2/28/11

DNA  repair  
Lehninger:  Chapters  8.3  &  25.2  
Addi9onal  informa9on:  Molecular  Biology  of  the  Cell  

• Types  of  DNA  damage  

• Repair  mechanisms:  
- Mismatch  repair  

- Base/Nucleo=de  excision  repair  

-­‐Direct  repair  
- Translesion  DNA  synthesis  

- Homologous  recombina=on  

DNA  molecules  are  constantly  being  damaged  

Common  types  of  damage:  
- mismatches:  replica9on  errors  
- hydrolysis:  depurina9on  and  deamina9on  
- oxida9on:  reac9ve  oxygen  species  from  metabolic  processes  (mitochondria)  
- methyla9on:  chemicals  
- pyrimidine  dimers:  UV  light    
- double-­‐strand  breaks:  ionizing  radia9on,  replica9on  fork  encountering  lesions      

Spontaneous oxidative damage Hydrolytic damage methylation

Figure 5-44 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

1
 2/28/11

DNA  lesions  must  be  repaired  

•  DNA  molecules  are  constantly  being  damaged  
•  Unrepaired  DNA  damage,  when  replicated,  usually  leads  to  either  a  base-­‐pair  subs9tu9on  
or  to  the  dele9on  of  one  or  more  base  pairs  in  the  daughter  DNA  

Muta=on  
•  A  permanent  change  in  nucleo9de  sequence  (point  muta9ons,  inser9ons  or  dele9ons)  

•  Most  muta9ons  are  neutral  or  deleterious,  rarely  they  provide  biological  advantage    

•  Fewer  than  1  in  1000  accidental  base  changes  in  DNA  results  in  a  permanent  muta9on;  
the  rest  are  eliminated  by  DNA  repair  

Cells  have  mul=ple  repair  pathways  to  deal  with  different  lesions  
Examples  of  repair  systems  in  E.  coli  

• Repair  mechanisms  are  carried  out  by  

different  enzymes  that  are  specialized  
to  deal  with  different  forms  of  DNA  
lesions  

• Several  percent  of  the  coding  capacity  

of  E.  coli  is  devoted  solely  to  DNA  repair  

• Many  repair  pathways  are  conserved    

from  bacteria  to  humans  

• In  humans,  >130  genes  encode  DNA  

repair  proteins  
 

2
 2/28/11

DNA  damage  and  cancer  

• DNA  damage  causes  cancer  
• DNA  damage  is  also  used  to  cure  cancer  (radiotherapy  and  chemotherapy)  
 

Muta=ons  in  genes  involved  in  DNA  repair  can  lead  to  cancer-­‐predisposi=on  syndromes  

Most  carcinogens  cause  muta=ons  

• Strong  correla9on  between  the  accumula9on  of  muta9ons  and  cancer  
• The  poten9al  of  a  chemical  to  induce  muta9on  can  be  measured  using  a  
specialized  bacterial  train  (Ames  test)  

Ames  test  for  carcinogens:  measuring  mutagenicity  

Salmonella  his=dine  
auxotroph,     -­‐his   -­‐his  
~25  spontaneous  
revertants  from    
108  cells  plated  
His=dine  
prototrophs  
-­‐his   -­‐his   -­‐  reversion  
Filter  soaked   frequency  
with  carcinogen   increased  from  
carcinogen-­‐  
induced    
muta=ons  

3
 2/28/11

Repair  pathways  
• The  ability  to  repair  damaged  DNA  is  essen9al  for  life  and  to  prevent  diseases  
• A  large  por9on  of  the  genes  in  our  genome  code  for  proteins  involved  in  repair  
pathways  
• We  will  discuss  in  detail  the  following  major  repair  pathways:  

•  Mismatch  repair  
•  Base  excision  repair  
•  Nucleo9de  excision  repair  
•  Direct  repair  
•  Translesion  DNA  synthesis  
•  Homologous  recombina9on  

Mismatch  repair  
• Type  of  lesion:  replica9on  errors  
• Old  strand  (template)  allows  for  repair  of  mismatches  in  the  new  strand  
• How  to  tell  which  strand  contains  the  mistake  due  to  misincorpora9on  during  
synthesis?  

