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Actividad tripanocida de flavonoides aislados de plantas medicinales argentinas.

Autores: Ulloa J., Sülsen V., Frank F., Cazorla C, Redko F., Coussio J., Malchiodi E.,
Muschietti L., Martino

Introducción
Las enfermedades causadas por protozoarios son responsables de una considerable
mortalidad y morbilidad en el mundo, predominantemente en las regiones tropicales y
subtropicales. La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana, producida por el
protozoo flagelado Trypanosoma cruzi, es un problema grave de salud pública en América
Latina. En la actualidad hay 90 millones de personas en riesgo de contagio y 24.7 millones de
infectados, de los cuales se estima que el 25% desarrollará una miocardiopatía chagásica
crónica (López y col., 2006). Los efectos adversos y la resistencia emergente a las drogas
actualmente disponibles en el mercado conlleva la necesidad urgente de encontrar nuevos
agentes terapéuticos contra estas enfermedades.

Si bien son numerosos los avances alcanzados en biología molecular, éstos no se han
traducido en nuevos medicamentos dirigidos a las necesidades de los pacientes para el
tratamiento de infecciones parasitarias (Troullier, 2002). Es necesario el descubrimiento de
moléculas novedosas con diferentes mecanismos de acción respecto a las drogas
antiprotozoarias ya existentes (Phillipson y Wright, 1991). Los productos naturales de origen
vegetal constituyen una fuente potencial de nuevas drogas, ya que los compuestos
provenientes de ellos son extremadamente útiles como moléculas líderes para la modificación
sintética y optimización de la bioactividad. En este contexto y como parte de nuestra
investigación sobre compuestos antiparasitarios de origen natural, hemos informado en un
trabajo previo la actividad tripanocida de 12 plantas medicinales argentinas (Sülsen y col.,
2006). De las especies ensayadas, los extractos orgánicos de Ambrosia tenuifolia y
Eupatorium buniifolium fueron los más activos con porcentajes de inhibición de las formas
epimastigótes de T. cruzi mayores al 70% a 100 µg/ml. Estos extractos se seleccionaron para
un estudio posterior con el fin de aislar e identificar los compuestos responsables de la
actividad tripanocida, que puedan servir de base para el desarrollo de drogas más eficientes
para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.

La especie Ambrosia tenuifolia Sprengel (Asteraceae) es un arbusto comúnmente conocido

como “ajenjo del campo”, “altamisa”, saltamisa” o “artemisa” que se encuentra distribuido en el
norte y centro de la República Argentina. La infusión de las partes aéreas y raíces se usa
tradicionalmente para tratar fiebres intermintentes, como estimulante, vermífugo, antineurálgico
y para dolores gastrointestinales (Hieronymus 1882; Saggesse 1959).

Eupatorium buniifolium H. et Arn. (Asteraceae) es un arbusto conocido vulgarmente como

“romerillo”, “romerillo colorado” o “chilca” que suele encontrarse en las regiones central y
noreste de Argentina. La infusión de las partes aéreas se utiliza en forma tradicional contra
dolores reumáticos (Ríos y col., 1993), en afecciones gastrointestinales (Burgstaller, 1999) y
como desinfectante (Rojas Acosta, 1905). De esta especie se identificaron flavonoides,
derivados del ácido hidroxicinámico (Muschietti y col., 1994) y ent-labdanos (Carreras y col.,
1998). La actividad antioxidante (Paya y col., 1996), antiviral (García y col., 1990), analgésica
(Miño y col., 2005) y la identificación de tres compuestos con actividad antiinflamatoria
(Muschietti y col., 2001) han sido previamente informados.

Materiales y métodos
Procedimientos experimentales generales. Los espectros UV e IR se realizaron en un
espectrofotómetro Shimadzu UV2101PC y un espectrofotómetro Bruker FT-IR IFS25
respectivamente. Los espectros de masa se midieron en un equipo Shimadzu QP 5000-GC 17
A y los de 1H-NMR (CDCl3) a 300 MHz en un equipo Bruker MSL 300. Para el analisis por
HPLC se empleó una columna semipreparativa RP-18 (LiChrospher, 5 m (125 x 4).

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Parásitos. Las formas epimastigotes de T. cruzi (cepa República Argentina) se hicieron crecer
en un medio bifásico y los cultivos se conservaron a 28ºC, manteniéndose mediante pasajes
semanales. El número se determinó con un hemocitómetro de Neubauer.

Material vegetal. La especie A. tenuifolia se recolectó en la provincia de Buenos Aires,

Argentina en abril de 2005. El material vegetal fue identificado por el Dr. G. Giberti y un
espécimen de herbario (BAF 649) está depositado en el Herbario del Museo de
Farmacobotánica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires.
E. buniifolium se recolectó en la provincia de Entre Ríos, Argentina, en mayo de 2004 y fue
identificado por el Ing. J. de D. Muñoz. Un espécimen de herbario (ERA-MUÑOZ 5067) se
encuentra depositado en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional de
Entre Ríos.

