Práctica Nº2 Biología

Molecular

•
Fundamento

El ADN se encuentra libre en el citoplasma de la célula procariota para su aislamiento

se debe tener en cuenta al rompimiento eficiente de las células. También la inhibición
de las enzimas Nucleasa y Proteasas que se liberan durante la disrupción celular. Este
Procedimiento tiene las siguientes etapas.

1. Degradación de la pared celular (compuesta por peptidoglicano)

mediante la actividad de la lisozima.
2. Lisis celular por disrupción de las membranas celulares por el
detergente dodecil sulfato de sodio (SDS). Este también reduce la
actividad de las nucleasas por su capacidad de desnaturalizar
proteínas. Nucleasa va a cortar en ADN y ARN
3. La adición de agentes quelantes como el ácido etilen diamino tetra
acético (EDTA) también inhibe las nucleasas removiendo los
cationes divalentes.
4. Purificación del DNA mediante la mezcla cloroformo-alcohol
isoamílico. Se usa para desnaturalizar y precipitar proteínas.
5. El DNA libre de proteínas se aísla mediante precipitación con etanol.

• Objetivo
• Observar e identificar el ADN

• Materiales

Materiales y equipos:

Dr. Mag. Rafael Prado Prado 10

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a. Incubadora bacteriológica a 37ºC.

b. Centrífuga.
c. Baño María a 60ºC.
d. Solución Salina Estéril (NaCl, 0.85%).
e. Solución de Lisozima (10 mg/ml).
f. SDS 25% (p/v).
g. Cloroformo-alcohol isoamílico (24:1).
h. Etanol 95%.
i. Etanol 70%.
j. Frasco de 10 ml.
k. Agua libre de nucleasas.

• Procedimientos

1. Inocular 50 ml de medio LB con una alícuota de cepa bacteriana

(Escherichia coli JM109). Incubar por 24 horas a 37ºC.

2. Verter cultivo bacteriano a un tubo Falcon de 15 ml y centrifugar a 6000

rpm durante 10 minutos. Eliminar sobrenadante.

3. Lavar las células con solución salina fisiológica-SSF: resuspender con 5

ml de SSF (NaCl 0.85% o NaCl 0.15 M), agitar con vortex por 2 minutos
y centrifugar a 6000 rpm por 10 minutos, eliminar sobrenadante.
4. Resuspender las células en 2.5 ml de NaCl (0.9%) 0.1M – 0.1 M EDTA,
agitar con vortex por 1 minuto y añadir 0.1 ml de solución de Lisozima
(10 mg/ml). Incubar la suspensión a 37ºC por 30 minutos.

5. Completar las lisis por adición de 200 ul de SDS al 25% (p/v) y calentar
esta preparación por 10 minutos a 60ºC en Baño María.Añadir Igual
volumen (1.25 ml) de solución cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y
mezclar suavemente. Luego centrifugar a 6000 rpm por 10 minutos a
temperatura ambiente.

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6. Separar la fase acuosa (superior) cuidadosamente con una pipeta

evitando contaminar con la fase inferior y transferirla a un frasco de 50
ml.

7. Suavemente agite la solución de ácidos nucleicos con una bageta o una

pipeta Pasteur mientras lenta y suavemente se añade dos y medio
volúmenes de etanol al 95%. Evitar la agitación vigorosa que puede
destruir el DNA.

8. El DNA forma una película fibrosa blanca en la interfase agua etanol. Se

continúa agitando suavemente hasta que se mezclen las fases y todo el
DNA haya quedado en la pipeta o bageta.
9. Secar el exceso de líquido presionando la pipeta en las paredes del
frasco.

10. Continuar la precipitación y deshidratación de la muestra por inmersión

del DNA adherido a la pipeta en un tubo de ensayo conteniendo etanol
al 70% (1 ml) y luego al 95% (1 ml).

11. Dejar secar a temperatura ambiente.

12. Para conservar el ADN colocar la pipeta con el ADN adherido en un

tubo Eppendorf con 500 ul de tampón TAE e nucleasas y hacer girar en
sentido inverso al de la precipitación. Conservar a temperatura de
congelación (-20º

1. Inocular 50 ml de medio LB con una alícuota de cepa bacteriana

(Escherichia coli JM 109). Incubar en agitación por 24 horas a 37º C.

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Al cabo de 24 horas el medio se turbia

por la presencia de bacterias (108 – 109
cel/ml).

El cultivo también se puede realizar en

una placa petri.

2. Verter el cultivo en tubos Falcon de 15ml y centrifugar a 6000 rpm

durante 10 minutos.

CENTRIFUGAR

Fase superior: medio

de cultivo usado

Fase inferior:
partículas
sedimentadas

3. Lavar los tubos con solución salina fisiológica estéril

(NaCl 0.85%): resuspender con 5 ml de solución salina y centrifugar a
6000 rpm durante 10 minutos, eliminar sobrenadante.

