Proteínas Totales

PROTEINAS TALES Y LA EVALUACION DE PROTEINA VICERAL

La mayoría de las proteínas plasmáticas son sintetizadas en el hígado. Otras

proteínas se encuentran en el plasma sanguíneo, que son de gran importancia
para valorar al paciente, son as gamma globulinas (anticuerpos) y la
hemoglobulina; la primera se sintetiza en los linfocitos T y la última en los
eritroblastos (eritrocitos jóvenes)

Las proteínas plasmáticas de los tejidos ocupan una posición central en el

metabolismo proteico; interaccionan con todos los tejidos o células del
organismo y están muy relacionadas con el metabolismo proteico en el hígado,
siendo estos: la albumina las globulinas y el fibrinógeno.

“DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS SERICAS TOTALES POR EL MÉTODO

DE BIURET”
OBJETIVO Que el estudiante aprenda a manejar métodos colorimétricos en
la determinación de proteínas

INTRODUCCIÓN
Las proteínas son compuestos a base de carbono, hidrógeno, oxígeno,
nitrógeno y generalmente azufre y fósforo. El elemento característico es el
nitrógeno. Todas las enzimas, algunas hormonas y muchos componentes
estructurales importantes de la célula son proteínas.
Las moléculas de proteína son muy grandes y contienen miles de átomos; su
estructura es extremadamente compleja. Gran parte de las proteínas
intracelulares son enzimas, sustancias que regulan la rapidez con que se han
de tener numerosas reacciones celulares.
Las moléculas de proteína están formadas por componentes más simples
llamados aminoácidos. Puesto que cada proteína puede tener cientos de
aminoácidos combinados en ciertas proporciones y orden es posible una
variedad prácticamente infinita de moléculas de proteína. Se han ideado
métodos de análisis para reconocer la disposición exacta de aminoácidos en
una molécula proteínica. La insulina, hormona secretada por el páncreas y
utilizada en el tratamiento de la diabetes, fue la primera proteína cuya
estructura se conoció. La ribononucleasa, secretada por el páncreas, fue la
primera enzima de la cuál se conoció el orden exacto de aminoácidos.
Pueden distinguirse varios niveles de organización en la molécula de proteína.
El primer nivel es la llamada estructura primaria, que depende de la serie de
aminoácidos en la cadena de polipéptidos. Esta serie, está determinada a su
vez, por la serie de nucleótidos de RNA y DNA del núcleo de la célula. Un
segundo nivel de organización de las moléculas proteínicas supone la adopción
de la forma de hélice u otra configuración regular por la cadena de polipéptidos.
Estas cadenas ordinariamente no se encuentran planas en una molécula de
proteína, sino que adoptan formas espiralazas para dar una estructura
tridimensional. Una de las estructuras secundarias comunes de las moléculas
proteínicas es el hélice enα, que se supone una formación espiralaza de la
cadena de polipéptidos básica. La hélice enα es una estructura geométrica muy
uniforme con 3.6 aminoácidos que ocupan cada vuelta de la hélice. La
estructura helicoidal es determinada y mantenida por la formación de enlaces
de hidrógeno entre residuos de aminoácidos en vueltas sucesivas de espiral.
Un tercer nivel de estructura de moléculas proteínicas es el desdoblamiento de
la cadena de péptidos sobre sí misma para formar proteínas globulares. De
nuevo enlaces débiles como enlaces de hidrógeno, iónicos e hidrofóbicos se
forman entre una parte de la cadena de péptidos y la otra parte, de modo que
la cadena se desdobla de una manera específica para dar una estructura
general específica de la molécula proteínica. Enlaces covalentes como los de
disulfuro (-S-S-) son importantes en la estructura terciaria de muchas proteínas.
La actividad biológica de una proteína depende en gran parte de la estructura
primaria específica que es mantenida junta por esos enlaces.
Cuando una proteína se calienta o trata con cualquiera de una variedad de
productos químicos, se pierde la estructura terciaria. Las cadenas de péptidos
espiralazas se desdoblan para dar una configuración aleatoria acompañada por
una pérdida de la actividad biológica de la proteína. Este cambio se
llama“desnaturali zación”.
Los 20 aminoácidos aminados que suelen encontrarse en las proteínas poseen
todos un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxílico (-COOH), pero sus
cadenas laterales son distintas. El mas simple de todos, la glicina, tiene como
cadena lateral un H; la alanita, un grupo –CH3. El grupo amino permite al
aminoácido aminado actuar como base y combinarse con ácidos; el grupo
ácido, le permite combinarse con las bases.
Los aminoácidos y las proteínas sirven deamortiguadores y pueden resistir a
cambios de acidez y alcalinidad. Los aminoácidos se unen entre sí para formar
proteínas mediante un enlace peptídico entre el grupo amino de una molécula y
