Alim. Nutr.
, Araraquara
v.19, n.1, p. 43-53, jan./mar. 2008
DESENVOLVIMENTO DE UMA BEBIDA LÁCTEA
PROBIÓTICA UTILIZANDO COMO SUBSTRATOS SORO
DE LEITE E EXTRATO HIDROSSOLÚVEL DE SOJA
RESUMO: Recentemente, a indústria de alimentos tem
mostrado grande interesse em desenvolver novos produtos
lácteos fermentados por microrganismos probióticos. Estes
microrganismos têm a capacidade de manterem-se vivos no
produto fermentado e sobreviverem à passagem pelo trato
gastrointestinal, trazendo melhorias no balanço da flora mi-
crobiana de indivíduos que consumam periodicamente es-
tes produtos. Neste trabalho, utilizou-se a técnica do plane-
jamento de experimentos para determinar a formulação da
bebida láctea utilizando como substratos leite de vaca, soro
de leite e extrato hidrossolúvel de soja. Através de análises
sensoriais determinou-se a aromatização da formulação es-
colhida, e associadas a análises físico-químicas e microbio-
lógicas determinou-se o tempo de prateleira do produto. A
formulação contendo 30% de extrato hidrossolúvel de soja,
36,6% de leite de vaca e 33,3% de soro de leite foi adotada
como sendo a formulação base ideal determinada por aná-
lises sensoriais e avaliação do crescimento celular duran-
te a fermentação. Durante o período de armazenamento, a
bebida láctea sabor morango apresentou células viáveis da
cultura mista adicionada dentro dos padrões estabelecidos
(1x106) até o 22° dia. A bebida láctea manteve a qualida-
de microbiológica no decorrer do período de estocagem. A
qualidade sensorial definiu o término do armazenamento
no 25° dia, pelo fato da bebida já apresentar uma acidez
bastante elevada, sendo rejeitada nas análises sensoriais.
PALAVRAS-CHAVE: Probióticos; formulação;
Bifidobacterium; bebida láctea; soja.
INTRODUÇÃO
A Ciência de Alimentos que anteriormente preocu-
pava-se em desenvolver alimentos para a sobrevivência hu-
mana passou a objetivar, recentemente, o conceito de pro-
duzi-los com qualidade. Aliado a isto, a idéia passou a ser
* Curso de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos – URI - Campus de Erechim - 99700-000 – Erechim – RS – Brasil.
** Departamento de Engenharia de Alimentos – URI – Campus de Erechim – 99700-000 – Erechim – RS – Brasil.
ISSN 0103-4235
Roberta KRÜGER*
Aniela Pinto KEMPKA*
Débora de OLIVEIRA**
Eunice VALDUGA**
Rogério Luis CANSIAN**
Helen TREICHEL**
Marco Di LUCCIO**
usá-los como veículo de promoção de bem-estar e saúde,
ao mesmo tempo reduzindo o risco de doenças.
Especificamente na área de laticínios uma nova ten-
dência que vem se apresentando é a produção de iogurtes
e leites fermentados funcionais. Isto porque, além destes
produtos possuírem grande aceitação pelo público em geral
e apresentarem excelente valor nutritivo, são veículos em
potencial para o consumo de probióticos.3 Segundo Heller9,
os consumidores estão familiarizados com o fato de que
alimentos fermentados podem apresentar microrganismos
vivos.
De acordo com a definição atualmente aceita, os
probióticos são microrganismos vivos que, quando ingeri-
dos em concentrações adequadas, exercem benefícios para
a saúde do consumidor. Os microrganismos mais frequen-
temente utilizados como probióticos pertencem ao grupo
das bactérias ácido lácticas, destacando-se, entre elas, os
gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium, que são usados
há séculos na produção de leites fermentados. Dentro de
cada um dos géneros existem várias espécies, por exem-
plo, Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium bifidum.
Existem outros microrganismos, que não bactérias, que
também são usados como probióticos, como é o caso de
algumas leveduras, em particular a espécie Saccharomyces
boulardii.11
Apenas iogurtes e leites fermentados contendo cul-
turas probióticas devem ser considerados funcionais.2 No
entanto, os consumidores em geral não sabem distinguir
quais são os produtos lácteos funcionais. A própria legisla-
ção brasileira para alimentos funcionais é incipiente.3
Uma questão ainda não conclusa pela literatura é a
quantidade e frequência de consumo de probióticos neces-
sários para assegurar os benefícios funcionais a eles atri-
buídos.8 Preconiza-se a ingestão semanal mínima de 300 a
500 gramas de produtos lácteos fermentados contendo en-
tre 106 a 107 UFC/mL. As embalagens de leites fermentados
comercializados no Brasil apresentam geralmente 80mL de
produto e, segundo Saxelin et al.14 essas garrafas pequenas
43
fazem parte do conceito de “dose diária” de companhias
multinacionais. A ingestão diária de leites fermentados em-
balados em garrafas de 80mL totaliza consumo semanal de
560mL. É preciso, no entanto, que estes produtos tenham
sido fabricados adequadamente e estocados na temperatura
de refrigeração correta para de fato apresentarem quantida-
de alta de microrganismos probióticos viáveis.
No Brasil, dos diversos leites fermentados disponí-
veis no mercado, apenas alguns contêm no rótulo a identi-
ficação do microrganismo presente. Em geral, o fabrican-
te limita-se a informar que o produto contém “fermentos
lácteos”. No entanto, a linhagem do microrganismo presen-
te no produto, bem como o número de células viáveis desta
cultura é que determina se este é ou não funcional. A legis-
lação deveria exigir que fosse veiculada esta informação no
rótulo para assim permitir aos consumidores a escolha de
produtos com linhagens potencialmente benéficas à saúde.
Além disso, sem estas informações do fabricante, é impos-
sível o controle de qualidade pelas agências governamen-
tais de fiscalização.3
Neste contexto, as investigações científicas mais
recentes têm demonstrado clara e inequivocamente a rele-
vância para a saúde de dois microrganismos probióticos:
Bifidobacterium, uma bifidobactéria (família de bactérias
benéficas presentes na flora intestinal ao nível do cólon) e
Lactobacillus acidophilus (presente na flora intestinal do
intestino delgado). Estas bactérias têm ações que se poten-
cializam mutuamente, isto é, têm entre si uma relação de
simbiose.5
Por outro lado, os produtos à base de soja exempli-
ficam as características que se buscam nos alimentos fun-
cionais. Além de possuírem uma proteína em quantidade e
qualidade, melhorariam os aspectos de funcionalidade dos
alimentos e o seu consumo regular contribuiria para dimi-
nuir os níveis de colesterol e triglicerídeos, prevenindo,
além disso, certos tipos de câncer. Além das vitaminas e
minerais, a soja é também fonte de fibras com propriedades
funcionais.10
Aliado à utilização do extrato hidrossolúvel de soja
no desenvolvimento de novos produtos com características
funcionais, as proteínas do soro de leite também contribuem
para reduzir o colesterol sangüíneo, oferecendo certa prote-
ção contra as doenças cardiovasculares. O uso de produtos
de soro, além dos benefícios nutricionais, oferece uma boa
relação custo/benefício.10
Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desen-
volver uma bebida láctea fermentada sabor morango utili-
zando como substratos soro de leite, extrato hidrossolúvel
de soja e leite de vaca.
MATERIAL E MÉTODOS
Matérias – Primas
As matérias-primas utilizadas na composição do
substrato para fermentação foram leite de vaca, extrato hi-
44
drossolúvel de soja e soro de leite. Utilizou-se leite UHT
desnatado, adquirido em estabelecimentos comerciais da
cidade.
O extrato hidrossolúvel de soja foi produzido no
Laboratório de Análise Sensorial do Centro Tecnológico da
URI – Campus de Erechim, seguindo metodologia indicada
pela EMATER regional.
O soro de leite, subproduto da produção de queijo
tipo lanche, foi gentilmente cedido pela Empresa COOCEL
(Cooperativa de Prestação de serviços, Industrialização,
Comercialização e Consultoria do Alto Uruguai Ltda).
Culturas Láticas
Para o desenvolvimento deste trabalho utilizou-
se uma cultura mista de Streptococcus thermophilus,
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus
acidophilus e Bifidobacterium sendo representada pelo
nome comercial My Bio 6 e My Bio 2 procedentes da
RHODIA BRASIL Ltda.
A cultura apresentava-se liofilizada e procedeu-se
sua reativação em leite em pó desengordurado após este ter
sido hidratado e esterilizado em autoclave a 121oC por 15
min, e conservado em estufa por 24 horas a temperatura de
37oC; procedimento este efetuado de acordo com recomen-
dações do fornecedor. Após este período, o inóculo foi repi-
cado em caldo MRS (de Man, Rogosa e Sharp – MERCK)
estéril, sendo utilizado 1mL de inóculo para 10mL de meio.
O meio foi mantido em estufa a 37oC por 24 horas. Após
esta etapa, os pré-inóculos foram conservados em geladeira
à temperatura de refrigeração até o momento de sua utili-
zação.
Métodos
Os métodos físico-químicos e os demais métodos
utilizados para produzir a bebida fermentada, acompa-
nhar a evolução da fermentação e a estabilidade da bebida
fermentada estão descritos a segui. A descrição detalhada
de alguns métodos, rotineiramente utilizados em análises
físico-químicas, são encontradas nas respectivas referên-
cias.
Métodos Físico-Químicos
Determinação do pH
Os valores de pH foram determinados em
potenciômetro digital (DIGIMED), devidamente calibra-
dos com soluções tampão de pH 7,0 e pH 4,0.12
Determinação da acidez total
A determinação da acidez total foi realizada medin-
do o teor de ácido lático presente em 100g de amostra pela
titulação com NaOH 0,1N de alíquota de 5mL de amostra
na presença de fenolftaleína como indicador.12
Determinação do crescimento celular Desproteinização do Soro de Leite