Replica=on  machinery  makes  mistakes   Methyla=on  marks  the  new  strand  (in  E.  coli)  
Without  MMR:  1  error  per  107  nucleo9des  
With  MMR:  1  error  per  109  nucleo9des  
Dam  methylase  

M e t h y l a t e s   t h e   N 6  
posi9on   of   adenines  
within  GATC  sequences  

Proteins  involved    
in  mismatch  repair  

Fig.  25-­‐22  

4
 2/28/11

Mismatch  correc=on:  scanning  and  nicking  

• Finding  the  mismatch:  MutL-­‐MutS  binds  to  all  
mismatches  (except  for  C-­‐C)   Mismatched  base  in  
newly  synthesized  
DNA  strand  

• MutH,  binds  to  MutL  and  to  GATC  sequences  

encountered  by  the  MutL-­‐MutS  complex  

• Repairs  mismatches  as  much  as  1,000  bp  from  a  

hemimethylated  GATC  sequence  

• MutH  is  a  site  specific  endonuclease    -­‐  inac9ve  

un9l  the  complex  encounters  a  hemimethylated   Up  to  1,000  bp  

GATC  
     

Comple=ng  methyl-­‐directed  mismatch  repair  

•   A  region  of  DNA  between  the  nick  and  the  mismatch  is  replaced  with  new  DNA  
•   Huge  energe9c  cost  for  the  cell  (up  to  1,000  bp  can  be  replaced)  

Fig.  25-­‐24  

5
 2/28/11

Mismatch  repair  and  cancer  

• All  eukaryo9c  cells  have  proteins  analogous  to  MutS  and  MutL  (example:  Msh2  in  
humans,  MutS  homolog  2)  
• Muta9ons  in  mismatch  repair  genes  predispose  to  cancer  
• Defects  in  the  human  hMLH1  gene  predisposes  pa9ents  to  familial  colon,  
endometrial  and  ovarian  cancers.    Defects  in  such  genes  could  account  for  up  to  
15%  of  all  human  colorectal  cancers  

Discovering  the  rela=on  between  Msh2  muta=ons  and  cancer  

Further  reading:  Fishel  R,  Lescoe  M,  Rao  M,  Copeland  N,  Jenkins  N,  Garber  J,  
Kane  M,  Kolodner  R  (1993).  "The  human  mutator  gene  homolog  MSH2  and  its  
associa9on  with  hereditary  nonpolyposis  colon  cancer".  Cell  75  (5):  1027–38.  
doi:10.1016/0092-­‐8674(93)90546-­‐3  

Basic  science   + Clinical  science   = Major  discovery  

Study  of  MutS  in   Mapping  mutated  locus   Muta9ons  in  a  human    
bacteria  and  yeast   in  HNPCC   MutS  homolog  (Msh2)  
predisposes  to  HNPCC  

Base  excision  repair  

• Type  of  lesion:  modified  bases  (example:  deaminated  cytosine)  
• Depurina9on  is  by  far  the  most  frequent  type  of  damage  suffered  by  DNA  

Common  sources  of  spontaneous  muta=ons  

Cytosine  deamina=on   Guanine  depurina=on  

Figure 5-45 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Figure 5-47 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

6
 2/28/11

Steps  in  base  excision  repair  

• Step  1:  DNA  glycosylase  cleaves  N-­‐glycosyl  bond,  
crea9ng  an  AP  site    
 
Each  DNA  glycosylase  is  generally  specific  for  one  
type  of  DNA  damage  
 
example:  uracil  glycosylase  removes  uracil  from  
DNA  resulted  from  the  deamina9on  of  cytosine  
 
(note:  AP  sites  are  also  formed  by  spontaneous  hydrolysis)  

•  Step  2:  the  enzyme  AP  endonuclease  cuts  the  

phosphodiester  bond  in  the  DNA  strand  containing  
the  AP  site  

•  Steps  3&4:  DNA  polymerase  I  and  DNA  ligase  repair  

gap    

Nucleo=de  excision  repair  

• Type  of  lesion:  "bulky  lesions"  that  cause  large  distor9ons  in  the  helical  structure  
 example:  pyrimidine  dimers  caused  by  UV  light  