el grupo carboxilo de la otra.
Los aminoácidos puros obtenidos de las proteínas tienen sabor dulce. Cuando
se ingieren proteínas son hidrolizadas a aminoácidos antes de ser absorbidas a
la corriente sanguínea. Los aminoácidos son llevados a todas las regiones del
organismo, donde sirven para la elaboración de nuevas proteínas, o son
metabolizados para liberar energía. Las proteínas tienen importancia primordial
como componentes estructurales de las células y como constituyentes
funcionales de enzimas y algunas hormonas, pero pueden servir también como
combustible para producción de energía. Los aminoácidos pierden primero su
grupo amino por una reacción enzimática llamadadesaminaci ón. El grupo
amino reacciona con otras sustancias para formar urea, que se excreta. El
resto de la molécula puede transformarse por una serie de fases intermedias
en glucosa, que se utiliza pronto como combustible, o almacenarse como
glucógeno
Las plantas pueden sintetizar todos los aminoácidos a partir de sustancias
simples. Los aminoácidos que los animales no pueden sintetizar y que deben
obtener en su alimentación se llaman aminoácidos esenciales. Debe
comprenderse que estos aminoácidos no son más esenciales que otros; sólo lo
son respecto a la alimentación, pues no es posible sintetizarlos.
Identificación de aminoácidos y proteínas: ℘Reacción de Ninhidrina Reacción
para la detección de aminoácidos, actualmente acoplada a sistemas de
valoración automática Tiene como objetivo detectar y cuantificar cantidades de
aminoácidos libres. Los aminoácidos, en general reaccionan con la ninhidrina
cuando son calentados con un exceso de la misma. Todos los aminoácidos que
poseen un grupo amino libre reaccionan y forman dióxido de carbono,
amoníaco y un aldehído que contiene un átomo de carbono menos que el
compuesto original. Esta reacción da lugar a la formación de un producto color
azul o púrpura (que posteriormente puede ser utilizado para cuantificar el
aminoácido). En el caso de la prolina, que estructuralmente no posee el grupo
amino libre, sino un grupo imino, la coloración final es amarilla. El amoníaco, la
mayoría de los polipéptidos y las proteínas pueden desarrollar coloración en
esta reacción, pero a diferencia de los aminoácidos, no liberan CO2. La
coloración azulada o violeta será proporcional a la concentración del
aminoácido.
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante energético que por
una desaminación oxidativa de los aminoácidos conduce a la formación del
aldehído correspondiente, con liberación de amoniaco y gas carbónico y
formación de la ninhidrina reducida o hidrindrantina. La molécula de
hidridantina, en presencia de otra de ninhidrina, condensa a través del
amoniaco produciendo una estructura denominada indanona o púrpura de
Ruhemann, manifestando un color rojizo, excepto para la prolina, hidroxiprolina
y en menor medida
para la histidina. Presenta su máximo de absorbancia a los 570 nm,
exceptuando los tres aminoácidos reseñados anteriormente. ℘Reacción de
Biuret El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por
la condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Esta
reacción está dada por aquellas sustancias cuyas moléculas contienen dos
grupos carbamino (-CO.NH) unidos directamente o a través de un solo átomo
de carbono o nitrógeno. El reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solución
acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa
en la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los
pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los
enlaces peptídicos. Esta última reacción provoca un cambio de coloración:
violeta púrpura o violeta rosado. Debe señalarse que el color depende de la
naturaleza de las proteínas; proteínas y péptidos dan un color rosado; la
gelatina da un color azul
℘Reacción de Millón La reacción del Millón se debe a la presencia del grupo
hidroxifenilo en la molécula proteica. Cualquier compuesto fenólico que no esté
sustituido en la posición 3,5 como la tirosina, el fenol y el timol producen
resultados positivos en esta reacción. De estos compuestos, sólo la tirosina
está presente en las proteínas, de manera que sólo las proteínas que tienen
este aminoácido ofrecen resultados positivos.
En esta prueba los compuestos mercúricos en medio fuertemente ácido (ácido
nítrico del reactivo) se condensan con el grupo fenólico formando un
compuesto de color rojo ladrillo o rojizo. La prueba no es satisfactoria para
soluciones que contienen sales inorgánicas en gran cantidad, ya que el
mercurio del reactivo del Millón es precipitado y se vuelve negativo, razón por
la cual este reactivo no se usa para medir albúmina en orina. Debe tomarse en
cuenta que en el caso de que la solución a examinar sea muy alcalina, debe
