PARCIAL PRACTICO - Resumen

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PARCIAL PRACTICO - Resumen
por keichi_saotome » 25 Jun 2010 15:59

Bueno, ahi va un pequeño resumen de detalles a tener en cuenta para el parcial de este sábado:

TP 1: Preparación de DNA plasmídico

Lo más importante es entender qué se hizo, y básicamente, el TP gira en torno a:

Lisis alcalina - Resuspensión diferencial - Centrifugación

SOLUCIONES UTILIZADAS:

1) Solución de resuspensión (Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM pH8). Su función es resuspender a las

bacterias y "dejar todo listo" para el paso siguiente.
Tris-HCL es un sistema buffer a pH 8. A pH básico (es decir, a baja concentración de H+ ), se favorecen
dos cosas:
• La repulsión entre cargas negativas de los grupos fosfato de los ácidos nucléicos.
• La repulsión entre cargas negativas entre cabezas polares de los fosfolípidos de membrana.
EDTA es un quelante de cationes divalentes Ca2+ o Mg2+. Esto produce también dos cosas:
• Secuestra iones Mg2+, que son cofactores de las nucleasas, impidiendo que estas enzimas "hagan
su trabajo".
• Secuestra iones Ca2+, desestabiliza las membranas de las bacterias.
Además, al ser una solución hipotónica ("menor concentración de sales de este lado de la membrana que
del otro") el agua entra a las células por ósmosis y se favorece su ruptura por el aumento de presión.

2) Solución de lisis alcalina (NaOH 200 mM, SDS 1%). Su función es lisar las bacterias.
El SDS es, como ya sabemos (obvio ) un detergente iónico que forma micelas con los fosfolípidos de
membarna y, por ende, los hace solubles. Desnaturaliza también a las proteínas al romper uniones
débiles que prducen su estructura 3D.
El NaOH aumenta el pH y desnaturaliza todo!

Eso sí, recuerden que el DNA plasmídico, si bien se desnaturaliza, sus dos hebras quedan "concatenadas"
(o sea, juntas ), el DNA genómico se fragmenta durante la lisis y el RNA es parcialmente degradado.

3) Solución de renaturalización (K+AcO- 3M pH 4.8, o "Acetato de Potasio" para los amigos...)

Bueno, este es ácido, por lo que lo primero que hace es neutralizar todo lo básico que veníamos
agregando.
Además los iones K+ ahora vienen a aportar su carga positiva para compensar las cargas negativas de las
hebras de DNA permitiendo su renaturalización, favorecida por haber mantenido al concatenación de sus
hebras. ¿Sólo se renaturaliza el DNA plasmídico? ¡Ni a ganchos! El DNA genómico también y lo que que
haya quedado de RNA también, pero como están fraccionados, ahora quedan "pedazos" de ácidos
nucléicos que se van hibridando al azar. Esto sumado a que el K+ reemplaza al Na+ en el SDS,
disminuyendo la solubilidad de este, forma una malla entre los DNA y las proteínas mal renaturalizadas.
Toooodo eso se ve favorecido por la incubación en frío, que hace que las moléculas rápidamente pierdan
energía cinética y no se puedan despegar si "no les gusta su pareja".

4) Isopropanol
Primero y principal: Es un alcohol. Al agregar un alcohol en una solución hace que disminuya la
polaridad el medio (es menos polar que el agua, y si ponemos algo menos polar, la solución en conjunto
va a ser menos polar, no es tan difícil...) Al ser la solución menos polar, las interacciones entre el soluto
(DNA) y el solvente (agua + isopropanol) son más débiles.
Teniendo en cuenta que el isopropanol tiene una cadena carbonada (no polar) más grande que el etanol,
hace que con menos volumen se logre el mismo efecto.

5)Alcohol 70%
Simplemente se utiliza para lavar el pellet, sacándonos de encima las sales que puedan haber quedado.

SOBRE LAS PREGUNTAS DE LA GUIA:

Las primeras 3 están respondidísimas en la explicación de los plásmidos que hay en la misma guía...

