Índice

1. Introducción 3
1.1. ¿Qué es Cultivo de Tejido Vegetal? 3
1.2. Infraestructura requerida para el cultivo de tejido 4

2. Descripción de las especies en estudio 4

2.1. Astrophytum myriostigma 4
2.2. Mammillaria candida 5

3. Objetivo de las actividades desarrolladas

3.1. Objetivo
6
4. Materiales y métodos 6
4.1. Preparación de medio basal de Murashige y Skoog (MS) 6
4.2. Preparación de ¼ MS con 1 % PEG
4.3. Preparación de medio basal Woody Plant Medium (WPM) 6
4.4. Preparación de medio ½ WPM con 1 % PEG y 1 % de CA 6
4.5. Siembra de especie A. myriostigma en medios de cultivo sólido 7
4.6. Transferencia de las especie M. cándida a suelo estéril 7
7
5. Resultados y discusiones 8 1
8
6. Conclusiones 9

1. Introducción
 El cultivo de tejidos vegetales fue desarrollado a partir de la
investigación de botánicos y fisiólogos vegetales desde 1950. Actualmente
se ha convertido en una herramienta internacional importante en la
selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción masiva de
cultivos de valor comercial que incluye tanto especies hortícolas, forestales y
frutales.

La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen al

conocimiento sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo
vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de
microbiología a través de las cuales los microorganismos se hacen crecer en
medios de cultivo estériles para su multiplicación e identificación. Desde
estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de
plantas se pueden multiplicar en gran número, haciendo crecer pequeños
trozos de tejido vegetal sobre medios sintéticos en condiciones asépticas.

1.1 ¿Qué es el cultivo de tejidos vegetales?

El punto de partida para el cultivo in vitro es la asepsia del tejido a fin

de cultivar posteriormente el material vegetal in vivo en un medio de cultivo
estéril. Este proceso requiere la disección del explante de la planta, su
tratamiento con agentes biocidas a fin de no introducir microorganismos 2
contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán pueden
generar una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo; en
otros casos se formarán estructuras reconocibles como tallos, órganos,
raíces, bulbos u otros órganos.

Los tejidos in vitro están ahora dentro de un microcosmos estéril, en

un recipiente de vidrio o de plástico y están protegidos del medio exterior no
estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en
el recipiente, debido a que cualquier microorganismo que penetre crecerá a
una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente
colonizarán y matarán a los tejidos vegetales.

Los tejidos pueden crecer sobre la superficie de un gel acuoso

solidificado con agar o ellos pueden colocarse en un medio líquido. En ambos
casos deben suministrarse los elementos minerales nutritivos esenciales
(sales de nitrato, potasio y calcio) para el crecimiento vegetal. También se
añaden las medias vitaminas, azúcares como fuente de energía y un cocktail
de hormonas vegetales, las cuales controlan el crecimiento y desarrollo de
los tejidos. Es conveniente preparar este medio nutritivo incorporando los
elementos químicos dentro del gel o líquido, ajustando el pH alrededor de 6
y esterilizando este medio de cultivo ya sea dentro del recipiente para
cultivo o en uno separado.
 Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en
general es necesario el suministro de luz, pero a intensidades menores que
la luz solar. De los carbohidratos agregados al medio provendrá la fuente de
energía más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios unos
latos niveles de luz. Una temperatura controlada también es necesaria para
estabilizar el crecimiento y mejorar la predictibilidad del desarrollo de los
tejidos.

1.2 Infraestructura requerida para el cultivo de tejido

Para realizar el cultivo de tejidos se requiere de una habitación limpia

en la que se localizen las campanas de flujo laminar. En éstas campanas el
aire que circula pasa a través de filtros por lo que el material puede
manejarse sin riesgos de contaminación por el operador y transferirse en
forma segura a medios nutritivos frescos. La transferencia, manipulación y
subdivisión del material se hace usando escalpelo y pinzas previamente
desinfectadas o flameadas en el mechero.
Otra zona importante es el cuarto de crecimiento que consiste en una
habitación iluminada, con aire acondicionado y con alto estándar de higiene
en el cual los cultivos de tejidos pueden crecer y desarrollarse en forma
segura por períodos de semanas o meses. Para mantener el régimen de
iluminación y temperatura óptimos se requiere un suministro de electricidad
confiable y adecuado, ya que cada planta producida puede consumir unos 3
0,5 Kw de energía.

