Allgemeine & molekulare Mikrobiologie I

1.Vorlesung
Bakterien sind die höchst evolvierte Form des Lebens: sie haben sich an alles angepasst!
- optimale Anpassung an ihre Lebensumstände.
Überall gibt es Leben in Form von Bakterien. Sie sind essentiell für uns. Wir haben ~10x mehr
bakterielle Zellen als menschliche Zellen (~1,5-2kg)

Prokaioten:
-einzelnes zirkuläres Nukleoid (=Chromosom); ist von KEINER Membran umgeben.
-Atmung direkt an der Zellmembran
-Fortbewegung: Flagellen, gleiten mit Fimbrien
- Sexpili
- Zellwand: Peptidoglycanschicht

Eukarioten:
- Hat einen Nucleus (Prokariont hat ein Nucleoitid)
-Es ist eine Membran um den Nucleus
-Viel größer als prokariontische Zellen

Das Nucleoid Ist das Kernäquivalent und ein einzelnes zirkuläres Chromosom
(E-coli ist 2-3mycrometer lang, und sein Chromosom hat 4,6x10^6 Basen, hat also eine Länge von
über 1000 Mycrometern. Ist also länger als die Zelle selbst.).
Um das zu ermöglichen ist die DNA in den meisten Fälle negativ supercoiled (verdrillt) durch
Gyreasen. Zusätzlich zu dieser Verdrillung gibt es noch histon-ähnliche Proteine (z.B. HU) und um
diese Proteine ist die DNA verdrillt (ähnlich wie bei Histonen in Eukaryotischen Zellen).
Das Chromosom haftet an der Membran fest. Also es gibt einen Punkt an dem das Chromosom an die
Membran gebunden ist.
-> Warum ist das essentiell? Was passiert, wenn man diese Bindung auflöst?
- Genau zum Zeitpunkt der Replication -> Diese Bindung an die Zellwand versichert, dass die 2
Chromosomen, nach der Replication, in die Tochterzellen aufgetrennt werden und das wirklich jede
Tochterzelle 1 Chromosom bekommt.
Genetic Map oft he Chromosome E-coli:
Das Chromosom der Bakterien wird in die "Genetic map" eingeteilt, also auf dem Chromosom sind
die Gene localisiert und man sieht hier in rosa, dort steht "DNA replication and repair", dort sitzt der
origin of replication (=Startpunkt für die Replication). An den Terminationssides läuft dann die
Replication zu Ende.
Wie man sieht ist das Chromosom von E-coli in Minuten eingeteilt (in 100 Minuten).
-> Wieso das?
- Die Ersten Experimente: Man hat eine unterbrochene Konjugation durchgeführt. Das war das
Experiment von F. Jacob und E. Wollman Ende der 50er Jahre. Bei der Konjugation wird die DNA in
ein anderes Bakterium übertragen. Bakterien mit dem F-Faktor (=Pasmid) auf dem die
konjugationsgene sitzen, diese kodieren wiederum für Proteine die zur Ausbildung eines
Konjugationspilus führen, und die auch DNA von der Donor Zelle (=Spenderzelle) in die Rezeptorzelle
übertragen können und somit einen Austausch der genetischen Information durchführen können.
Jakob und Wollman haben sich aber ganz bestimmter Stämme bedient, und zwar von den Hfr-
Stämmen (=High frequenzy of replication) in denen dieser F-Faktor ins Chromosom integriert ist und
dadurch kommt es dann zur Übertragung des Chromosoms.
Sie haben dann diese Konjugation immer wieder unterbrochen. Da ja die Konjugation bei einem
bestimmten Locus beginnt, haben sie es einfach nach 5min, nach 10min, usw. unterbrochen und
untersuchten dann jeweils den Rezipienten, welche Gene zu welcher Minute schon übertragen sind,
indem sie testen, ob dieser Stamm z.B. schon Lactose verwerten kann. Somit konnten sie dann eine
erste, sehr primitive Genkarte von E-coli erstellen. Zu den 100min kam es deswegen, weil der ganze
Vorgang für das gesamte Chromosom einfach 100min dauerte.
Im Cytoplasma findet der ganze Stoffwechsel statt. Außen ist die Membran die das CP umgibt, sie ist
also nach außen hin abgedichtet. Sie ist also eine selektiv durchlässige Membran. In erster Linie
enthält das Cytoplasma viel Wasser (80%). Es sind aber auch die ganzen Nucleinsäuren enthalten,
also die mRNA, rRNA, tRNA, sRNA und die Plasmide.
Plasmide: Also im Gegensatz zum Chromosom, das an die Membran gebunden ist, sind Plasmide
zirkuläre DNA Fragmente die frei in der Zelle herumschwimmen. Die Plasmide sind so aufgebaut,
dass sie auch einen origin of replication haben, und es gibt Plasmide mit verschiedenen
Mechanismen der Replication, dadurch gibt es auch Plasmide die in einer höheren Kopienzahl
vorkommen (zwischen 300-500 Kopien pro Zelle), oder auch Plasmide die nur zwischen 10-20
Kopien/Zelle vorliegen haben, oder wie z.B. der F-Faktor nur in einer Kopienanzahl von 1-2
vorkommt.
Auf den Plasmiden sind auch die Konjugationsgene drauf, welche für die Ausbildung des Pilus
notwendig sind.
Plasmide die in freier Wildbahn vorkommen, enthalten manchmal auch Antibiotika Resistenzen, aber
alle haben Informationen drauf, die den Zellen einen Vorteil bringt. Diese können aber auch verloren
gehen, und bei der Zellteilung werden die Plasmide, dadurch da sie ja nicht fixiert sind, einfach
zufällig verteilt.
Wenn jedoch kein Selektionsdruck vorhanden ist, gehen die auch relativ schnell verloren (denn
zusätzliche Information bedeutet zusätzliche Translation und zusätzliche Proteinsynthese) denn dann
sind die Plasmide nur eine Last, weil auch Zellen ohne Plasmide wachsen auch schneller.
Die Ribosomen sind der Ort der Proteinsynthese. E-Coli hat ca. 2000 versch. Proteine.
Hier in schwarz ist die mRNA, die 30S Untereinheit in Türkis, die 50S Untereinheit in orange.
Das sind die größten Maschinen der Zelle, sie bestehen aus RNA und Proteinen. Sie haben einen
Durchmesser von ca.25nm (=250A).
Zellhülle: Cytoplasmatische Membran (Gram +, -) = innere Membran
-Aus Phospholipiddoppelschicht + Proteine
-Proteine schwimmen darin frei herum
-Cholesterol bei Eukarioten, Diplotän bei Prokarioten
-Phospholipid Doppelschicht: innen hydrophobe Fettsäuren, außen hydrophil
-Die Fettsären werden an die Bedingungen angepasst
-ungesättigte Fettsäuren erhöhen die Fluidität und umgekehrt (bei geringen Temperaturen)
Das CP ist von einer Membran umgeben und von einer Zellwand.
Das ist die Zellwand eines Gram- Bakteriums. Was Gram-, und + vereint, ist die cytoplasmatische
Membran (=Innere Membran). Die innere Membran ist aufgebaut aus einer
Phospholipiddoppelschicht und Proteinen die eingelagert sind. Das Ganze nennt sich "fluid-mosaic
model". D.h. die Proteine die in den Phospholipidbelayer inseriert werden, schwimmen eigentlich in
diesem herum. Sie sind also nicht verankert, sondern können sich durch die Membran bewegen.
Cytoplasmatische Membran: Die Zusammensetzung der Cytoplasmatischen Membran ist: 40%
Phospholipide, 60% Proteine.
Diese Proteine verleihen der Membran die Asymmetrie, weil die Membran ist eigentlich
symmetrisch.
Die Membran wird verstärkt durch Hopanoide, welche strukturell sehr ähnlich dem Cholesterol sind
(Cholesterole sind nur in Membranen von Eukarioten vorhanden). Die Membranen der Prokaryoten
werden von Hopanoide wie z.B. Diplotän verstärkt. Die Phospholipid Doppelschicht.
Es sind amphipatische Moleküle vorhanden, d.h. nach außen ist der Hydrophile Bereich mit den
Glycerinmolekülen die einen Phosphatrest besitzen, und nach innen gerichtet die Hydrophoben
Fettsäuren.
Also es gibt das Glycerol mit der Phosphatgruppe welche über eine Esterbindung mit den Fettsäuren
verbunden sind.
Die Fettsäuren werden an die Bedingungen angepasst, und die Art der Fettsäure (gesättigt oder
ungesättigt) trägt auch zur Fluidität der Membran bei. Ungesättigte Fettsäuren erhöhen die Fluidität,
d.h. unter Bedingungen wo die Zelle erhöhte Fluidität braucht oder sie gleichhalten will, aber z.B.
unter geringeren Temperaturen, wird die Zelle mehr ungesättigt Fettsäuren einbauen um die
Fluidität auch unter geringen Temperaturen zu erhalten. Diesen Vorgang nennt man "Homeoviscous
Adaption", also die Zusammensetzung der Lipiddoppelschicht wird an die Umweltbedingungen
angepasst.
Es gibt auch noch Unterschiede zwischen Spezies im Aufbau der Fettsäuren.
Es gibt also nicht nur die Anpassung, sondern auch noch die Spezies ist ausschlaggebend welche
Fettsäuren eingebaut werden.
Im Vergleich von Gram-, und +: Der Unterschied:
Gram+ haben keine Äußere Membran, dafür haben sie aber eine wesentlich dickere
Peptidoglycanschicht.
Gram-Färbung: ->Warum eig. Gram+ und -?
- Diese Unterscheidung kommt vom J. Gram, er hat sie mit einem Iod-Caliumiodid-Komplex
angefärbt. Dadurch entstand ein Lack, der Alkohollöslich ist. Dann hat er manche Bakterien mit
Ethanol behandelt, werden manche Bakterien entfärbt und andere behalten die Farbe. Um die
entfärbten Zellen wieder sichtbar zu machen gibt es eine Gegenfärbung, das ist z.B. Karbolfuchsin
werden die Gram- rot. Somit konnte er zwischen den Bakterien unterschieden. Bei denen wo sich der
Lack nicht mehr aus der Zelle rauslösen kann, nannte er Gram+ und umgekehrt.
Die Gram positive Hülle: Der Unterschied von Gram+, und - besteht nur in der Dicke der
Peptidoglycanschicht.

Die äußere Wand von Gram+ besteht aus:

Der 20-80nm dicke Peptidoglycanschicht, und es sind auch Proteine, Teichonsäuren und
Lipoteichonsäuren in der Peptidoglycanschicht eingebaut. Diese Teichonsäuren sind Polymere aus
Glycerophosphatresten und Ribitolphosphatresten. Sie sind dafür da um z.B. mit eukaryotischen
Zellen zu interagieren. Wenn diese Zellen aber lysieren und diese Teichonsäuren und
Lipoteichonsäuren freigesetzt werden, dann sind diese auch Antigene für uns, d.h. unser
Immunsystem reagiert dann auf diese Teichonsäuren.
Die Gram negative Hülle: Haben nur eine sehr dünne Peptidoglycanschicht (ca. 2-3nm). Aber sie gibt
dem Bakterium eine Form, eine Struktur, und schützen die Bakterien vor osmotischer Lyse.
-> Was passiert, wenn Zellen in Hypotones Medium kommen? (=Konz. von Salzen ist innen höher wie
außen)
- Zellen würden platzen
Peptidoglycan: Hyoptones Medium= Konz. der Salze ist innen größer als außen.
Das Peptidoglycan wirkt wie ein Netz die die Zelle in Form hält und die osmotische Lyse verhindert.
Wenn man das Peptidoglycan mit Lysozym abverdaut, kommt es zu Wassereinstrom und die Zellen
platzen. Wenn man eine isotonische Lösung hat passiert nichts. Man kann das Peptidoglycan
abverdauen und man hat den Protoplasten.
Das Lysozym spaltet die 1,4-ß-glycosydische Bindung des Peptidoglycans.
Die Grundbausteine des Peptidoglycans sind 2 Aminozucker (N-Acetylglucosamin und N-
Acetylmuraminsäure), sind also 2 Aminozucker mit Acetylierten Aminoresten.
Der Unterschied von der Muraminsäure ist, dass sie noch mit einer Milchsäure verestert ist.
Diese Grundbausteine werden alternierend zu Ketten zusammengebaut, also diese Kette "Nam-Nag"
bilden also das Rückgrat der Peptidoglycanschicht. Und damit das Rückgrat, das um die Zelle herum
verläuft noch vernetzt wird, gibt es Peptidbrücken, die ausgehend von der N-acetylmuraminsäure
über Peptide verbunden wird.
UNTERSCHIEDE +, -:
N-Acetylglucosamin ist noch an Milchzucker gebunden
-DAP nur im Peptidoglycan von Gram -
-Gram + haben Pentaglycinbrücken (damit ist Lysin mit Alanin verbunden)
Gram -: Hier sieht man das Gitter das ausgebildet wird. Hier gibt es wieder feine Unterschiede
zwischen Gram+, und -.
Die Diaminopimelinsäure ist sehr einzigartig, weil sie nur im Peptidoglycan von Gram - vorkommt und
sie ist verwand mit dem Lysin, aber sie kommt eben nur in den Peptidoglycanketten vor.
Gram +: Im Gegensatz dazu, haben Gram+ noch Pentaglycinbrücken, und anstelle der
Diaminopimelinsäure Interaktion ist bei ihnen das Lysin mit dem Alanin über eine Pentaglycinbrücke
verbunden.
Die Gram negative Hülle: Außerhalb vom Peptidoglycan ist die Äußere Membran mit der
Lipopolysaccharidschicht vorhanden. Die äußere Membran ist im Gegensatz zur inneren
asymmetrisch, weil schon die Peptidschicht selber asymmetrisch ist. Innen haben wir die normalen
Peptide und außen die Lipopolysaccharide.
Diese äußere Membran ist von Porinen durchzogen, und diese sind meistens trimere
Membranproteine, und jedes dieser Monomere hat einen kleinen Kanal und durch diesen Kanal
können Proteine durchdiffundieren. Der weitere Transport in der Inneren Membran ist dann aber
sehr gerichtet und wird durch spezifische Transportmoleküle weitergeleitet.

Die Außenmembran (OM): Die äußere Membran ist asymmetrisch

- Durchzogen von Porine: kleine Moleküle (unter 600 Dalton) können durchpassieren
-1 AS ist ca. 110 Dalton groß
-LPS an LPS gebunden
- LPS in freier Form ist toxisch/infiziös

Porine: OmpF hat einen Kanal mit einem Durchmesser von 7x11A, d.h. kleine Moleküle unter einer
Größe von 600Dalton können durchdiffundieren (1AS hat 110 Dalton), d.h. 5-6 lange
Aminosäuremoleküle können da durch.

Lipopolysaccharid: Die von der äußeren Membran nach innengewandte Proteine sind Phospholipide,
und nach außen ist das Lipid A. Und an das Lipid A ist die Lipopolysaccharidschicht angedockt. Also
Dockungsmolekül dient das Octonat und dann die Oligosaccharide. Die Oligosaccharide können
zwischen verschiedenen Spezies variieren.
Für die Stabilität der LPS Schicht sind Calcium Ionen notwendig, denn das verringert die Fluidität vom
LPS und stabilisiert es so.
Endotoxin: LPS ist in seiner freien Form toxisch. D.h. wenn Zellen lysieren, und LPS frei wird, dann
kann LPS an dem TLR (total light rezeptor) andocken und somit die Cascade für das angeborenen
Immunsystem aktivieren.
Man kann an ein toxic shock syndrom erleiden, wenn zu viel LPS vorhanden ist.

Zweiteilung: Es ist eine Zweiteilung, d.h. das Wachstum verläuft nach dieser geometrischen Reihe
(unter optimalen Bedingungen) in exponentiellem Wachstum.
Die endgültige Zellzahl ist die Anzahl der Ursprünglichen Zellen x 2^der Anzahl der Generationen.
In arithmetischer Kurve, sieht man das exponentielle Wachstum. Die Schräger der Gerade ist
abhängig von der Generationszeit (das ist die Zeit die die Zellen brauchen um sich einmal zu
verdoppeln). Es ist also die gemessene Zeit durch die Anzahl der Generationen.
Von dem ableiten kann man auch die spezifische Wachstumsrate K, was die Anzahl der Generationen
pro Stunde angibt (=Steigung der Gerade). Es gibt also Bakterien die eine steilere/niedrigere
Wachstumsrate haben.
Typische Wachstumsraten und Generationszeiten: -Bacillus sterathermophilus ist ganz rasch. Er hat
ein Temperaturoptimum von 60°C, hat eine Generationszeit von nur 11 Minuten.
-E-coli hat bei 37°C seine optimale Temperatur und ein optimales Wachstum von 20min (=> 3
Generationen pro Stunde).

Typische Wachstumskurve einer bakteriellen Population in einer diskontinuierlichen Kultur: Wie

schaut das Wachstum in einer diskontinuierlichen Kultur aus?
- Wenn man die Zellen zuerst animpft, kommen diese Zellen aus einer stationären Phase (sie hatten
also schon den Stress einer stationären Phase) und brauchen hier eine LAG Phase (obwohl die Zellen
alles haben was sie brauche, haben sie eine LAG Phase).
-> Warum haben sie eine LAG Phase?
- Der ganze Metabolismus der Zellen, die aus der stationären Phase kommen, der muss sich erst an
die Bedingungen anpassen (auch wenn die Bedingungen ideal sind) um den Metabolismus optimal
anlaufen zu lassen. D.h. es gibt eine LAG Phase vor dem exponentiellen Wachstum.
Es gibt dann eine fast lineare Phase (die Zellen haben sich also an die optimalen Bedingungen
gewöhnt) und nützen auch die Ressourcen die sie bekommen, und diese Phase ist die Phase des
Exponentiellem Wachstums (d.h. jede Zelle dieser Population wächst und teilt sich).
Danach kommen sie in die stationäre Phase, hier fangen die Zellen an zu verhungern (weil ja
Nährstoffe irgendwann ausgehen) und zusätzlich kommen auch noch viele Stoffwechselendprodukte
im Medium vor und dadurch wird auch das Wachstum wieder eingeschränkt. In dieser stationären
Phase bleibt das Wachstum einfach stehen, außerdem sind wachsende und sterbende Zellen
gleichermaßen vorhanden und dadurch die OPTISCHE Dichte gleichbleibt.
Hinten kommt es dann zu einer absterbe Phase wo wirklich alle Nährstoffe ausgehen und die meisten
Zellen absterben (=> die Zahl der sterbenden Zellen ist größer als die Zahl der wachsenden Zellen).
Hier sind jetzt aber 2 verschiedenen Kurven, eine rote und eine grüne.
Grün= optical density
Rot= viable count
Die zwei Kurven bezeichnen das Wachstum der ein und derselben Population.
-> Warum bekommt an dann zwei verschiedene Kurven?
- Es sind zwei verschiedene Messmethoden mit denen man das Wachstum verfolgen kann. Die eine
ist die Messung der optischen Dichte (man sieht, dass die Dichte zunimmt und so das Medium trüb
wird). Man sieht einfach die Zellen in ihrem Wachstum. Der Nachteil dabei ist, dass man auch tote
Zellen mitzählt (weil die ja noch immer vorhanden sind). Der Vorteil der optischen Dichtemessung ist
die Zeit, man nimmt die Probe, stellt sie ins Photometer und man weiß wo man ist.
Im Gegensatz dazu kann man das Zellwachstum auch mit einer Lebendkeimzahlbestimmung
verfolgen. Dabei nimmt man aus der Kultur eine Probe und man verdünnt diese Probe bis zu einer
zählbaren Zellmenge und plattiert diese Mengen auf den Platten aus. Man muss natürlich diese
Platten erstmal inkubieren (bei E-coli geht das über Nacht, bis man wirklich von einer einzigen Zelle
eine zählbare Kolonie sieht) und sie auszählen. Über den Verdünnungsgrad kann man dann auf die
Bakterien pro Milliliter zurückrechen und man bekommt dann diese Lebendkeimzahlkurve.
Optische Dichte: Vorteil: man kann die Zeit messen; Nachteil: auch tote Zellen werden mitgezählt
-Manche Zellen lysieren-> optische Dichte fällt
Aber durch das Platzen der Zellen fällt die optische Dichte wieder.

In der Exponentiellen Phase ist das Wachstum im Gleichgewicht, d.h. die Zunahme von Biomasse pro
Zeiteinheit ist konstant.
Man sollte Experimente immer in dieser Phase durchführen, weil das Zellwachstum konstant bleibt
und in der Exponentiellen Phase ist das Wachstum viel einheitlicher/ HOMOGENER. Denn sobald sie
aus dieser Phase entweder vorher oder nachher raus sind, ist die Heterogenität einer Population sehr
viel größer und dadurch werden Experimente nicht mehr so gut reproduzierbar.

In einer semikontinuierlichen Kultur= man will die Zellen in der exponentiellen Phase halten, indem
man sie gleich nach der exponentiellen Phase wieder in neues Medium verdünnt (manuell oder mit
Hilfe eines Turbidostats).

