mit hohen Enzymkonzentrationen. Man bestimmt den Anfangszustand des Testsystems und
setzt das Enzym dann in so hoher Konzentration zu, das die gewünschte katalysierte
Reaktion in kurzer Zeit praktisch vollständig abläuft. Aus der Differenz zwischen Anfangs-
und Endzustand wird die umgesetzte Substratmenge bestimmt. Aufgrund des Gleich-
gewichts zwischen Hin- und Rückreaktion wird ein Teil des Substrats nicht restlos in Produkt
umgewandelt. Um eine weitgehend irreversible Umwandlung zu erreichen, muss in der
Regel eines der Reaktionsprodukte aus der Testmischung entfernt werden. Das lässt sich
zum Beispiel durch eine weitere praktisch irreversible Reaktion, die von einem Hilfsenzym
katalysiert wird, oder durch chemische Umsetzung eines Produktes erreichen. Wenn z. B.
bei einer Reaktion H+-Ionen entstehen, können diese durch Neutralisation, d. h. indem ein
hoher pH-Wert eingestellt wird, entfernt werden.

Enzymatische Bestimmungen von Metaboliten sind in der Regel genauer und wesentlich
spezifischer als Bestimmungen mit chemischen Methoden. Eine häufig angewandte chemi-
sche Methode zur Bestimmung von Pyruvat im Serum beruht auf der Bildung des Hydrazons
mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin. Aber andere im Serum, physiologisch und pathologisch,
vorkommende Ketosäuren (α-Ketoglutarat, Acetoacetat und Oxalacetat) reagieren ebenfalls
und täuschen eine zu hohe Pyruvatkonzentration vor. Spezifisch kann hingegen Pyruvat mit
Hilfe des Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH) bestimmt werden. Bevor auf Einzelheiten
dieser Bestimmung eingegangen wird, sollen einige generelle Überlegungen angestellt
werden.
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Jede chemische Reaktion erreicht einen Gleichgewichtszustand. In der Schreibweise

A+B C+D

zeigt der Doppelpfeil an, dass die Reaktion in beiden Richtungen, vorwärts und rückwärts,
verläuft. Wenn die Reaktion mit einer Mischung von A und B beginnt, so wird die Bildung von
C und D, die Hinreaktion, zunächst relativ schnell verlaufen. Mit der Anhäufung von C und D
setzt nun aber auch die Rückreaktion ein, die umso schneller wird, je mehr C und D gebildet
sind. Proportional wird die Hinreaktion langsamer werden, je mehr A und B verbraucht sind.
Im Gleichgewichtszustand laufen Hin- und Rückreaktion mit gleicher Geschwindigkeit ab.

Die Gleichgewichtslage einer Reaktion wird durch das Massenwirkungsgesetz ausgedrückt.


Die Geschwindigkeit einer Reaktion ist das dem Produkt der Konzentrationen der Reaktions-
teilnehmer proportional, d. h. für die oben genannte Reaktion:

vhin = k1 [A] . [B] und vrück = k2 [C] . [D]

wobei k1 und k2 die Geschwindigkeitskonstanten und vhin und vrück die Geschwindigkeiten
der Vorwärts- und Rückwärts-Reaktion bedeuten.

Im Gleichgewichtszustand ist

vhin = vrück und damit


k [A] . [B] = k [C] . [D]
1 2

Daraus folgt:

k1 [C ] ⋅ [ D ]
=K =
k2 [ A ]⋅ [B ]

Das Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten wird als Gleichgewichtskonstante K defi-


niert; sie gibt an, in welchem Konzentrationsverhältnis die Reaktanten im Gleichgewichts-
zustand vorliegen.