En la pregunta 4 preguntan sobre las partes del plásmido. De estas, hay una que por ahí está un poco
complicada la explicación en la guía (o al menos a mí me costó entenderla), que es la parte del gen Lac
Z. Básicamente, el Polylinker (la parte donde uno corta con enzimas de restricción para meter algún
inserto) esta DENTRO del gen Lac Z, por lo que, si ponemos un inserto en el plásmido, este gen estará
"apagado" o knockeado, y por ende, no detectaríamos actividad de la &beta -galactosidasa.
Los promotores PT3 y PT7, si se fijan en el dibujo, apuntan uno para cada lado. Estos son promotores de
esos dos fagos (T3 y T7) y si tenemos RNA pol de alguno de esos fagos, podemos transcribir en uno u otro
sentido.
Los demás, creo que se entienden bien en la guía.

La pregunta 5, que nos pregunta en qué se basan los métodos de extracción plasmídica, se respondería
con lo primero que dije (con un poco de explicaciones, obvio), que es "Lisis alcalina, renaturalización
diferenciada, centrifugación".

Pregunta 6: Acá no se si hay mucho para decir... si nos basamos solamente en lo que hicimos en el TP, a
las proteínas las sacamos con la renaturalización rápida y al RNA lo sacaron solo algunos grupos tratando
la muestra con RNasas.
La pregunta 7 está también bastante explicada en la guía. Si es un plásmido con alto número de copias,
al clonar vamos a tener mucho plásmido, que es lo que queremos, ¿no?

La pregunta 8 habla sobre las soluciones. Esto ya está explicado (read above)

En la pregunta 9, los 10 microlitros no nos interesan. Para eliminar proteínas, ya lo dijimos dos veces,
desnaturalizás y renaturalizás rápido. El DNA plasmídico se renaturaliza de manera correcta porque es
chiquitito y las proteínas se unen unas con otras y forman una red que precipita con la centrifugación.
Otra forma que se me ocurre es tratar la muestra con proteasas... pero te quedan las proteasas! A esta
la eliminás como dijimos antes...
Si además tenés sales, lavás con etanol al 70% (que es lo que hicimos en el TP)

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TP 2: Electroforesis en geles de agarosa

El fundamento es simple:

Las moléculas de ADN están TODAS cargadas negativamente por su esqueleto de grupos fosfato. Si las
sometés a un campo eléctrico, van a ir al polo positivo (ánodo). Mientras más cargada esté una
molécula, el polo positivo "tira con más fuerza" de ella y, como la molécula de DNA tiene más cargas
negativas cuanto más grande es, la fuerza con la que el ánodo atrae a la molécula es mayor.
OJO, recuerden la fórmula de la Fuerza que vimos en dinámica: F = m x a. Si bien aumenta la fuerza
con el aumento de carga de la molécula, también disminuye su aceleración con el aumento de masa.
Como la relación carga/masa en las moléculas de DNA es relativamente constante, la aceleración de las
moléculas es también constante. (Se entiende???)
La velocidad final a la que migren las moléculas tiene que ver con la resistencia del medio, es decir, las
fuerzas de rozamiento o fuerza de viscosidad, la cual depende del tamaño y la forma de la molécula,
ya que depende de cuánto "le cuesta" a la molécula pasar por los poros del gel de agarosa. La agarosa,
al ser disuelta, forma una red estabilizada por interacciones débiles que forma estos poros de los que
hablamos recién.

¿De que forma afectan la forma y el tamaño a la corrida de las partículas?