Der Chemostat (kontinuierliche Kultur): Dieser Chemostat ist eine kontinuierliche Exponentielle
Kultur. Die Bakterien wachsen in diesem Chemostaten und haben einen kontinuierlichen Zufluss von
frischem Medium, sie mit Hilfe eines Magnetrührers belüftet werden, und es ist auch ein
kontinuierlicher Ablauf von Bakterien. D.h. die Wachstumsrate in diesem Chemostaten kann man
jetzt durch den Zufluss des neuen Mediums bestimmen. Man kann also einen so genannten "Steady
State einstellen".

2.Vorlesung
Zweiteilung: Alles was im Cytoplasma ist wird nach dem Zufallsprinzip an die Tochterzellen
weitergegeben. Man unterscheidet zwischen versch. Arten der Segregation:
1) Zytoplasmatische Bestandteile werden dispersive weitergegeben, also einfach an die Tochterzellen
teilweise altes und teilweise neues Material.
Z.B. Das Ribosom ist ja der Ort der Proteinbiosynthese (sind also Ribonucleotidpartikel), sind also
große Moleküle, bestehend aus RNA und Proteinen. Die Ribosomen sind sehr stabil und werden über
einige Generationen weitergegeben. Erst wenn es kaputt ist oder nicht mehr funktioniert werden die
Ribosomen disassembliert und wieder neu zusammengesetzt mit den neuen Bestandteilen. Also
diese werden zufällig weitergegeben.
2)Die semikonservative Segregation, wo die Hälfte neu synthetisierter Bestandteile und die Hälfte an
alter Bestandteile an die Tochterzellen weitergeben wird.
3) Die konservative Segregation, ist, wenn eine Zelle nur alte Bestandteile kriegt und eine Zelle nur
neue Bestandteile kriegt. -> wo könnte das denn der Fall sein?
- Die polaren Regionen. Wenn ich z.B. polar begeißelte Bakterien habe die nur an einem Pol begeißelt
sind, dann würde nach der Zellteilung nur eine Tochterzelle diese polaren Flagellen bekommen. Oder
z.B. auch die polar angelegten Chemotaxisproteine. Also einfach alle Membranproteine, die polar
angelagert sind.

Cytoplasma: Es wird also im Prinzip ausverteilt, die Bestandteile die in der Mutterzelle waren,
werden verdünnt nach mehreren Teilungszyklen und wir haben hier die Dispersive Segregation.
Das Nucleoid: Das Nucleoid/ das Chromosom/ DNA.
Was passiert mit der DNA vor der Zellteilung?
- sie muss zuerst repliziert werden.

Wie verläuft die DNA-Replikation? Das Melson & Stahl Experiment: M. Melson und F. Stahl haben ein
einfaches Experiment gemacht um die Frage zu beantworten wie DNA repliziert wird.
1) Ist es ein semikonservatives Modell, wo immer ein Strang neu repliziert wird?
2) Ist es ein konservatives Modell, wo ein Parentalstrang komplett repliziert wird? Und dieser neue
Strang an die Tochterzelle weitergegeben wird?
3) Oder ist es ein dispersives Modell, wo bestimmte Abschnitte von alten und neuen Strängen
gemischt werden?

Das Experiment:
Sie haben Zellen von E-coli genommen und haben sie mit einem Stickstoff 15 (=N15) Medium
gelabelt, d.h. die Zellen in einem Medium wachsen lassen, indem N15 vorhanden war, welches
natürlich eine größere Masse hat. Nach 20min wurden die E-colis im Medium transferiert indem nur
noch N14 vorhanden war. Also ein Medium mit geringerer Masse als das Medium mit N15. Und unter
diesen Bedienungen haben sie dann die Bakterien isoliert, also das Chromosom isoliert, und haben
die DNA auf einem Cäsium-Chlorid-Gradienten getrennt.
Und auf diesem Cäsium-Chlorid-Gradienten, also dadurch dass zuerst der schwere Stickstoff
eingebaut wurde, wandert die DNA wesentlich weiter nach unten.
Also hier ist einfach ein CsCl-Gradienten von einer geringen Konzentration bis zu einer hohen
Konzentration. Die Masse die hier aufgetrennt wird, läuft so weit, bis es ein Gleichgewicht einstellt,
d.h. die DNA bleibt hier stehen und kann dann nicht mehr weiterwandern.
Hier ist also nur schwere Chromosomale DNA. Wenn man jetzt nach 20min Inkubation in einem N14
Medium den ganzen Prozess wiederholen, also wieder das Chromosom isolieren, die DNA wieder auf
dem CsCl Gradienten auftragen, dann ist die Masse des Chromosoms natürlich geringer.
-> Die DNA wird semikonservativ repliziert.
Also wir haben einen schweren und einen leichten Strang. Nach einer weiteren Generation, also nach
40min in diesem Medium, bleibt jetzt ein Teil auf dieser Höhe (weil es hat ja immer noch die
Mischung aus N14 und N15), d.h. diese Höhe bleibt bestehen, aber es wird dann neue DNA
synthetisiert die nur noch N14 gelabelt ist. In dem Fall ist es dann eine Auftrennung der Intensität
50:50 (bei 40min).
Nach der nächsten Generation nimmt diese Bande natürlich ab, es ist dann eine Auftrennung von
75:25 und nach vielen weiteren Generationen verdünnen die sich komplett aus und es ist dann
irgendwann nur noch N14 gelabelte DNA.
Wie hätte das Resultat ausgesehen, wenn es sich um ein Konservatives Modell gehandelt hätte?
- Es würde die Mischung fehlen, diese Bande würde es nicht geben.

Wie wäre das Ergebnis bei einem dispersiven Modell?

- Im ersten Fall würden wir wieder diese Mischung erhalten, und diese Mischung würde einfach
schön langsam nach oben wandern.

Es ist ein sehr simples Experiment: Der Einbau von verschieden schweren Isotopen in das
Chromosom. Aber sie konnten dadurch Beweisen, dass es sich um ein semikonservatives Modell
handelt, dass jeweils einer der parental Stränge in die Tochterzellen aufgeteilt wird und jeweils der
zweite dazu neu repliziert wird.
Konservativ ist z.B. die Zelloberfläche (polarer Beriech)
-Nucleoid: DNA muss zuerst repliziert werden
-Franclin & Stahl: semikonservatives Modell -> je höher die Dichte des CsCl -> sinkt
-Nach 20min Zentrifugation ist die Masse schon geringer -> gesamte DNA wird semikonservativ
repliziert -> es gibt einen leichten und einen schweren Strang
Irgendwann nur noch N14
(auf den Folien von Genetik bei Loidl alles erklärt)

Wo startet die DANN Replikation?: Gibt es 1 Punkt von dem die Replikation startet? Läuft sie nur in
eine Richtung? ..
Das Experiment: Die Zellen sind wieder gelabelt, und zwar sind sie während der Replication mit
Tricium gelabelt und mit Thymidin belastet worden. Man hat wieder die chromosomale DNA isoliert
und geschaut wie der Einbau von Tricium vonstattengeht.
Zuerst hat man die Zellen in einer hohen Konzentration von Tricium wachsen gelassen, dann in einer
niedrigeren Konzentration von Tricium gelabeltem Thymidin.
Man hat gesehen, dass sich die hohe Menge an Radioaktivität sich um den Origin of Replication
gelagert hat. Und ausgehen von dem Origin geht der Einbau von Thymidin nach links und rechts
weiter.
Und in der Gegenwart von der niedrigeren Konzentration nimmt dann die Radioaktivität schön
langsam ab.
Es wurde gezeigt, dass es sich um eine bidirektionale Synthese der DNA Stränge handelt und dass es
von einem Origin of replication ausgeht.
Man hat sich das Chromosom vom Sv40 Virus zu Nutze gemacht und man hat mittels
Elektronenmikroskopie den origin of replication und diese Replikationsblase zeigen können. Das
Chromosom vom Virus ist auch zirkulär, man hat es mit ecoA1 linearisiert, und ausgehend von
diesem linearisierten Fragment konnte man mit dem Elektronenmikroskop gut zeigen, dass es einen
origin of replication gibt und ausgehend von diesem ori, wird die Replikationsgabel in beide
Richtungen verlängert.
Also 1 Origin of replication und dann breitet sich die Replikationsgabel in beide Richtungen aus.
Die Initiation der DAN Replication: Es gibt verschiedene Bereiche:
1) Zum einen gibt es 9bp lange DNA Boxen.
(DnaA= das 1. PROTEIN das in der Replication eine Rolle spielt)
Also es gibt am origin of replication verschiedene Sequenzen die für die Bindung des DnaA Protein
notwendig sind.
DnaA bindet an R1, R2, R3, R4, R5 und an diese Bereiche I1, I2, I3.
2) Dann gibt es AT-reiche 13bp Sequenzen, die man das "DNA unwinding element" nennt.
- Wofür sind die AT-reichen Sequenzen notwendig?
- weil zwischen A-T nur 2 Wasserstoffbrücken sind anstatt 3 wie bei G-C, das bedeutet A-T kann man
leichter brechen als G-C.
3) flankiert wird das Ganze von AT reichen Regionen, die das Schmelzen der Stränge noch zusätzlich
begünstigen.
Was macht jetzt aber DnaA?
- hier ist eine schematische Darstellung vom origin of replication, von dieser DnaA Binderegion, und
man sieht, dass hier verschiedene DnaA Proteine an diese Region binden. Und man sieht eine Helix
Form über die DNA forcieren (durch die Bindung) und dadurch kommt es zur ersten Öffnung der AT
reichen Region.
Es gibt ca. 1000 Moleküle in der Zelle, aber es gibt verschiedene Formen von DnaA. Denn es gibt eine
ATP-gebundene Form und eine ADP-gebundene Form. Das Verhältnis zwischen den 2 Formen trägt
dazu bei, ob es zu einem Replikationszyklus kommt.

DnaA „the DNA replication initiator“: DnaA- dieses Protein besteht aus 4 verschiedenen Domänen:
1) I: Interaktionsdomäne: Sie führt einerseits zur Dimerisierung, also das Protein muss ja hier
multimerisieren, es ist also diese Dimerformation. Andererseits gibt es in der Domäne I eine
Bindestelle, die diese Interaktion mit anderen Hilfsproteinen ermöglicht.
2) Dann gibt es einen Linker: er ist eine unstrukturierte, sehr flexible Region. Er ist nötig für
Konformationsänderungen von der einen Domäne zur anderen, die sehr wichtig ist um die helicale
Form ins Chromosom, in die DNA reinzubringen.
3) Die Domäne III: Sie ist ein so genanntes "AAA-Motiv". Sie ist eine Domäne die in vielen ATPasen zu
finden ist. Wann immer ATP Hydrolyse für etwas notwendig ist, findet man diese Domäne.
4) IV: sie ist die DNA Bindedomäne.
Man sieht hier, wie DnaA mit der Helix interkaliert.
Man sieht hier in Vergrößerung, wie DnaA mit der Helix interkaliert. Man sieht hier also die Minor,-
und Majorgroove, und man sieht auch, dass die DNA ein leichtes banding hat, das bedeutet, in
diesem Fall hat die DNA ein negatives Supercoilling (-> während der Replikation wird die DNA
aufgedreht-> dadurch bildet sich das supercoilling, und nur wenn die DNA in der negativen supercoill
ist, kann sich DnaA hier anlagern) diese Interaktion ist Sequenzspezifisch, weil es direkt mit den
Nucleotiden interagiert.
Es ist also eine Sequenzspezifische Interaktion. -> Dadurch ist dieses Motiv in den DnaA Bindestellen
vorhanden.
Es gibt 3 Regionen, R1, R2, R4. Da ist die Sequenz wirklich optimal für Bindung von DnaA, und
dadurch, dass die Affinität so hoch ist, kann neben DNA ATP auch noch DNA gebunden werden die
mit ADP besetzt ist.
Unten sieht man DnaA mit den verschiedenen Domänen. Es gibt die Domäne IV die direkt mit der
DNA interagiert. Dann die AAA+ Domäne, den Linker und die Dimerisierungsdomäne. Diese großen
Distanzen werden dann überbrückt, indem die DNA noch mehr gebogen wird.
Die anderen sides, sind die so genannten "Low affinity sides". Hier kann DnaA nur binden, wenn sie in
ihrer ATP gebundenen Form vorkommt. Es kommt dann zur Dimer-Formation und die Dimere
interagieren auch über die Domäne III, also über die AAA+ Domäne.
Hier sehen wir eine DnaA die mit diesen 20 Molekülen bepackt ist. Wir sehen hier die high affinity
sides, dann kommen hier noch mehr Proteine DnaA hinzu, in ihrer ATP gebundenen Form. Durch
diese Polymerisation kommt es zur Helix Ausbildung und dadurch kommt es zu einer
Torsionsspannung die die Wasserstoffbrücken an dem DUE Element aufbricht, und der Origin of
Replication geht auf.
Hemimethylierung: alter Strang ist methyliert und neuer nicht.
-Protein erkennt diese Bereiche und bindet-> bildet Dimere aus und diese bilden lange Polymere (n-
terminaler Bereich) => KEINE Neuinitiation!
-irgendwann wird dann auch der Tochterstrang methyliert.
Hier haben wir die Struktur von DnaA und man sieht hier die III. Domäne und hier in der Mitte sieht
man ein Molekül (in dem Fall ist es ADP gebunden), man hat hier den ADP gebundenen Zustand in
Grau, und in Gegenwart von ATP ist die Struktur in Braun aufgezeichnet.
Man sieht, dass es entweder durch die Bindung von ADP oder ATP, zu einer kleinen
Konformationsänderung kommt. Diese Konformationsänderung ist jetzt nicht so dramatisch, aber für
die Regulation der Replication ist es sehr wichtig.
Hier ist es wieder ADP gebunden.
Hier sind die Moleküle DnaA mit weißen Sternchen (ADP gebundene Form) und mit orangen
Sternchen die ATP gebundene Form.
Man sieht hier, dass wenn ADP gebunden hat, dann ist diese Stelle hier blockiert und die
Polymerisation der Moleküle kann nicht vonstattengehen. Denn die Polymerisation schaut so aus,
dass diese Helix hier direkt in die Position kommt in der das ATP gebunden hat.

In dieser Helix des zweiten Moleküls gibt es den Arginin Rest, welcher in späterer Folge sehr wichtig
ist, um zu einer ATP Hydrolyse zu führen indem das Gammaphosphat abgespalten wird, und das ist
wiederum wichtig für die Auflösung dieses Komplexes, weil dieses Protein muss ja dann im Endeffekt
wieder weg von der DNA um die Replication zu erlauben.

Die Regulation der Replication via DiaA: Neben dem Verhältnis vom DnaA in seiner ATP und ADP
gebundenen Form, kommt es zur zeitlichen Abfolge auch noch durch Hifsproteine.
Eines dieser Hilfsproteine ist DiaA, und dieses Protein bildet ein Tetramer aus und führt zur
Interaktion bzw. hilft der Interaktion zwischen den Dimeren von DnaA zu stabilisieren.
Also diese Interaktion (Stabilisierung der Dimere von DnaA) wird von DiaA noch verstärkt. Das bildet
auch diese Tetramere aus.

Die Regulation der Replication über den datA Locus: Gleich nach dem origin of replication liegt das
Gen für dnaA (=GEN, weil klein und kursiv geschrieben).
In der anderen Richtung gibt es den sogenannten "datA Locus" hat genau wie der origin of
replication, hoch affine DnaA Bindungsstellen. In den Moment wo dieser Locus repliziert wird, titriert
dieser Locus freies DnaA Protein weg (das steht dann nicht mehr zur Verfügung für eine Neuinitiation
der DNA Replikation).
Also das ist ein Mechanismus um freies DnaA Protein wegzufischen, um zu diesem Zeitpunkt eine
Neuinitiation zu verhindern.

Die Regulation der Replication durch SeqA: Es gibt auch noch einen 2. Mechanismus und der hat
etwas mit den GATC Sides zu tun.
Unter normalen Bedingungen ist das Chromosom an diesen GATC Sides methyliert.
-> Warum ist das so und welchen Vorteil hat das, dass diese Sides methyliert sind? Welchen Sinn hat
die Methylierung von beiden Strängen?
- Der Organismus erkennt so die eigene von fremder DNA.
Welchen Vorteil hat das?
- Das Restriktionsmodifikationssystem erkennt so z.B. Phagen DNA (denn diese haben natürlich eine
nicht methylierte DNA) und schneiden sie.
Dieses System macht sich aber auch die Regulation der Replication zu nutzen, denn wenn die
Neusynthese startet, dann ist die Dam-Methylase (die dafür zuständig ist) nicht so schnell, dass es
sofort die Stränge methylieren kann, und somit haben wir hier im semikonservativen Modell, ein
Methylationsmark am alten Strang, und am anderen Stang gibt es kein Methylationmark.
D.h. die DNA liegt kurzfristig in Hemimethylierter Form da. Und diese Hemimethylierung in der
Region des Origin of Replication (Die ganzen Sternchen bezeichnen die GATC Seides in dieser Region)
die führen dazu, dass ein Protein (SecA) diese Hemimethylierten Bereiche erkennt und bindet an
diese DNA Fragmente im Bereich des origin of relication mit der C-terminalen Domäne. Mit der N-
terminalen Domäne bildet es Dimere aus. Und diese N-terminalen Dimere bilden lange Polymere.
Dadurch wird die ganze Region des origin of replication sequestriert. Und es kann zu keiner
Neuinitiation kommen.
Nach einer gewissen Zeit kommt dann die Dam-Methylase und entfernt SecA wieder von diesen
Bereichen und methyliert dann auch den Tochterstrang.
Wenn es dann genug DnaA gibt, wäre es dann wieder bereit für eine Neuinitiation.

Die Ausbildung des Pre-priming-Komplexes: Jetzt sind wir also bei diesem Open-complex, indem das
DUE Element aufgebrochen wird und zu diesem Zeitpunkt, wird der DnaB, DnaC Komplex rekrutiert
(DnaB ist die Helicase). DnaC ist wieder eine ATPase, die auch diese AAA+ Domäne hat, und die auch
ein DNA Paralog darstellt (Sie ist also ähnlich, hat aber eine andere Funktion). Und dieser Komplex
bindet an dieser Replikationsblase und formt den Pre-Priming-Komplex.

RIDA:
DnaA hat noch eine intrinsische ATPase Aktivität, die für die Inaktivierung notwendig ist.
Damit DNA ATP jetzt von der DNA weggebracht wird, und zu DNA ADP kommt, dafür braucht es die
SLIDING CLAMP.
Das ist die ß-Untereinheit der Polymerase.
Mechanismus:
wir haben also die ß-clamp und Hda (=IdaB), welches die ADP-Hydrolyse katalysiert.
Das Hda Protein hat wieder einen Arginin Finger.
Mechanismus:
Hda hat wieder einen Arginin finger, und bindet an diese ß-clamp und über die Polymerase wird die
ß-clamp weitergeschoben, und clashed in die ATP gebundenen DnaA Proteine rein. Der arginin finger
induziert die Hydrolyse von dem Gammaphosphat des ATP und spaltet dieses ab. Durch diese
Abspaltung des ersten Gammaphosphats kommt es zu dieser Strukturänderung (Erinnerung: die
graue und braune Variante der Lokalisation der Domäne III in Gegenwart von ATP/ADP). Sobald die
erste ATP Hydrolyse vonstattengeht, kommt es in dem nächsten DnaA Protein zu einer
Konformationsänderung, da jetzt ADP vorhanden ist, und diese Konformationsänderung induziert
dann die ATP Hydrolyse von dem nächsten DnaA Protein.
Also es braucht nur den Anstoß (die erste ATP Hydrolyse über Hda) und dann geht die ATP Hydrolyse
über die ganzen DnaA Proteine vonstatten und diese lösen sich dann von der DNA ab.

Re-activation of DnaA: Wie kommt es jetzt aber wieder zur Regeneration? Denn iregndwie muss
DnaA ja wieder mit einem ATP ausgerüstet werden?- Das passiert auf diesem DARS1 Locus (=Dna
reactivation Sequenz), da gibt es 2 von diesen Loci. Diese sind eigentlich hoch affin für DnaA in seiner
ADP gebundenen Form. Hier passiert aber im Prinzip genau das Gegenteil von dem was am Origin of
replication passiert, denn dort zwingt das Protein, in seiner ATP gebundenen Form, der DNA eine
Struktur auf, nämlich die helicale Struktur.
Und dieser Locus aber, bringt das Protein in eine Konformation, in der die Affinität für ADP sehr
niedrig ist, d.h. ADP geht weg und die Affinität für ATP sehr hoch.
so wird es wieder regeneriert.
Das passiert auch beim Wachstumszyklus: Von einer Zellteilung zur nächsten passiert dieser Prozess
bis die Konzentration der ATP Form des DNA Proteins wieder hoch genug ist, die Sequestrierung des
origin of replication zu Ende ist, und das ganze System wieder von vorne beginnen kann.

Die Initiation der DNA Replication: Das hier ist der Prepriming Komplex. Und das nächste Protein ist:
DnaG.
Es ist eine RNA Polymerase die die DNA als Template braucht (die kommt aber erst später) und
danach kommt die Polymerase und die ß-clamp.