Als Anwendungsbeispiel soll Pyruvat mit Hilfe der Lactatdehydrogenase (LDH) bestimmt
werden. LDH katalysiert die folgende Reaktion:

LDH
Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+
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Mit Hilfe des Massenwirkungsgesetzes soll berechnet werden, unter welchen Bedingungen
die Reaktion von Pyruvat zu Lactat quantitativ abläuft. Die Gleichgewichtskonstante K' hängt
vom pH-Wert und von der Temperatur ab. Bei pH 7.0 und 25°C beträgt sie:

[ Pyruvat ] ⋅ [ NADH ]
K' = = 2 , 3 ⋅ 10 −5
[ Lactat ] ⋅ [NAD ]
+

K' ist die "scheinbare" Gleichgewichtskonstante, die sich von der pH-unabhängigen
thermodynamischen Gleichgewichtskonstante K unterscheidet. Für die LDH-Reaktion ist

[ Pyruvat ] ⋅ [[ NADH ]] ⋅ [H + ] = 2 , 3 ⋅10 − 12 mol / l


K =
[ Lactat ] ⋅ [NAD + ]
Um die pH-abhängige Konstante K' für ein gegebenes pH zu berechnen, wird K durch die
gegebene Wasserstoffionenkonzentration dividiert.

−12
bei pH 7: [H + ] = 10 −7 mol / l ; K ' pH =7 , 0 = 2 , 3 ⋅10−7 = 2 , 3 ⋅ 10 −5
10

− 12
bei pH 8: [H + ] = 10 −8 mol / l ; K ' pH = 8 , 0 = 2 ,3 ⋅10− 8 = 2 , 3 ⋅ 10 − 4
10

2 , 3 ⋅ 10 −12
bei pH 9: [H + ] = 10 −9
mol / l ; K '
pH = 9 , 0
=
−9
= 2 , 3 ⋅ 10 −3
10

und so weiter.

Da die enzymatische Metabolitbestimmung in gepufferter Lösung ausgeführt wird und die


Wasserstoffionenkonzentration praktisch konstant bleibt, genügt K' zur Charakterisierung der
Reaktion.

Im menschlichen Blut beträgt die Pyruvatkonzentration ungefähr 5·10-5 mol/l. Nachdem Blut
enteiweißt und ein aliquoter Teil des Überstandes mit Puffer, NADH und LDH in der
Messküvette gemischt worden ist, beträgt die Pyruvatkonzentration 2·10-5 mol/l. Die
Lactatkonzentration im Blut beträgt ungefähr 1 10-3 mol/l, d. h. die Konzentration im Bestim-
mungsansatz beträgt 4 10-4 mol/l.
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Das Ergebnis der Pyruvatbestimmung wäre zufrieden stellend, wenn 99% des Pyruvats zu
Lactat reduziert würden; d. h. die Pyruvatkonzentration sollte von 2.10-5 mol/l auf 0,02 10-5
mol/l oder um 1,98 10-5 mol/l abfallen. Zu Beginn des Tests liegen folgende Konzentrationen
vor:

Pyruvat = 2 ⋅ 10-5 mol/l


NADH = 10 ⋅ 10-5 mol/l
Lactat = 40 ⋅ 10-5 mol/l
NAD+ = 0

Für jedes mol Pyruvat, das reduziert wird, wird ein mol NADH oxydiert, und es werden 1 mol
Lactat und 1 mol NAD+ gebildet. Nachdem 99% oder 1,98 10-5 mol/l Pyruvat reduziert
worden sind, sind folgende Konzentrationen im Reaktionsansatz vorhanden:

-5 -5 -5
Pyruvat = 2 ⋅ 10 − 1;98 ⋅ 10 = 0,02 10 mol/l
-5 -5 -5
NADH = 10 ⋅ 10 − 1;98 ⋅ 10 = 8,02 10 mol/l
-5 -5 -5
Lactat = 40 ⋅ 10 + 1,98 ⋅ 10 = 41,98 10 mol/l
-5 -5
NAD+ = 10- 5 + 1,98 ⋅ 10 = 1,98 10 mol/l

In die Gleichung für das Massenwirkungsgesetz eingesetzt errechnet sich:

[ Pyruvat ] ⋅ [ NADH ] 0 , 02 ⋅10 −5 ⋅ 8 , 02 ⋅10 −5


= = 1 , 92 ⋅ 10 −3
[ Lactat ] ⋅ [NAD + ] 41 , 98 ⋅10 −5 ⋅1 , 98 ⋅10 −5
Das Resultat zeigt, dass nach einem Umsatz von 99% der Quotient immer noch größer als
K' = 2,3. 10 ist, d. h. die Reaktion wird weiterlaufen, bis nahezu 100% des Pyruvats
-5

reduziert worden sind. Diese Berechnung zeigt, dass die Bestimmung von Pyruvat in einem
Gemisch mit der LDH möglich ist.

Allgemeine Fragestellungen

Isoenzyme: Definition, Vorkommen und molekulare Grundlagen der Isoenzymentstehung;


LDH, ihre Rolle im Stoffwechsel und in der Klinik;
Glykolyse, Gluconeogenese, Cori-Zyklus;
Grundbegriffe der enzymatischen Katalyse;
Definition der Enzymaktivität, der Enzymaktivität pro Volumen (Reaktionsgeschwindigkeit)
und der spezifischen Aktivität;
Prinzip der Substratbestimmung und Aktivitätsbestimmung.
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B. ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE

Eine Reihe von physikalischen und chemischen Methoden steht zur Verfügung, um die
Geschwindigkeit enzymkatalysierter Reaktionen zu bestimmen. Besonders günstig sind aber
die Methoden, bei denen nicht von außen in die Reaktion eingegriffen werden muss, sondern
bei denen z. B. während der Reaktion die Änderung eines optisch messbaren Parameters
erfolgt. Auf diesem Prinzip kann die Aktivität von Oxidoreduktasen bestimmt werden, die
NAD+ oder NADP+ als Cosubstrat umsetzen. Die entstandenen NADH oder NADPH haben
eine zusätzliche Absorptionsbande bei 340 nm; d. h. die Zunahme der Extinktion während
der Reaktion ist ein Maß für den Umsatz der Cosubstrate. Die entsprechenden Konzentra-
tionsänderungen werden dann mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes berechnet (für
weitere Einzelheiten siehe Versuch "Grundlagen der Enzymkinetik").

Substratbestimmung und Aktivitätsbestimmung werden anhand der von LDH


katalysierten Reaktion durchgeführt.

CH3 CH3
| LDH |
+ +
C = 0 + NADH + H CH-OH + NAD
| |
- -
COO COO

Pyruvat L(+)Lactat

LDH kommt praktisch in allen Geweben vor. Hohe Aktivitäten lassen sich im Herzmuskel, in
der Leber, im Skelettmuskel, in Erythrozyten und Thrombozyten nachweisen.

Gewebsverteilung der LDH-Isoenzyme

Viele Enzyme sind aus mehreren identischen oder nicht-identischen Untereinheiten aufge-
baut. Vielfach sind diese Enzyme nur aktiv, wenn sie die richtige Quartärstruktur aufweisen.
Austausch der Untereinheiten ergibt eine Familie von Enzymen innerhalb eines einzigen
Organismus, die alle die gleiche Reaktion katalysieren. Diese so genannten Isoenzyme
unterscheiden sich in ihren physikalischen Eigenschaften (Molekulargewicht, isoelektrischer
Punkt, Denaturierungstemperatur) wie auch in ihren katalytischen Eigenschaften (KM, pH-
Optimum, Wechselzahl). Da diese Untereinheiten vielfach Genprodukte von dublizierten
Genen sind, die aus einem einzigen Präkursor entstanden sind, haben sie noch viele
gemeinsame Eigenschaften. In den vorliegenden Übungen sollen die Isoenzyme der LDH
studiert werden. Anschließend wird die Bedeutung der Isoenzyme als diagnostisches Mittel
in der Klinik diskutiert.
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Funktionen der LDH-Isoenzyme