Lo del tamaño es bastante fácil de entender. Básicamente, mientras más grande es la molécula, va a
haber menos cantidad de poros por los que esta pueda pasar, y entonces "pierde tiempo" moviéndose
buscando la forma de avanzar. Al ser más chica la molécula, pasa más fácilmente por los poros.
Lo de la forma, requiere que entendamos las 3 formas topoisoméricas del DNA plasmídico. La primera es
la forma en la que la molécula se encuentra in vivo, que es la forma superenrollada o CCC (coiled-coil
circle) y bueno, es muy compacta, por lo que corre con mucha facilidad. La segunda es la lineal, en la
que la molécula "ocupa más lugar", pero solo en una dimensión y la más lenta es la forma circular
abierta (CA) que es más grande en el plano (o sea, en dos dimensiones).
SOLUCIONES UTILIZADAS:

1) Solución de agarosa (Agarosa 0,8%. Bromuro de etidio 10 mg/ml y TAE 1X)

La agarosa, simplemente cumple la función de ejercer resistencia a la corrida de las partículas, y
mientras más concentrada esté, mayor será esta resistencia (útil si queremos analizar moléculas
pequeñas).
El bromuro de etidio es un compuesto aromático que se intercala entre las bases nitrogenadas del DNA.
Este compuesto fluoresce en el naranja al ser irradiado con luz UV, pero al estar intercalado entre las
bases, esta fluorescencia aumenta 20 veces.
El TAE es simplemente un buffer, que lo vamos a ver después.

Buffer de siembra 3X (Xilene-cianol 0,1%, Azul de bromofenol 0,1% y glicerol 15%). También llamado
"loading buffer" y es lo que agregamos a al muestra para poder sembrarla en el gel.
El glicerol le da densidad a la muestra. ¿Para qué? Bueno, si no lo pusiéramos, echamos la muestra
en el gel y esta difunde y se nos pierde en el buffer de corrida. Con el glicerol nos aseguramos de que
quede depositada en nuestra calle de corrida.
El Xilene-cianol y el Azul de bromofenol son colorantes que corren como moléculas de DNA de 5kpb y
500pb respectivamente. Nos sirven para darnos cuenta de cuándo detener la corrida (tengamos en
cuenta que mientras hacemos la corrida no vemos el DNA, por lo que estos colorantes son nuestra única
referencia.

Buffer de corrida (TAE 50 X) (Tris base 242g, Acido acético glacial 57,1 ml, EDTA 0,5 M pH 8 100 ml y
H2O hasta llegar a un litro).
Es el líquido que va encima del gel. Los primeros dos compuestos forman el buffer. ¿Por qué utilizamos
un buffer en lugar de agua? Bueno, en primer lugar, necesitamos mantener un pH básico para
asegurarnos de que ningún protón nos neutralice la carga del DNA. Pero más importante aún es que
necesitamos que haya sales disueltas (o sea, partículas cargadas), ya que el agua pura NO CONDUCE LA
ELECTRICIDAD!
El EDTA colabora, secuestrando cationes divalentes, en mantener este pH.

Cosas a tener en cuenta:

• No se puede hacer una medición del tamaño de moléculas en la forma superenrollada, ya que
moléculas de DNA del mismo tamaño pueden estar enrolladas de distinta manera y correr a
distintas velocidades
• El método para calcular los tamaños, basados en una curva de calibración realizada a partir del
marcador de PM, es preciso, pero solamente en los valores medios. Si nos vamos hacia los
extremos, al graficar log(PM) en función de la distancia recorrida, vemos que se empiezan a
separar cada vez más de la linea de tendencia, por lo que los valores obtenidos cercanos a
estos extremos van a ser cada vez menos precisos.
 • En las muestras que fueron tratadas con RNasas, la banda correspondiente a la forma CCC se ve
menos definida y la lineal en muchos casos ni se ve. Esto es simplemente porque la cantidad de
RNA que tenemos en la muestra es muy grande y el bromuro de etidio "no alcanza" para todas
las moléculas (o sea, se lo queda en gran parte el RNA)

CUESTIONARIO:

La primera pregunta ya fue explicada.