Die DNA-Synthese: Die DNA Polymerase benötigt ein freies 3' OH Ende (=den Primer) um
anzudocken. Sie brauch in erster Linie einen Primer, denn wenn der origin of replication aufgeht,
dann ist da ja kein freies 3' Ende. Und dieser Primer ist genau das, was DnaG, die Primase herstellt.
Der Primer ist ein RNA Fragment (damit der Primer wieder entfernt werden kann). Das wird dann
aufgefüllt und die DNA Ligase verschmilzt dann die DNA Stücke.
Die DNA Polymerase synthetisiert dann den alten Strang komplementär auf der Basis des alten
Stranges. Der Nucleophile Angriff wird von der DNA Polymerase katalysiert.
Die Pyrophosphatase spaltet die Phosphate auf.
In Hellgrün ist die DNA Polymerase. Die Struktur der Polymerase schaut aus wie eine Hand. Und
genau in dieser Beuge liegt die DNA drinnen, und dort drinnen kann jetzt einerseits sich das
Nucleotid sich anlagern, und in dem Moment wo es ein korrektes Nukleotid ist, kann sich diese
Basenpaarung ausbilden und hier ist dann das Alphaphosphat in der richtigen Position zum 3'-OH.
Im Prinzip katalysiert die DNA Polymerase nur diese richtige Konformation und das Näherbringen
dieser 2 Kompartimente so, dass der Nucleophile Angriff leicht vonstattengeht.
Ist es ein falsches Nucleotid, das in der Bindetasche sitzt, kann keine Basenpaarung ausgebildet
werden, dadurch verändert sich die Struktur und die Distanz für diesen Nucleophilen Angriff viel zu
weit ist und es dadurch es nie zu dieser kovalenten Bindung kommt.

DNA-Polymerasen: In Bakterien gibt es verschiedene Polymerasen.

Pol1, Pol2, Pol4 haben jeweils nur 1 Molekül. Pol5 hat noch zusätzlich 2 Proteine.
Pol3 hat in der Replication die größte Aufgabe. Sie besteht aus vielen verschiedenen Molekülen, (Tau
Komplex und die 2 ß-Clamps.)
Die DNA Polymerase III:
Die Replication läuft über eine Replikationsgabel dann in beide Richtungen, und es muss einerseits
der Leitstrang synthetisiert werden, dort ist es einfach, die Synthese kann in eine Richtung vollzogen
werden, weil immer das freie 3' OH Ende vorhanden ist. Am Folgestrang ist es schwieriger: Da muss
in die andere Richtung synthetisiert werden. Deswegen kommt es hier immer zu einer Umfaltung,
aber die Core Enzyme werden dimerisiert durch den Gamma-Tau-Komplex und die Sliding Clamp. Der
Gamma Tau Komplex bildet diese Dimere aus, die die Pol3 Enzyme für den Leitstrang und für den
Folgestrang zusammenhält.
So bleibt die Replikationsgabel an beiden Seiten immer konstant. Die Bindung der ß-clamp ist
einerseits geöffnet, die DNA wird durch gefedelt und an den Gamma-Komplex gebracht.

DNA-Synthese:
Es sind RNA Primer die immer wieder synthetisiert werden. Hier kommt also wieder die Primase zum
Einsatz, sie synthetisiert immer in gewissen Abständen einen RNA Primer der immer wieder der
Anfangspunkt für die DNA Polymerase ist, die Synthese verläuft bis zum nächsten RNA Primer.
-> Was passiert dann an diesem RNA Primer?
- die Polymerase 1 zerstört den RNA Primer und füllt dann dieses Loch mit DNA wieder auf, und ganz
zum Schluss kommt die DNA Ligase die dann alles kovalent ligiert.
Die Sliding Clamb ist hier vorne, der Gamma Tau Komplex und die 2 core Enzyme der Polymerase
ausgestattet mit der sliding clamp.
Von dem RNA Primer ist ein Stück DNA, durch die Helicase, schon aufgespalten ist, also schon
einzelsträngig vorliegt.
Damit diese Einzelsträngige DNA noch geschützt wird und nicht abgebaut wird, binden kleine
Proteine daran und schützen sie so.
Indem Moment wo der Core Komplex den Folgestrang bis zum nächsten RNA Primer synthetisiert
kommt hier die Primase, bindet daran und synthetisiert wieder den nächsten RNA Primer.
Die ß-Clamp bleibt an der DNA, das Core Enzym wird umpositioniert und die Primase freigesetzt, und
der Gamma-Tau Komplex bringt eine neue ß-clamp an diesen Bereich, wo der RNA Primer
synthetisiert wurde, und bringt das Core Enzym wieder an diese RNA Hybridregion und die RNA
Polymerase synthetisert wieder diesen Strang.
Das DNA bindende Protein bildet ein Tetramer aus und bindet an die single strand Bereiche.

Die Termination der DNA Replication: Was passiert, wenn die Replikationsgabeln sich wieder treffen?
- Dann muss der Komplex wieder abgelöst werden und es kommt zur Termination der Replication.
Die 2 Polymerasen treffen sich wieder und um abzusichern, dass die Replication wirklich durchläuft,
und das im Endeffekt das ganze Chromosom repliziert wird, und ob ja kein Fehler passiert ist, dafür
gibt es die Terminations Sides.
Genau gegenüber dem origin of replication ist TerC (=die eigentliche Terminationsstelle). Links und
rechts davon gibt es aber homologe Bereiche, welche alle in Richtung des richtigen
Terminationspunktes vorliegen. An diesen Bereichen binden Proteine, die verhindern, dass die
Replikationsgabel von hier weiterläuft und das die Replikationsgabel die von der anderen Seite
kommt da hinläuft.
Im Endeffekt läuft dann alles auf diesen einen Replikationspunkt hin.
Protein bindet am Terminator - je nachdem von welcher Seite die Helicase kommt-> wird Protein
abgelöst oder eingeklemmt (TUS Protein) nicht permisive Seite oder permisive Seite
-Haken hält Protein fest-> Helicase fällt ab
Deletion von TUS Protein ist letal!
Dieses Tus Protein wird gebraucht um zu einer Termination zu führen. Dieses Protein bindet jetzt am
Terminator. Dieses Protein hat 2 verschiedene Richtungen, wenn die DNA Helicase von der einen
Richtung kommt (von der Permisiven Seite), dann kann die Helicase das Protein von der DNA
ablösen. In dem Moment wo die 2 Stränge auseinandergebracht werden, löst sich das Protein ab.
Wenn die Helicase von der Nicht-permisiven Seite kommt, dann bleibt das Protein am Terminator
sitzen und wird richtig eingeklemmt.
Dafür ist hier dieses C notwendig, (die Strichelchen sind immer die konservierten Bereiche der
Terminatoren). Das G ist also durch alle Terminatorsequenzen konserviert (weil es eine bestimmte
Funktion hat). Und hier sieht man das das Tus Protein sich an die DNA bindet.
Was passiert, wenn die Helicase von der Nicht-permisiven Seite daherkommt?
- Die H-Brücken gehen auf, die DNA wird geöffnet und dann bindet das C genau in eine Bindepocket
von diesem Tus Protein. D.h. es ist ein richtiger Haken der das Protein an der DNA festhält und das
Protein kann sich nicht mehr ablösen.
=> Indem Moment fällt die Helicase ab und somit auch die Polymerase die aus dieser Richtung
kommt.
Wie gesagt, das Tus Protein sitzt am Terminator, das Replisom kommt mit der Helicase, gefolgt von
der Polymerase.
Die Helicase kommt von der Nicht-permesiven Seite und dadurch bindet das Protein noch stärker an
die DNA -> das Replisom fällt ab und die single strand binding proteins die den Bereich der noch nicht
repliziert ist im einzelsträngigen Bereich schützen.
Von der anderen Seite kommt das andere Replisom, es ist die permesive Seite, von der Seite kann die
Helicase das Protein von der DNA leicht ablösen, und der Replisomkomplex (Die Helicase mit der
Polymerase) synthetisieren jetzt weiter und replizieren auch diesen Einzelstrang fertig, bis die
Replication vollständig aufgelöst ist.
Die Deletion von Tus oder von den Terminationsregionen ist absolut letal.
-> Was passiert, wenn das Chromosom repliziert wird und es zu dieser Termination kommt? Was
passiert mit diesen ringförmigen Molekülen?
- die 2 replizierte Chromosomen sind miteinander verbunden, es entsteht also eine Kette
(=Catenane) wegen der Verdrillung. Diese Catenane müssen aufgelöst werden, sonst werden die
Chromosomen nicht in die Tochterzellen aufgeteilt.
Für die Auflösung sind die Topoisomerasen zuständig. Diese schneiden das Chromosom auf und
sorgen dafür die Chromosomen zu trennen und auch dass diese Verdrillung entwunden wird. Dafür
gibt es verschiedene Topoisomerasen. Die wichtigsten für die Auflösung der Catenane sind die
Topoisomerasen 2, das wäre z.B. die Gyrease. Die Gyrease besteht aus Dimeren von GyrA und GyrB
und diese Gyrease nimmt einen Strang und schneidet ihn durch.

Die Topoisomerasen: Die Gyrease (ein Dimer von GyrA und ein Dimer von GyrB) greift einen Strang
und schneidet ihn.
Durch Konformationsänderung wird ein Strang hineingezogen, aufgeschnitten, der zweite Strang
wird durch dieses Loch durchgezogen, und hier oben durch GyrB wird der erste Strang der
geschnitten wurde, wieder ligiert.
Die TopoII muss dafür natürlich beide Stränge schneiden, was dazu führt, dass diese Ketten aufgelöst
werden.
Die 2. Familie der Topoisomerasen sind die Topoisomerasen I, und wie der Name schon sagt, wird
hier nur 1 Strang geschnitten, d.h. ähnlich wie bei dem anderen System, kommt es hier nur zu einem
DNA Bruch, aber nur zu einem Einzelstrangbruch, es kommt während dieses Einzelstrangbruchs zu
einer kovalenten Bindung zwischen der DNA und dem 5' Ende mit dem Tyrosinrest von der TypI
Topoisomerase. Der 2. Strang wird hindurchgezogen und dann kommt es wieder zu Ligation des
ersten Stranges. (Das wäre die Form von Typ IA - also die Kovalente Bindung zwischen dem 5' Ende
und dem Tyrosin).

Dann gibt es noch die Form von Typ IB:

Typ IB hätte eine kovalente Bindung mit dem 3' Ende der DNA

Beide haben aber gemeinsam, dass nur ein Strang geschnitten wird, der zweite dann durchgezogen
und dadurch wird die Verdrillung der DNA relaxiert.

Der Gendosis Effekt:

Die Replication in E-coli dauert 40min. Die Generationszeit von E-coli beträgt 20min, d.h. dass die
Replication für die nächste Zellteilung schon beginnen muss, wenn die vorherige Zellteilung grad
passiert ist.
-> Das bedeutet was?
- unten links sieht man das Chromosom von E-coli, die Terminationsside, die Sternchen sind der
origin of replication. Das wäre jetzt, wenn e-coli 40min für eine Generation braucht, also die
langsame Form.
Wenn wir uns jetzt e-coli anschauen das nur 20min für seine Replication braucht, muss die
Replication schon starten BEVOR die erste Replication zu Ende ist. D.h. es besteht ein Gendosis-
Effekt. Also je schneller die Zellen wachsen, umso mehr Kopien gibt es von den Genen, die in diesen
Bereichen, rund um den origin of replication sitzen.
Es gibt also von diesen Genen nicht nur eines in der Zelle, sondern plötzlich vier.
-> Welchen Vorteil könnte das haben? Welche Art von Regulation könnte das haben? Wie können
das die Bakterien ausnützen?
- Gene, deren Produkte die Zelle unter diesen Bedingungen wirklich in hohen Mengen braucht, die
also für einen schnellen Metabolismus von Nöten sind, die sollten eigentlich im Bereich des origin of
replication liegen. Welche wären das? Wenn es einer Zelle gut geht teilt sie sich schnell, sie muss also
was machen?
- Sie braucht viele Proteine und viele Proteintranslationsmaschinen (=also viele Ribosomen).
Und wenn man sich die Genkarte von E-coli anschaut, sieht man den origin of replication, gegenüber
die Replicationside, und man sieht hier in Grün die Proteine die im Ribosom vorhanden sind, aber
auch alle Proteine, die zur Synthese von Ribosomen und zum esamble des Ribosoms von Nöten sind.
Und man sieht, dass in einer Hälfte mehr Gene für das Ribosom vorhanden sind als in der anderen.
Und dadurch kann man sagen, dass man rein über die Lokalisation der einzelnen Gene am
Chromosom auch schon sehr viel über deren mögliche Funktion, über deren Essentialität sagen
kann. Also wenn man mit einem Gen oder Protein arbeitet von dem man wirklich noch nicht weiß
was es tut (auch in E-coli gibt es noch ganz viele Y-Proteine, von denen man nicht weiß was sie tun).
Ein guter Ansatz zum Herausfinden der Funktion ist es, sich die Lokalisation am Chromosom in
Relation zum origin of replication, zum Terminator und auch zur Relation der Nachbar Gene sich
anzusehen.

3.Vorlesung
Wie wird die Zelle verlängert ohne dass die Struktur der Zellwand Schaden nimmt?
Das Peptidoglycan bildet ein Netz um die Zelle herum, die die Zelle vor osmotischer Lyse schützt und
sie ist aufgebaut von den alternierenden Aminozuckern und quervernetzt ist durch Peptidbrücken.

Längenwachstum der Zelle: Peptidoglycan:

Ein Strang wird herausgenommen und durch 3 neue ersetzt => Verlängerung
-Viele Enzyme sind daran beteiligt.
Um das Längswachstum konstant auszubauen, geht die Zelle einen einfachen Mechanismus nach->
Jeder 2. Strang wird durch 3 neue ersetzt. D.h. es wird ein Strang rausgenommen, der eigentlich als
Template dient, und wird durch 3 neue ersetzt und dadurch kommt es zu einer Verlängerung.
Dadurch dass die Glycankette in der Richtung rundherum geht, und ein Strang als Template dient,
kann der Durchmesser nur konstant bleiben.-> Weil der Strang ja nicht verlängert werden kann, er
wird einfach nur durch 3 neue ersetzt.
Da ist eine ganze Menge an Enzymen daran beteiligt, welche einen richtigen Komplex bauen und
dieser Komplex wandert dann den Stang entlang und jedes Enzym hat eine bestimmte Aufgabe.
Man sieht hier die Anordnung dieser Glycankette, sie geht rundherum und die
Peptidquervernetzungen sind in der Längsachse zu finden.
-> Wie bleibt die Zellform erhalten? Wie bleibt die Länge der Glycanketten erhalten?
Man sieht hier die 3 alten Stränge und der grüne Strang wird durch die unteren 3 (blau) neuen
Stränge ersetzt.
Die Enzyme spielen hierbei eine wichtige Rolle.
Die monofunktionale Transglycosidase: Das Erste Enzym ist nur eine Transglycosylase, welche die
Nam-Nag-Kette synthetisiert (=also den mittleren Strang dieser 3 neuen Peptidoglycanketten).
Die lytische Transglycosylase ist dafür zuständig den alten Strang wieder abzubauen.
Für das Aufbrechen der alten Seitenketten sind die 2 Endopeptidasen und/oder die zwei Amidasen
verantwortlich.
2 monofunktionale Transpeptidasen: Sind nur dafür zuständig, die Transpeptidierung zwischen den
Seitenketten der zwei neuen Seitenstränge mit den Peptidseitenketten der alten Stränge zu
verbinden. Dann wären die 3 neuen Stränge synthetisiert und an die alten angekoppelt.
2 bifunktionale Transglycosylasen: Diese 2 bifunktionalen Enzyme können einerseits als
Transglycosilase wirken oder als Transpeptidasen. D.H. diese 2 Enzyme bauen die Nam-Nag-Ketten
auf und gleichzeitig schließen diese Peptidketten.
Also es sind 2 bifunktionale Enzyme.

Der Multienzymkomplex: Dieser ganze Enzymkomplex wandert jetzt den alten Akzeptor Strang
entlang und synthetisiert die drei neuen Stränge und baut sie über die Transpeptidasen gleichzeitig
ein.
Bakterien wollen eigentlich nichts verschwenden, wenn sie hier diesen Akzeptor Strang abbauen,
dann sind hier aber noch die Aminozucker und Aminosäuren vorhanden welche wichtigen
Substanzen sind. Was passiert dann mit dem Akzeptor Strang?
Was passiert mit dem Akzeptorstrang?
- Degradierung durch Enzymkomplex -> Einzelbestandteile durch die Membran ins Cytoplasma
hineingeschleust -> werden wiederverwendet für die Proteinbiosyntese und Peptidoglycansynthese
(alles wird für die Peptidoglycansynthese wiederverwendet)

Turnover und Recycling vom Peptidoglycan: Was passiert dann mit dem Akzeptorstrang? -> es gibt
ein System was für das Recycling dieser Fragmente zuständig ist: Als erstes passiert ja die
Degradierung des Multienzymkomplex durch die Amydasen und Peptidasen. Dann werden alle
Bestandteile wieder durch die Membran (=durch die Permease AmpG) ins Cytoplasma
hineingeschleust.
Diese ganzen Untereinheiten gehen dann in die Neusynthese des Peptidoglycans und werden wieder
angehängt und wiederverwendet. Andererseits spalten die Peptidasen die Peptide auf. Einige davon
werden wiederverwendet für die Proteinbiosynthese und andere (wie die Aminopimilinsäure)
werden wieder der Peptidoglycansynthese zugeführt.
Also es wird nichts verschwendet, sondern alles wird ins Cytoplasma gebracht um wiederverwendet
zu werden für den Aufbau für neues Peptidoglycan.

„Replication“ der Zellwand:

Das System ist optimiert um die Verdoppelung abzusichern.
Hier sind ja diese 12 Stränge. Wenn man jeden 2. durch 3 neue ersetzt, dann kriegt man genau eine
Verdoppelung.
So werden links und rechts gleichzeitig neue Stränge hinzusynthetisiert und gleichzeitig den alten
Strang abbaut, erhaltet man die Stabilität der Zelle permanent.
Andererseits, dadurch dass man immer 3 neue für einen alten ersetzt, erhält man genau die
Verdoppelungsrate aufrecht.

Murein Segregation in E-coli: Sobald die Zelle genau die doppelte Länge erreicht, wird in der Mitte
ein Septum geformt, und da wird das präseptale Murein eingebaut.

Peptidoglycansynthese: Wie wird das Peptidoglycan überhaupt synthetisiert?

- Hier sieht man die Cytoplasmatische Membran, den Cytoplasmatischen Bereich (oben) und den
periplasmatischen Bereich unten.
Die Peptidoglycansynthese findet an 3 verschiedenen Orten statt. Sie beginnt im Cytoplasma, dort
werden die Precursor-Moleküle zusammengebaut.
Der nächste Schritt findet an der Innenseite der cytoplasmatischen Membran statt, diese Vorläufer
(Moleküle) werden dann nach Außen geflippt.
Der 3. Schritt der Polymerisation findet im periplasmatischen Bereich direkt am alten Peptidoglycan
statt.

Es gibt aber ein Problem dieser Synthese: Einerseits brauchen diese polaren Moleküle, die ja durch
die Membran müssen, einen Carrier um durch die hydrophoben Bereiche der Membran zu kommen.
Andererseits muss die Polymerisation im periplasmatischen Bereich Energie freisetzen. Denn es gibt
dort kein ATP, d.h. es kann kein ATP für die Polymerisation verwendet werden.
Wie geht die Peptidoglycansynthese, wenn kein ATP vorhanden ist?
- gestartet wird das Ganze im Cytoplasma mit einem UDP-NAM, mit einer N-acetyl-Muraminsäure. Es
gibt verschiedene Mur-Ligasen (=Mur=Murein), die die Aminosäuren an die NAM Seitenkette
dranknüpfen ->durch diese Verknüpfung kommt es zur Bildung des Park´s Nucleotid. Das ist jetzt der
Vorläufer der an die Membran drangekoppelt wird. Diese Koppelung wird durchgeführt vom MraY.
Dieses Protein katalysiert jetzt die Fusionierung zwischen dem Park´s Nucleotid und dem Carrier. Das
Carrier-Molekül ist das Paktoprenol, das direkt in der Membran in dem Lipid-belayer drinnen sitzt
und die Verankerung vom Park´sen Nucleotid an der Membran sichert.
Der nächste Schritt ist die nächste Mur-Glycoyl-Transferase, und die katalysiert jetzt die Interaktion
von dem NAM (=N-acetyl Muraminsäure) die mit den 4 Aminosäuren und mit dem N-acteyl-
Glucosamin ausgerüstet ist.
Dieses Molelül ist jetzt das LipidI (=1). Das Molekül LipidII (2) wird jetzt durch die Membran
geschleust.
Außen sind die Transpeptidasen und Tranglycosidasen die gegen den Austausch des
Akzeportstranges gegen die 3 neuen wirken.
Die Transpeptidasen nennt man auch "Penicillin-binding-proteins" (=PBP´s).
Penicillin verhindert die Peptidoglycansynthese.
Warum macht es das?
- das beruht auf der Struktur von Penicillin -> es ist eine Fusion aus dem Cystein und dem Valin.
Das D-Alanin-D-Alanin sind die Endaminosäuren in den Peptidbruücken. Dadurch das diese Penicillin-
binding-proteins zu der Peptidierungsenergie führen, erkennen sie diese Alanine und binden daran
und führen diese Reaktion durch.
Das Penicillin Molekül miminkt genau diese 2 Alanin Reste und bindet an die Penicillin-binding-
proteins und inhibiert die Transpeptidierungsreaktion. (=Grundmechanismus warum Penicillin die
Peptidoglycansynthese inhibiert und dann zur Lyse von Bakterien führt).
Es gibt noch eine andere Version von Antibiotika die in die Peptidoglycansynthese eingreifen kann
und das wirkt genau anders herum als Penicillin.
Es bindet, oder miminkt die Penicillinbindeproteine und miminkt die Bindetasche der Proteine,
bindet an D-Alanin-DAlanin und blockiert die Interaktion auf diese Art und Weise.
Also sie blockiert die Aminosäuren, damit das Protein nicht binden kann.
Penicillin blockiert die Bindetasche des Proteins.