A determinação do crescimento celular da cultura
mista ou de um dos probióticos inoculados foi realizada
através de densidade ótica (D.O) da amostra, medida em
espectrofotômetro (Agilent Tecnologies) em comprimento
de onda de 650nm.
Obtenção do Extrato Hidrossolúvel de Soja
O fluxograma de obtenção do extrato hidrossolúvel
de soja é apresentado na Figura 1.
A metodologia empregada na obtenção do extrato
hidrossolúvel de soja foi desenvolvida a partir de dados
obtidos na EMATER regional, cujo processamento foi rea-
lizado manualmente.
A adição de bicarbonato de sódio (NaHCO3) foi rea-
lizada para promover a inativação da enzima lipoxigenase,
responsável pelo sabor indesejável de feijão cru, caracterís-
tico da soja.10
O soro de leite utilizado foi o soro proveniente da
fabricação do queijo tipo lanche. Após a coleta este mate-
rial foi aquecido a 80oC por 15 minutos e, posteriormente,
filtrado a fim de se promover a separação da proteína.16
Tratamento Térmico dos Substratos
O tratamento térmico foi realizado para a mistura de
extrato hidrossolúvel de soja, soro de leite e leite de vaca
nas devidas proporções. Corrigiu-se o pH da mistura para
7,5 com NaOH 0,4N, após as amostras de substrato foram
pasteurizadas em erlenmeyer de 500mL em banho-maria a
80oC por 20 minutos.10
Otimização das Condições Operacionais da Cultura
O objetivo desta etapa foi otimizar o crescimento
da cultura mista de S. thermophilus, L. delbrueckii subsp.
Bulgaricus, L. acidophilus e Bifidobacterium visando obter
as melhores condições de operação para a referida cultura.