La segunda nos pregunta si sl pH del buffer es importante, y también se explicó que la poca
concentración de H+hace que las moléculas de DNA mantengan su carga negativa. Si utilizáramos un
buffer de pH 3, muchas de estas cargas se neutralizarían y la molécula no correría en la electroforesis.
La tercera y la cuerta pregunta también fueron respondidas.
Con respecto a la 5ta pregunta.. nos piden que expliquemos qué pasa si dañamos mecánicamente a las
moléculas. Simplemente lo que pasaría es que tendríamos una banda más gruesa correspondiente a la
forma CA del plásmido (por ruptura mecánica es muy difícil que se produzcan plásmidos de la forma
lineal, simplemente porque tendríamos que hacer un corte en cada hebra EXACTAMENTE EN EL MISMO
LUGAR, lo cual es excesivamente poco probable.
Lo que nos preguntan luego es qué pasaría si tratamos a la muestra con una enzima de restricción con
un solo sitio de corte por molécula de plásmido, y es en realidad lo que hizimos con EcoR1, y nos da una
banda correspondiente al plásmido en la forma lineal.
La última pregunta tiene una parte que es importantísima, que es donde dice "del cual no conoce el
mapa". Si no sabemos cómo es el plásmido, y no sabemos el tamaño, es imposible determinar si el
mismo tenía solo dos sitios de corte para esa enzima, ya que pueden haber distintas secciones con
tamaños iguales (o lo suficientemente similares como para que no detectemos la diferencia).
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TP 3: Transformación bacteriana

Lo más importante:
Las bacterias tienen 3 formas de intercambio de información genética. Transformación: Las bacterias
competentes logran obtener moléculas de DNA desnudo del medio extracelular. Este DNA puede ser
degradado, mantenido como episoma (elemento replicativo autónomo), o incorporado al DNA genómico
¿A qué me refiero cuando digo "competentes"? A que tienen la capacidad de transformarse. Esta
capacidad es transitoria y asociado a crecimiento rápido y falta de nutrientes.
Recuerden, por las dudas, que quien descubrió la transformación bacteriana fue Griffith y luego Avery,
McLeod y Mc Carty descubrieron que esa transformación se debía al DNA y no a proteínas, hidratos de
carbono, etc.
Las otras dos (conjugación y transducción) no creo que sean demasiado importantes para este parcial,
pero tinen una explicación bastante resumida en la guía por las dudas.

EN EL LABORATORIO:
Lo primero fue hacer competentes a las bacterias. Esto lo hicieron previamente los docentes, mediante
el método de Hanahan.

¿Cómo transformamos a las bacterias?

En resumen:
• Enfriamos a las bacterias en presencia del DNA y de CaCL2. Con esto logramos que el
Ca2+ disminuya la repulsión de los fosfolípidos de la membrana de las bacterias, y que el frio
disminuya la fluidez de la misma. El CaCL2 además altera la pared celular.
• Shock térmico a 42ºC por 1 min y medio. Con esto más la presencia de Ca2+ se forman poros en
la membrana y por estos poros entra el plásmido a la bacteria.
• Recuperación con LB sin antibiótico. Esto es simplemente para que las bacterias que hayan
adquirido el plásmido empiecen a expresar el gen de resistencia a la ampicilina (sino se mueren
todas al plaquear con ese antibiótico).

CONTROLES:
• Control de viabilidad: Se plaquea a las bacterias en LB sin antibiótico para comprobar que
realmente en la muestra inicial teníamos bacterias capaces de duplicarse y formar colonias.
Este control lo hicieron algunos grupos.
• Control negativo: En lugr de transformar a las bacterias con DNA plasmídico, se utilizó agua
estéril. Con esto nos aseguramos de que las bacterias no fuesen naturalmente resistentes a la
ampicilina. Si esto fuese así, ese antibiótico no podría utilizarse como presión de selección para
quedarme solo con las bacterias transformadas.
• Control Positivo: Se transformó a las bacterias con una masa conocida de una muestra conocida
del plásmido. Con esta muestra lo que tenemos es un experimento de referencia, para ver lo
que tiene que suceder "si todo va bien". Además, es la que utilizamos para luego calcular al
eficiencia de transformación, ya que confiamos en esa muestra de plásmido (o al menos en
quien lo preparó para nosotros
).