2. Descripción de las especies en estudio.

Dentro del laboratorio se cuenta con una gran variedad de cactáceas,

que requieren de mantenimiento para su preservación. Como parte del
desempeño de actividades del servicio social trabaje con dos de ellas, las
cuales se describen a continuación.

2.1. Astrophytum myriostigma

Descripción:

La especie, conocida popularmente como birrete de obispo, es de tallo

globular, deprimido en el ápice, mide entre 10 y 25 cm. de diámetro y puede
presentarse un tanto columnar cuando el ejemplar es adulto. Es de color
verde aunque está cubierta de manera abundante por escamosidades
blancas muy pequeñas que le confieren un aspecto blanco grisáceo. Las
costillas habitualmente son cinco, aunque también existen formas de cuatro
a ocho costillas, muy prominentes y agudas. Las aréolas son muy pequeñas
y están muy juntas. Son completamente inermes y están cubiertas
generalmente de pelos parduscos. Las flores miden alrededor de 6 cm de
diámetro y son de color amarillo. Existen diversas variedades entre ellas,
quadricostatum, con sólo cuatro costillas y nudum, de tallo color verde, sin
restos de escamas (Figura 1).

Figura 1. Aspecto de una planta de A. myriostigma en floración.

2.2. Mammillaria candida

Descripción:

La planta es de forma globular al comienzo, aunque con la edad se vuelve

cilíndrica, midiendo entre 10 y 14 cm. de diámetro. Tiene el ápice
ligeramente deprimido y amacolla por la base en edad adulta. Los
tubérculos están muy cerca entre sí, son cilíndricos, prominentes y de su
4
base aparecen pelos blancos de la misma longitud que aquellos, que se
vuelven más densos en la parte apical. Las espinas radiales se presentan
en número de 40 o más, de color blanco y casi 1 cm. de longitud. Están
entrecruzadas entre sí escondiendo casi por completo el tallo. Las espinas
centrales son entre 8 y 12, aciculares, de color blanco con la extremidad
amarronada y miden entre 4 y 7 mm de longitud.Las flores son de color
blanco con la parte central rosada, miden 2 cm de longitud y 1,5 cm de
diámetro. Aparecen en forma de corona entre las espinas alrededor
del ápice (Figura 2).

Figura 2. Aspecto de una planta de M. cándid.

3. Objetivo de las actividades desarrolladas

 3.1Objetivo

Ver el efecto del AIB y de las diferentes tapas usadas en el

enraizamiento y la compactación de los explantes.

4. Materiales y métodos

4.1 Preparación de medio basal de Murashige y Skoog (MS).

La concentración de los componentes del medio MS corresponde a la escrita

originalmente por Murashige y Skoog (1962) y se describe a continuación:
Solución I. Pesar 18 g de CaCl2, disolver en agua desionizada y aforar
hasta 50ml.
Solución II. Pesar 9.25 g de MgSO4 .7 H2O, 4.25 g de KH2PO4, disolver en
agua desionizada y aforar hasta 250 ml.
Solución III. Pesar 0.557 g de FeSO4.7H2O, 0.672 g de Na2EDTA o 0.744g
de Na2EDTA.2H2O disolver en agua desionizada y aforar hasta 100 ml.
Solución IV. Pesar 2.23 g de MnSO4. 4 H2O, 0.86 g de ZnSO4.7H2O, 0.62 g
H3BO3, 0.083 g de KI, 0.025 g de Na2MoO4.H2O, 0.0025g CuSO4.5H2O;
0.0025 g de CoCl2.6H2O, disolver en agua desionizada y aforar hasta 100
ml.
Solución V. Pesar 0.05 g de glicina, 0.0125 g de piridoxina HCl, 0.025 g 5
de tiamina, HCl, 2.5 g de mio-inositol, 0.0125 g de ácido nicotínico,
disolver en agua desionizada y aforar hasta 250 ml.
Todas las soluciones se filtraron a través de papel Whatman No. 1 y se
almacenaron a 4 °C, a excepción de la solución V que se almacenó en
congelador a -20 °C.