Isoenzyme werden von Pro- und Eukaryonten produziert, um den metabolischen Fluss zu
einer gegebenen Zeit den besonderen Bedingungen der Umgebung anzupassen. Die kataly-
tischen Eigenschaften dieser Isoenzyme können leicht geändert werden, indem ein Typ einer
Untereinheit in der Syntheserate verändert wird, was leichter gelingt, als die Synthese eines
gesamten neuen Enzyms. In Säugern prädominieren bestimmte Isoenzyme häufig entweder
in bestimmten Geweben oder in einem Gewebe zu einer bestimmten Entwicklungszeit. Die
LDH ist aus vier Untereinheiten aufgebaut, die entweder dem Typ M (Muskeltyp) oder dem
Typ H (Herztyp) entsprechen. Diese Untereinheiten werden durch nicht-kovalente Bindungen
zusammengehalten. Die Kombination dieser beiden Untereinheiten zu einem Tetramer in
unterschiedlichen Relationen ergibt fünf Isoenzyme: H4, H3M, H2M2, HM3 und M4, die man
auch als LDH 1, 2, 3, 4 und 5 bezeichnet. Die Anteile der fünf LDH-Isoenzyme im Cytosol
sind von Gewebe zu Gewebe unterschiedlich, innerhalb eines Organs jedoch relativ
konstant.

Die Verteilung der LDH-Isoenzmye in den verschiedenen Organen weist eine Korrelation zu
deren O2-Versorgung auf. Das H4-Isoenzym arbeitet relativ langsam und wird durch einen
Überschuss an Pyruvat gehemmt. Das M4-Enzym hat dagegen eine wesentlich höhere
Wechselzahl und wird kaum durch Pyruvat gehemmt (Tabelle I).

Tabelle I

Eigenschaften der LDH-Isoenzyme

Isoenzym Wechselzahl Km(Pyr) Hemmung durch Pyruvat von


physiologischen Konzentrationen
H4(LDH 1) 45.000 sec-1 1 . 10-4 M ja

M4(LDH 5) 100.000 sec-1 3 . 10-5 M nein

Die Zelle gewinnt viel mehr ATP durch die Verstoffwechselung des Pyruvats im
Citronensäurezyklus als durch Umsetzung zu Lactat. Dazu ist allerdings Sauerstoff nötig, um
das produzierte NADH reoxydieren zu können und damit in der Atmungskettenphospho-
rylierung ATP zu synthetisieren. In einem aeroben Gewebe, wie im Herzen, steht Sauerstoff
immer in genügenden Mengen zur Verfügung, so dass jede Umwandlung von Pyruvat zu
Lactat, d. h. Abzug dieses Metaboliten vom Citronensäurezyklus, einen Energieverlust
darstellen würde. Deshalb dominieren in diesem Gewebe die Isoenzyme H4 und H3M, deren
Aktivität Pyruvat bei physiologischen Konzentrationen hemmt. Dementsprechend wird
Pyruvat nicht zu Lactat umgesetzt, sondern im Citronensäurezyklus verstoffwechselt. In
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anaeroben Geweben mit limitiertem Sauerstoffangebot, wie z. B. in kontrahierenden


Skelettmuskeln, wird ATP unabhängig von der Verfügbarkeit von Sauerstoff während der
Umwandlung von Glucose in Pyruvat produziert. Wenn die ATP-Konzentration sinkt, steigt
der Fluss der Glykolyse um ein vielfaches an, um die notwendige Menge ATP zu
+
synthetisieren. Unter diesen Bedingungen muss NADH schnell in NAD überführt werden,
+
weil es sonst zum Stopp der Glykolyse kommen würde. NAD kann aber durch die LDH-
Reaktion schnell regeneriert werden. Deshalb herrscht in solchen anaeroben Geweben das
4
Isoenzym M mit hoher Wechselzahl vor, dessen Aktivität Pyruvat nicht hemmt. Als Produkt
der Reaktion akkumuliert Lactat, was schließlich im Cori-Zyklus zur Gluconeogenese benutzt
werden kann.