MEDIOS DE CULTIVO:

LB (Bacto-triptona 10g, Extracto de levadura 5g, NaCl 5g, llevado a un litro con H2O y esterilizado por
autoclavado x 20 min.)
Bcto-triptona (puede ser también Caseina) es la fuente de nitrógeno para las bacterias.
El Extracto de levaduras son básicamente levaduras machacadas que aportan el resto de los nutrientes
que va a necesitar la bacteria para crecer y duplicarse.
El NaCl no tengo ni idea de para qué lo pusimos... pero supongo que será también como nutriente
para las bacterias...
LB sólido: Lo mismo que el anterior, pero se le agregan 15g de bacto-agar por litro de LB y se vuelve a
autoclavar por 20 min.

CUESTIONARIO:
Pregunta 1: Tubos. El 1ro es el control negativo, el segundo es el control positivo y el tercero es el de
nuestro plásmido, con el cual vamos a obtener la cantidad de DNA plasmídico que teníamos
originalmente, usando la fórmula EF = UFC / &mu g DNA.
Las preguntas 2 y 3 ya fueron respondidas.
Con respecto a la pregunta 4, Avery, McLeod y McCarty trataron al producto de lisado de los
pneumococos de la cepa S (letales para el ratón) con enzimas que degradan lípidos, proteínas,
polisacáridos, RNA y DNA y vieron que las únicas que no transformaron a las bacterias de la cepa R de la
forma que vió Griffith eran las tratadas con DNasas.
Pregunta 5: ¿Por qué no un medio líquido? Simple, porque necesitamos poder contar las colonias
formadas, y para eso necesitamos que estén quietitas mientras se duplican.
Pregunta 6: A ver, nos dan 1,5 ng de plásmido. Si tenemos 200 colonias, ya podemos calcular la
eficiencia. Primero hay que pasar los ng a &mu g. 1,5 ng son 1,5 x 10-3 &mu g. Listo, la eficiencia de
transformación es: EF = 200 UFC / 1,5 x 10-3 &mu g = 133333 UFC / &mu g DNA.

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TP 4: Actividad de la &alpha -amilasa

Resumencito:

La &alpha -amilasa es una enzima que degrada el almidón en dextrinas lineales (producto de la ruptura
de amilosas) y ramificadas (producto de la ruptura de amilopectinas).

El principio principal (jeh) del experimento que realizamos es el hecho de que, en presencia de iodo, el
almidón presenta una coloración azulada por la interacción entre el iodo y las moléculas de amilosa.
Cuando la &alpha -amilasa degrada el almidón, elimina esta propiedad de la amilosa y deja de presentar
esta coloración.

Para agregar el iodo a la solución, teniendo en cuenta que el I2 es poco soluble en agua, se lo mezcla
con el anión ioduro (I-), obteniéndose I3-, que es más soluble porque está cargado. A esto se lo llama
"solución de Lugol"

A tener en cuenta:

La dilución óptima es aquella que nos permite tener tiempos medibles que se puedan usar como
referencia a la hora de medir la actividad enzimática luego de distintos tratamientos o pre-
tratamientos. Estando en la dilución óptima, el tiempo de referencia debe ser de 3 a 8 minutos.
Diferencia entre tratamientos y pre-tratamientos: los pre-tratamientos los hacíamos ANTES de comenzar
a medir la actividad enzimática y los tratamientos los hacíamos MIENTRAS medíamos esta actividad.

Lo que se mide en este experimento es la desaparición de sustrato, como ya vimos.