Una alternativa para preparara este medio es usar medio MS (Murashige

y Skoog) preparado comercialmente para lo cual se pesan 4.4 g del polvo
comercial por litro de meido.

4.2. Preparación de ¼ medio basal con 1% PEG.

1. Se pesaron 4.4 g de medio MS (o se agregaron 1 ml de la solución I, 10

ml de la solución II, 5 ml de la solución III, 1 ml de la solución IV y 10 ml
de la solución V).
2. Se añadieron 10 g de polietilenglicol (PEG) y 30 g de sacarosa.
3. Se aforó a 1 L, se agregaron 4.2 g de agar y 2.2 g de phytagel y se
fundió en placa de calentamiento.
4. Se vació el medio en frascos medianos y se esterilizaron en autoclave
por 15 min, a una presión de 120 lb/pulg2 y a una temperatura de 121
°C.
Nota: para preparar ¼ MS se dividen todas las cantidades entre 4, excepto el
agar y el phytagel.

4.3. Preparación de medio basal Woody Plant Medium (WPM).

Para preparar el medio WPM se prepararon las siguientes soluciones:

Solución I. Pesar 0.95 g de CaCl2. 2 H2O, 3.86 g de nitrato de calcio,
disolver en 100 ml de agua desionizada.
Solución II. Pesar 9.25 g de MgSO4. 7H2O, 4.25 g de KH2PO4 disolver en
250 ml de agua desionizada.
Solución III. Pesar 3.73 g de EDTA- Na2 y adicionar CuSO4.5H2O, disolver
en 100 ml de agua desionizada.
Solución IV. Pesar 2.23 g de MnSO4.H2O, 0.86 g de ZnSO4, 0.62 g de
H3BO3, 0.025 g de Na2MoO4. 2H2O, 17 g de K2HPO4, 99 g de K2SO4,
disolver en 1 L de agua desionizada.
Solución V. Pesar 50 mg de Glicina, 12.5 mg de piridoxina-HCl, 2.5 mg
de Tiamina- HCl, 2.5 g de mio-inositol, 12.5 mg de ácido nicotínico,
disolver en 250 ml con agua desionizada.
Nota: Todas las soluciones con excepción de la IV, se filtraron a través
de papel Whatman No. 1 y se almacenaron a 4 °C.
6
4.4. Preparación de ½ WPM con 1% PEG y 1% de carbón activado (CA).

1. Se pesaron 0.4 g de NH4NO3, se agregaron las soluciones indicadas (10

ml de solución I, 5 ml de solución II, 0.5 ml de solución III, 5 ml de
solución IV y 10 ml de solución V) y se
2. Mezclaron con 10 g de PEG (Polietilenglicol), 10 g de CA (carbón
activado) y 20g de sacarosa.
3. Se aforo a 1 L y se fundió para agregar 4.2 g de agar y 2.2 g de
phytagel.
4. Se coloco en frascos medianos y se esterilizaron en autoclave por 15
min, a una presión de 120 lb/puldas2 y una temperatura de 121 °C.
Nota: para preparar ½ WPM se dividieron todas las cantidades entre dos,
excepto el agar y el phytagel.

4.5. Siembra de la especie A. myriostigma en medios de cultivo sólido.

Una vez seleccionado el material a resembrar se transfiere a los

medios en campana de flujo laminar, en condiciones de asepsia, utilizando
un mechero pinzas bisturí y alcohol para la desinfección del material. La
resiembra se realiza con sumo cuidado para evitar que se contaminen los
frascos por bacterias debido a la mala esterilización del material o al mal
manejo. Para resembrarlos es necesario sumergir las pinzas y bisturí en
alcohol, y pasarlos por el mechero, después de esto se puede tomar cada
explante. Una vez resembrado todo el material los frascos se sellan con
vitafilm y se llevar al cuarto de crecimiento.

Se evaluó la formación de callo, hidratación y el color del brote de

acuerdo a los siguientes parámetros:
Descripción

Callo Hidratación Color

0 I II III 0 I II III Vo V Vcf

c
s/callo

oxidación)Verde cafesoso (algo de

Pequeño

Mediano

Verde obscuro

Verde claro (Algo de hidratación)

Compacto

Poco hidratado

Moderadamente hidratado

Muy hidratado(translucido
Grande

Para evaluar el efecto del AIB, los brotes se sumergieron en una solución
de AIB en una concentración de 1 mg/ml por 1 min. y después se
transfirieron al medio. Con el fin de incrementar la ventilación se usaron
tapas perforadas a las cuales se les colocó un tapón de algodón (5 frascos) o
a tapón de microporo (5 frascos). Como testigos se usaron frascos con tapa
normal.