Die metabolische Funktion der LDH ist in der nächsten Abbildung zusammengefasst:

Nachweis von LDH-Isoenzymen

Aufgrund der hohen Proteinkonzentrationen des Serums ist der Nachweis der LDH-Iso-
enzyme im Serum nicht einfach. Mit Hilfe einer spezifischen Färbemethode, die die Sub-
stratspezifität der LDH-Isoenzyme ausnutzt, können die einzelnen Isoenzyme dargestellt
werden. Dazu ist eine Trennung der LDH-Isoenzyme aus verschiedenen Gewebeextrakten
durch Elektrophorese auf Zelluloseacetat notwendig. Nach der elektrophoretischen Trennung
werden die Zellulose-Acetatstreifen in einer alkalischen Färbelösung inkubiert, die NAD, das
Lactat und zwei Redox-Farbstoffe enthält. An den Stellen, an denen sich LDH-Isoenzyme
+ +
befinden, werden von Lactat und NAD Pyruvat, NADH und H gebildet. Der Wasserstoff des
NADH wird über Phenacin-Methosulfat (PMS) durch zwei Redoxsysteme auf farbloses
Tetrazoliumchlorid übertragen. Das durch die Reduktion des Tetrazoliumsalzes entstandene
blauviolette Formazan lokalisiert die Stellen mit LDH-Aktivität auf der Folie.
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Durch Hybridisierung von M4 und H4 können alle Isoenzyme erzeugt werden. Diese
Hybridisierung kann durch langsames Einfrieren und Wiederauftauen erreicht werden, da die
Quartärstruktur der LDH im Eisgitter nicht stabil ist. Bei der Renaturierung zum quartären
Enzym bilden sich dann alle fünf Isoenzyme. Nach Trennung und Färbung können die
gebildeten Mengen der fünf Isoenzyme durch Densitometrie ermittelt werden, wenn man
annimmt, dass die Intensität der Färbung der Enzymaktivität proportional ist.

Alternativ kann die Isoenzymmenge an M4 auch durch milde Denaturierung ermittelt werden.
Die H-Untereinheit ist gegen Denaturierung in Harnstoff oder Hitze stabiler als die M-
Untereinheit. M4 kann deshalb durch Inkubation in Harnstoff oder durch Erhitzen auf 60°C
inaktiviert werden, wonach die Menge an H4 im Serum gemessen und anschließend
berechnet werden kann.

Klinische Anwendung

Die Identifizierung von Isoenzymen der LDH beruht auf ihrer schnellen elektrophoretischen
Trennung und bildet damit die Basis für verschiedene klinische Anwendungen, die sowohl
die Gewebeart als auch deren Zerstörungsgrad definieren können. Dazu wird sehr häufig
das Isoenzymmuster der LDH in Serum bestimmt. Normalerweise ist der LDH-Aktivitäts-
spiegel in Serum sehr niedrig.

Im pathologischen Fall werden die Zellmembranen des geschädigten Organs meist permea-
bel für Enzyme und andere Makromoleküle, die dann in den extrazellulären Raum austreten
können. Gelangen sie in ausreichender Konzentration in den Intravasalraum, so können sie
quantitativ im Blutplasma bestimmt werden, was Rückschlüsse auf Ausmaß und Umfang der
Beschädigung zulässt.