Extracción y aislamiento. Las partes aéreas de A. tenuifolia (1000 g) y de E. buniifolium (300 g)

se secaron al aire, se molieron a polvo fino y se extrajeron con CH 2Cl2-MeOH (1:1) según lo
descripto previamente (Sülsen et al., 2006). El fraccionamiento de estos extractos se llevó a cabo
de la siguiente manera:
20 g del extracto orgánico de A. tenuifolia (ATOE) se purificó por cromatografía en columna (CC)
de Si gel 60 (500 g) eluyendo con ciclohexano, ciclohexano-EtOAc (5:5), EtOAc y MeOH. Se
recolectaron 24 fracciones de 500 ml cada una. El análisis por cromatografía en capa delgada
(TLC) de las fracciones (FE: Si gel 60 F254; FM: tolueno-EtOAc (5:5) permitió combinar aquellas
idénticas hasta obtener un total de 5 fracciones F1AT-F5AT. La fracción F4AT (3g) fue sometida a CC
de Sephadex LH-20 (110 g) eluída con un gradiente de n-hexano-EtOAc (100:0 a 0:100) y
MeOH 100%, obteniéndose un total de 120 fracciones de 10 ml cada una. De las fracciones 105-
107 se obtuvo el compuesto 1.
20 g del extracto orgánico de E. buniifolium se purificaron por CC de Si gel 60 (500 g), eluyendo
con ciclohexano, ciclohexano-EtOAc (5:5), EtOAc and MeOH. Se recogieron 18 fracciones de
500 ml cada una. Los eluatos se monitorearon por TLC (FE: Si gel 60 F 254, FM: tolueno-EtOAc
(5:5) y se reunieron en 5 fracciones finales (F1EB-F5EB). La fracción F2EB (5 g) se sometió a una CC
de Sephadex LH-20 (100 g) eluyendo con un gradiente de solventes de hexano/EtOAc (100:0 a
0:100) y EtOAc/MeOH (100:0 a 0:100). Se recolectaron 70 fracciones que fueron reunidas en 13
grupos (F2EB.1-F2EB.13) de acuerdo a su perfil cromatográfico (TLC). De la fracción F2EB.7 purificada
por TLC preparativa seguida de HPLC semipreparativa en fase reversa (RP-18, gradiente de
MeOH/H2O, flujo = 1 ml/min) se obtuvo el compuesto 2.
Compuesto (1): polvo amarillo. UV λ max=MeOH: 275, 335; NaOMe: 222, 276, 328, 395; AlCl3:
222, 252 (sh), 267 (sh), 302, 360; AlCl3/HCl: 222, 252 (sh), 267 (sh), 301, 354; NaOAc: 221,
275, 299, 344, 350; NaOAc/H3BO3: 275, 341. MS: m/z= 300 [M+] (100%), 285 [M- Me]+ (47%),
282 [M-H2O]+ (40%), 257 [M-MeCO]+ (45%), 167 [A1-Me]+ (11%), 139 [A1-MeCO]+ (17%), 121
[B2]+ (7%), 118 [B1]+ (11%). 1H-NMR (500 MHz): δ = 3.72 (3H, s, OCH3), 6.60 (1H, s, 3-H), 6.70
(1H, s, 8-H), 7.05 (2H, d, H-3´, 5´), 7.95 (2H, d, H-2´, 6´).
Compuesto (2): polvo amarillo. IR (KBr): ν max (cm-1)= 3376, 2938, 2856, 1724, 1654, 1610,
1466, 1370. UV: (λ max, nm)= MeOH: 270, 338; NaOMe: 275, 290 (sh), 370; AlCl 3: 230 (sh),
278, 290 (sh), 310 (sh), 350; AlCl3/HCl: 280, 290 (sh), 300 (sh), 355, 410 (sh); NaOAc: 273,
298 (sh), 365; NaOAc/ H3BO3: 273, 298 (sh), 365. EI-MS: m/z= 344 [M+] (100%), 343 [M-1]+
(45%), 329 [M-Me]+ (67%), 326 [M-H2O]+ (33%), 315 [M-HCO]+ (13%), 311 [M-Me-H2O]+ (18%),
301 [M-MeCO]+ (46%), 283 [M-Me-CO-H2O]+ (34%), 258 [M-Me-CO-MeCO]+ (22%), 167 [A1-Me]
+
(22%), 139 [A1-MeCO]+ (8%), 135 [B2]+ (38%), 132 [B1]+ (12%), 111 [A1-MeCO-CO]+ (13%).
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H-NMR (500 MHz): δ = 3.85 (3H, s, OCH3), 3.90 (3H, s, OCH3), 4.04 (3H, s, OCH3), 6.55 (1H,
s, 8-H), 7.03 y 8.08 (2H, d, H-3´, 5´ y H-2´, 6´).