Resultados obtenidos y explicación:

• Pre-tratamiento con proteinasa K:
Sin actividad. Esto significa que, o bien la enzima es una proteína, o bien que depende de la
presencia de una proteína que la active.
• Pre-tratamiento de la enzima con calor (100ºC):
Se espera que no haya actividad (de todas maneras, uno de los grupos que hizo este
experimento midió un tiempo mayor a 5 minutos para la reacción... ) Esto es porque a 100º,
esta enzima ya debería estar desnaturalizada y no podría cumplir su función.
• Efecto del pH:
A pH muy alto, o a pH muy bajo, el balance de cargas en el medio está modficado, por lo que
las diferencias de cargas entre los restos de los aminoácidos de la proteína cambian y, por
ende, esta proteína cambia su conformación 3D. Es por esto que se encontraron tiempos de
reacción muy altos (o no se encontró reacción) para pH 2 y pH 12.
• Incubación a 0ºC, a temperatura ambiente y a 70ºC:
En este caso, se somete a la enzima a temperaturas diferentes a su temperatura óptima. A 0 ºC
la energía cinética de las moléculas es, en promedio, baja, por lo que son poco frecuentes los
"choques" entre la enzima y el sustrato con la energía suficiente para realizar la reacción. A
temperatura ambiente, aún es poca la energía cinética del medio, pero más cercana a la
temperatura óptima. A 70%, las moléculas tienen más energía de la necesaria, pero el
problema es que ahora se empieza a desnaturalizar la enzima, por lo que tampoco se ve mucha
actividad.
• Presencia de NaCl:
Se ve que en presencia de iones Cl- la enzima tiene una actividad mayor, lo que indica que el
ion Cl-favorece a la reacción de la &alpha -amilasa.

CUESTIONARIO:
Todas las preguntas fueron respondidas, a excepción de la 3ra, que pregunta a qué temperatura y pH
esperaríamos que la &alpha -amilasa tuviera su actividad óptima.
La respuesta real es que no se pueda estimar esto , ya que más alla de que las condiciones normales
de la saliva son 37 ºC y ph 7 (o cercano al neutro), no sabemos si la enzima actúa en condiciones
normales

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TP 5: Inducción enzimática
Bueno, básicamente el Operón Lac es un ejemplo de cómo funciona la regulación de la transcripción en
bacterias. El funcionamiento teórico ya lo sabemos (o al menos, eso espero), pero de todas maneras lo
vamos a ir viendo en el experimento.
Lo que hacemos es manipular al sistema (el operón lac) y luego de esto, salvo en uno de los tubos,
lisamos las bacterias y exponemos su contenido. Esta parte es el experimento y lo que sigue es el
revelado.
¿Qué medimos en el revelado? la producción de &beta -galactosidasa, pero de manera indirecta viendo
su actividad al degradar al ONPG, que da como producto un compuesto de color amarillo.

TUBOS PREPARADOS:
• 1) Cultivo bacteriano + Solución fisiológica
No pasa nada... y es lo que esperábamos, porque si no ponemos ningún inductor del sistema, no
se debe producir &beta -galactosidasa y, por ende, no debe haber reacción enzimática.
• 2) Cultivo + Solución fisiológica + IPTG
El IPTG es un análogo estructural de la lactosa que funciona como inductor gratuito, es decir,
induce al sistema, pero no es degradado por la &beta -galactosidasa.
En este tubo hemos visto mucha actividad enzimática, lo cual es esperable por lo que acabamos
de ver.
• 3) Cultivo + Solución fisiológica + lactosa
Esta vez utilizamos lactosa, que funciona induciendo al sistema, pero en la medida que se
sintetiza &beta -gal, esta va consumiendo a la lactosa, por lo cual el resultado obtenido (menos
reacción que en el tubo anterior) era también el esperado.
• 4) Cultivo + Solución fisiológica + lactosa (pero no lisamos a las bacterias)
No vimos reacción enzimática, lo cual demuestra que la &beta -gal permanece dentro de la
célula y que el ONPG no ingresa a la misma.
• 5) Cultivo + Solución fisiológica + Lactosa + Cloranfenicol
El Cloranfenicol es un antibiótico que inhibe la síntesis protéica. El hecho de que no hayamos
detectado actividad de la &beta -gal nos indica que efectivamente el sistema debe
ser inducido, ya que la proteína no está presente en la célula antes del agregado de lactosa.
• 6) Cultivo + Solución fisiológica + Glucosa.
La glucosa inhibe a la enzima adenilato ciclasa, responsable de transformar el ATP en AMPc. De
esta manera, la proteína CRP, al no haber AMPc disponible, no logra facilitar la unión entre la
RNA pol y el DNA, por lo que más allá de que la lactosa induce al sistema, no hay transcripción.
• 7) Cultivo + Solución fisiológica + Lactosa + Glucosa + AMPc
En este caso, el agregado de AMPc debería compensar lo visto en el tubo Nº 6. Sin embargo,
vemos que no hubo reacción enzimática en este tubo, por lo cual podemos sospechar que el
AMPc no ingresó a la célula (habría que medir la cantidad de AMPc dentro de las bacterias para
comprobarlo), o que la cantidad de AMPc no fue la suficiente (para coprobarlo habría que
repetir el experimento con mayor concentración de AMPc) o simplemente la muestra de la cual
disponíamos no contenía AMPc funcional.
 • 8) Solución fisiológica + lactosa
Es nuestro blanco de reacción, ya que no esperamos que haya reacción en absoluto. Lo
utilizamos entonces, como referencia de lo mínimo de coloración obtenible.
• 9) Cultivo + Solución fisiológica + lactosa (pero la lactosa la agregamos luego de lisar las
bacterias)
Si la &beta -gal existiese de antemano en la bacteria y la lactosa simplemente activara a esta
enzima, en este caso deberíamos ver actividad enzimática. El resultado negativo de este
experimento confirma que la lactosa induce al sistema, en lugar de activar una proteína ya
presente en la bacteria.