Limpeza e seleção dos grãos

Adição de água

Fervura a 100oC/5 min

Lavagem em água corrente

Adição de água

Fervura a 100oC/5 min

Trituração dos grãos por 3 minutos

Adição de bicarbonato de sódio

Filtração com coador de pano esterilizado

Cozimento por 10 minutos após a fervura

Adição de sal e açúcar

Homogeneização

Extrato hidrossolúvel de soja

FIGURA 1 – Fluxograma do processo de obtenção do extrato hidrossolúvel de soja.

45
Para isto, utilizou-se uma técnica de planejamento de expe- realizados em duplicata e os dados apresentados referem-
rimentos, avaliando o efeito dos fatores: temperatura, pH e se a médias aritméticas, sendo os desvios-padrão obtidos
agitação sobre o crescimento celular. A análise estatística inferiores a 5%.
dos dados experimentais permitiu otimizar as condições
operacionais em função do crescimento celular. Posterior-
mente, esses dados foram utilizados para determinar as Tabela 3 – Experimentos realizados para obtenção da for-
condições de fermentação da bebida láctea. mulação base da bebida láctea- etapa 1.
O intervalo de estudo destes fatores foi definido em
função de resultados apresentados na literatura.16 Visando Extrato
Soro de Leite Leite de Vaca
avaliar o efeito das variáveis de processo no crescimento Ensaio Hidrossolúvel
(%) (%)
celular, um planejamento experimental completo 23 com de Soja (%)
triplicata no ponto central para avaliação do erro experi- 1 50 40 10
mental foi realizado. A Tabela 1 apresenta o intervalo de 2 40 50 10
estudo das variáveis independentes. 3 10 50 40
4 10 40 50
Tabela 1 – Intervalo de estudo das variáveis. 5 40 10 50
6 50 10 40
Variáveis (-1) (0) (+1) 7 33 33 33
Temperatura (ºC) 30 36 42
Agitação (rpm) 0 100 200
pH 5,5 6,5 7,5 Neste planejamento, através de correlações feitas
com o crescimento celular (D.O), avaliou-se que estas fai-
xas estipuladas para os substratos poderiam ser ampliadas.
Para cada experimento descrito utilizou-se para 1mL Visando a otimização da mistura, dois novos planejamen-
de inóculo para cada 50mL de caldo MRS. As amostras fo- tos (Tabelas 4 e 5) foram necessários para se obter uma
ram mantidas em agitador orbital em temperatura e agita- formulação base.
ção controladas e amostras foram retiradas de 2 em 2 horas
para avaliação do crescimento celular e pH. O crescimen-
to celular foi avaliado através da densidade ótica (D.O), a Tabela 4 – Experimentos realizados para obtenção da for-
qual foi determinada realizando-se leituras de absorbância mulação base para bebida láctea fermentada – etapa 2.
das amostras em espectrofotômetro (Agilent Tecnologies) Extrato
(λ=650nm) e pH em potenciômetro digital. Em uma pri- Soro de leite Leite de vaca
Ensaio hidrossolúvel
meira etapa foram realizados os experimentos apresentados (%) (%)
de soja (%)
na Tabela 2. 1 25 25 50
2 33 33 33
Tabela 2 – Matriz do planejamento experimental para oti- 3 22 45 33
mização dos fatores (valores reais e codificados). 4 30 45 25
Agitação
Ensaio T (°C) pH
(rpm) Tabela 5 – Experimentos realizados para obtenção da for-
1 30 (-1) 5,5 (-1) 0 (-1) mulação base para a bebida láctea fermentada – etapa 3.
2 42 (1) 5,5 (-1) 0 (-1) Extrato Leite de
3 30 (-1) 5,5 (-1) 200 (1) Soro de leite
Ensaio hidrossolúvel vaca
(%)
4 42 (1) 5,5 (-1) 200 (1) de soja (%) (%)
5 30 (-1) 7,5 (1) 0 (-1) 1 25 30 45
6 42 (1) 7,5 (1) 0 (-1) 2 33,3 30 36,6
3 30 25 45
7 30 (-1) 7,5 (1) 200 (1) 4 30 33,3 36,7
8 42 (1) 7,5 (1) 200 (1)
9 36 (0) 6,5 (0) 100 (0)
Obtenção da Bebida Láctea Fermentada e Aromatiza-
ção
Planejamento das Formulações
A Figura 2 apresenta o fluxograma geral para obten-
Após determinadas as condições de operação mais ção da bebida láctea fermentada.
favoráveis para o crescimento da cultura láctea, empregou- Após a pasteurização a 80oC por 20 minutos, as
se outro planejamento experimental (Tabela 3) visando amostras foram resfriadas à temperatura de 400C onde se
obter a concentração ideal de cada um dos substratos na procedeu à adição do estabilizante. Utilizou-se como esta-
formulação da bebida láctea. Todos os experimentos foram bilizante a Carragena (DCA – Indústria e Comércio Ltda)