Ensayos biológicos
Determinación de la actividad tripanocida. La inhibición del crecimiento de las formas
epimastigotes de T. cruzi se evaluó en concentraciones finales de 0.3 a 100 g/ml de cada
compuesto. Los parásitos en crecimiento exponencial se centrifugaron a 1200 g x 15 min y se

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ajustaron a una densidad celular de 1.5 x 10 6 parásitos/ml en medio LIT fresco suplementado
con suero fetal bovino (Gibco®) al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina.
Los parásitos se sembraron en microplacas de 96 pocillos (150 l/pocillo) y se hicieron crecer
por 72 h en ausencia (control) o en presencia de las diferentes concentraciones de los
compuestos (por triplicado para cada una de las 6 concentraciones analizadas) a 28 ºC. Los
controles negativos conteniendo etanol:agua se ensayaron en paralelo. Como control positivo
se utilizó Benznidazol (Roche) a 5, 10, 15 y 20 M. A las 16 hs las células se incubaron con
pulsos de 1 Ci por pocillo de (3H)-timidina (Perkin Elmer). Las cuentas por minuto (cpm) de
los cultivos por triplicado se midieron con un contador de centelleo líquido automático
(Packard, Downers Grove, IL). El porcentaje de inhibición fue calculado como 100 – [(cpm de
parásitos tratados/cpm de parásitos no tratados) x 100]. La concentración del compuesto a la
cual el crecimiento del parásito es inhibido en un 50% (IC50) fue calculada usando un método
matemático basado en los principios de un triangulo recto: CE50: D – [(A – 50% respuesta
máxima) . X]/Y ; A: respuesta inmediatamente superior al 50% de la respuesta máxima; D: log
concentración correspondiente a la respuesta A; C: log concentración correspondiente a la
respuesta B; X: D – C; Y: A – B (Alexander y col., 1999).

Resultados y Discusión
A partir del fraccionamiento de los extractos orgánicos de A tenuifolia y E. buniifolium se
aislaron dos compuestos con actividad tripanocida sobre las formas epimastigotes de T. cruzi.
Los compuestos 1 y 2 se identificaron como los flavonoides hispidulina y santina
respectivamente, por comparación de sus datos espectroscópicos (IR, UV, MS y 1HRMN) con
los reportados en la literatura (Ferraro y col., 1987; Sachde K, Kulshreshlha, 1983). La
hispidulina había sido aislada previamente de esta especie por Silva et al.(1992). Esta es la
primera vez que se informa la presencia de santina en E. buniifolium.
Los resultados del ensayo in vitro de ambos flavonoides, a diferentes concentraciones, se
presentan en la Fig.1. A 100 g/ml la hispidulina inhibió la replicación del parásito un 78.87%
y la santina un 95.20% con valores de IC50 de 14.00 g/ml y 16.79 g/ml respectivamente.
Los flavonoides son compuestos polifenólicos naturales ampliamente distribuidos en el reino
vegetal. Presentan gran número de actividades farmacológicas (antioxidante, antiinflamatoria,
anticarcinogénica, hepatoprotectora, antitrombótica, antialérgica y antiviral), algunas de las
cuales sugieren que ciertos miembros de este grupo podrían afectar significativamente la
función de varios sistemas celulares de los mamíferos. (Middleton y col., 2000). La actividad
tripanocida de los flavonoides y su relación estructura-actividad (SAR) ha sido extensamente
investigada por Tasdemir y col. (2006).
Un posible mecanismo de acción de los flavonoides como agentes tripanocidas sería su
capacidad para interactuar con la proteína gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH)
de T. cruzi que inhibe la principal vía de producción de ATP en el parásito. Se ha demostrado
que las flavonas e isoflavonas altamente oxigenadas resultan los compuestos más activos
como inhibidores de esta proteína (Moraes y col., 2003).
La hispidulina ya ha sido descripta como antioxidante, espasmolítica y anticonvulsivante
(Dabaghi-Barbosa y col., 2005; Hazekampet y col., 2001; Kavvadias y col., 2004). Las
principales actividades biológicas informadas para la santina son aquellas relacionadas con
sus propiedades antiinflamatorias tanto in vivo como in vitro (Martinez y col., 1997; Silvan y
col., 1998; Abad y col., 2004). Sin embargo, esta es la primera vez que se describe la actividad
tripanocida de estos compuestos.
Conclusiones
Se concluye que los flavonoides hispidulina y santina, aislados de las especies A. tenuifolia y
E. buniifolium respectivamente, poseen actividad tripanocida contra las formas epimastigotes
de T. cruzi. Se continúa con la evaluación de la actividad in vivo y la identificación de otros
compuestos bioactivos provenientes de estas especies.

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100
100 µg/ml
30 µg/ml
75
10 µg/ml
% In h ib ic ió n

3 µg/ml
50
1 µg/ml
0.3 µg/ml
25

0
Hispidulina Santina
Fig 1. Inhibición del crecimiento de epimastigotes de T. cruzi

Agradecimientos Esta investigación es subsidiada en parte por PICT 2002 05-11240 (Agencia
Nacional de Promoción Científica y Tecnológica), PIP 02419 (Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas) y UBA-CYT B101.

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