SOLUCIONES UTILIZADAS:
Buffer Z... jamás nos explicaron para qué sirve cada cosa...
Cl3CH (cloroformo): junto con el SDS son utilizados para lisar las bacterias.

CUESTIONARIO:
Pregunta 1: La diferencia entre la inducción y la activación, es que por medio de la inducción, se logra
que se exprese un gen y se produzca de novo una proteína, mientras que en la activación, la proteína ya
está presente en la célula y esta es activada (valga la redundancia ).
Pregunta 2: Hacemos un experimento con un tubo, al cual le agregamos bacterias, Solución fisiológica,
IPTG, ONPG y AMPc. Si las bacterias son Crp- solamente veríamos actividad basal. Veríamos actividad
enzimática normal en una bacteria Cya- y en la Wild Type también veríamos actividad, pongamos o no
AMPc.
Pregunta 3:Bueno, se me va a complicar el tema del gráfico, pero básicamente, el gráfico de población
bacteriana vs. tiempo (gráfico de crecimiento) es la curva diauxia que vimos que crece un poco, luego
se forma una meseta y luego vuelve a crecer. El primer crecimiento corresopnde a las bacterias
alimentándose con glucosa, la meseta al momento en el que no hay glucosa, se empieza a producir
AMPc, se empieza a producir &beta -gal, etc, y luego comoienza a crecer nuevamente la colonia, ahora
alimentada por lactosa.
El gráfico de actividad de la &beta -gal se mantiene cerca del 0 mientras hay glucosa y luego comienza a
crecer sin detenerse hasta que el sustrato limite la reacción (no se frena en una meseta como el
anterior).
Pregunta 4:El IPTG y el ONPG ya fueron explicados, uno induce al sistema y el otro lo usamos para el
revelado del experimento.

Me olvidaba!!! Tengan en cuenta la diferencia entre Síntesis de escape y Expresión basal!!!

La síntesis de escape es la que se da en los instantes en los que, espontáneamente, el represor se

despega del operador y la RNA pol puede transcribir.
La expresión basal es la síntesis que se produzca aún sin que se unan el CRP + AMPc al promotor (esto se
da porque la RNA pol tiene poca afinidad, pero no es nula).
Tengan en cuenta que el Operón Lac tiene dos controles.
El control positivo es el que ejerce el AMPc junto con la proteína CRP para favorecer la transcripción.
El control negativo es el que ejerce el represor para evitar la transcripción.