46
na proporção de 0,1 grama para cada 100mL de produto,
padrão obtido na Legislação para produtos fermentados.10
Foram adicionados 2% de inóculo, para a mistura selecio-
nada. A mistura assim obtida era acondicionada em agita-
dor orbital nas condições de operação estabelecidas.
Formulação base
Tratamento térmico
Fermentação
Adição de estabilizante
Adição de aromatizante, corante e polpa
Embalagem
Armazenamento
Avaliação da estabilidade da bebida
FIGURA 2 – Fluxograma do processo de produção da be-
bida láctea fermentada.
A formulação otimizada foi aromatizada com aroma
artificial de morango (RCC 73993/9, RHODIA BRASIL
Ltda), colorida com corante artificial Vermelho Bordeaux
“S” (ARCOR), a seguir foi adicionada a polpa de morango
(MAYSA Ltda) e adoçante (sacarose).
As concentrações de aroma e de corante utilizadas
foram às indicadas nos rótulos dos produtos. Para as con-
centrações de polpa e de açúcar utilizou-se o resultado de
um planejamento de experimentos citado em estudo ante-
rior.16
Tratamento Estatístico
O tratamento estatístico dos dados foi realizado
segundo metodologia de planejamento de experimentos
e análise de superfície de resposta, em nível de 95% de
confiança, com auxílio do software Statistica 5.0 (Statsoft,
USA).
Avaliação da Estabilidade da Bebida Láctea
A bebida fermentada sabor morango foi armazena-
da sob refrigeração (4oC), em copos plásticos de 250mL
para avaliação de sua estabilidade físico-química, micro-
biológica e sensorial realizada a partir do primeiro dia, nos
intervalos de 7, 14, 19, 22 e 25 dias de estocagem, respec-
tivamente.
Estabilidade físico-química
A estabilidade físico-química da bebida foi avalia-
da em amostras coletadas ao acaso e homogeneizadas pre-
viamente às determinações de pH e acidez total (% ácido
láctico).
Estabilidade microbiológica
A avaliação microbiológica da bebida láctea sabor
morango, foi realizada paralelamente à avaliação físico-
química e sensorial, em amostras coletadas ao acaso. O
número de células da microflora essencial presente na
bebida, S. thermophilus, L. delbrueckii, subsp. Bulgaricus,
L. acidophilus e Bifidobacterium foi determinado pela
contagem total de células viáveis. Foram realizadas
diferentes diluições da amostra em água peptonada 0,1%,
conforme o tempo de fermentação, através de testes
prévios realizados, para que fosse possível a contagem das
colônias. Assim semeou-se 1mL de amostra, nas diluições
estabelecidas, em placa de Petry com meio MRS agar em
camadas. Incubou-se as placas invertidas em jarras de
anaerobiose, contendo gerador de atmosfera de CO2, dentro
de estufa à 42°C/48hs.10
A contagem celular mínima de cultura específica
recomendada para bebidas lácteas fermentadas é de 1,0 x
106 células viáveis/mL no momento do consumo. Alguns
autores indicam que a maioria dos produtos lácteos fermen-
tados apresenta-se na faixa de 1 x 107 UFC/mL e que este
valor poderia ser aceito com o possível limite mínimo para
a contagem celular.10
As demais determinações microbiológicas foram
efetuadas de acordo com metodologia descrita por Silva et
al.15 onde se avaliou a presença de coliformes fecais (NMP),
salmonella e contagem de bolores e leveduras. O número
mais provável de bactérias do grupo coliforme, embora não
estabelecido pela legislação, foi determinado, visto que es-
tes microorganismos são indicadores das condições higiê-
nicas mantidas durante o processamento do produto. Esta
determinação foi realizada pela semeadura de três séries
de tubos, contendo 9mL de caldo lauril sulfato triptose e
tubo de Durhan invertido, com 1mL de diferentes diluições
da amostra. Os tubos foram incubados a 37oC por 24 a 48
horas para verificar a formação de gás e turvação do meio,
indicativos da presença destes microorganismos. A partir
dos tubos positivos, com formação de gás, foram semeados
com alça de platina, os tubos contendo o meio Escherichia
coli (E.C), mantidos em banho-maria a 44,5oC por 24 à 48
horas para verificar a formação de gás. O NMP de colifor-
mes fecais/mL de amostra foi calculado pelo número de
tubos positivos confirmados.
A contagem de bolores e leveduras foi realiza-
da pela semeadura de diferentes diluições em meio Agar
Padrão para Contagem (PCA) previamente esterilizado,
com cloranfenicol. Nas placas adicionou-se aproximada-
mente 20mL de meio e colocou-se 1mL das diferentes di-
luições, distribuindo-se com uma alça de vidro. As placas
47
foram incubadas a 25oC por 5 dias e o resultado expresso
em UFC/mL.
A análise de presença de salmonellas foi realizada
em 25mL de amostra homogeneizada em 225mL de caldo
peptonado pré-enriquecimento em incubadora por 24 horas
a 37oC. Após a incubação, 1mL da solução foi transferi-