Pre septales Murein wird von den Fts Proteinen synthetisiert.

Wenn es zur Einschnürung kommt, ändern sich auch die Peptidinteraktionen. Die laufen dann nicht
mehr ganz parallel ab.
Mureinhydrolasen= Amindasen

Zellteilung und Septum Bildung in E-coli:

In der Septumbildung sind ganz viele Proteine daran beteiligt.
Sie assoziieren alle an dieser Einschnürungsstelle. Fast alle haben eine Transmembranhelix.
Welche Eigenschaften müssen die Transmembranhelices haben damit sie sich in die Membran
einlagern?
-> sie müssen sehr hydrophob sein.
Der eigentliche Actorplayer ist FtsZ, welches dann zu der Einschnürung führt.
Warum Fts Proteine?
- Fts war eigentlich nur der Phänotyp den man in Deletionsmutanten gesehen hat.
Mutanten in diesen Genen haben filamentöses Wachstum gezeigt -> es sind ganz lange Zellen
geworden die sich zwar verdoppelt haben sich aber nicht Teilen konnten. Dadurch nur
Längenwachstum. Deswegen filamentous growth= Fts
Die Replikation und Partitionierung sind in Ordnung aber es kann sich kein Septum ausbilden.
Der Mainplayer ist FtsZ.
Es ist ein Homolog von Tubulin. Tubulin bildet ja in den Eukaryonten die Mikrotubuli aus und auch
das Cytoskelett.
Man sieht hier das Tubulin welches diese langen Ketten bildet. Dann sieht man noch das FtsZ welches
sehr ähnlich einer Untereinheit bzw. einer Domäne von Tubulin ähnlichsieht.
In der Zelle sind ca. 5-20.000 Moleküle vorhanden (hängt vom Stadium der Zelle während der
Zellteilung ab). FtsZ ist eine GTPase. Und die Polymerisation von FtsZ ist ATP abhängig.
Wir haben hier die Bindung von GTP (immer in der Interaktionsdomäne sitzt das GTP). Und immer,
wenn FtsZ ein Polymer bildet ist es eine lange Kette (weil Tubulin gestreckt).
Das Ganze muss aber zur Einschnürung führen, und der Mechanismus der zu dieser Biegung führt ist
die GTP Hydrolyse.
In dem Moment wo GTP zu GDP Hydrolysiert kommt es dann zur Einschnürung.
In der Interaktionsdomäne sitzt das GTP
-Biegung durch GTP-Hydrolyse => Krümmung

FtsA ist der Motor der Maschinerie (es ist ein ATP Hydrolysierendes Enzym). FtsA bindet direkt an die
Membran.
ZipA ist ein Anker für FtsZ. FtsZ bindet einerseits an FtsA, bindet aber auch an ZipA, wird somit an die
Membran gebracht.
 FtsI wird dann noch als Transpeptidase eingesetzt. Es sitzt an der Cytoplasmatischen Membran,
schaut aber in den periplasmatischen Bereich.
FtsW ist eine Flippase, die das LipidII (2) durch die Membran flippt.
FtsK ist die DNA Pumpe die das Chromosom in die Tochterzellen bringt.
FtsK bindet an die Membran (es ist in der Membran verankert), jedes Molekül FtsK hat 4
Transmembrandomänen und immer 6 Ftsk Moleküle bilden ein Hexamer das dann als DNA Pumpe
fungiert.
Die weiteren Domänen von FtsK sind die alpha und ß Domäne die zusammen den Motor bilden, und
hier die gamma Domäne ist diejenige die die DNA rekrutiert und an die Translokase bringt. Das
Hexamer bildet einen Ring (mit einer Breite von 30A), und durch diesen Ring passt genau eine DNA-
Doppelhelix durch.
Die Translokationsrate ist extrem hoch (7kB pro sec werden da durchgeschleust). Sie ist zurzeit die
schnellste bekannte DNA Pumpe.
Hier sieht man nochmal von oben wie diese Hexamere diesen Tunnel (Ring) bilden und daneben
einen Querschnitt wo die DNA durch den Tunnel durchgeht. Man sieht genau den Abschnitt aus
alpha und beta Untereinheiten (also den Motor).
Alpha und beta sind über einen Linker verbunden, und können ihre Konformation zueinander
verändern.
Wie verändern alpha und beta ihre Konformation zueinander?
- In dem Moment indem die alpha Domäne an der DNA bindet, dann kommt es zu einer
Konformationsänderung. -> Die alpha Untereinheit vergrößert den Winkel zur ß Untereinheit.
Dadurch wird die DNA auf die andere Seite gezogen. Dann interagiert die beta Untereinheit mit der
DNA -> dadurch wird dieses Movement wieder zurückgebracht und die erste Interaktion kann wieder
passieren. Dadurch wird die DNA immer um 5,5A weitergezogen.
Durch die Rotation kommt es zur Interaktion der beta Untereinheit mit dem nächsten Molekül.
Da die DNA die Form einer Helix hat, kommt es immer wieder zu einer Interaktion mit einer
Untereinheit des Hexamers.
Und durch die Konformationsänderungen des Hexamers kommt es zum Durchziehen der DNA.
Diese Translocasen (=Hexamer) bilden sich ja auch noch an der DNA aus. Einerseits sind
Topoisomerasen dafür zuständig und andererseits bildet sich das Hexamer rundherum aus.
Die KOPS-sides sind Orientierungssides fürd die FtsK Pumpen (=polare Sequenzen die so angeordnet
sind, dass dann zum Schluss die 2 Chromosomen in die Tochterzellen gehen.).
Ganz zum Schluss: 2 Rekombinasen bilden eine Holiday Struktur aus (XerC), und XerD führt zur
Auflösung der Holiday Struktur (=letzter Schritt wie die Chromosomen in die Tochterzellen gelangen
können)

Wie wird die Zellmitte definiert?

Welcher Mechanismus sagt "hier ist die Mitte".
Dafür gibt es 2 versch. Systeme:
1) Nucleoid Occlusion.
Das führt dazu, dass genau in dem Bereich (indem sich das Nucleoid befindet) kann FtsZ nicht zur
Hydrolyse führen. (FdsZ kann sich erst zum Schluss dort anlagern).
Was ist das Signal?
-Das Noc (in E. coli ist es SlmA) Protein bindet an das Chromosom, bindet aber nicht random daran
sondern es gibt bestimmte Bindestellen. Diese sind nur rund um der OriC und der Terminator ist
ziemlich frei von diesen Bindestellen.
In blau: FlmA (=Effektorprotein) das in diesen Bereichen an die Zelle bindet.
In gelb: FdsZ
-> das Protein hat eine hohe Affinität für FdsZ und rekrutiert FdsZ. Aber durch die Interaktion von
SlmA mit FdsZ, kann FdsZ keine GTP Hydrolyse durchführen, und die FdsZ Protofilamente bleiben
zwar am Chromosom gebunden, aber können nicht mit der Membran interagieren. Und können auch
keine Biegung vollführen. Sie werden einfach blockiert. Indem Moment wo aber die Zelle sich streckt,
die Zelle wächst, und in der Terminatorregion kein SlmA mehr vorhanden ist, und gleichzeitig die
Menge an FdsZ dramitsch steigt, kann FtsZ genau in der Mitte binden (über ZipA und FdsA) und es
kommt dann hier zur Septumbildung.
So zeigt ein Protein an, welche Regionen im Chromosom wo liegen.
Genau in dem Bereich wo das Nucleoid liegt, kann kein FdsZ binden, und sich somit kein Septum
ausbilden kann.
Der Bereich an den Polen: eig. könnte sich FdsZ auch hier anlagern? -> hier kommt das zweite System
ins Spiel:
-Min-System.
Bei diesen Mutanten wurden kleine Zellen (Mini Zellen) abgeschnürt.

Das Min-System:
minE: bildet filamentöse Zellen -> der Z-Ring wird gar nicht gebildet
minC: deswegen werden Mini Zellen ausgebildet, d.h. der Zellkern wird nicht richtig positioniert
minD: führt zu Mini Zellen.

Die Überexpression von MinC, D: Z-Ring wird nicht ausgebildet-> es kommt zu filamentösen Zellen.
Der MinC, D Komplex inhibiert FdsZ und MinE inhibiert den MinC, D Komplex.
-> diese roten Punkte sind MinC, D hetero Dimere, und in Rot sind sie in ihrer ATP gebundenen Form.
MinC inhibiert die Polymerisation von FdsZ und verdrängt gleichzeitig die Ankerproteine FdsA und
ZipA von der Membran.
Also MinC ist hier Membrangebunden und diese Assoziation zur Membran wird durch MinD mediert.
MinD (=ATPase) assoziiert MinC an die Membran.
Nur in diesen Heterodimeren Komplex ist dieses System aktiv.
MinE lagert sich an die Membran an und es stimuliert die ATP Hydrolyse. D.h. Min E wandert entlang
der Membran an diese Heterodimere von MinC, D und stimuliert die ATP Hydrolyse, dadurch werden
die Dimere von der Membran weckgebracht. Dieser Ring wandert dann bis zum Pol und die MinC, D
Dimere (die jetzt ein ADP haben) sind frei und wandern ganz weit weg, von der ATP Hydrolase und
werden wieder mit ATP ausgerüstet. Dann binden sie ganz weit weg von dem an den anderen Pol.
Wenn man das ganze laufen lässt, entsteht eine Oszillation von MinE nach links und rechts.
Gleichzeitig auch eine Oszillation von MinC, D von einem Pol zum anderen.
Daraus ergibt sich, dass die höchste Konzentration von MinC, D (in ATP gebundener Form) hier an
den Polen ist.
Dadurch, dass MinC, das FdsZ und ZipA und FdsA inhibiert, ist die Ausbildung des Z-Ringes an den
Polen inhibiert.
Wenn man diese 2 Systeme zusammenfasst:
Also einerseits Nucleoid-Occlusion: hier kann sich kein Z-Ring ausbilden.
Und andererseits das Min-System (MinC, D) blockiert die polaren Regionen und somit kann FdsZ nur
in der Mitte bleiben um sich Auszubilden.
Ganz zum Schluss muss ja die Interaktion vom Peptidoglycan der einen Zelle und dem Peptidoglycan
der anderen Zelle muss ja ganz zum Schluss aufgelöst werden, und für diese Auflösung gibt es wieder
Proteine. So genannte Amidasen (AmiA, B, C).

Trennung der Tochterzellen:

Amidasen: Sie sind richtige Peptidoglycanhydrolasen die diese finalen Interaktionen auflösen.
EncV und NIpD: sind Faktoren die mit dem Divisom assoziiert sind, sind auch Membranproteine, und
diese aktivieren die Hydrolasen. Denn die Hydrolasen dürfen nur zu einem Zeitpunkt aktiv sein, wo
wieder das Peptidoglycan an den Polen ausgebildet ist. Erst dann dürfen die letzten Links geschnitten
werden.
Sie sorgen also dafür, dass es nicht zu einer vorzeitigen Teilung der Zellen kommt.

Proteintransport durch die cytoplasmatische Membran:

60% in der Membran sind Proteine.-> 25% müssen um an den Zielort zu gelangen durch eine
Membran durch.
Dafür gibt es verschiedene Systeme:
1 Sec abhängige pathway (GSC). Dieser Transportweg ist hoch konserviert.
2) Tat-System.
Es wird durch 3 versch. Proteine aufgebaut. Das 3. Protein besteht aus Multimeren. Diese Multimere
lagern sich ein und bilden eine Pore. Diese passt sich an das Protein an das durchschlüpft.
Besonderheit: Auch gefaltete Proteine können hindurch (bei Sec können nur ungefaltete Proteine
hindurch, nur eine einzelsträngige Aminosäurekette passt hindurch.)

Leadersequenzen: Wie weiß die Zelle welches Protein wohin muss?

Deswegen sind die Proteine die durch die Membran müssen, mit einem speziellen Label versehen,
und das ist die so genannte "Leader Sequenz". Die Leader Sequenz liegt am Endterminus des Proteins
und ist meistens eine Sequenz von 15-40 Aminosäuren (im Fall vom Sec System sind es meistens 20
AS). Die Proteine haben also unterschiedliche Labels, entweder gehen sie mit dem Tat-System durch
oder mit dem Sec System. Das Tat ist das Twin-Arginin-System (benannt nach den 2 Argininen, die in
der endterminalen Region vorhanden sind), das "Z" steht für einen polaren Rest (polare AS), und
dahinter sind dann im Abstand von 1 AS, hydrophobe AS angelagert. Dieses Motiv sagt dem System
"dieses Protein muss mit dem Tat System durchgeschleust werden.). Dahinter ist noch die
hydrophobe Region und noch eine kurze, polare Region.

Für das Sec System ist diese Leader Sequenz kürzer (ca. 20AS lang), hat genau eine Endterminale und
eine C-terminale polare Region, die unterbrochen ist durch eine hydrophobe, ungeladene Sequenz.
Das Leaderpeptid ist wirklich nur dafür da, um zu sagen "ich muss dort hin!". Dieses Leaderpeptid
interagiert dann mit der inneren Membran, und lagert sich in die innere Membran ein und der
wichtige Part hier/ die wichtige Sequenz hier ist noch eine Schnittstelle, für die Leaderpeptidase
(LepB), (LepA hat eine ganz andere Funktion, nämlich in der Translation). LepB ist auch in der
Cytoplasmatischen Region und schneidet irgendein Alanin an diesem Motiv das Leaderpeptid ab und
setzt das Protein an der Periplasmatischen Seite frei. Dieses Peptid wird dann wieder disassembliert,
die AS werden wieder regeneriert und werden wieder für die Proteinbiosynthese verwendet.
Das Sec-Translocon ist hochkonserviert, deswegen auch "general secretory pathway" (GSP). Es
kommt in Gram-, und + Bakterien vor. Man findet den gleichen Komplex auch in Archeen und auch
im endoplasmatischen Reticulum (dort ist genau der gleiche Transportweg wie in der
cytoplasmatischen Membran).
Wie funktioniert das Ganze jetzt?
- es gibt 2 verschiedene Möglichkeiten dieses Sec-Translocon zu verwenden:
1) Die Mehrheit der Inneren Membranproteine läuft über diesen Pathway: Das Ribosom interagiert
direkt mit dem Translocon. D.h. die Proteine werden co-translational durch das Translocon
durchgeschleußt und der Motor dieses Durchschleußens ist das Ribosom. Das Ribosom synthetisiert
richtig durch die Membran hindurch. Für diesen Mechanismus ist der Signal-recognition-pathway
zuständig: Der Signal Recognition Particle ist ein ganz besonderer Komplex, denn er besteht
einerseits aus der RNA und andererseits aus dem Protein. Es ist ein Ribonuclein Particle. Es gibt das
FfH Protein, das ist eine GTPase, und dann gibt es noch die 4.5 sRNA (ist eine RNA von genau 114
Nucleotiden). Dieser Protein-RNA-Komplex erkennt die Signalsequenz (deswegen muss die
Signalsequenz am Endterminus des Nucleotids liegen, weil es ist das erste, was direkt aus dem Peptid
exittanel vom Ribosom kommt), also das Ribosom translatiert die RNA und während der
Peptidproteinsynthese kommt schon die Signalsequenz als erstes raus und das Signal Recognition
Particle erkennt sofort diese Sequenz und bindet daran, und bringt das Ribosom, die RNA direkt an
die Membran. Diese Interaktion wird vom Signal Recognition Particle Receptor (FtsY) stimuliert, und
die zwei interagieren. Das Signalpeptid wird an das Sec-Translocon übergeben und das Ribosom
interagiert jetzt mit dem Sec Translocon. Und dieses Heterodimer zwischen dem Signal Recognition
Particle und dem FtsY geht dann weg. Es kommt zur GTP Hydrolyse. FtsY bleibt in der Membran
gebunden und das Signal Recognition Particle wird wieder mit GTP ausgerüstet und sucht sich das
nächste Ribosom, das ein Membranprotein translatiert.
Wie die Funktionsweise von diesem SRP ist: es bindet an die 4.5s Untereinheit des Ribosoms, genau
dort wo das Peptid herauskommt.
Diese RNA ist eine hochstrukturierte RNA, und bildet einen Hairpin aus.
Andererseits ist hier in blau das FfH Protein mit den versch. Domänen (das wäre das SRP).
In grün sieht man schon die Interaktion mit dem Rezeptor FtsY. Hier ist die GTP Bindestelle, sie ist
genau zwischen den zwei Proteinen.
FtsY und FfH schauen sich sehr ähnlich. Sie teilen sich in ihrer Ähnlichkeit die Endterminaledomäne
von FfH, die bei FdsY in der Mitte zu finden ist, und sie teilen sich auch die GTPase Domäne.
Zusätzlich hat FdsY die A-Domäne, welche für die Membranloclisation von FdsY verantwortlich ist.
Die N-Domäne und die G-Domäne (die sind gleich). FfH hat zusätzlich noch die M-Domäne, welche
die hohe Affinität für die 4.5sRNA dominiert.
Man sieht hier wie die M-Domäne mit dem Tetraloop interagiert.
Hier ist die Struktur vom Heterodimer, diese Struktur kann aber nur aufgelöst werden, indem man
ein GMPPCP verwendet. Normalerweise würde hier ein GTP sitzen -> warum ist hier dieses Analogon
anstelle von GTP?
- Dadurch ist der Komplex eingefroren, denn normalerweise würde es in diesem Komplex zur GTP
Hydrolyse kommen, diese Hydrolyse wird durch das eine Nucleotid der 4.5sRNA induziert, und das
hat genau die gleiche Funktion wie der Arginin Finger (bei dem DnaA Protein) der genau in die
Bindestelle zu dem Gammaphosphat vom ATP geht. Hier haben wir die gleiche Funktion, dass dieses
Nucleotid zur GTP Hydrolyse führt und somit könnte man den Komplex gar nicht Strukturell auflösen,
weil man einfach in den Moment die GTP Hydrolyse induzieren würde.

Insertion von Proteinen in die cytoplasmatische Membran: Hier ist dieses Nucleotid, es schaut genau
in Richtung der ATP Bindestelle. Dann ist hier noch das Analogon mit dem man das auflösen könnte
(sonst würde es zur Hydrolyse kommen).
Wie funktioniert das jetzt am Ribosom?
-Wir haben hier das Ribosom synthetisiert, das Signalpeptid kommt aus dem Peptitexitunnel raus.
FfH bindet einerseits an das Ribosom, andererseits an die 4.5 sRNA und zusammen erkennen sie das
Signalpeptid, vor allem über diesen Loop der 4.5 sRNA.
Wenn man das Ganze jetzt dreht sitzt der Signal Recognition Particle hier oben, welches mit dem GTP
ausgerüstet wird und interagiert hier jetzt mit dem Signal Recognition Particle Receptor und wird
über diese Interaction ans SecY Translocon rekrutiert. In diesen Moment übergibt dann auch das
Signal Recognition Particle das Peptid an das Translocon => es kommt zur Interaktion zwischen dem
Ribosomalen Protein L23, mit dem Translocon. L23 mediiert dann diese Interaktion. Durch diese
Interaktion, also durch diese Bindung, kommt es zu einer Konformationsänderung des Signal
Recognition Particles zusammen mit dem Rezeptor, und durch diese Recolisation kommt es genau
zur GTP Hydrolyse.
Also nur in dem Moment wo das Signalpeptid in SecY interagiert, und L23 mit dem Translocon
interagiert, wird diese Hydrolyse getriggert, genau durch dieses Nucleotid (das hier in die GTP
Bindestelle hineinragt) und dadurch wird dann die Auflösung dieses Komplexes induziert. -> Dann
löst sich das Signal Recognition Particle vom Ribosom wieder ab und auch die Interaktion mit dem
SRP Rezeptor (FdsY) wird dissoziiert.
4. Vorlesung
Proteinexport in Bakterien:
Was passiert aber in der Zelle als erstes beim Proteinexport?
Er setzt sich zusammen in 3 Schritten:
1) In der Zelle, im cytoplasmatischen Bereich, eine Sortierung (ist es ein Membranprotein? Bleibt es
im Cytoplasma?) Wieso werden die Proteine erkannt die durch die Membran müssen? -> diese
Proteine haben ein Signalpeptid.