Die im Serum messbare LDH-Aktivität stellt eine Summe der aus verschiedenen Organen
stammenden Isoenzyme dar. Deswegen kann aus einer einfachen Aktivitätsmessung nicht
unbedingt auf die Organherkunft des Enzyms geschlossen werden. Da aber im Falle der
LDH das Verhältnis der einzelnen Isoenzyme von Organ zu Organ unterschiedlich ist, spie-
gelt sich die Schädigung eines bestimmten Gewebes auch als typisches Isoenzymmuster im
Serum wider. Eine solche Differenzierung der LDH-Isoenzyme nach Organen ist mit Elek-
trophorese möglich. Auf diese Weise lässt sich z. B. unterscheiden, ob eine Erhöhung der
LDH-Aktivität im Serum auf eine Schädigung des Herzmuskels oder der Leberzelle zurück-
zuführen ist.
30

Elektrophoretische Auftrennung von LDH-Isoenzymen aus menschlichen Seren


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C. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL

1. BESTIMMUNG VON PYRUVAT IM OPTISCHEN TEST NACH WARBURG MIT LDH


ALS BEISPIEL EINER SUBSTRATKONZENTRATIONSBESTIMMUNG

Drei Küvetten werden wie im Pipettierplan angegeben angesetzt. Die Abnahme der Extink-
tion bei 366 nm wird nach Zugabe der LDH bis zu einem konstanten Wert verfolgt. Vor
Beginn der Messung wird das Photometer bei 366 nm gegen eine mit Phosphatpuffer ge-
füllte Küvette geeicht. Diese Eichung wird von Zeit zu Zeit überprüft.

Pipettierplan

Ansatz Nr.

1 2 3

ml Na-Phosphat-Puffer 1,50 1,50 1,50


(0,1 mol/l, pH 7.4)

ml NADH (0,01 mol/l) 0,05 0,05 0,05

ml Na-Pyruvat 0,05 0,10 0,15

ml H2O 0,38 0,33 0,28

Der Küvetteninhalt wird gemischt und die Anfangsextinktion (E0) gemessen. Nach 30 sec
wird überprüft, ob E0 unverändert bleibt. Bei konstanter Extinktion wird die Reaktion durch
Zugabe des Enzyms (jeweils 0,02 ml) gestartet. Dazu wird das Enzym durch Anlegen der
Pipette an die Küvettenwand direkt in die Küvette pipettiert. Es wird sofort gründlich
durchgemischt, damit die Enzymmenge vollständig und gleichmäßig suspendiert wird. In
Abständen von 1 min wird die Extinktion abgelesen, bis keine Änderung mehr registriert wird.
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Extinktion

Zeit Ansatz 1 Ansatz 2 Ansatz 3

Eo

30 sec

Start durch Zugabe von LDH (0,02 ml/Küvette; mischen)

1 min

2 min

3 min

4 min

5 min

6 min

2A BESTIMMUNG DER AKTIVITÄT PRO VOLUMEN VON H4 UND M4 BZW. DER LDH
IM NORMALSERUM UND IM SERUM VON HERZINFARKTPATIENTEN

Pipettierplan

H4 M4 normal Infarkt-
Serum serum

ml Phosphatpuffer 1,50 1,50 1,50 1,50


(0,1 mol/l, pH 7.4)

ml NADH (0,01 mol/l) 0,05 0,05 0,05 0,05

ml H2O 1,30 1,30 0,95 1,25

ml H4 (20 µg/ml) 0,05 0 0 0

Ml M4 (12,5 µg/ml) 0 0,05 0 0

ml Normalserum 0 0 0,40 0

ml Herzinfarktserum 0 0 0 0,10
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Küvetteninhalt wird gründlich durchgemischt und nach Eichung des Photometers gegen
Phosphatpuffer die Extinktion abgelesen und nach 30 sec noch einmal überprüft.

Im weiteren Verlauf sollen die Ansätze einzeln nacheinander weiterbehandelt werden, um


exakte Zeitabstände zwischen den Extinktionsablesungen einhalten zu können.

Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml Pyruvatlösung (0,01 mol/l) pro Küvette gestartet.
Nach Zugabe von Pyruvat wird gründlich gemischt. Die Extinktion soll 15 sec nach dem
Mischen und danach in den angegebenen Abständen (genau!) abgelesen werden.

abgelesene Extinktion

sec H4 M4 normal Infarkt-


Serum serum

30

Start durch Zugabe von Pyruvat (0,1 ml/Küvette)

15

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300
34

2B ABSCHÄTZUNG DER MENGE H4 IN NORMAL UND HERZINFARKT-SEREN


DURCH HARNSTOFF-STABILITÄTSTEST

Pipettierplan

H4 M4 Normal Infarkt-
Serum serum

ml Harnstoff (6 mol/l) 1,50 1,50 1,50 1,50


in Phosphatpuffer
(0,1 mol/l, pH 7.4)

ml NADH (0,01 mol/l) 0,05 0,05 0,05 0,05

ml H2O 1,30 1,30 0,95 1,25

ml H4 (20 µg/ml) 0,05 0 0 0

ml M4 (12,5 µg/ml) 0 0,05 0 0

ml Normalserum 0 0 0,40 0

ml Herzinfarktserum 0 0 0 0,10

Die Proben werden gut gemischt und bei Raumtemperatur für 1,5 Minuten stehen gelassen.
Anschließend wird die LDH-Aktivität pro Volumen, wie im Teil A beschrieben, bestimmt.
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abgelesene Extinktion

sec H4 M4 normal Infarkt-


Serum serum

30

Start durch Zugabe von Pyruvat (0,1 ml/Küvette)

15

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

3. ELEKTROPHORESE DER LDH-ISOENZMYE AUF ZELLULOSEACETATFOLIEN

Vom Assistenten werden Gewebeextrakte aus Herz, Leber und Niere einer Maus für die
Zelluloseacetatfolien-Elektrophorese ausgegeben.

Die Elektrodenräume des Elektrophoresegefäßes werden mit je etwa 400 ml Veronal-Puffer


bis zur Markierung gefüllt, die restlichen 100 ml werden in eine Glasschale gefüllt, wo sie
zum Befeuchten der Folien dienen. Die Folien, von denen jede zum Auftragen von 3 Proben
geeignet ist, können im trockenen Zustand mit Kugelschreiber bezeichnet werden. Die
Streifen werden vorsichtig auf die Oberfläche des restlichen Puffers in die Glasschale gelegt
und erst untergetaucht, wenn sie die Lösung vollständig aufgesaugt haben. Nach etwa 5 min
werden die Membranen wieder aus der Lösung genommen und zwischen zwei Filterpapier-
streifen von überschüssiger Flüssigkeit befreit. Mit der Pinzette (!) werden sie so in die
Streifenträger eingesetzt, dass die Stifte in die Perforationslöcher greifen und das Streifen-
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ende in die Pufferlösungen eintauchen. Diese zuletzt genannten Handgriffe vom Ablöschen
der Folien an müssen rasch durchgeführt werden, damit die Streifen nicht wieder trocknen,
was durch das Auftreten weißer Flecken angezeigt wird. Von den zu untersuchenden Pro-
teinlösungen wird jeweils ein Tropfen auf ein Stückchen Parafilm pipettiert. Durch vorsich-
tiges Berühren der Tropfenoberfläche mit dem Mikroauftragstempel wird eine geringe, je
nach Stempelgröße definierte Menge der Lösung aufgenommen und kurz auf die Folie durch
einfaches Niederdrücken der Taste und unter Verwendung der Auftragsbrücke überstempelt.
Zwischen den einzelnen Auftragungen ist die Stirnseite des Stempels mit aqua dest.
(Spritzflasche) zu reinigen und durch Auftupfen auf Filterpapier abzutrocknen. Zur
Verminderung der Diffusion sollen die Proben in rascher Folge aufgetragen werden. Nach
dem Entfernen der Auftragsbrücke und dem Aufsetzen des Deckels wird an das Gerät eine
Spannung von 200 Volt gelegt. Dabei ist zu beachten, dass die meisten LDH-Isoenzyme
(und auch Serumproteine) bei dem gewählten pH-Wert von 8.6 mehr oder weniger stark
anodisch wandern, wofür ihnen der größte Teil (etwa drei Viertel) der Folie als Laufstrecke
zur Verfügung stehen muss. Die Elektrophoresedauer beträgt für die Trennung der LDH-
Isoenzmye ca. 60 min. Danach werden die Enzymbanden als blauviolette Streifen sichtbar
gemacht. Die Membranen werden von den Färbegelen abgelöst, unter aqua dest.
gewaschen und zwischen Filterpapier getrocknet.