do para tubos contendo 9mL de meio enriquecido seletivo
(caldo selenito cistina e caldo tetrationato) e incubados a
37oC por 24 horas, após esse período com o auxílio de uma
alça de platina o material foi transferido para placas con-
tendo meio Ramback (MERCK). Esta placa foi novamente
incubada a 37oC por mais 24 horas, sendo a confirmação
dada pela presença de colônias vermelhas na placa.
Estabilidade sensorial
A ocorrência de alterações no sabor, aroma, apa-
rência e textura da bebida durante o período de armaze-
namento foram determinadas pela avaliação sensorial. As
amostras foram escolhidas ao acaso, homogeneizadas, dis-
tribuídas em copos plásticos, com codificação balanceada e
apresentadas à equipe de provadores selecionados. Foram
avaliados os atributos aparência, textura, aroma e sabor em
escala estruturada de 9 pontos.
A estabilidade das características sensoriais da be-
bida láctea fermentada sabor morango durante a estocagem
foi investigada em intervalos de 0, 7, 14, 19, 22 e 25 dias.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Estudo das Condições Operacionais da Cultura
Para se avaliar a melhor condição de processo para a
referida cultura utilizou-se um planejamento experimental,
testando-se diferentes níveis de pH, temperatura e agita-
ção. O efeito da agitação foi avaliado devido ao fato de
a cultura ser, segundo o fabricante, aeróbia facultativa. O
intervalo de estudo das variáveis foi definido em função de
resultados apresentados na literatura.16 O planejamento em-
pregado nesta etapa com os resultados da densidade ótica,
ao final da fase de latência da curva de crescimento durante
a fermentação, é apresentado na Tabela 6.
Tabela 6 – Crescimento celular obtido no planejamento ex-
perimental.
Experimento DO (λ=650nm)
1 2,7 (32 horas)
2 5,5 (24 horas)
3 2,5 (32 horas)
4 0,1 (12 horas)
5 3,6 (32 horas)
6 8,2 (24 horas)
7 13,0 (32 horas)
8 0,6 (16 horas)
9 0,2 (26 horas)
Conforme pode ser visualizado nas Figuras 2 e 3, a
temperatura e a agitação exercem grande influência sobre
48
o crescimento celular. À temperatura de 30oC, com agita-
ção de 0 e 200rpm, obteve-se o crescimento celular mais
acentuado com pH inicial do meio de 7,5, porém o experi-
mento com agitação apresentou uma fase lag muito longa,
o que seria inviável industrialmente. Aumentando-se esta
temperatura constatou-se um aumento no crescimento ce-
lular. A 42°C e 0 rpm observou-se que para o pH 7,5 a D.O.
chegou a valores próximos a 8, enquanto que a 200 rpm
o crescimento foi muito inferior. Cabe salientar que estas
contagens podem ser referentes cultura mista previamente
inoculada ou a qualquer um dos microrganismos presentes
na referida cultura.
Os dados cinéticos referentes aos experimentos rea-
lizados são apresentados nas Figuras 2, 3 e 4.
Para verificar a influência das variáveis de processo
no crescimento, foi realizada a análise estatística dos dados
experimentais. Os resultados estão apresentados na Tabela
7. Neste ponto, cabe frisar que a análise foi realizada para
um tempo de 18 horas, fase exponencial de crescimento
para todas as condições experimentais.
O modelo obtido para o crescimento celular em meio
sintético, com coeficiente de correlação (R2) = 0,9986, foi:
DO= 0,769+ 1,218*T+0,164*pH -1,57*agit -1,145*T*agit +1,06*pH*pH
Onde: T=temperatura; agit=agitação; pH=pH.
O desvio padrão médio dos parâmetros foi em tor-
no de 0,02, para as faixas estudadas. A análise estatística
dos dados experimentais confirmou que a temperatura e a
agitação foram os fatores que mais afetaram o crescimento
celular, sendo que a temperatura apresentou efeito positivo
e a agitação um efeito negativo no crescimento celular, este
último resultado já esperado já que as culturas lácteas são
anaeróbicas facultativas. Já a interação das variáveis tem-
peratura e agitação resultou em um efeito negativo, ou seja,
mesmo tendo uma temperatura ideal se existir agitação não
será obtido um bom resultado.
Com os resultados obtidos pode-se concluir que,
quando da utilização desta cultura mista em meio MRS, a
condição que maximiza o crescimento celular é a tempera-
tura de 42oC, pH inicial de 7,5 e agitação de 0rpm.
Planejamento das Formulações
A formulação base foi definida com base no cres-
cimento celular como aquela referente ao Experimento 4
(Tabela 5): 30% de extrato hidrossolúvel de soja, 33,3% de
soro de leite e 36,7% de leite de vaca.
Aromatização da Bebida Láctea
As concentrações de aroma e de corante utilizadas
foram as indicadas nos rótulos dos produtos. Para as con-
centrações de polpa e de açúcar utilizou-se o resultado de
um planejamento de experimentos citado em estudo ante-
rior.16
 4 14
13
pH 5,5 pH 5,5
12
pH 7,5 pH 7,5
11
3
10