Transport einmal im Nichtgefaltetem Zustand, und einmal wo das Protein im Cytoplasma gefaltet
werden kann, wo sich sogar Komplexe aus mehreren Proteinen und Molekülen bilden können, und
diese Komplexe können dann im gefalteten Zustand durch die Membran transportiert werden.
2) Translokation durch die Membran
3) Maturation (wo das Signalpeptid abgeschnitten wird) und dann targeting, es kommt in die innere
Membran, wo es dann bleibt oder wird in den äußeren Bereich transportiert.

Sec abhängiger pathway, wo wir dieses sec translocon haben. Das Sec Translocon ist aus 3
verschiedenen Proteinen aufgebaut: SecYEG (kann direkt Co-translational verwendet werden indem
das Signalpeptid vom signalrecognition particle erkannt wird, das Ribosom an das Translocon
heranbringt wo es zu einer Interaktion zwischen dem Ribosom und dem Translocon kommt, und
dann das Signalpeptid in das Translocon hinein positioniert wird. Die Translation (=die treibende
Kraft) schleust das Protein hindurch.
Der zweite pathway:
Die Mehrzahl der outer membrane Proteine (OMPs) werden posttranslational durch das Translocon
transportiert mithilfe vom Chaperone SecB und SecA.
Das Ribosom translatiert das Protein, danach interagiert Chaperone SecB mit dem Protein (SecB
erkennt zwar das Signalpeptid, aber bindet nicht daran (sowie SecA) sondern bindet an den Rest des
Proteins, SecB kann so das Protein an SecA überbringen.) SecA bindet dann an das Signalpeptid in
dieser Bindetasche. SecA übergibt dann das Signalpeptid an das Translocon. SecA ist eine ATPase,
d.h. SecA dimerisiert, bindet an das Sec-Translocon und über diese Dimerisation und über die ATP
Hydrolyse kommt es zu der Konformationsänderung, die dann dazu führt, dass das Protein immer
wieder durch das Translocon geschoben wird.
Zum Schluss, wenn diese Translokation beendet ist, kommt LepB (=leader Peptidase) und schneidet
zwischen dem Signapeptid (das noch in der Membran lokalisiert ist) und entlässt dieses Protein in
seinem nativen Zustand.
Sec YEG Komplex: Die Proteine die dieses Translocon aufbauen (YEG) bestehen nur aus
Transmembrandomänen, die in die Membran eingelagert sind, und in der Mitte bildet sich eine Pore.
In Türkis= das sind Aminosäuren der verschiedenen Transmembrandomänen, und diese bilden das
laterale Gate, durch das hindurch das Protein geschoben wird.
Eine kleine Helix in der Gate verhindert, dass es zu einem Austausch von innen und außen kommt.
Die Helix ist also ein Deckel der das Translocon zuhält, in dem Moment wo nichts transportiert wird.
Ansonsten könnte eine ungefaltete Aminosäurekette durch und demnach auch andere Dinge
durchdiffundieren.

SecA: Motorprotein:
Es gibt verschiedene Wege des Einbaus
Das Membranprotein (in grün) muss nicht durchmarschieren, sondern es wird in das Translocon
hinein gedrillt, und das Translocon bleibt immer noch verschlossen, aber die lateral gate, dieser Ring,
öffnet sich zu einer Seite, und lässt diese Transmembrandomäne (die im SecY Kanal drinnen sitzt)
nach außen. Das Transolocon erkennt also welche final destination das Protein hat.
Wenn jetzt ein Protein ist, dass wirklich ins Periplasma transportiert werden muss, schaut die
Struktur von SecY wieder ganz anders aus. Also in dem Moment entfernt sich auch dieser Plaque, der
Deckel geht auf, das Membran kann durchmarschieren.
Das Signalpeptid wird in die innere Membran inseriert, wir haben also zuerst dieses Öffnen der
lateral gate, die Aminosäuren öffnen den Ring in eine Richtung -> Das Signalpeptid kann in die
Membran einwandern, der Plaque öffnet sich und der Rest des Proteins kann durch das Translocon
durch in den periplasmatischen Raum gelangen. Und erst wenn das ganze Protein durchtransloziert
ist, kommt LepB und schneidet das Signalpeptid wieder ab.
SecA= Motor Protein= ATPase
3 verschiedene Wege.
Einerseits kann das SecA-Dimer direkt an das Signalpeptid binden, andererseits brauch et SecB. Zum
Schluss wird das Signalpeptid eingelagert.
Sec DF:
Ein Monomer von SecA schaut so aus:
wir haben 2 Nucleotid-Bindedomänen (also ATP Bindedomänen). Eine davon reguliert die ATPase
Domäne, die andere ist die aktive ATPase Domäne.
Die preproteinbining Domäne (=die Bindetasche in der das Signalpeptid bindet).
Die wing domain hat eine wichtige Funktion aufgrund ihrer Konformationsänderung.
Die protone motive force spielt auch eine Rolle.
Der Protonenfluss wird durch SecF und SecD Protein mediiert.
Protonmotiveforce trägt also zur Translocation bei und wahrscheinlich die Konformationsänderungen
stimuliert.

Die Synthese von SecA wird von SecM stimuliert:

Das Protein kommt gebunden an das SecA Dimer an das Translocon an. Es folgt eine ATP Hydrolyse
(durch die Konformationsänderung) => in dem Moment kommt es wieder zur Monomerisierung, d.h.
ein Molekül verlässt diesen Komplex wieder.
Es werden pro ATP Hydrolyse ca. 20-30 Aminosäuren vom Protein durchgeschleußt und es kommt
immer wieder zu diesen Konformationsänderungen die diesen Austausch von ATP induzieren.

SecM:
Wenn das Ribosom die Proteinsynthese von SecM durchführt, dann bleibt das Ribosom auf der SecM
RNA stehen.
Die Shine Dalgarno von SecA ist durch eine Hairpin Struktur geschlossen. Dadurch kann das Ribosom
die Ribosom Bindungsstelle nicht sehen (weil die Anit-shine dalgarno kann nicht an der dalgarno
binden, weil sie ja schon in einer Hairpin Struktur gebunden ist). Wenn das Ribosom kommt und
SecM translatiert bleibt das Ribosom hier stehen aufgrund der Eigenschaften dieses Peptids (enthält
sehr stark geladene Aminosäuren). Dadurch wird hairpin Struktur aufgelöst und die
Ribosomenbindungstelle für SecA ist frei. SecA kann also exprimiert werden, es kommen neue
Ribosomen die hier translatieren und SecA synthetisieren. Wenn genug SecA in der Zelle vorhanden
ist, passiert folgendes: SecM hat auch ein Signalpeptid-> SecM wird in die Membran eingebaut und
wird von SecA erkannt-> SecA bindet und beginnt SecM durch das Translocon durchzuschleusen, und
die Energie die es dafür aufwendet ist genug um das Peptid aus dem Ribosom rauszuziehen. Dadurch
kann das Ribosom weitertranslatieren, bis zum Ende des SecM Proteins und es kommt zur
Translationstermination-> das Ribosom löst sich ab und die inhibitorische Sekundärstruktur bildet
sich wieder und die Ribosomenbindestelle ist wieder inhibiert.-> es kann keine weitere Translation
von SecA stattfinden.

YidC:
YidC ist eine Membraninsertase.
Sie hilft einerseits den Co-translationalen Transport, interagiert dann direkt mit dem Sec Translocon
und stimuliert das Öffnen der lateralen Gate und der Einbau der Transmembran Domäne.
Andererseits kann YidC das ganz alleine, ist also Sec independent. Und in dem Fallt transportiert YidC
kleine Membranproteine in die Cytoplasmatische Membran ganz alleine.
Dieser YidC Pathway ist sehr hoch konserviert.
Es kommt in Gram+ und - vor. Auch in den Archeen.
Es hat sehr viel Ähnlichkeit mit dem Sec Translocon. Hier das Ribosom mit der kleinen Untereinheit in
Gelb und die große Untereinheit in blau und in Rot das YidC-Dimer.
Die Proteine L29, L23, L24 und ein Helix Bereich der rRNA bauen diese Öffnung des Peptittunnels auf.
Und genau an dieser Öffnung sitzt ein Dimer von YidC.

Der SecY Komplex:

Wenn wir das jetzt mit dem SecY Komplex vergleichen, sieht man das auch hier ein Tunnel offen ist,
durch den das Protein hindurchgedrillt werden kann. Und das Protein ganz eigenständig diese
Translocation bewerkstelligen kann.

CyoA :
Wird nur über YidC in die Membran inseriert. CyoA spielt bei der Atmungskette auch eine Rolle.

GSP (=Sec abhängiger Pathway)

Die ungefalteten Proteine werden entweder Cotranslational oder Postranslational durchgezogen

Das Tat-System:
Erlaubt es gefaltete Proteine und sogar ganze Komplexe durch die Membran zu transportieren.
Vorteil weil im Cytoplasma gibt es ATP (Im periplasmatischen Bereich nicht).
Tat System kommt von den zwei Argininen die im Signalpeptid sitzen, und das ist das
Erkennungsmotiv für diesen Transportmechanismus.
Der große Unterschied zum Sec-abhängigen-System ist, dass einzig und allein die Protonemotive-
force (=Protonenfluss) die Energie für den Transport bereitstellt.

Das Tat System benötigt nur 3 verschiedene Arten von Proteinen.

1) TatA
2) TatB
3) TatC
TatC ist ein Multitransmembranprotein, baut sich in die Membran ein und erkennt das Signalpeptid
eines Proteins, dass über diesen Mechanismus nach draußen transportiert wird, d.h. es erkennt also
das Signalpeptid und erkennt das Tat-motive.
Die Interaktion mit TatA wird reguliert durch TatB und eine Helixinteraktion. TatB dient auch dazu,
dass Protein/den Komplex durchzuschleußen.
TatA hat nur eine Transmembrandomäne, und hier lagern sich sehr viele TatA Proteine in der
Membran zusammen, und dadurch kann die Größe der Pore bestimmt werden. Also die Menge der
TatA Proteine bestimmen die Größe der Pore. -> Die Größe der Pore wird an das Molekül angepasst
(indem viel TatA Proteine miteinander interagieren).

Proteintransport in die äußere Membran:

Im Periplasmatischen Bereich muss ja nochmal ein sorting stattfinden. Es gibt Proteine die in der
Inneren Membran bleiben, oder aber in die äußere Membran eingelagert oder auch sekretiert
werden.
Wie werden jetzt die Moleküle in die äußere Membran transportiert?
In der äußeren Membran sind Lipoproteine eingelagert (=Proteine die einen hydrophoben Bereich
haben um in der Membran verankert zu werden) des Weiteren gibt es dort ß-barell Proteine, die
diese trimeren Poren bilden durch die kleine Moleküle durchdiffundieren können und außerdem sitzt
da draußen noch das LPS. All diese Moleküle müssen an die äußere Membran transportiert werden.
Da ATP im Periplasma nicht vorhanden ist, müssen diese Reaktionen auf einer anderen Basis
ablaufen.
Die Mehrheit der äußeren Proteine wird posttranslational getargeted.

ß-barell-Proteine:
ß-barell-Proteine werden über die Sec-Maschinerie nach innen transportiert. Chaperone binden
einfach an diesen Proteinen und den Transport an die äußere Membran medieren.
Der Bam-Komplex (=YidC) ist ein Membranprotein mit einer Pore und assoziierte Proteine sind
Lipoproteine, die sind in der äußeren Membran verankert die auch die Translokation unterstützen
und den Einbau in die äußere Membran initiieren.
Die Protease (SurA mit den Chaperonen) und die binden mit unterschiedlicher Kapazität an
verschiedene Proteine. Eine weitere Protease führt dazu, dass falsch eingebaute Proteine wieder
degradiert werden und die Aminosäuren wieder nach innen transportiert werden
(=Reparaturmechanismus).

Lipopolysaccharide:
Werden durch einen anderen Mechanismus in den Periplasmatischen Bereich gebracht. Sind auch an
der Inneren Membran in Richtung des Cytoplasmas inseriert. Eine ATPase flippt diese
Lipopolisaccharide durch die Membran.
Lipopolysaccharidsynthese: Hier sind Glycosyltranferasen, die die Zucker an die Lipide anhängen und
dann haben wir diesen Flipp des Core Lipides A an die Innenseite der Membran. Hier ist auch der ABC
Transporter beteiligt,

MsbA: ABC-Transporter:
Hat verschiedene Konformationen, je nachdem ob das LPS gebunden hat oder nicht. Es ist also in
erster Linie diese Open Apo stage (=Transmembrandomäne). Das Protein dimerisiert in der
Membran. Beim roten Sternchen kann das Lipopolysaccharid binden und wenn das passiert, kommt
es zu einer Konformationsänderung. Die ATP Hydrolyse wird induziert und in dem Moment kommt es
zu einer weiteren Konformationsänderung=> Gate öffnet sich zum Periplasma hin und entlässt das
Lipopolysaccharid in die Membran, aber jetzt in die periplasmatischen Seite. Bleibt aber in der
Membran gebunden.

Lipopolysaccharidtransport:
Es gibt noch eine weitere ATPase und einen weiteren Energieaufwändigen Mechanismus und der
wird durch diesen Komplex (LptF und 2 ATPasen!) getriggert.
Auch hier erfolgt über eine Konformationsänderung das Herausheben des LPS aus der Membran und
wird wieder Energie getrieben durch die ATP-Hydrolyse. Dann gibt es noch das LPS Chaperon
induziert dann den Transport an die äußere Membran.
Es gibt jetzt 2 Mechanismen:
1) das LptA direkt an das LPS bindet und dann ein Molekül LptA mit einem LPS nach außen wandert
an das ß-barell Protein und das ß- barell Protein erlaubt dann den Flipp an die Außenseite der
Membran.
2) Ein Multiproteinkomplex der die ATPase mit dem ß-barell Protein verbindet und über diese Kette,
die innen und Außenmembran verbindet, diesen Transport mediiert.

Lipoproteine sitzen im Lipilayer, können an verschiedenen Stellen/ verschiedenen Orten sitzen.

Können in der Membran in den Periplasmatischen Raum schauen, in der äußeren Membran in den
Periplasmatischen Raum, oder sie können verankert in den Pilayer nach außen in die Umgebung
schauen, und hier verankert sein.
Wie zeichnen sich jetzt solche Proteine aus?
Sie haben eine Signalsequenz, damit die Zelle weiß "dieses Protein muss transportiert werden", sie
haben aber zusätzlich auch eine Lipobox. Die Lipobox besteht aus diesem Motiv: hier ist ein spezielles
Cystein, und noch einige Aminosäuren (Lysin). Diese Lipobox sagt dem System "Dieses Protein muss
jetzt mit diesen Fettsäuren ausgestattet werden" weil die ja der Anker für die Membran Bindung
sind. Dann gibt es noch das Lol-sorting-signal, welches sagt "dieses Protein muss hier an der
Periplasmatischenseite der Cytoplasmatischen Membran sein", oder "es muss weitertransportiert
werden"- Also es gibt hier sehr viele Motive die ganz genau sagen, wohin das Lipoprotein gebracht
werden muss.
Es gibt dann noch einen sehr flexiblen Linker, damit die Konformation des Proteins sich ausbilden
kann ohne, dass die Membranverankerung inferiert. Und dann gibt es noch eine funktionelle
Domäne.

Lipopolysaccaridtransport in die äußere Membran:

In erster Linie haben wir den Transport ins Sec-Translocon, und die Positionierung des Signalpeptits
dann im Anschluss in der Membran. Und dieses Signalpeptid mit der Lipobox, (=also das
hochkonservierte Cystein, und entweder Glycerin/Alanin, Alanin/Serin und das Leucin als Lipobox)
das wird jetzt erkannt, von der Lipoprotein Glyceryl Transferase, und durch diese Transferase kommt
es zu einer Aminoester Bildung mit dem Glycerol zwischen dem Cystein. Danach kommt die
Leaderpeptidase die diese Lipobox erkennt und das Signalpeptid und die Leaderbox abspaltet, das
nennt man dann Apolilipoprotein. Hier werden noch weitere Fettsäuren drangehängt (von der N-
acetyl Transferase) und dann kommt es zum Lol-System. Dieses transferiert die Lipoproteine der
äußeren Membran weiter. Das Lol-avoidance-Motif (ist ein Asparagin): wenn ein Asparagin hier
positioniert ist, bleibt das Protein in der inneren Membran, wenn hier aber eine andere Aminosäure
sitzt, wird es über das Lol-System weiterdirigiert.

Lol-System:
Wie schaut jetzt der weitere Weg aus? Wir haben es schon beim LPs gesehen: Es brauch eine ATPase
um die hydrophobe Interaktion mit der Membran jetzt aufzulösen, um dieses Protein rauszuheben.
Bei den Lipoproteinen ist es sehr ähnlich: das erste Protein in der Cascade ist eine ATPase. Die
Domäne hier innen (es ist wieder ein Heterodimer aus C und E) und an der Cytoplasmatischenseite
ist ein Dimer aus der ATPase LolD und es ist wieder die gleiche Konformationsänderung, d.h. in erster
Linie in der Apo-Form ist dieses Molekül zur Innenseite offen, das Lipoprotein kann hier interagieren.
Dann kommt es zur ATP-Bindung, also die 2 ATPasen interagieren miteinander, und die Gate geht
jetzt zur Periplasmatischen Seite auf. Die ATP Hydrolyse ist notwendig, damit alles wieder zur
Ausgangsstellung kommt. Die ATP Hydrolyse kann aber erst in dem Moment passieren, in dem dieses
Protein übergeben wird an ein anderes Chaperon. ->Warum muss das so sein? -> Das Lipoprotein
lagert sich zwischen den zwei Proteinen C und E an, die Proteine interagieren, ATP wird gebunden
und in dem Moment öffnet sich die Gate zur periplasmatischen Seite, hat aber in dem Moment das
Protein schon aus der Membran herausgehoben, sie hat also dieses Hydrophobe Interaktion schon
gelöst. Warum kann es erst zu der Hydrolyse kommen, wenn das Lipoprotein mit seinem Chaperon
interagiert? -> Weil wenn dieser Bereich frei im Periplasma wäre, würde es sofort wieder an die
Membran binden und der ganze ATP Aufwand wäre umsonst. Deswegen ist es an die Übergabe an
das Chaperon gekoppelt, dann erst kommt es zur Hydrolyse und die Gate geht wieder zum
Cytoplasma hinauf.
Der Hydrophobe Bereich muss geschützt bzw. abgeblockt werden, dass diese Membraninsertion
nicht passieren kann. -> LolA hat eine Bindetasche die Hydrophobe Bereiche aufnehmen kann (die
Fettsäuren können sich darin schön anlagern.
Diesen Mechanismus nennen wir mouth-to-mouth. D.h. hier haben wir auch eine Bindestelle in
diesen Molekülen die, wenn das Lipoprotein herausgehoben wird, den hydrophoben Bereich
abblockt, und dann folgt eine Übergabe in das LolA-Chaperon. Und das transportiert es jetzt an ein
Lipoprotein (LolB). Dieses Lipoprotein ist in der äußeren Membran inseriert. Der Hydrophobe Bereich
wird also mouth-to-mouth übergeben.
Dieser mouth-to-mouth Mechanismus ist absolut nur Affinitätsgetrieben.
5.Vorlesung
Proteinexport:
Wie werden Proteine oder andere Moleküle, Toxine, Nucleinsäuren... nach außen transportiert?
Für die Proteinsekretion stehen der Zelle 5 Sekretionssysteme zur Verfügung.
Typ IV kann mit anderen Zellen (zb Pflanzenzellen) interagieren.
Typ I, III und IV: exportieren Proteine direkt aus dem Cytosol -> Sec-UNABHÄNIGE Sekretionssysteme.
Sie haben an der Inneren Membran ABC-Reporter, sie haben eine ATP Hydrolyse.
Typ II und V sind Sec-ABHÄNGIG, um die Moleküle durch die innere Membran zu schleußen und die
Sekretionsysteme übernehmen den Transport nach außen.

Das einfachste ist das Typ V: ist ein Autotransporter (=Protein, welches durch die äußere Membran
muss, in erster Linie auch sein Transportprotein beinhaltet). Das Protein ist zunächst auf der mRNA
codiert als ein chimäres Gen. Es hat einerseits diese Translokatordomäne, die dann das ß-barell-
Protein in der äußeren Membran aufbaut, und das eigentliche Protein, dass dann zum Schluss
exportiert werden soll, dass schleußt sich dann durch seine eigene Pore durch und es trägt auch eine
Proteasedomäne (über die wird der Virulenzfaktor abgeschnitten). Das ß-berall Protein das jetzt in
der äußeren Membran sitzt, wird in dein meisten Fällen wiederverwendet, es kann aber auch
abgebaut werden. Meistens bleibt es aber hier sitzen und wird Teil eines anderen Transportsystems.
Die IgA Protease bringt ihr eigenes ß-barell Protein von N-gonorrheae mit. Es gibt versch. Wege:
einerseits ein einzelnes ß-barell durch dessen Kanal das Protein hindurchgeschleußt wird oder
mehrere ein Hexamer oder ein Multimer bilden und durch den Inneren Kanal wird es
durchgeschnitten und durch die Protease freigesetzt.

Chaperon/Usher-Sekretionsweg:
wieder das Automembran-Protein in der äußeren Membran angelagert, zusätzlich zu diesen noch ein
Chaperon, dass das Protein nachdem es durch den Kanal durch ist, in Empfang nimmt, auch seine
Faltung unterstützt und dann an das äußere Membranprotein weiterleitet.
Also das Chaperon transportiert und trägt zur Faltung bei.