ser previamente neutralizada, ya que el álcali precipitaría al ion mercurio en
forma de óxidos amarillos. Además, proteínas como la ovoalbúmina producen
un precipitado blanco que progresivamente por acción del calor se torna rojo;
pero las peptonas dan solamente una solución de color rojo. ℘Reacción de
Xantoproteica Esta prueba caracteriza a los aminoácidos aromáticos (tirosina,
fenilalanina, triptófano. Esta reacción se debe la presencia de un grupo fenilo
en la molécula proteica. Los complejos de la molécula proteica que son de
importancia en esta reacción son la tirosina y el triptófano. La fenilalanina no
reacciona en las condiciones que se realiza en el laboratorio. Para esta prueba
se produce la nitración del anillo bencénico presente en los aminoácidos
obteniéndose nitrocompuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjado en
medio fuertemente alcalino (formación de ácido picrámico o trinitrofenol). No
puede realizarse esa reacción para identificar albúmina en orina, por el color
anaranjado de la reacción final. Las proteínas que tienen en su composición
estos aminoácidos también darán la reacción. La positividad se reconoce por la
aparición de un color amarillo o verde debido a la formación de
nitrocompuestos.
℘Prueba de los grupos SH: Es una prueba para identificar aminoácidos
azufrados y las proteínas que los contienen, se reconocen por la formación de
una coloración negra o gris. ℘Prueba de Sakaguchi Esta prueba es positiva
para compuestos que contengan el grupo guanidinio como la arginina ya que
casi todas las proteínas poseen ese aminoácido.El reactivo que se utiliza
contiene α-naftol e hipoclorito sódico, en medio alcalino. La aparición de una
coloración roja es indicativa de una reacción positiva. El desarrollo de un color
rojo marca la reacción positiva y se debe a la presencia del grupo guanidina,
que caracteriza la arginina.
℘Prueba de Hopkin-Cole Implica la reacción del grupo indol del triptofano con
el ácido glioxílico y las proteínas que lo contienen, en presencia de ácido
sulfúrico concentrado. La positividad se reconoce por la aparición de un anillo
color violeta-rojizo.
℘Prueba de Jaffé Si acontece la aparición de una coloración roja, se tratará de
una prueba positiva para la creatinina. Puede ser leída a 520 nm, detectándose
hasta 5 μg/mL. ℘Prueba de coagulación: Es una prueba para identificar:
albúminas, globulinas, glutelinas y prolaminas. La positividad se manifiesta por
la formación de un coágulo. No se conoce exactamente el mecanismo de
reacción, se cree que ocurre cierta deshidratación de la molécula proteica.
℘Prueba de Sulfato de amonio: Las proteínas, como otros coloides son
precipitadas por soluciones concentradas de sales de amonio [NaCl.
(NH4)2SO4 y NaSO4 ]. Aparentemente la precipitación se debe a la
neutralización y deshidratación de la molécula, seguida de agregación y
precipitación.
℘Reacción de Ehrlich La presencia de anillos aromáticos fenólicos o
nitrogenados en la cadena lateral de los Aminoácidos se puede identificar
mediante la reacción con ácido sulfanílico y nitrito de Sodio por formación de
sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo así detectar la presencia
de Tirosina e Histidina libres o formando péptidos y proteínas.
℘Reacción con acetato de Plomo alcalino Los Aminoácidos azufrados como
Metionina, Cisteina y Cistina se reconocen por la formación de precipitados de
Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona
con Acetato de Plomo en medio alcalino.
La mayoría de las especies animales tienen valores de proteína séricas de
alrededor de 7.6 g por 100 ml. En general aumenta cuando hay una ingesta
disminuida de fluidos o cuando hay pérdida de líquidos (diarrea, vómitos,
quemaduras, etc.). Cuando los niveles disminuyen a 5.3 o menos se presenta
edema inmediatamente. La disminución puede deberse a muchas causas tales
como excreción renal (albuminuria) o cuando la síntesis de proteína esta
disminuida debido a la desnutrición, deficiencia de vitaminas o enfermedades
de las vías digestivas y del hígado.
Proteínas séricas Son proteínas globulares que permanecen en el suero tras la
acidificación de la leche a pH = 4,6 o por la acción del cuajo, no interviniendo
en la formación de la cuajada, razón por la que también se las denomina
proteínas séricas. Y se detectan en el suero de quesería una vez separado del
gel por tecnologías clásicas.
La determinación de proteínas séricas en sangre sirve para confirmar
desórdenes relacionados con la sangre, riñones, enfermedades hepáticas,
deficiencias proteicas, diagnóstico de tumores. Valores normales: Proteínas
totales 6.6 a 7.9g/dl
Albúmina 3.3 a 4.5g/dl
Alpha-1-globulina 0.1 a 0.4g/dl
Alpha-2-globulina 0.5 a 1g/dl
Beta globulina 0.7 a 1.2g/dl