Densidade ótica (650 nm)

Densidade ótica (650nm)

9
8
2 7
6
5
4
1
3
2
1
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
Tempo (horas) Tempo (horas)

(a) (b)

FIGURA 3 – Dados cinéticos obtidos no planejamento experimental: T=30°C, 0rpm (a) e 200rpm (b).

8 0,8

pH 5,5 pH 5,5
7
pH 7,5 pH 7,5

6 0,6
Densidade ótica (650 nm)

Densidade ótica (650 nm)

4 0,4

2 0,2

0 0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tempo (horas) Tempo (horas)

(a) (b)
FIGURA 4 – Dados cinéticos obtidos no planejamento experimental: T=42°C e 0rpm (a) e 200rpm (b).

2,5

pH 6,5

2,0
Densidade ótica (650 nm)

1,5

1,0

0,5

0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Tempo (horas)

FIGURA 5 – Dados cinéticos obtidos no planejamento experimental:

Ponto central – T=36°C, 100rpm.

49
Tabela 7 – Modelo estatístico experimental.
Modelo:
R= 0,99859 DO18= a0 + a1*T+a2*pH+a3*agit+a4*T*agit+a5*pH*pH
a0 a1 a2 a3 a4 a5
Parâmetro 0,769 1,218 0,164 -1,570 -1,145 1,061

Assim, definiu-se para 200mL de bebida láctea 10g
de polpa, 8g de açúcar, 0,25g de aroma e 0,1mL de coran-
te.
Estabilidade da Bebida Láctea
Estabilidade físico-química
A análise dos dados permitiu observar que durante
o período de estocagem da bebida, o pH apresentou dimi-
nuições consideráveis, visto que o pH inicial era de 4,98,
chegando a pH 4,35 no 19o dia de armazenamento, como
pode ser observado na Figura 5.
1,0
A utilização de bactérias bífidas em culturas mistas
possibilita a produção de compostos voláteis que mascaram
o sabor e aroma característico da soja em misturas fermen-
tadas.10
Tortelli 16 em um estudo com cultura mista de S.
thermophilus e L. delbrueckii subsp. bulgaricus, utilizando
a formulação base para a bebida láctea de 55% de extrato
hidrossolúvel de soja, 35% de leite de vaca e 10% de soro
de leite mostrou que durante o armazenamento a qualida-
de físico-química apresentou alterações significativas, pelo
fato da bebida inicialmente já apresentar um baixo valor
de pH, a acidez ficou bem evidenciada a partir do 7° dia.
Constatou-se que no 10° dia de armazenamento, a aparên-
cia e homogeneidade permaneceram praticamente inalte-
radas, havendo também pouca alteração no aroma global
5,0

0,9
e ácido, porém o sabor apresentou alterações significativas
0,8 4,8
no que diz respeito ao sabor de soja.
0,7
Acidez (% de ácido lático)