NaCl
0.85%

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CENTRIFUGAR

4. Resuspender las células en 2.5 ml de solución NaCl 0.85% - EDTA 0.1 M

y añadir 0,1 ml de solución de lisozima (10 mg/ml). Incubar la
suspensión a 37ºC por 30 minutos en agitación.

NaCl 0.85% 25 ml.

EDTA 0.1 M

Lisozima 10 mg/ml
5. Completar la lisis por adición de 0,2 ml de
SDS al 25% (p/v) y calentar esta preparación
por 10 minutos a 60 ºC en baño maría.

SDS 25% 0,2 ml o 200 ul.

Toda la turbidez de la
suspensión se vuelve
transparente.

El baño María acelera la

Dr. Mag. Rafael Prado capacidad
Prado de destrucción de 10
los lípidos por parte de la
SDS.
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6. Añadir 3.5 ml de solución cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y mezclar

suavemente.

Al colocar el cloroformo-alcohol
isoamílico se debe mezclar
suavemente y no agitar ya que
se pueden romper las moléculas
de DNA. Los grumos que se
observan son debido a la
presencia de proteínas.

7. Transferir la mezcla a un tubo Falcon de 15 ml y centrifugar a 6000 rpm

por 10 minutos a temperatura ambiente.

CENTRIFUGAR

Solo se requiere el DNA. Lo demás se

considera contaminante.

DNA en solución acuosa

Cloroformo, alcohol Isoamílico y lípidos

Dr. Mag. Rafael Prado Prado
Proteínas coaguladas, restos de pared de 10
membrana.
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8. Separar la fase acuosa (superior) cuidadosamente con una pipeta

evitando contaminar con la fase inferior y traspasarla a un frasco de 10
ml.

El DNA se encuentra enrollado en

la pipeta como una mucosidad,
formando una película fibrosa.

9. Agitar suavemente la solución de ácidos nucleicos con una bagueta

mientras se añade lenta y suavemente dos volúmenes de etanol al 95%.
Evitar la agitación vigorosa que puede destruir el DNA.

Etanol 95%

2
Dr. Mag. Rafael Prado Prado volúmenes 10
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El DNA forma una película fibrosa en la interfase agua etanol. Se continúa

agitando suavemente hasta que se mezclen las fases y todo el DNA haya
quedado en la bagueta.

10. Secar el exceso de líquido presionando la bagueta en las paredes del

vaso de precipitación.

11. Lavar la muestra por inmersión del DNA adherido a la bagueta en un

tubo de ensayo conteniendo etanol al 70% (1ml) y luego al 95% (1ml).

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Etanol 70º Etanol 90º

12.Dejar secar a temperatura ambiente.

13. Recuperar el DNA en un tubo de ensayo con agua destilada libre de

nucleasas o buffer TE (tris-EDTA), mediante agitación de la bagueta en
sentido reverso.

Se conserva en un tubo
Eppendorf. Se agita en sentido
contrario para que el DNA se
libere de la pipeta. Queda
disuelto en agua ultra pura o
Buffer

• Fundamentos:
la extracción del ADN requiere una serie de etapas básicas en 1er Tendrá q
ue romperse la pared celular y la membrana plasmática para atender al
núcleo de la célula. A continuación debe romperse la membrana nuclear para
dejar libre e ADN, por ultimo Hay que proteger el ADN de la acción enzimática
y finalmente para aisar el ADN este debe presipitar el alcohol.

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• Objetivos

Durante la presente practica el estudiante:

1. Analiza el proceso de extracción de DNA

2. Describe las etapas de extracción de DNA bacteriano

Materiales
1. Una porción de hojas de espinaca
2. Detergente liquido
3. Sal
4. Agua destilada
5. Zumo de piña o de papaya
6. Alcohol al 96º
7. 1 baso de precipitado
8. Tubos de

1) Explique la función que cumple el detergente en la prueba de

extracción de célula vegetal también la sal?

.El detergente cumple la función de destruir las membranas celulares la sal encargada
de dar el medio hipertónico que se necesita.

2) Explique el mecanismo y la función que cumple el jugo de

papaya

Las papayas son ricas en su componente llamado PAPAINA o PAPAYOTINA ,es una
enzima con propiedades parecidas a la pepsina o la tripsina, para romper los enlaces
peptídicos.

3) Explique la función que cumple el alcohol en la siguiente

practica
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Sirve para formar 2 fases y es en la interfase que hará su aparición posteriormente al

ADN

4) El material Obtenido en la práctica es una mezcla de ADN?

Abra presencia de ARN en dicho material?

Si hay ARN por que después de obtener en interfase las moléculas de ADN no
purificado como es un experimento purificado por electroforesis teniendo como
agregados dentro la molécula de ARN

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