Gamma globulina 0.5 a 1.6g/dl Valores aumentados: en enfermedades

inflamatorias; enfermedades del colágeno; deshidratación; diabetes; acidosis
diabética; cirrosis; algunos linfomas; mieloma; enfermedad de Waldenstrom;
Lupus eritematoso sistémico; algunas enfermedades infecciosas; artritis
reumatoidea; vómitos y/o diarrea. Métodos de Determinación de proteínas
séricas Debido a que la albúmina sérica y por lo menos una pequeña fracción
de las globulinas se sintetizan en el hígado, las proteínas del suero son
afectadas tanto cualitativa como cuantitativamente en los procedimientos
hepáticos. En cualquier enfermedad que ocasione alteraciones hepocelulares
la concentración de seralbúmina estará disminuida. En diversas hepatopatías
las globulinas séricas pueden alcanzar niveles suficientes que basten para
mantener la concentración total de proteínas a niveles normales o elevados,
aun en presencia de una notable reducción de la albúmina.
Debido a estas causas, las cifras cambiantes de albúmina sérica proporcionan
índices valiosos con respecto a la severidad, evolución y pronóstico de las
hepatopatías. Los niveles bajos de albúmina y levados de globulina en suero,
indican origen hepatocelular de la ictericia o de la hepatopatía. En la ictericia
obstructiva, los cambios de las proteínas del suero se presentan tardíamente,
una vez que se han instalado las alteraciones hepatocelulares secundarias. Sin
embargo, la colangitis y la cirrosis biliar ocasionan alteraciones hepáticas que
pueden no ser precedidas por alteraciones en las proteínas. Más aun, las
alteraciones de las proteínas séricas pueden volver a la normalidad antes de
que la convalecencia de la hepatitis se haya completado. La interpretación del
significado de la determinación de las proteínas séricas requiere, por lo tanto,
un gran cuidado y criterio.
Las concentraciones séricas de proteínas totales, albúmina y globulina pueden
determinarse químicamente. El fraccionamiento por electroforesis proporciona
una determinación más exacta de los componentes de las proteínas séricas
Las proteínas normalmente difunden desde el plasma al LCR a través de la
barrera sangre-LCR. La mayor parte de las proteínas séricas se hallan en el
LCR e incluyen el fibrinógeno y la lipoproteína beta en concentraciones bajas.
Las proporciones de concentración entre plasma y LCR se relacionan
moderadamente bien con los radios hidrodinámicos, y no tan bien con los
pesos moleculares.
Métodos Los métodos utilizados para medir las proteínas totales en el LCR
pueden clasificarse en 6 categorías: 1. Procedimientos turbidimétricos
a) Ácido sulfosalicílico más sulfato sódico
b) Ácido tricloroacético (TCA)