TypII Sekretionssystem:
Aufbau sehr ähnlich wie bei Typ II.
Wird nach außen transportiert und hilft Clepsiella, dieses Polysaccarid aus Pflanzen zu degradieren,
um dann die einzelnen Moleküle wieder als Nahrung aufzunehmen. Aber zuerst muss das
Polysaccharid extrazellulär zersetzt werden.
Hier wird das Protein durch das Sec-Locon in den Periplasmatischen Raum gebracht, und über diesen
Multiproteinkomplex (Gsp Komplex) in den outtermembrane Kanal gebracht und weitergeleitet.
Im Unterschied zum Chaperon/Usher Pathway ist, dass dieser Komplex durch den Periplasmatischen
Raum verbunden bleibt. Also wir haben direkt eine Verbindung zwischen der äußeren und inneren
Membran.

TypIV Sekretionssystem:
Sec-unabhängig.
Das Sekretionssystem übernimmt auch den Transport durch die Innere Membran. Es kann auf 2
verschiedene Arten passieren:
Einerseits kanns noch sec abhängig Proteine tranlozieren, andererseits kann es selbständig DNA
aufnehmen und nach außen transportieren und über diesen Pilus in Eukariotische Zellen
transportieren.

TypI Sekretionssystem:
Typ I: hat einen ABC Transporter, der das Protein erkennt und über ATP Hydrolyse durch den
Periplasmatischen Raum das Protein nach außen transportiert.
Hier wieder das Membranfusionprotein das den ABC Transporter direkt mit der äußeren Membran
verbindet. Über diesen Mechanismus werden meist Lipasen, Toxine und Proteasen sezerniert.
Das Substrat hat keine N terminale Signalsequenz (wie beim sec-transportsystem) sondern die
Signalsequenz ist im C-Terminus. Und diese Signalsequenz wird dann spezifisch von dem ABC
Transporter erkannt.

TypIII Sekretionssystem:
typ III:
ein Komplex sitzt direkt in der Inneren Membran und ist verbunden mit dem Komplex der äußeren
Membran. Das Protein kommt mit dem Periplasmatischen Bereich nicht in Berührung, sondern wird
direkt weitergeleitet in den pilus, der wiederum direkt in eine Eukariotische Zelle penetriert.
das Type III System schaut sehr ähnlich aus wie ein großes Molekül in der Membran, nämlich wie der
Motorblock des Flagellums. Man hat den gleichen Ring in der äußeren Membran, es gibt auch diesen
Transportkanal. Der Motor des Flagellums in der inneren Membran. Das Flagellum wird auf die
gleiche Art und Weise aufgebaut wie viele C-Proteine die notwendig sind um das Flagellum
aufzubauen. Beim Type III gibt es noch diesen Haken der notwendig ist für die Rotation des
Flagellums und dann werden die Proteine immer weiter nach außen gebracht

2 versch. Arten von Signalen: einerseits sitzt ein Signal in der mRNA, also die mRNA wird an den Ort
des Transportes gebracht und die Synthese des Proteins erfolgt dann vor Ort. Das Protein wird hier
vom Ribosom synthetisiert.
Dann gibt es noch den N-terminus des Proteins eine Erkennungssequenz die dann über diese Syc
Chaperone direkt erkannt wird und dann an das Typ III secretionssystem angelagert wird.

Die Yops-Proteine interagieren in der Eukariontischen Zelle direkt mit dem Signaltransduktionsweg
und inhibieren somit die Immunantwort.
Die Yops Proteine affektieren diese GTPasen die für die GTP Hydrolyse notwendig sind für diesen
Signaltransduktionsweg.

Import:
Wie nimmt die Zelle Moleküle von außen auf?
Kleine Moleküle kommen in erster Linie durch die Outtermembranechannels hindurch, die einfach
Poren in die äußere Membran machen wodurch kleine Moleküle durchdiffundieren können. (das ist
in der Äußeren Membran!)
Wenn wir aber die Innere Membran anschauen, denn dort ist das Ganze schon sehr viel dichter.
Man unterscheidet 3 grundlegende Transportmechanismen:
1) Passive Diffusion -> Moleküle diffundieren einfach durch
2) erleichterte Diffusion: Sehr selektive Poren aber die nur die Diffusion erlauben. D.h. es kann kein
Transport gegen einen Konzentrationsgradienten erfolgen. d.h. es kann in der Zelle keine höhere
Konzentration auftreten als außen -> deswegen nur eine erleichterte Diffusion.
3) Der aktive Transport verbraucht Energie. Der ist eine richtige Pumpe, d.h. es kann der Transport zu
einer größeren Konzentration hin erfolgen. Die Konzentration kann also erhöht werden.

Passive Diffusion:
Kleine, ungeladenen Moleküle können leicht durchdiffundieren. Die einzige Vorrausetzung ist dass
diese Substrate amphiphisch sind und die Konzentration der Moleküle außen höher ist als innen.
Also wenn die Konzentration außen höher ist können sie nach innen diffundieren. Wenn es eine
hypotone Lösung ist, wo die Konz. innen und außen gleich ist, bleiben der Influx und Influx konstant.
Welche Moleküle können durch?
-Gase haben eine sehr hohe Diffusionsrate. Ethanol kann auch sehr gut durch. (wenn man etwas
desinfizieren will, und man dafür Alkohol verwendet, sollte man nie einen 96%igen Alkohol
verwenden, weil der diffundiert wesentlich schlechter durch als ein 70%iger!)
Wasser diffundiert relativ gut durch, ( Hat einen Wert von 100 in der rate of permeability, alles
andere wird dann dazu verglichen).
Größere Moleküle wie Glukose, Ionen und geladene Moleküle können NICHT durch diese Membran
diffundieren. Für diese braucht es spezifische Transportsysteme.

Osmose und erleichterte Diffusion:

Wenn Konz. außen und innen gleich dann ist der Wasseraustausch konstant.
Wenn die Salze in der Zelle höher sind dann diffundiert das Wasser in die Zelle hinein (Ohne den
Peptidoglycan würde die Zelle aufgedunsen werden und platzen.)
Wasser kann mit einer bestimmten Rate durch diese Membran durchdiffundieren. Was ist aber wenn
die Zellen von einer Bedingung in eine andere kommen? Dann ist Passive Diffusion nicht mehr
ausreichend, dann muss diese ERLEICHTERTE Diffusion her.
Aquaporin ist ein Wasserkanal. Es ist ein Tetramer und durch jeden Kanal passt genau ein
Wassermolekül. Durch diese Aquaporine kann das Wasser sehr viel schneller durchdiffundieren=>
Osmose findet viel schneller statt.

Aktiver Transport:
Ist spezifisch, verbraucht Energie, ist eine Pumpe und kann einen Konzentrationsgradienten
aufbauen.
Hier unterscheiden wir wieder zwischen 3 verschiedenen Transportsystemen:
1) Ganz einfacher Transportweg, dieser ist durch Protonen getrieben, er braucht also die Protone
motive force.
2) Die Gruppentranslokation
3) Die ABC Transporter

Einfacher aktiver Transport:

Lactose wird mithilfe eines Symporters in die Zelle hinein transportiert. Ein Symporter transportiert
also zusammen mit der Lactose Protonen in die Zellen. Das ist also der Aufwand den die Zelle
betreiben muss um die Lactose in die Zelle hinein zu bekommen.
Es gibt auch für Natriumionen solche Antiporter. Also für jedes Molekül Natrium das nach außen
transportiert wird, wird ein Proton nach Innen transportiert (=Ausgleich der Ladung).
Dann gibt es noch die Phosphat Symporter, wo Phosphat zusammen mit Protonen in die Zelle
gebracht wird.

Die Gruppentranslokation unterscheidet sich von den Transportsystemen grundlegend. Da hier das
Molekül, das in die Zelle transportiert werden will, WÄHREND dem Transport modifiziert wird.
Gruppentranslokation am Beispiel des Glukosetransportes:
Das Enzym 2c sitzt in der Membran und ist der Transportkanal für die Glukose. Die Glukose wird hier
aufgenommen, wird aber während des Transports phosphoryliert und kommt in der Zelle als
Glucose-6-phosphat an. Dieses Phosphat kommt vom Phosphenolpyrovat das hier über diesen
Enzykomplex. Dabei sind 4 verschiedene Enzyme beteilig: Die Phosphorylierung wird von einem
Enzym an das nächste weitergegeben und dann vom Enzym 2b Komplex auf den Enzym 2c Komplex
übergeben und damit wird dann die Glukose phosphoryliert.
Non-specific-Komponents:
Wir haben hier Non-specific compoments, d.h.: es gibt verscheidene Gruppentranslokationssysteme
die miteinander kommunizieren müssen. Und diese Komponenten sind für alle die gleichen. Und die
2 Komponenten hinten, die Membrankomponente, sind spezifisch für den Zucker der hier
transportiert wird.
Die Glucose wird zu Glucose-6-phosphat. -> Das ganze System ist ein extrem hoher energetischer
pathway, also es wird viel Energie aufgewendet, um die Glucose nach innen zu transportieren.
Trotzdem ist es für die Zelle von Vorteil, dass es schon ein Glucose-6-phosphat hat, weil das ist der
Grundbaustein um dann direkt in die Glycolyse zu gehen. D.h. die Zelle hat also mit einem Schritt,
zwei Schritte gemacht: Den Transport und gleichzeitig die Modifikation um dann Glucose-6-
6phosphat in der Glycolyse zu verwerten.

Hier sieht man die Interaktionen, denn es gibt diese Gruppentransloation für Mannitol, Glucose und
Mannose in diesem Fall hier.
Die universellen Proteine, die vom phosphonolpyrovat das Phosphat erhalten, und dieses
phosphorelierte Protein kann jetzt mit den anderen Enzymcomplexen interagieren.
Was der große Vorteil daran ist, ist dass es einen Crosstalk in der Zelle gibt, der die Aufnahme dieser
Zucker reguliert. Jedes Bakterium hat seine Vorlieben für spezielle Zucker, z.B. E-coli liebt Glucose.
Solange Glucose im Medium vorhanden ist, wird über dieses System verwendet.

Aktiver Transport: ABC Transporter:

Diese Systeme sind dafür da, dass Zucker so verwertet werden, wie sie vorkommen, und wie es für
die Bakterien optimal ist und dass die anderen Systeme die in diesem Moment nicht gebraucht
werden abgeschaltet werden.
Spezifisch für den Transport von zb Maltose da ist.
Es gibt also ein Maltoporin, das in der äußeren Membran sitzt, und die Diffusion von der äußeren
Membran von Maltose erlaubt. Im periplasmatischem Bereich wird Maltose durch ein Protein
gebunden (MalE). -> dann ABC-Transporter: nach innen offen und nach außen geöffnet um die
Maltose freizulassen.
In dem Moment wo MalE mit der Maltose gebunden an dieses Protein bindet, öffnet sich der Kanal
nach außen und die Maltose kann nach Innen, und nach erfolgter ATP Hydrolyse wird die Maltose ins
Cytoplasma entlassen.

Protonmotrische Kraft:
PMF= protone motive force
-brauchen wir für den Transport, für die ATP Synthese und für die Bewegung.
Es ist in der Inneren Membran eine Elektronentransportkette, wo im Prinzip die Knallgasreaktion in
kleinen Schritten unterteilt abläuft, und das Gnaze ist gesteuert über diese 4 Komplexe. Zum Schluss
werden 8 Protonen über diese Elektronentransportketten nach außen transportiert, ausgehend vom
NADH und vom FADH2

E-coli:
Diese Komplexe in jeweils 2 Proteine zusammegefasst, die eben über diese Quinone zu diesem
Elektronentransport kommen. Es kommt zum Aufbau des Protonengradienten von außen nach
innen.
Die Protonen werden über Kanäle nach Innen geschleußt, und oben ist ein Hexamer aus beta und
alpha Untereinheiten, und darin zwischengelagert wird jedes Mal ein ADP und ein Phosphat, und in
dem Moment wo die Protonen durch den Kanal durchwandern kommt der Elektronenmotor in
Drehung und durch diese Drehung wird oben wieder eine Konformationsänderung induziert, die die
ATP Synthese katalysiert. Es kommt dann immer wieder zur Drehung und jeweils ATP erzeugt.

Das Flagellum:
Dieser Ring mit den Proteinen in der inneren Membran sitzt. Außen ist wieder der Kanal durch
welchem die Protonen durchgeschleußt werden. Über dem P Ring ist die ganze Verankerung
stabilisiert. In der äußeren Membran ist der L Ring.
Dieser Hook ist notwendig um das Schleudern der Flagellen zu erzeugen, wenn sich die Flagellen im
Uhrzeigersinn sich drehen.
Das Flagellin (=Protein aus dem Flagellum aufgebaut ist). Weil hier unterschiedliche Ladungen sind,
dadurch kommt es durch den Protonenfluss zu Drehung des Flagellums. Die Geschwindigkeit vom
Flagellum ist also abhängig vom Protonenfluss und dadurch kann sich die Geschwindigkeit der
Drehung sich nicht ändern. Aber dafür kann sich die Richtung der Drehung ändern.
Aufbau des Flagellums:
Die Sensorkinase ist eine Transmembran und sitzt in der inneren Membran, hat eine Domäne die
nach außen schaut, an die das Signal binden kann, und hat eine Kinase Domäne die im
cytoplasmatischem Bereich positioniert ist, und hier kommt es zur phosphorelierung. =>
Effektordomäne wird in ihrer Konformation geändert und durch diese Änderung kommt es zur
Weiterleitung des Signals.

Bewegung:
Bewegung läuft im homogenen Feld immer gleich: zuerst drehen sich die Flagellen gegen den
Uhrzeigersinn, => Flagellen bündeln sich und das Bakterium kann geradeaus schwimmen. Dieser run
dauer 1 sec und danach für 0,1 sec zum taumeln (Drehung der Flagellen im Uhrzeigersinn), dadurch
entbündeln sich die flagellen und schlgen in allen richtungen=> Taumeln. Dann wieder gegen den
Uhrzeigersinn und die Zelle schwimmt einfach weiter in die Richtung wohin sie gerade schaut. Ist ein
Zufallsprodukt.
Wie können sie aber auf Quelle zu oder weckschwimmen? Was können sie da verändern obwohl die
ganze Bewegung ungerichtet ist?
Sie können die Zeit des runs verändern: wenn sie gegen den Zuckergradienten schwimmt, wird der
run verkürzt, und das so lange bis sie in seine Richtung schwimmt.
Wie kann die Zelle den run verändern?
Wie nehmen sie die Umgebung wahr?
Hauptfaktoren: Signaltranduktion.
Signaltransduktion kommt dadurch zustande, weil es eine Sensorkinase und einen responseregulator
gibt. Es gibt also 2 Komponenten, deswegen "two-compoments-system" für die Signaltransduktion.

6.Vorlesung
Gerichtete Bewegung im Bezug zu einer Reizquelle:
Bakterien haben ca. 5 verschiedene Taxis-Systeme.
Können sich dann entweder hin oder zu der Quelle bewegen. wie machen sie das aber?
-> Chemorezeptoren (=Chemosensorische Proteine)
Wenn die Flagellen gegen den Uhrzeigersinn rotieren, dann bündeln sie sich und es kommt zu einem
"run"=> Bakterien schwimmen gerade aus. In einem konstanten Wechsel drehen sich dann plötzlich
In den Uhrzeigersinn und es kommt zu diesem "tumbling", also sie taumeln rum.
unter homogenen Bedingungen ist immer ca. 1sec run und 0,1 sec taumeln, ohne irgendwelche
Wahrnehmung von außen.

Chemorezeptorproteine:
Elektronenmikroskopische Aufnahme
- unten "Array" von Chemorezeptoren, sie sitzen in der cytoplasmatischen Membran. -> Diese
Rezeptoren sitzen in der Cytoplasmatischen Membran

In der CM (=Cytoplasmatische Membran) sitzen die 5 verschiedenen Rezeptorproteine. Alle diese

Sensorkinasen wirken auf das CheW/ CheA System und führen dann einerseits zur Kontrolle der
RICHTUNG (nicht der Geschwindigkeit) der Flagellenrotation, und andererseits kommt es zu einer
Adaptierung an den Liganden oder das Molekül das hier eben wahrgenommen wird.
Hier sieht man das Ganze auf einer Softagarplatte (hat nur 0,5% Agar Anteil, dadurch sind mit Wasser
gefüllte Kanäle in der Platte durch die dann die Bakterien schwimmen können): Die hellen Punkte=
da hat man die Bakterienkultur aufgetragen, und man sieht da, dass sich die Bakterien in der Platte
so richtig ausdehnen.
Wie kann man sich die Modallität anschauen?
-> das wäre so ein Capillar Assay. Aus dieser Kapillare kommt die Glucose und wie man sieht: die
Bakterien schwimmen richtig an diese Kapillare zu.

Chemotaxis:
Externer Stimulus: Entweder ein Lockmittel oder ein Prepellent, und bindet an die Sensorkinase und
dadurch kommt es dann zur Phosphorelierung von CheA (in dem Sinn die Histidin Kinase und das ist
der Unterschied auch zu anderen Kinasen ->CheA bildet somit die Kinasendomäne ist aber ein
eigenständiges Protein. Dieses Phosphat wird dann am CheY übertragen (CheY ist der Response
regulator in diesem System). CheY ist das Protein das dann mit dem Motor des Flagellums in
wechselwirkung tritt (in seiner phosphorelierten Form) und dann eine Rotation (=Taumeln) im
Uhrzeigersinn bewirkt.
CheZ= Phosphatase die dephosphoreliert und somit das Taumeln wieder auflöst.
ANdererseits phosphoreliert CheA auch CheB (CheB ist eine Methylesterase).
CheR (=Methyltransferase), CheR methyliert diesen Rezeptor und reduziert somit auch die Affinität
für die Moleküle.
D.h. unterm Strich: Es kommt dazu, dass die Rezeptormoleküle bzw. die Sensordomänen immer
diesen Konzentrationsgradienten füllen können. Also je näher das Bakterium der Quelle (zB Zucker)
kommt, irgendwann ist ja die Sensordomäne blockiert, weil einfach die Zuckermoleküle binden =>
d.h die Bakterien können die erhöhte Konzentration eigentlich nicht mehr messen, und um das zu
gewährleisten, werden diese Moleküle methyliert, dadurch wird die Konformation geändert, und die
Affinität ist nicht mehr so hoch, d.h. die Zuckermoleküle binden nur wenn die Konzentration höher
wird. Also die Sensordomänen werden desensibilisert.
Um das dann wieder Rückgängig zu machen gibt es CheB.
Änderung der Rotationsrichtung der Flagellen.
Die Geschwindigkeit der Rotation ist vom Protonenfluss abhängig (=protonmotive force), und kann
überdieses Sytem nicht gesteuert werden, nur die Richtung!

Chemorezeptorproteine:
hier: Sensor Domäne, die transmembranhelices (in der Cytoplasmatischen Membran), dann die
HAMP Domäne (also die 4 einfach Helices die sich unterschiedlich anordnen und deren Konformation
geändert wird durch die Bindung eines Stimulus. Diese HAMP Domäne gibt dann über
Konformationsänderung Information weiter.

Chemotaxis zu einem Lockstoff:

Wie funktioniert das System, wenn ein Lockstoff gebunden wird?
In dem Moment wo die Zelle auf einen Lockstoffquelle zuschwimmt und einen Lockstoff bindet,
ändert sich die Konformation über die HAMP Domäne-> Die Phosphorelierung von CheA kann jetzt
nicht mehr stattfinden=> somit wird CheY durch CheZ dephosphoreliert (dieser Mechanismus findet
dann konstant statt) und der Flagellenmotor dreht sich gegen den Uhrzeigersinn! D.h. das
Schwimmen wird VERLÄNGERT. Es wird im Prinzip nur das Taumeln reduziert und somit das
Schwimmen verlängert.
Unter den gleichen Bedingungen kann jetzt CheR diese Region methylieren-> d.h. durch die
Methylierung word diese Bindung insensitiver, der Zucker kann erst wieder binden, wenn die
Konzentration sich erhöht.
In dem Moment wo da kein Zucker mehr gebunden ist, die Zelle in die andere Richtung schwimmt,
oder überhaupt der Zucker verschwunden ist, kommt jetzt CheB zum Einsatz und entfernt wieder die
Methylierung wodurch die Sensibilität für den Lockstoff wieder heruntergeht und es auch schon bei
niedrigeren Konzentrationen von diesem Lockstoff zu Interaktionen kommt und der ganze
Mechanismus wieder von vorne beginnt.
Chemorezeptoren sind immer als Dimere in der Membran angelagert und funktionieren als Dimere.
Die Konformation eines Methylacceptingchemotaxisprotein, das normalerweise einen Lockstoff
wahrnimmt. In Abwesenheit eines Lockstoffes: CheA wird phosphoryliert -> dieses Phosphat an CheY
weitergegeben wird-> CheY am Flagellenmotor bindet und es kommt zu diesem regulatorischen
Schwimmen und Taumeln. Also unter diesen Bedingungen geht das sehr periodisch in dieser 1 sec
und 0,1 sec vonstatten.
Also es ist einerseits eine Wahrnehmung (ein Sensingsystem) , und andererseits eine
desensibilisierung des Methylacceptingchemotaxisproteins drinnen, um zu gewährleisten, dass
ansteigende Konzentrationen dagegeben werden können.
Bei einem Repellent würde das ganze System genau umgekehrt funktionieren weil ein repellent
würde diese Situation (wo CheY phosphoryliert wird) die gebundene Version darstellen.