0,6 4,6 Estabilidade microbiológica

0,5
pH

0,4 4,4 A contagem celular mínima de cultura específica

0,3
0,2
acidez
0,1 pH
0,0
0 4 8 12
Tempo (dias)
FIGURA 6 – Relação entre pH e acidez durante o armaze-
namento da bebida láctea sabor morango.
A partir de 22 dias de estocagem verificou-se acen-
tuada acidificação do produto, causando a desestabilidade
da estrutura protéica e sua coagulação, visto que as proteí-
nas do leite apresentam ponto isoelétrico em pH próximo a
4,6010 e as da soja, pH 5,2.1
A elevada acidez e o baixo pH aos 25 dias de ar-
mazenamento, possivelmente esteja relacionada a ação do
Lactobacilus acidophilus, microorganismo conhecido pela
grande capacidade de produção de ácido no meio de fer-
mentação. Devido à sua característica de alta acidez, os
produtos acidófilos são apreciados por um grupo restrito de
consumidores.10
O uso de bifidobactérias em culturas mistas, prin-
cipalmente com lactobacilos, proporciona a formação de
ácido L(+)láctico e as propriedades benéficas associadas a
estas bactérias intestinais.10
recomendada para bebidas lácteas fermentadas é de 1,0 x
4,2
106 células viáveis/mL no momento do consumo (8). Al-
guns autores indicam que a maioria dos produtos lácteos
4,0
16 20 24 fermentados apresenta-se na faixa de 1 x 107 UFC/mL e que
este valor poderia ser aceito com o possível limite mínimo
para a contagem celular.10 A Tabela 8 apresenta o compor-
tamento da cultura mista da bebida láctea no decorrer do
armazenamento.
Tabela 8 – Desenvolvimento da cultura mista na bebida lác-
tea no decorrer do armazenamento.
Tempo de armazenamento (dias)
Células viáveis 0 7 14 19 22 25
(UFC/mL) 3x107 107 2x106 2x106 1x106 105
A contagem final, após 22 dias de estocagem, de cé-
lulas viáveis na bebida fermentada mostrou-se dentro dos
limites recomendados para este produto, tornando-o atrati-
vo como adjunto na dieta humana. Cabe salientar que estas
contagens podem ser referentes cultura mista previamente
inoculada ou a qualquer um dos microrganismos presentes
na referida cultura.
As demais determinações microbiológicas foram
efetuadas de acordo com metodologia descrita por Silva et

50
al.15 onde se avaliou a presença de coliformes fecais (NMP),
salmonella e contagem de bolores e leveduras. O número
mais provável de bactérias do grupo coliforme, embora não
estabelecido pela legislação, foi determinado, visto que es-
tes microrganismos são indicadores das condições higiêni-
cas mantidas durante o processamento do produto.
O resultado das análises microbiológicas realizadas
ao longo do período de armazenamento estão apresentados
na Tabela 9.
A ausência de bactérias do grupo coliformes e sal-
monela indica que as bebidas foram processadas em boas
condições higiênico-sanitárias. A presença de bolores e le-
veduras fornece informações sobre as condições higiênicas
mantidas durante o processamento e estocagem de um ali-
mento.
Assim, de acordo com a Resolução no 12, de 2 ja-
neiro de 2001 (Agência Nacional de Vigilância Sanitária –
ANVISA), a bebida láctea apresentou padrões microbioló-
gicos situados dentro dos limites estabelecidos para leites
fermentados, mostrando excelente qualidade microbiológi-
ca, mantida durante o período de estocagem estabelecido
para cada formulação.
Estabilidade sensorial
Os resultados da Análise Descritiva Quantitativa –
Perfil de Características da Formulação no decorrer do ar-
mazenamento é apresentado na Tabela 10 e Figura 6.
No 22° dia de armazenamento constatou-se um li-
geiro incremento nos atributos aroma, sabor de soja e ácido.
Os resultados mostraram que a bebida láctea fermentada
apresentou estabilidade sensorial durante aproximadamen-
te 22 dias.
Macedo 10 manteve com a formulação base de uma
bebida láctea contendo 35% de leite de vaca, 35% de soro
de leite de búfula e 30% de extrato hidrossolúvel de soja e
a combinação das culturas L. casei shirota e B. adolescentis
uma estabilidade físico-química, microbiológica e senso-
rial até o 28° dia de armazenamento.
Tortelli 16 com a formulação base de 55% de extrato
hidrossolúvel de soja, 35% de leite de vaca e 10% de soro
de leite e a cultura mista S. thermophilus e L. delbrueckii
susbp. bulgaricus, obteve para a bebida láctea desenvolvi-
da, estabilidade físico-química, microbiológica e sensorial
até o 7° dia de armazenamento.