Forma=on  of  pyrimidine  dimers  induced  by  UV  light  

7
 2/28/11

Steps  in  nucleo=de  excision  repair  

• Step  1:  the  enzyme  complex  Excinuclease  cleaves  
•  Step  2:  the  enzyme  AP  endonuclease  cuts  the  phosphodiester  bond  in  the  DNA  
strand  containing  the  AP  site  
•  Steps  3&4:  DNA  polymerase  I  and  DNA  ligase  repair  gap  

Fig. 8-34

Nucleo=de  excision  repair  and  cancer  

• Human  gene9c  disease,  Xeroderma  pigmentosum  (XP)  -­‐  a  defect  in  the  
enzyme  that  excises  Py-­‐dimer  -­‐  leads  to  mul9ple  skin  cancers  
• In  extreme  cases  all  exposure  to  sunlight  must  be  forbidden,  no  maler  how  
small    
 

8
 2/28/11

Direct  repair  (photoreac=va=on)  

• Type  of  lesion:  "bulky  lesions"  that  cause  large  distor9ons  in  the  helical  structure  
 example:  pyrimidine  dimers  caused  by  UV  light  
• Simple  reversal  of  damage:  the  enzyme  DNA  Photolyase  captures  energy  from  light  
and  uses  it  to  break  the  covalent  bonds  linking  adjacent  pyrimidines  
The  ac=on  of  photolyase  

Translesion  synthesis  
• Type  of  lesion:  damaged  DNA  template.  A  replica9on  fork  can  encounter  a  lesion  
that  has  not  been  repaired  
   example:  pyrimidine  dimer  or  apurinic  site    
• In  translesion  synthesis  (TLS),  the  replica9on  machinery  can  bypass  these  lesions  
• TLS  is  catalyzed  by  a  special  class  of  DNA  polymerases  –  the  Y  family  (in  E.  coli:  Pol  
IV  (DinB)  and  Pol  V  (UmuC  /  UmuD)  
• TLS  polymerases  incorporate  nucleo9des  in  a  manner  that  is  independent  of  base-­‐
pairing  (but  s9ll  needs  template):  can  synthesize  DNA  over  a  lesion  
• TLS  is  error-­‐prone:  it  reduces  fidelity  to  one  error  in  ~1000  nucleo9des.    Although  it  
is  likely  to  introduce  muta9ons,  spares  the  cell  the  worse  fate  of  an  incompletely  
replicated  chromosome:  TLS  is  a  last  resort    

Error  prone  repair  

TLS  pol  

9
 2/28/11

Summary  
Mistakes  of  DNA  replica=on  
 
1.  Mismatch  repair  -­‐  Pol  III  
 (improves  overall  fidelity  replica9on  by  a  factor  of  102  to  103)  
 
Damages  incurred  throughout  the  life=me  of  a  cell  
 
2.  Excision  repair  -­‐  Pol  I  
 a.  Base  excision  repair  -­‐  removal  of  damaged  base  
 b.  Nucleo9de  excision  repair  –  remove  bulky  lesions  (e.g.  pyrimidine  dimer)  
 
3.  Direct  repair  -­‐  DNA  photolyases  (not  present  in  placental  mammals)  
 Photoreac9va9on  of  pyrimidine  dimers  induced  by  UV  
 
Damages  encountered  at  replica=on  forks    
 
4.  Error-­‐prone  repair  -­‐  Pol  IV  and  Pol  V  (in  bacteria)  
 
5.  Recombina9onal  DNA  repair  (will  be  addressed  in  "Recombina9on"  lecture)  

Assignments  
 
• Textbook  Problems:  page  1018-­‐1019:  problems  11,  12  

• Addi=onal  assignments:    
1.  Speculate  on  why  the  mismatch  repair  system  is  so  highly  conserved  from  bacteria  to  humans.  
 
2.  What  is  the  major  evidence  that  DNA  damage  causes  cancer.    
 
3.  What  would  happen  if  TLS  polymerases  were  used  more  frequently  than  normal  replica9ve  DNA  
polymerases.  
 
• Sugges=on  of  topics  for  review  session:  
o Mechanism  of  DNA  synthesis  via  TLS  polymerases  
o Types  of  TLS  polymerases  

10