Quorum Sensing:
Quorum sensing= die Bakterien müssen wissen "wieviele sind wir und wie viele sind um mich herum
von meiner eigenen Art?", "hat es überhaupt Sinn dieses Antibiotikum zu produzieren?". Der
pathway der dahinter steht nennt sich Quorum sensing.
=> Bakterien schauen nach "ist mein Quorum vorhanden?", (Quorum definiert die Menge an
Individuen die eine Abstimmung machen dürfen)
Quorum sensing wurde entdeckt durch diesen kleinen Squid, dieser Tintenfisch hat ein Leuchtorgan
hinter den Augen=> Symbiose mit Bakterien.
Der Tintenfisch ist damit unsichtbar für seine Beute, da er unter dem Mondlicht keinen Schatten
mehr wirft.
Wachstumskurve von Fisheri.
Am Anfang: Lichtemission sehr gering. Dann: Induktion der Lichtemmision (in der späten stationären
Phase).
-Lichtemmison weil "wir sind zu viele".
Die Zellzahl misst man mit der Konzentration von Botenstoffen.
Überprüfung ob die Bakterien Botenstoffe abgegeben haben: In einem Medium wo die
Konzentration schon erreicht ist, zentrifugieren alle Zellen ab bis das Medium steril und frei von
Zellen ist, und dann werden frische Zellen in diesem Medium angeimpft (zusammen mit frischem
Medium). Man impft also die Zellen in einem Konditionellen Medium an.
Hier: 2 verschiedene Kulturen und deren optische Dichte.
Oben: angeimpft mit dem Überstand von vorher.
unten: in einem komplett frischen Medium.
-man sieht, dass die Lichtemission im alten Medium sofort weitergeht.
Im neu angeimpften Medium passiert das nicht, erst zu einem gewissen Zeitpunkt.

V. fischeri schwimmt im Meer herum und die Menge an fischeri schwankt zwischen 10-10.000/ml.
Fischeri kommt dann über die Tentakel in dieses Leuchtorgan hinein und die Innenwand es
Leuchtorgans stellt die Bedingungen dar, die verhindern, dass andere Bakterien sich darin
kolonialisieren. V. fischeri kolonialisiert dieses Organ und nach ca. 8-10 Stunden erreicht die Zellzahl
10hoch11 pro ml. Wenn diese Konz. erreicht=> Leuchten.
Symbiose zw. Tintenfisch und Bakterium. (Fischeri hat eigene Nische und Squid wird unsichtbar).
Licht hat die gleiche Wellenlänge wie das Mondlicht.
Er spukt in regelmäßigen Abständen einen Teil der Bakterien wieder aus => hält den Kreislauf in
Schwung. Dadurch können junge, frisch geschlüpfte Tintenfische solche Bakterien kriegen. Außerdem
kann er so in Zeiten wo kein Mond scheint sein Licht runterregulieren.
Erst wenn eine gewisse Konzentration erreicht worden ist, kommt es zu einer Induktion des
Leuchtens.

Das System funktioniert so:

LuxI synthetisiert die Signalmoleküle. Diese Moleküle können durch die Membran ganz schnell nach
außen diffundieren. Und das müssen sie auch, denn wenn diese Moleküle in der Zelle bleiben
würden, würde es direkt eine Aktivierung des respons regulators geben.
Die Moleküle sind jetzt nach außen diffundiert, und können erst bei einer Konzentration von 10nM
wieder durch die Membran hineindiffundieren. Wenn sie hineindiffundieren binden diese Moleküle
direkt an LuxR (den Transkriptionsfaktor). LuxR bindet an den Promotor von dem Lux Operon. Das
Lux Operon wird transkribiert und translatiert und es kommt dann zur Emission von Licht.

Das Luxoperon:
alle Enzyme die in dieser Cascade beteiligt sind, sitzen in einem Operon, werden also als eine mRNA
synthetisiert. Dort sind jetzt diese 5 Gene lokalisiert. So wird also abgesichert dass dieses Operon nur
zu diesen Zeitpunkt exprimiert wird und dass die verschiedenen Komponenten in den richtigen
Konzentrationen zueinander vorhanden sind, manche sind transkriptional und translational
zueinander gekoppelt.
A und B= Komponenten für die Luciferase.
C= reductase
D= Synthease
E= Transferase
-Durch A+D+E: Fettsäuren werden zu aliphatischen Aldehyden reduziert, und diese werden dann von
Lux A und B (also das Enzym ist ein heterodimer, weil 2 verschiedene Untereinheiten). Die Luciferase
katalysiert dann die oxidation von FMNH2 mit diesen alipatischen Aldehyden und daurch wird Licht
bei einer Wellenlänge von 490nm emmitiert (=wie Mondlicht)

Wenn LuxR noch die Expression von LuxI induziert => POSITIVER Feedback loop.
=> Dadurch wird noch mehr LuxI expremiert, dadurch wird die Synthese noch mehr angekurbelt =>
Boost von Acetylhommorrinlactome.

Autoinucer:
In Gram +: Modifizierte Oligopeptide: Kleine Peptide die zirkularisiert sind oder iwi anders modifiziert
sind.
Diese Peptide können nicht diffundieren, dafür aber andere Systeme.
Das Peptid wird in der Zelle synthetisiert. Es ist hier ein Transportprozess.
Die Peptide müssen exportiert werden. Meistens ist aber der finale Prozessierungsschritt der dieses
Peptid in seine aktive Form bringt, passiert während des Transports. Also der Transport ist auch der
letzte Prozessierungsschritt.
Wenn das Propeptid in der Zelle bleibt ist es inaktiv. Es wird dann exportiert und prozessiert und
bindet somit entweder an die Histidinkinase (2 Komponeneten System) oder es wird dieses
Propeptid sekretiert und prozessiert und wieder selektiv nach innen transportiert und Bindet dann an
einen Rezeptor.
In Gram -: Als diffusionfähige Moleküle: Diffundieren nach außen und wieder in die Zelle hinein und
binden an den Rezeptor

Quorum sensing in Gram+: Staph. Aureus:

Möchte auch wissen "sind wir genug um jetzt Virulenzfaktoren zu sezenieren"?
Hier haben wir wieder ein Operon, in welchem die verschiedenen Sensorkinasen sitzen.
Einerseits agrB oder agrC.
Das Prozessierungsenzym sitzt in der Membran. Das Exportprotein wird synthetisiert uns
transportiert. Während des Transport wird es modifiziert. (Wir haben diese zirkularisierung und auch
prozessiert) Es werden also im terminalen Stücke abgeschnitten.
Das aktive Peptid bindet jetzt an die Sensorkinasen agrC und phosphoreliert den Responseregulator
agrA und dieser bindet jetzt an diesen 2 Promotoren, und aktiviert sie (von hier gibts wieder diesen
positiven Feedbackloop) die Expression dieses Operon wird induziert und andererseits wird die
Transkription von RNAIII (ist eine regulatorische RNA) wird stimuliert.
RNAIII: Diese RNA hat jetzt verschiedene Bereiche -> bilden dann targed mRNA aus und dann werden
die virulenzfaktoren synthetisiert und die Expression von cell adhesion proteins reduziert wird
Pseudomonas Aeroginosa:
=Pathogen bei Cystischer Fibrose Patienten, das kolonilaisiert sich in den Lungen an -> viel Schleim in
der Lunge.
-Pseudomonas bildet sogennatne Biofilme aus. D.h. zuerst lagern sich wenige Bakterien an die
Epithelzellen an-> es bilden sich Mikrokolonien, und wenn die Konzentration hier durch Quorum
sensing hoch genug ist, dass es Sinn macht diese Biofilme auszubilden, wird dann ein Polysaccharid
(=Biofilmmatrix) gebildet und dadurch können die Zellen darin solche Gebilde bilden die dann bis zu
80mykrometer in Höhe sind. Genau diese Biofilme machen es dann so schwer-> dass Immunsystem
kommt daran nicht mehr dran und auch Antibiotika kommen nicht mehr an die Zellen dran. Diese
Polysaccharide sind also der Schutz für Pseudomonas. Viele Tote jedes Jahr.
Das Interessante an Pseudomonas ist, dass die Systeme viel komplizierter sind als z.B. E-coli.
Zur Ausbildung eines Biofilms (um das Quorum u bestimmen) gibt es 2 verschiedene Systeme:
es sind 2 verschiedene Homoserin Lactone:
Einerseits das LasIR Sytem und dann noch das RhIIR System.
Welchen Voteil aber bringt diese Kombination aus 2 verschiedenen QS-Systeme für Pseudomonas?
-> das eine System ist nicht nur ein backup System fürs andere, sondern sie interagieren auch: in dem
Moment wo das LasIR autoeniuser sezeniert und wiederaufnimmt, der Regulator jetzt wieder aktiv
wird. LasIr bindet einerseits an das Las regulon, andererseits aktiviert er aber auch RhIIR => d.h die
sind voneinander abhängig. Welche Konsequenz hat das aber für die Zellen?
-> es sind 2 verschiedene response regulatoren, die sich aber durch eine Zeitcascade
unterscheiden=> Pseudomonas kann somit auch zeitlich aufeinander abgestimmt oder nacheinander
gewisse Gene exprimieren.
Und wir haben auch 3 Klassen von Genen: das eine das nur durch Las System reguliert werden kann,
eines das nur durch das Rhl System reguliert werden kann und eines das von beiden die
Transkriptionsfaktoren braucht um exprimiert zu werden. Also man hat wesentlich besseres
findtuning der Expression von Virulenzfaktoren in der Biofilmmatrix.
Was wird in diesen Systemen expremiert?
->PQS-System= Das ist ein Quinolone Signal, dass die Immunantwort der Wirtes supprimieren kann.
Einerseits Elastase (für den Biofilmaufbau), anderseits Cyanide, Pyocyanin und Chitinasen als
Virulenzfaktoren.
Also durch diese Systeme kann die Virulenz auf das Quorum abgestimmt werden.

Quorum nicht nur Kommunikation der eigenen Art sonder auch Kommunikation zwischen versch.
Spezies.
LuxS kommt in 50% der bekannten Bakterien vor.

Plaque auf Zähnen: Biofilm der aus ganz vielen verschiedenen Bakterien besteht, und über dieses
System kommunizieren die auch miteinander und bauen einen gemeinsamen Biofilm auf. Wobei
auch jedes Bakterium in diesen Film eine gewisse Aufgabe hat.

Vibrio Harveyi:
Er hat verschiedene Moleküle. Zur Aufnahme des Signals haben wir in der inneren Membran
Sensorkinasen sitzen und zusätzlich ein periplasmatisches Bindeprotein (LuxP) das bindet dann den
Autoinducer 2 und erst dann bringt es den autoinduser zur Sensorkinsase.
Diese Sensorkinasen sind jetzt in Abwesenheit der Moleküle (also wenn Quorum noch nicht gegeben)
keine Sensorkinasen sondern nur Kinasen. D.h. sie phosphorylieren sich und sie phosphorelieren
auch einen responseregulator , es kommt also zur Phosphorylierung von LuxU -> dieses überträgt
sein Phosphat auf LuxO-> Phosphorylierung von LuxO, und dieser Response Regulator stimuliert jetzt
zusammen mit einem Sigma Faktor die Synthese von kleinen RNA´s (sRNAs) und einem Molekül
(Hfq). -> und dort wo die Ribosomen an der mRNA binden wird die mRNA blockiert=> keine
Translation => Degradierung der mRNA.
=>Keine Lichtemmission!
Wenn das Quorum gegeben ist, und die Menge der Autoinducer hoch ist, ändert sich die Aktivität der
Sensorkinasen, und es sind keine Kinasen mehr, sondern Phosphatasen!
=> Responseregulator wird dephosphoreliert, die Synthese der kleinen RNA´s kann nicht stattfinden
=> Translation von LuxR jetzt erlaubt => LuxR kann die Expression des Operons stimulieren und es
kommt zur Lichtemission.

Stören der Kommunikation „Quorum quenching“:

Stören zwischen Prokariot und Prokariot, die einen wollen nicht, dass die anderen sich hier ansiedeln.
D.h. wenn sie die Kommunikation stören, kann die 2. Spezies nicht wissen wie viele sie sind =>
dadurch werden z.B. keine Virulenzfaktoren ausgebildet.
Bacillus hilft sich somit um sich gegen Gram- zu wehren. Er segregiert eine AHL-Lactonase-> d.h. der
Lactonring wird gespalten => das autoinuser Molekül kann so nicht mehr an den Responseregulator
binden (auch wenn es wieder hineindiffundiert nicht) und die Kommunikation wird gestört.
Bei Ralstonia ist es ähnlich, es ist nur ene AHL-Acylase.
Also Bacillus und Ralstonia inhibieren das Quorum sensing von Gram negativen Bakterien.
Variovorax hat ein anderes System, er degradiert AHL aber er verwertet das sofort als Energie und
Nahrungsmittelquelle.

Wenn Pathogene Bakterien uns infizieren, dann brauchen sie auch dieses Quorum sensing System
um die Virulenzfaktoren einzuschalten.
Auch Epithelzellen sezernieren AHL-Lactonasen und somit das Quorum sensing von Pseudomonas
unterbrechen und somit diese Kolonialisierung reduzieren.
-> Man forscht daran dieses System auszunutzen um Virulenzfaktoren/Biofilme zu reduzieren.

7.Vorlesung
Differenzierung bakterieller Zellen:
Die Bakterien im Biofilm können schwimmen und sich bewegen aber in dem Moment wo sie sich am
Biofilm anheften, verlieren sie diese Funktion - sie sind dann inmotil. Sie bilden die Flagellen zurück,
und differenzieren sich somit von Planktonischen Zellen zu angehefteten, inmotilen Zellen. Diese
beginnen dann mit der Produktion dieser Exopolisacchariden Schleimschicht und reifen zu diesen
Biofilmen heran. Erst wenn der Biofilm eine gewisse Größe bekommt, beginnen sich diese Zellen sich
wieder zu dfferenzieren, und aus diesen sessilen Zellen im Biofilm entstehen an der Oberfläche diese
Planktonischen Zellen, bilden wieder Flagellen aus und differenzieren sich wieder zu schwimmenden
Bakterien.
Deswegen hier auch quorum sensing: denn nur unter bestimmten Bedingungen in einer kritischen
Masse ist man entweder sessil und bildet diesen Biofilm aus oder man ist planktonisch und somit
abzusichern, dass Bakterien neue Oberflächen besiedeln können und wiederum zu Ausbildung eines
Biofilms führen.
Und genau das ist für cystische Fibrose Patienten ist das gefährlich, denn diese Planktonischen Zellen
machen es sehr schwer Lungentransplantationen durchzuführen, denn auch die neuen Lungen
werden wieder sehr schnell besiedelt.

Bacillus subtillis.
Unter großen Stressbedingungen bzw. unwirklichen Bedinungen können viele Bakterien Sporen
ausbilden. D.h. sie schrauben ihren Metabolismuns komplett zurück und es kommt zu einer so
genannten Cryptobiosis und diese Sporen können Jahrtausende überstehen und sind sehr resistent
gegen alle Einflüsse von Außen.
Der Lebenszyklus von subtillis:
Unter guten Bedingungen ohne Stress: ganz normale Zellteilung
Wenn dann aber die Bedinungen schlecht werden, dann kann eine asymmetrische Zellteilung initiiert
werden. Dabei wird an einem Pol die Vorspore gebildet und diese Forespore wird von der
Mutterzelle umhüllt und freigelassen. Wenn sich die Bedingungen sich wieder ändern, kann diese
Spore wieder auswachsen.
Diese Sporen brechen das Licht ganz anders als vegetative Zellen und das kommt daher weil diese
Zellen fast komplett dehydriert sind (es ist kaum Wasser drinnen).
Asymmetrische Zellteilung -> die Spore bildet sich an einem Ende der Zelle.
Die Sporulation beginnt erst, wen die Zelle eine gewisse Dichte hat. Das Wachstum der Zelle wird
eingestellt.
Diese Sporen sind schon lange bekannt. Der erste der diese Sporen gesehen und gezeichnet hat war
Ferdinand Cohn. Er hat schon 1876 Untersuchungen zur Sporulation gemacht.

Endosporen:
Aufbau von Innen nach Außen:
Die DNA bleibt erhalten. Sie ist im Cytoplasma vorhanden. Das Cytoplasma ist extrem kondensiert
und stark entwässert. Einige wenige Enzyme bleiben im Cytoplasma aber erhalten. Also einige
essentielle Enzyme und Ribosomen bleiben ebenfalls im Cytoplasma erhalten (denn Proteinsynthese
muss sofort starten können).
Dann folgen einige Schichten die die Spore schützen. Der Cortex besteht aus der Peptidoglycanhülle
des Bakteriums (Gram + haben ja eine sehr dicke Peptidoglycanschicht) und diese doppelte
Peptidoglycanhülle zwischenden Membranen, es ist eine entwässerte Form der Muraminsäure,
beschützt das Cytoplasma.
Dann gibt es den Coat, dieser Coat ist eine stark Proteinhaltige Schicht. In der Mutterzelle werden
diese Proteine während der Sporulation synthetisiert. Es laufen dann verschiedene Programme in der
Mutterzelle und in der Zelle die dann zur Spore wird ab.
Während sich die Spore ausbildet, produziert die Mutterzelle Proteine, die über ein spezielles Enzym
an die Membran gebracht werden und diese Membran umschließt dann die Spore. Diese Membran
ist ja dicht bepackt mit Proteinen. Das ist dann im Endeffekt der Coat.
Zum Schluss gibt es dann noch das Exosporium (ist eine doppelte Membran). Und in dieser Membran
umschließt die Mutterzelle die Spore und daher ist es eine doppelte Membran.
Eigenschaften der Endosporen:
Die DNA muss diese Zeitspanne in der Spore überdauern.
In den vegetativen Zellen haben wir normalerweise die B-Form der DNA, die die aktive Form ist, diese
B-Form ist aber sehr sensibel, vor allem für Hitze und Radioaktive Strahlung, und um diese DNA zu
schützen, gibt es die "Small Acid Soluble Proteins" (SASPs). Das sind kleine Peptide, von 60-73
Aminosäuren in Länge, und diese binden an die DNA und bringen die DNA von der B-Form in die A-
Form. Und diese A-Form ist sehr viel resistenter und stabiler unter Bedingungen in denen die Sporen
überdauern können. Das ist ein Mechanismus in dem die DNA geschützt werden kann.
Der Sporulationsfaktor IVA (4A), bringt die synthetisierten Proteine zur Membran und somit wird
eine richtige Proteinschicht ausgebildet.
Ein wichtiges Molekül in der Sporulation ist die Dipicolinsäure. Sie ist nur in den Sporen vorhanden.
Diese bildet ein Chelat mit Calcium -> also während der Sporulation wird viel Calcium aufgenommen,
und durch diese Quervernetzung und diesen Komplex wird das Wasser verdrängt und diese Spore
wird extrem dehydriert.
Wenn die Bedingungen es wieder erlauben, und es wieder zur Gerulation kommt, wird die
Dipicolinsäure zusammen mit dem Calcium exportiert, d.h. es wird ausgeschieden und somit kann
das verdrängte Wasser wieder ersetzt werden, es kommt also wieder zur Rehydrierung.
Die Dipicolinsäure ist wirklich nur ganz spezifisch für Sporen.

Natürliche Kompetenz oder Sporulation?:

Wie kommt es aber zur Ausbildung einer Spore? Welche Signale?
-> Quorum Sensing; Die Sporulation hat nur einen Sinn wenn die Population groß ist, und auch nur
unter speziellen Bedingungen wird die Sporulation initiiert.
Es ist hier eine Cascade mit dem Quorum sensing (in Gram+): Es ist hier ein Peptid (ComX), dieses
Peptid wird in der Zelle zu einem Propeptid synthetisiert (=hat also eine endterminale Signalsequenz)
und wird über ComQ hinaustransportiert und gleichzeitig prozessiert, also der Endterminus wird
entfernt. ComX, wenn die Konzentration an der Außenseite groß genug ist, bindet an die
Sensorkinase ComP. ComP wird dann autophosphoreliert und dadurch wird ComA phosphoryliert,
und wie der Name schon sagt, führt diese Regulationscascade zur Kompetenz. Also viele Gene die für
die Kompetenz notwendig sind werden eingeschaltet. D.h. dieser Regulationsmechanismus ist
einerseits für die natürliche Kompetenz zuständig und andererseits hat er auch einen Effekt in der
Sporulation.
Was ist jetzt natürliche Kompetenz? Die natürliche Kompetenz ist eine Eigenschaft von Gram+
Bakterien, dass sie fremd DNA aufnehmen können. (Gram- haben diese Eigenschaften nicht, im Labor
werden sie dann zuerst kompetent gemacht). Aber Bacillus ist eh Gram+.

Wie schaut der Mechanismus aus der diese Kompetenz verleiht?