4 2. Espectrofotometría ultravioleta a 210 mn después de:

a) Cromatografía en columna.
b) Ultrafiltración

3. Métodos de Lowry utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteau

a) Con blanco
b) Sin blanco

4. Procedimientos modificados del biuret con medición a 300 nm 5. Métodos

inmunológicos. En Estados Unidos se utilizan mucho los métodos
turbidimétricos. Existe una relación lineal entre la turbiedad y la temperatura, y
es esencial en control exacto de esta última para obtener resultados
reproducibles. El ácido sulfosalicílico de mayor turbiedad con la albúmina que
con las globulinas; sin embargo, las variaciones de la relación albúmina-
globulina no tienen efecto significativo sobre el método de SSA/SS (3% de
ácido sulfosalicílico en 7% de sulfato sódico) de Meulmans o el método del
TCA de Meulmans (3% de ácido tricloroacético). Como consecuencia de las
variaciones de reactividad observadas con la albúmina y globulina, no debe
utilizarse albúmina como estándar para los métodos turbidimétricos. Las
ventajas de estos métodos comprenden su sencillez y el hecho de que algunos
medicamentos que interfieren con los procedimientos de Lowry y del Biuret sin
blanco no provocan turbiedad con el SSA o el ácido tricloroacético (TCA). Las
desventajas incluyen el hecho de que se necesitan aproximadamente 500 μl de
LCR, en comparación con 25 a 200 μl para los otros métodos, y la xantocromía
y el metotrexato intratecal pueden provocar interencias.
La espectrofotometría ultravioleta (UV) a 200 nm se basa en el principio de que
las soluciones de proteínas muestran una absorbancia intensa entre 210 y 220
nm, lo cual refleja la presencia del enlace peptídico. Las interferencias debidas
a los polipéptidos de cadena corta y a los fármacos pueden eliminarse por
cromatografía de columna o con un blanco preparado por ultrafiltración. Los
trastornos de la relación albúmina-globulina no tienen efecto, puesto que la
albúmina y la globulina tienen absorbancia comparable a 210 nm. La
espectrofotometría UV sólo requiere entre 100 y 200 μl de LCR y la precisión
parece ser algo superior a la de los métodos turbidimétricos. Por otra parte,
requiere más tiempo y es más difícil que estos métodos; el limite superior del
intervalo de regencia por este método es algo mayor (60mg/dl) que para otras
técnicas, y no todos los laboratorios disponen de la instrumentación necesaria.
El método de Lowry con el reactivo de Folin-Ciocalteau se utiliza mucho en
Europa. Este método comporta dos reacciones: a) una reacción inicial de la
proteína y el cobre, relacionada con la reacción del biuret; b) una segunda
reducción de los ácidos fosfotúngstico y fosfohemolíbdico con el complejo de
cobre-proteína, así como con tiosina y triptófano. El método de Lowry sólo
precisa 100 a 200 μl de LCR. Sin embargo, es más prolongado y más difícil
que los métodos turbidimétricos, y está sujeto a interferencias variables
derivadas de los fenoles y fármacos producidos endógenamente (salicilatos,
cloropromacina, tetraciclina y sulfamidas).
Varios autores entre ellos Burgi (1967) han descrito métodos de Biuret
modificados. No obstante estos parecen menos utilizados que los
procedimientos turbidimétricos, la espectrofotometría UV o el método de Lowry.
Solo se necesita de 100 a 200 μl de LCR. Los métodos del Biuret requieren
más tiempo y son más difíciles que los turbidimétricos y están sujetos a
interferencias derivadas de los polipéptidos de cadena corta (las cuales pueden
compensarse utilizando como blanco un filtrado libre de proteínas).
Aunque sean descritos métodos de fijación de colorantes, la experiencia hasta
la fecha parece limitada, en comparación con otros métodos de proteínas de
LCR, es una desventaja. También se han descrito métodos inmunológicos para
las proteínas totales de LCR. Una importante ventaja consiste en que solo se
necesita pequeñas cantidades de LCR ( 25 a 50 μl). Después de establecer las
condiciones de reacción y estandarizar los reactivos, la técnica es
relativamente simple y comparable a los métodos turbidimétricos. Las
desventajas estriban en que diferentes proteínas pueden originar diversas
curvas de precipitinas, así como distintas respuestas de dispersión luminosa,
cuando están ligadas a su anticuerpo específicos. Así mismo, puede producirse
una variación entre diferentes lotes de antisueros. Aunque los métodos
inmunológicos ofrecen ventajas significativas para las proteínas totales del
LCR, su empleo más amplio exigirá mayor experiencia, así como antisueros
fiables que reaccionen de manera uniforme con todas las proteínas del LCR.