Tabela 9 – Avaliação da estabilidade microbiológica durante o armazenamento da bebida láctea sabor morango.
Tempo de armazenamento (dias)
0 7 14 19 22 25

Coliformes Totais (NMP/mL) A A A A A A

Coliformes Fecais (NMP/mL) A A A A A A

Salmonella (em 25g) A A A A A A

Bolores e leveduras (UFC/mL) A A 103 2,0x102 103 5,4x103

Tabela 10 – Perfil de características da bebida láctea fermentada sabor morango durante o período de estocagem,
obtido através de análises sensoriais.
Tempo de armazenamento (dias)
Característica
0 7 14 19 22 25
Aparência
Homogeneidade 6,78b 7,00a 6,50b 6,07b 7,30a 3,89b
Aspecto 8,00a 6,44b 7,33a 7,60a 7,60a 4,67b
Textura
Consistência 7,25a 6,87a 4,80b 5,54a 5,80a 3,89b
Aroma
Global 6,60ab 7,80a 7,67b 7,20a 5,80ab 6,67ab
Soja 4,00b 3,67a 4,00b 3,64a 4,57ab 5,44ab
Ácido 3,67a 3,62a 3,60a 4,08a 5,10a 3,56a
Sabor
Global 6,87a 7,22a 3,12a 5,53a 5,50a 6,11a
Soja 5,89a 4,00a 3,75a 4,77a 5,40a 5,33a
Ácido 3,00b 5,00ab 7,00a 6,33a 6,60a 5,11ab

51
 Avaliação da bebida láctea sabor morango durante o
armazenamento
Homog.
9
8
Sabor ác. 7 Aspecto 0 dia
6
5
4 7 dias
3
Sabor soja 2 Consist. 14 dias
1
0
19 dias

22 dias
Sabor global Aroma Global
25 dias

Aroma ác. Aroma Soja

FIGURA 7 – Perfil de características da bebida sabor morango durante o período de armazenamento.

Assim, a bebida láctea desenvolvida neste estudo
apresentou um tempo de prateleira significativo quando
comparado aos estudos anteriores, representando um resul-
tado satisfatório, considerando o fato de não se ter adicio-
nado nenhum conservante no produto.
CONCLUSÕES
O tratamento térmico das matérias-primas mos-
trou-se eficiente no controle microbiano, não apresentando
alterações significativas no decorrer do armazenamento,
apresentando-se sempre com níveis inferiores ao padrão da
Legislação em vigor para bebidas lácteas fermentadas.
O crescimento da cultura mista de S. thermophilus,
L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus e
Bifidobacterium em caldo MRS atingiu seu máximo
crescimento em 4 horas de incubação nas condições de
temperatura de 42o C, sem agitação e com pH inicial de
7,5.
A formulação contendo 30% de extrato hidrosso-
lúvel de soja, 36,6% de leite de vaca e 33,3% de soro de
leite foi adotada como sendo a formulação base ideal deter-
minada por análises sensoriais e avaliação do crescimento
celular durante a fermentação.
Durante o período de armazenamento, a bebida lác-
tea sabor morango apresentou células viáveis da cultura
mista adicionada dentro dos padrões estabelecidos (1x106)
até o 22° dia.
A bebida láctea manteve a qualidade microbiológica
no decorrer do período de estocagem. A qualidade físico-
química apresentou pequenas alterações significativas, pelo
fato da bebida inicialmente já apresentar um baixo valor
de pH, a acidez ficou bastante evidenciada a partir do 14o
dia de armazenamento. A qualidade sensorial definiu o tér-
mino do armazenamento no 25° dia pelo fato da bebida já
apresentar uma acidez bastante elevada, sendo rejeitada nas
análises sensoriais. Assim, a bebida láctea sabor morango
desenvolvida neste trabalho teve uma vida útil de aproxi-
madamente 22 dias.
KRUGER, R.; KEMPKA, A.P.; OLIVEIRA, D.;
VALDUGA, E.; CANSIAN, R.L.; TREICHEL, H.; DI
LUCCIO, M. Formulation of a probiotic milky drink using
as substrates milk whey and soy hidrosoluble extract. Alim.
Nutr., Araraquara, v.19, n.1, p. 43-53, jan./mar. 2008.
ABSTRACT: In recent years, fermented milky products
from probiotic microorganisms have awakened up a great
interest in food industry. These microorganisms are able to
stay alive in fermented product and can survive during the
gastro-intestinal process, and thus, improve the microbial
flora of humans being who consummate regularly these
products. In this work, an experimental design is used in
investigating the formulation of strawberry fermented milky
drink from serum milk, cow milk and soy hidrosoluble
extracts. By mean of sensorial analysis, the aromatic degree
of the chosen formulation is determined. The formulation
with 30% of soy hidrosoluble extract, 36.6% of cow milk
and 33.3% of serum milk was defined as ideal in terms of
sensorial analysis and evaluation of cell growth. By mean
of sensorial, physicist-chemistries and microbiologicals
analyses the shelf-life of the product was defined. During
the storage period, the fermented milky drink presented
viable cells according to the Legislation (1x106 UFC/mL).
The acidity presented high values from 22nd of storage.
quality defined the shelf life as 25 days, with no addition
of conservants, due to the high acidity of the fermented
milky drink. The sensorial quality defined the shelf life as
25 days, with no addition of conservants, due to the high
acidity of the fermented milky drink.
KEYWORDS: Probiotic; formulation; Bifidobacterium;
milky drink; soy hidrosoluble extract.

52
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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53