Hier außen ist diese dicke Peptidoglycanschicht. Und unten (türkis) in diesem Kompetenzklaster sind
die Gene für die Major und Minor Pseudopilins, und diese werden über dieses Membranprotein,
durch die Innere Membran transportiert und über die Komplexe ComP und ComA wird ein
Pseudopilus synthetisiert, das funktioniert ähnlich wie in den Transportsystemen, auch hier haben
wir ATPasen die für den Transport zuständig sind (ComC ist auch für die Prozessierung des Propilins
zustndig). Dieser Pseudopilus ist jetzt die Atachement-side für DNA, also wenn in der Umgebung der
Bakterien Doppelsträngige DNA herumschwimmt, hat diese DNA eine sehr hohe Affinität für diesen
Pseudopilus, und über den Pseudopilus wird die DNA in diesen ATP-Transporter kanalisiert. Dieser
Transporter dreht jetzt die Doppelhelix auf und es wird nur ein Einzelstrang in die Zelle
hineintransportiert.
Was ist der Vorteil für Bacillus DNA aus der Umgebung aufzunehmen? -> Er kann sie Verdauen.
Bacillus kann die DNA verdauen.
Man kann die DNA wieder in die Untereinheiten aufspalten, und er kann die Moleküle in den eigenen
Metabolismus einfließen lassen. Also einerseits ist sie ein Nahrungsmittel, andererseits dient sie als
Template um eigene Fehler zu reparieren. Es kann aber auch zur genetischen Diversität beitragen,
indem Informationen von anderen Bakterien aufgenommen werden, wie z.B. Antibiotikaresistenzen.
- Welches Problem stellt sich aber der DNA wenn da Fremd DNA reinkommt?
-> normalerweise wird fremde DNA sofort abgebaut, doch hier ist sie einzelsträngig und wird somit
vom Restriktionssystem der Zelle nicht erkannt.

Signaltransductionscascade:
Es gibt neben dem Competenzsystem ein zweites System, (ein 2. Quorum sensig System), und dieses
Quorum sensig System hat diesen CSF (Competents and Sporulation factor) als Quorum sensing
Molekül, es ist wieder ein kleines Peptid, das in der Zelle zu einem Pre-Peptid synthetisiert wird.
Dieses wird ganz normal über den Sec-Kanal nach Außen transportiert. Es gibt sogar 2 Vorstufen, das
Pre-Pro-CSF-Peptid. Das in grün eingezeichnete ist das Signalpeptid, das durch die Signalpeptidase
abgespalten wird. Und dann gibt es noch das Pro-CSF und eine spezifische Protease, die nur dazu da
ist aus dieser Vorstufe des Quorum sensing Peptids das Oppture CSF zu machen.
Das CSF wird nicht als Signal in die Zelle über eine Histidinkinase weitergeleitet (so wie ComX),
sondern hier haben wir einen Oligopeptid-Transporter der spezifisch das Molekül wieder in die Zelle
hineinpumpt. Und hier ist es sehr wichtig, dass das Pre-Peptid (das ist ja die inaktive Form) nachdem
es nach direkte Interaktion wieder Aktivität aufzeigt, und nicht nur das Signal aufzeigt, muss natürlich
unterscheiden werden zwischen dem aktiven Peptid und dem neu Synthetisierten das nach Außen
muss. Also dieser Schritt ist sehr wichtig, damit die Zelle differenzieren kann "wird das synthetisiert
oder ist das was von Außen?".
Dieses CSF Molekül, dieses Peptid, hat jetzt verschiedene Aufgaben. Diese Aufgaben unterscheiden
sich nur in der Konzentration dieses Moleküls, welches sie dazu bringt verschiedene Aufgaben zu
erfüllen.
RapC ist ein Regulator (ein Transkriptionsregulator, ein Transkriptionsfaktor) der einerseits die
Synthese von ComA (=Responseregulator) inhibiert und somit die Initiierung der Kompetenzcascade
der natürlichen Kompetenz inhibiert. Wenn jetzt die Menge an diesem Molekül niedrig ist, dann wird
RapC blockiert/inhibiert.
Erhöht sich aber die Konzentration von diesem Molekül, dann hat das Molekül eine Affinität zu der
Histidinkinase und blockiert diese. Wenn die Histidinkinase blockiert ist, dann ist der ganze Weg zur
Kompetenz auch blockiert. -> In dem Moment wo die Kompetenz blockiert ist, bindet das Peptid an
RapB (=Responseregulator), er wird inaktiv, und dadurch bleibt die Phosphorelierung des
Sporulationsfaktors Spo0F und die Sporulation wird initiiert. D.h. ausschlaggebend für die Kompetenz
ist also die Konzentration des ERGMT (Kompetenz und Sporulations Faktor).
Unter niedriger Konzentration kommt es zur Ausbildung der Kompetenz, erhöht sich die
Konzentration wird die Kompetenz inhibiert und über diese Cascade die Sporulation initiiert.

Der Lebenszyklus von B. Subtillis:

Wir sind hier ganz am Beginn der Sporulation, wo das Signal zur Sporulation gegeben ist.
Einerseits kriegt die Zelle das Signal über das Quorum sensing, und andererseits bekommt die Zelle
ein Signal wegen einer Verhungerung -> dann kommt es zur Phosphorylierung von Sensorkinasen.
Diese Signale, die diesen Phosphorelate stimulieren, sind bis heute nicht wirklich identifiziert-> Im
Labor haltet man die Zellen einfach in ein Minimalmedium damit sie verhungern (um Sporulation zu
initiieren) und als 2. trigger wird Mangan hinzugegeben. Wieso Mangan? -> Magnesium ist essentiell
in der Zelle, und Mangan ersetzt Magnesium in der Zelle und dann kommt es einerseits zu
Konformationsänderungen in Proteinen, Enzymen und in der RNA und dadurch wird die Zelle einem
extremen Stress ausgesetzt. Dieser Stress führt zur Phosphorylierung der Kinasen.

Induktion der Sporulation: Aktivirung von Spo0A:

-das alles (diese Cascade) führt zur Phosphorelierung des Masterregulators der Sporulation Spo0A,
und der Transkriptionsfaktor, gemeinsam mit dem Sigmafaktor H, das zusammen initiiert die
Transkription von weiteren Sporulationsfaktoren.
Spo IIE (2E) bindet an FDSZ, repositioniert FDSZ von der Mitte an die Pole und führt somit zur
Asymetrischen Teilung => es kommt zur Septumbildung an den Polen.

Symmetrische Teilung:
in einer vegetativen Zelle sind 2 verschiedene Systeme um FDSZ genau an die Mitte der Zelle zu
positionieren, einerseits den MinCB-Gradienten, der durch die Oszillation und Ablösen der Membran
und wieder Anheften an die Membran diesen Konzentrationsgradienten ausbildet und somit sich
FDSZ sich nicht an die Pole anlagern kann.
Und andererseits gibt es das Nucleotid-occlusion-System wo spezielle Proteine an die DNA anlagern
(in Bacillus ist es NOG) und verhindert, dass FDSZ sich in der Polregion anlagern kann.

Asymmetrische Teilung:
Während der Asymmetrischen Teilung, die dann zur Sporulation führt, gibt es einen Faktor (SpoIIE),
und der bindet direkt an FDSZ -> führt zur Repositionierung von FDSZ. Zunächst bildet sich so eine
helicale Form von FDSZ aus. Durch die Repositionierung bilden sich 2 Z-Ringe an den Polen aus und
an dem Ring wo mehr FDSZ gelagert ist kommt es zur Ausbildung der Einschnürung (Septum) des Pols
und der Prä-Spore.

Pre-Spore chromosom segregation:

Wie schaut es mit dem Chromosom aus?
- In der veg. Zelle sieht man das replizierte Chromosom.
- In der Asymmetrischen Zellteilung kommen wieder versch. Sporulationsfaktoren, die sich direkt an
den origin of reclipation anlagern, und dann zu einer Polaren Verankerung des Chromosoms führen
(bei den veg. Zellen ist die Anlagerung in der Mitte, die dann mit der Tochterzelle nach außen
wächst). In der Mitte des Septums sitzt SpoIIIE (3E) (=DNA Transporter) und übernimmt während der
Sporenbildung die Funktion von FdsK (=die DNA Pumpe, die in der veg. Zelle, die Chromosomen in
die Tochterzellen transportiert) -> DNA wird so in die Prä-Spore transportiert.
Nachdem die Spore vollkommen ausgebildet ist, beginnt, ein unterschiedliches Programm
abzulaufen. Einerseits ein transkriptionelles Programm für die Spore, und ein transkriptionelles
Programm für die Mutterzelle. Unter diesen Bedingungen hat ja jeder seine eigene Aufgabe, in der
Mutterzelle werden die Proteine synthetisiert die dann in den Code eingebaut werden und dieses
Umlagern beginnt, und in der Prä-Spore müssen viele Dipicolinsäuren synthetiert werden usw.
-> Also wird die Genexpression unterschiedlich ablaufen.
Wie können die Zellen aber das dann regulieren, wenn das plötzlich aufgeteilt wird? -> Durch
Alternative Sigma-Faktoren!
Diese sind in der Spore und in der Mutterzelle aktiv, und diese kommunizieren miteinander und
koordinieren so die Genexpresion der Spore und der Mutterzelle.

Transkription:
Die RNA-Polymerase (ist für die Transkription verantwortlich) erkennt den Promotor und bindet an
den Promotor, dann öffnet sie die DNA uns synthetisiert dann die RNA. Es gibt unterschiedliche
Promotoren, für unterschiedliche Bedingungen, also muss die Affinität der Polymerase auch
differenziert werden für diese unterschiedlichen Promotoren, und diese Affinität der RNA-
Polymerase wird durch den Sigma-Faktor definiert. In der Zelle gibt es ganz unterschiedliche Sigma-
Faktoren, die unter verschiedenen Bedingungen exprimiert werden, und diese Sigma-Faktoren
kompetitieren um ihre Bindungsstelle an der RNA-Polymerase und definieren die Affinität der RNA-
Polymerase.
Der Sigma-Faktor hat 4 verschiedene Domänen, und diese Domänen lagern sich dann an die versch.
Regionen (an die -35, -10 Region, am Discriminator) an.
In der Sporulation ist es in erster Linie der Sigma-Faktor H, zusammen mit Spo0A. Diese
Sigmafaktoren sind eben die aller Ersten. Dann werden die Sigmafaktoren E und F synthetisiert, aber
in der Zelle bevor die Zellteilung stattfindet. D.h. zu diesem Zeitpunkt müssen die beiden Sigma-
Faktoren noch inaktiv sein weil die sind dann spezifisch für die Transkription einerseits in der
Mutterzelle (Sigma E), und Sigma F für die Transkriptionscascade in der Spore zuständig.

Hier die Situation vor der Zellteilung:

In rot das Kompartiment der Mutterzelle, in grün das Kompartiment der Forespore. Mit Hilfe von
SigmaH und Spo0A werden die 2 Sigma Faktoren synthetisiert, entweder in Form eines Pro-Sigma-
Faktors, (der Sigmafakor ist länger und dadurch dass er eine Extention hat, ist er inaktiv und der
Sigma Faktor muss erst prozessiert werden, d.h. geschnitten werden auf seine aktive Länge).
In der Forespore, bzw mit SigmaF ist das ganze komplizierter, denn er ist noch mit dem Anti-Sigma-
Faktor gebunden. Also ein Protein bindet noch am Sigma-Faktor und inaktiviert ihn so.
-> wie aktiviert man ihn?
- es gibt einen anti-anti-Sigma-Faktor. D.h. dieses Protein wird synthetisiert und es hat eine höhere
Affinität für den Sigma-Faktor, als der Anti-Sigma-Faktor zum Sigma-Faktor. D.h. der anti-anti-Sigma-
Faktor titriert SpoIIAB weck von sigmaF und entlässt so sigmaF => SigmaF wird aktiv und bindet an
die RNA-Polymerase und führt einerseits zur Expression von best. Proteinen die für die Ausbildung
der Hülle (für die Umschließung der Forespore) wichtig sind, und andererseits gibt der aktivierte
Sigma Faktor ein Signal durch die Membran zur Mutterspore. Es kommt dann zur Synthese von
SpoIIR (=Membranprotein, das in dem Septum sitzt) und leitet das Signal weiter, dass SigmaF in der
Forespore jetzt aktiv ist und somit kommt es in der Mutterzelle zur Response. -> Der aus dem Pro-
SigmaE wird durch den Faktor SpoIIEA (=der aktive Sigma Faktor). Und der aktive Sigma Faktor führt
zur Expression von allen Proteinen die notwendig sind für die Umschließung der Forespore und für
die Ausbildung des Cortex und Coad.
Die Mutterzelle umhüllt dann die Spore und in weiterer Folge ist der SigmaG wieder mit einem anti-
Sigma-Faktor gebunden und in der Mutterzelle ist der Pro-Sigmafaktor-K der durch eine Protease
prozessiert werden muss.
So werden die Regulationsmechanismen aufeinander abgestimmt.
Es gibt einen anti-anti-Sigma-Faktor. D.h. dieses Protein wird synthetisiert und es hat eine höhere
Affinität für den Sigma-Faktor, als der Anti-Sigma-Faktor zum Sigma-Faktor. D.h. der anti-anti-Sigma-
Faktor titriert SpoIIAB weck von sigmaF und entlässt so sigmaF => SigmaF wird aktiv und bindet an
die RNA-Polymerase und führt einerseits zur Expression von best. Proteinen die für die Ausbildung
der Hülle (für die Umschließung der Forespore) wichtig sind, und andererseits gibt der aktivierte
Sigma Faktor ein Signal durch die Membran zur Mutterspore. Es kommt dann zur Synthese von
SpoIIR (=Membranprotein, das in dem Septum sitzt) und leitet das Signal weiter, dass SigmaF in der
Forespore jetzt aktiv ist und somit kommt es in der Mutterzelle zur Response. -> Der aus dem Pro-
SigmaE wird durch den Faktor SpoIIEA (=der aktive Sigma Faktor). Und der aktive Sigma Faktor führt
zur Expression von allen Proteinen die notwendig sind für die Umschließung der Forespore und für
die Ausbildung des Cortex und Coad.

Kannibalismus:
Es ist ein Populationsphänomen in Baciullus. Der Kannibalismus führt dazu, dass sporulierende Zellen
die Nicht-sporulierenden Zellen zur Lyse bringen. -> wieso?
- es geht um, dass die Sporulation wirklich Ausgeführt wird wenn sie das Signal bekommen, egal ob
die Bedingungen passen oder nicht. D.h. für die ganze Population ist das ein Vorteil, die Sporulation
so lange hinauszuschieben, bis wirklich gar keine Nahrungsmittel mehr vorhanden sind.
- Wenn also die Zellen zur Lyse von nicht sporelierenden Zellen führen, dann können sie wieder in die
vegetative Phase zurückgehen und zögern so die Sporulation hinaus.
Warum das funktionieren muss und kann: Jede bakterielle Population ist heterogen!-> D.h. jede Zelle
in der Population ist in einer unterschiedlichen Phase. D.h. auch dass während der Initiation der
Sporulation immer nur zuerst einige Zellen sporulieren, die meisten aber noch nicht. Deswegen
Sporulation solange hinauszögern bis keine Nahrung mehr da ist.
SKF: Ist ein zirkuläres Peptid, die hier sich in die Membran sich einlagern und zur Lyse führen.
Einerseits sind dann auch die Zellen immun gegen diese Killin Faktoren. Denn sie sind ja erst am
Beginn der Sporulation. Also die Zellen die diese Proteine ausgeben, haben eine Immunität gegen sie.

Differenzierung bakterieller Zellen:

Neben der Differenzierung der Sporen gibt es noch Caulobacter crescentius. Hier wird differenziert
zwischen sessilen Zellen (mit einem stalked pole) an einer Oberfläche angeheftet sind, und wenn sie
sich Teilen (und nur die sessilen stalked Zellen können sich teilen) dann bleibt die sessile stalked Zelle
an ihrem Ort sitzen und die neue Zelle bekommt ein Flagellum und kann sich bewegen. Erst wenn
diese Zelle dann eine Nische mit optimalen Bedingungen findet, wird die Zelle wieder differenziert,
d.h. das Flagellum wird abgebaut, und der Stiel wird wieder ausgebildet und sie haftet sich an eine
Oberfläche an. Erst dann kann wieder die nächste Teilung erfolgen.
Wie kommt es zu dieser Asymmetrischen Zellteilung?
(Zellen können nur eine gewisse Anzahl an Teilungen durchlaufen, und das Alter der Zellen wird über
den Pol definiert.)
Der Pol definiert das Alter der Zellen. An den Polen sind Proteine angelagert, die dort immer sitzen. -
> warum aber sitzen einige Proteine nur an den Polen?
- Die Chemotaxis Proteine sitzen immer in der Membran an den Polen. -> Was verhindert, dass sie
iwo anders lokalisiert werden?
- Die Krümmung der Membran und des Peptidoglycans, trägt dazu bei, dass die polaren
angeordneten Proteine genau dort bleiben. Die Transmembrandomänen von diesen polaren
Proteinen schauen anders aus als Transmembrandomänen am Rest der Membran. Also die
Krümmung definiert polare Proteine. => Chemotaxis Proteine bleiben an einem Zellpol und können
nicht herumwandern.
Der alte und neue Pol definiert das Alter und auch die Seite des Stalk (=die Sessile Zelle) und die neu
synthetisierte Schwärmerzelle.

CtrA:
Die Regulation der Differenzierung, wird über dem Masterregulater (=CtrA) inhibiert. Die
Phosphorelierung reguliert die Aktivität von CtrA. CtrA ist ein Transkriptionsfaktor und bindet an
Promotoregionen. Das CtrA Gen (im Bild links) ist unter Regulation, d.h. wenn CtrA synthetisiert wird,
und dann phosphoreliert wird, dann bindet der phosphorelierte Transkriptionsfaktor an dem
Promotor 2, aber nun nicht mehr an den Promotor1.
-> welche Idee steckt dahinter, dass ein Gen 2 Promotoren hat?
- Es kommt zu einer längeren RNA. Das kann die Sekundärstruktur der RNA beeinflussen und damit
einerseits de Stabilität der RNA beeinflussen und andererseits kann sich auch die
Translationseffiziens ändern (=die Affinität des Ribosoms für den Start verändert sich).-> Die 5'
untranslatierte Region schaut anders aus.
Die Schwärmerzelle ist voll mit dem phosphoreliertem Transkriptionsfaktor. Dieser reguliert eine
ganze Cascade von Genen, und in dem Moment wo die Schwärmer Zelle eine Nische findet, wird die
Genexpression so umgeändert, das sich der Stalk (=Stiel) ausbildet und das Flagellum degradiert
wird. Gleichzeitig wird aber eine Protease expremiert die zur kompletten proteolyse von CtrA führt.
Also der masterregulator CtrA wird komplett degradiert in der Zelle.
In dem Moment wo sich die sessile Zelle beginnt zu Teilen, kommt es zur CtrA Transkription
(ausgehend vom Promotor 1), in der ganzen Zelle ist wieder CtrA vorhanden.
Der erste Promoter wird dann blockiert und der zweite Promoter wird aktiviert -> und CtrA wird
phosphoreliert. Die Phosphorelierung ist abhängig (weil sie ja ein Responseregulator ist) duch
Sensorkinasen die Informationen von Ausen bekommen.

-> Wie kommt es aber zu einem Konzentrationsunterschied in der sessilen Zelle und der swarmer
Zell?
- Die Sensorkinasen sind polar angeordnet,
-CtrA reguliert direkt 38 verschiedene Gene, unter welchen auch Regulatoren, und dadurch reguliert
Ctra 144 indirekte Targets zusätzlich. Also 7% vom Genom werden von CtrA reguliert.

CtrA ist überall vohanden, wie kommt es aber zur unterschiedlichen Genexpression?
-> Die Sensorkinasen sind polar angeordnet. Die Sessile Zelle hat andere Sensokinasen am Pol als die
swarmer Zelle. Die Sythese der Sensorkinasen ist koordiniert mit der Sythese des Flagellums, oder
mit der Synthese des Stalks. Dadurch kommt es zur Integration der Sensorkinse Pc an dem
Schwärmerpol und Difg an de Pol an dem der Stiel ist. Der andere Komplex ist auf beiden Polen
gleich, der Unterschied liegt in diesen 2 Kinasen.
Diese 2 Kinasen reagieren so: Pc führt zur dephosphorelierung von (ist also eig. eine Phosphatase und
keine Kinase), DifK (Transkriptionsfaktor) und am Pol der sessilen Zelle führt DifG zur
phosphorelierung von DifK. Je nachdem ob Phosphoreliert oder nicht, bindet es an diese
Sensorkinase und führt zur dephosphorelierung von Ctra. Wenn DfK nicht an der Sensorkinase
bindet, ist sie aktiv und sie phosphoreliert CtrA.
->es sind also untersch. Phosphorelierungsgradienten von CtrA an diesen 2 Polen.
-In der Sessilen Zelle ist Nicht-phosphoreliertes CtrA
-In der Swarmer Zelle ist es phosphoreliert und es kommt zur Ausbildung des Flagellums.
Die Pole werden also definiert von 2 verschiedenen Sensorkinasen bzw die Phosphatase.