Transferencia de las especie M. cándida a suelo estéril.

Las plantas de M. cándida que eran demasiado grandes y no cabían en la

maceta se transfirieron a tierra estéril de la siguiente manera:
a) En el fondo de la maceta se colocó una pequeña capa de grava y
después una cantidad moderada de la mezcla de tierra estéril.
b) Se humedeció la raíz de la planta en una mezcla de agua con
enraizador Raizone Plus de la marca FAX.
 c) Se colocó la planta en la maceta y se rodeó perfectamente con la
tierra estéril, cuidando de que la tierra no la cubriera por completo.
d) Las plantas se pasaron a un recipiente con agua para que fueran
regadas de manera ascendente.

5. Resultados y discusión.

Los resultados de los experimentos para evaluar el efecto del AIB y de la

ventilación se presentan en los siguientes cuadros. Se observó que en el
medio control (1/4 MS + 1 % PEG) conforme pasa el tiempo, los brotes no
formaron callo pero aumentó la hidratación de los brotes de nivel I a nivel II
(Cuadro 1).

Cuadro 1. Crecimiento de brotes de A. myriostigma en medio

control sin AIB.

Tiemp Callo (%) Hidratación Color (%)

o (%)
(días) 0 I II III 0 I II III V Vc Vc
o f
0 10 10 5 50 8
0 0 0
30 10 50 50 100
0
57 10 25 75 100 Con
0 el medio
89 10 10 100 de ¼ de
0 0 MS + 1%
120 10 10 100 PEG + AIB
0 0 0 y tapa
con tapón
de algodón se observó que ninguno de los explantes formo callo, a demás
que la hidratación disminuyo considerablemente hasta obtener un 66.6 % de
hidratación tipo 0 y por consiguiente mayor compactación y un mejor color
(Vo) (cuadro 2).

Cuadro 2. Crecimiento de brotes de A. myriostigma con AIB y tapas con

tapón de algodón.

Tiemp Callo (%) Hidratación (%) Color (%)

o 0 I II III 0 I II III Vo Vc Vc
(días) f
 0 10 20 70 30 50 20
0
30 10 30 70 30 40 30
0
57 10 60 40 40 40 20
0
89 10 66. 16. 16. 83. 16.
0 6 6 6 3 6
120 10 66. 33. 83. 16.
0 6 3 3 6

Al usar las tapas con microporo con medio ¼ MS +1 % PEG + AIB,

observamos que los explante no presentaron callo y la hidratación disminuye
pero solo un poco (cuadro 3).

Cuadro 3. Crecimiento de brotes de A. myriostigma con AIB y tapas con

tapón microporo.

Tiemp Callo (%) Hidratación Color (%)

o (%)
(días) 0 I II III 0 I II III Vo Vc Vcf
0 10 10 30 20 50 9
0 0
30 10 25 75 12 75 12.
0 .5 5
57 10 25 75 25 75
0
89 10 25 50 2 12 62. 25
0 5 .5 5
120 10 12 62. 2 87. 12.
0 .5 5 5 5 5

A continuación se presenta un grafico general de crecimiento de la raíz para

A. myriostigma, donde se puede observar que el mejor crecimiento fue
dentro de los frascos que tenían tapa de algodón.
 Figura 3. Comparación de las diferentes tapas en el crecimiento de la raíz.

Además se pudo apreciar que existe una mayor contaminación en los frascos 10
con tapa de microporo, tal vez por que el poro es muy grande como para
dejar pasar algunas esporas.

6. Conclusiones

1. Las tapas de microporo presentan mayor contaminación que las de

algodón.
2. Las tapas de algodón permiten un mejor crecimiento del explante y
mayor compactación.
3. El AIB permite un mayor crecimiento de de raíz en comparación de los
que no fueron introducidos en este.
4. Por lo que es recomendable trabajar con tapas con tapón de algodón
en otros experimentos.