LDH-spezifische Anfärbung

Man bereitet ein 1%iges Agarosegel, indem man 1,0 g Agarose in 100 ml Elektrophorese-
puffer unter kräftigem Rühren auf dem Magnetrührer zum Sieden erhitzt und im Thermo-
staten auf 45°-50°C abkühlen lässt. In 25 ml dieser Lösung (45°-50°C warm!) werden

2 mg NAD
5 mg Tetrazoliumsalz (MTT)
200 mg Lithium-Lactat und einige Körnchen
Phenacinmethosulfat

gelöst. Auf Objektträgern (Nivelliertisch) verteilt man je 2 ml dieser Mischung und lässt sie
erstarren. Diese Färbegele sind vor Beendigung der Elektrophorese herzustellen und bis
zum Gebrauch vor Licht geschützt aufzubewahren. Auf sie werden die Folien mit der Auf-
tragseite nach unten sofort nach Abschalten des Stromes und Entnahme der Streifen
luftblasenfrei von der Mitte aufgelegt. In der Dunkelheit wird ca. 15 min inkubiert. Danach
werden die Folien mit Wasser abgewaschen und zwischen 2 Lagen Papier getrocknet.
37

D. AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION

Zu Versuch 1

Berechnen Sie aus der Differenz der Anfangsextinktion und der Extinktion nach Ende der
Reaktion mit Hilfe des Lambert-Beer'schen Gesetzes die Konzentration der Pyruvat-Lösung.
38

Zu Versuch 2

A Für jede Küvette sollen die gemessenen Extinktionswerte in Abhängigkeit von der
Zeit graphisch dargestellt werden. Für jeden Ansatz soll aus dem linearen Teil der
Darstellung die Abnahme der Extinktion pro Zeit (ΔE/min) ermittelt werden und
daraus die Aktivitäten der LDH pro Volumen (µmol . min . ml-1) in den einzelnen
-1

Ansätzen berechnet werden. Das erstellte Bild bitte einkleben.

(Für die Berechnung siehe "Grundlagen der Enzymkinetik")


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B Zuerst wie in Teil A beschrieben die LDH-Aktivitäten pro Volumen in (µmol.min-1.ml-1)


berechnen.

Anschließend soll aus den Daten der Anteil an denaturierter H4 in der gereinigten H4-
Probe errechnet werden. M4 dürfte vollständig denaturiert worden sein. So kann an-
genommen werden, dass die verbleibende Aktivität im Harnstoff behandelter Seren
ausschließlich auf H4-Aktivität zurückzuführen ist. Der Verlust an H4-Aktivität wird mit
dem oben bestimmten Anteil an H4-Denaturierung korrigiert. Bei der Berechnung der
Aktivitätswerte der Seren wird dieser prozentuale H4-Verlust während der Harn-
stoffbehandlung berücksichtigt.
40

Zusammenfassung

LDH-Aktivität pro Volumen Verlust

vor Harnstoff- nach Harnstoff-


Probe behandlung behandlung
U/ml U/ml %

H4

M4

Normalserum

Herzinfarktserum

Anteile in %

H4 nicht H4

Normalserum

Herzinfarktserum
41

Zu Versuch 3

Beschreiben Sie, welche LDH-Isoenzyme in Ihrer Gewebe-Probe nachgewiesen werden


konnten.
42

E. SCHLUSSFOLGERUNGEN

Zu den häufigsten Fehlern beim Experiment und seiner Auswertung siehe "Grundlagen der
Enzymkinetik".