Ciclo superior de Laboratorio de Análisis y Control de Calidad,

Microbiología.

Carlos Carballo Rodríguez

Examen final práctico del 30/5/2011 al 3/6/2011

- 1.a Recuento de coliformes totales en una muestra de

pepino:

Muestra a analizar: pepino

Medios utilizados: placa de ENDO agar, 100 ml de ringer.

Técnica utilizada: filtración de membrana

Incubación: 37ºC/24 h

Para la determinación de coliformes totales en una muestra de pepino,

proporcionada por el profesor y almacenada en nevera, utilizo la técnica de
filtración de membrana.

El martes 31/05/2011 preparé el ringer, que es una solución eluyente que

acompaña al pepino en su trituración en el Stomacher. Para ello, pesé 0.25
g de ringer en una balanza analítica del laboratorio de química, ya que
nuestra balanza no es tan precisa. Diluí el soluto en 100 ml de agua medida
con una probeta. El material de vidrio utilizado para la preparación de
ringer no tiene porque ser autoclavado, pero el ringer preparado si que irá a
autoclave.

El miércoles 01/06/2011, procedí a la preparación de la práctica. Primero

pesé 20 g de pepino en condiciones asépticas (flameando la espátula ) y los
metí dentro de una bolsa de Stomacher acompañado de 80 ml de ringer.
Machaqué el pepino en el Stomacher y lo filtré en un vaso con ayuda de una
gasa. Cerca del vaso y de la gasa, tener un mechero de alcohol encendido
para evitar posibles contaminaciones. Luego de filtrar el pepino, hice una
dilución de la muestra, añadiendo 60 ml de agua y 40 ml de pepino.

Para filtrar por membrana, necesitamos el equipo de filtración:

Introducí la parte inferior en el equipo de vacio, coloqué un filtro de
membrana con unas pinzas flameadas y con mucho cuidado sobre el, lugo
la parte más ancha del equipo de filtrado, sujeté con una pinza, abrí la llave
de vacio y puse la mustra en el deposito ancho. Cuando realicé está práctica
tuve la precaución de tener un mechero de alcohol cerca para evitar
posibles contaminaciones.

En este caso, no se filtro la muestra y cuando cerré la llave de vacio y quité

el material de filtración del equipo de vacio, se movió la pinza y perdí la
muestra, por lo que tuve que preparar una nueva dilución de ringer que fue
a autoclavar.

El jueves 02/06/2011, repeti el proceso anterior, pero en vez de 20 g de

pepino, pesé 10 g y en vez de añadirle 80 ml de ringer, añadí 90 ml. Repetí
todo el proceso y esta vez si que filtró. Una vez acabado el filtrado, cogí el
filtro de membrana con unas pinzas esterilizadas (podemos ayudarnos con
una asa recta, también esterilizada a la llama) y lo coloqué en la placa de
ENDO agar. Cuando está sembrado lo llevé, en posición invertida, a la
estufa de 37ºC a incubar durante 24 horas.

El viernes 03/06/2011 retiré la placa de la estufa y anoté los resultados:

TMC ufc/ 10 g de muestra. Las colonias son muy numerosas y muy
pequeñas, que abarcan toda la superficie del medio.

En esta práctica no es necesario confirmación por lo que ya se dá por

terminada.
 - 1.b Recuento de enterococos fecales en una muestra de
mosto:

Muestra a analizar: mosto

Medios utilizados: placa de KF agar

Técnica utilizada: filtración de membrana

Incubación: 37ºC/48 h

Para la determinación de enterococos fecales en una muestra de mosto

proporcionada por el profesor, utilizo la técnica de la filtración de
membrana.

Lunes 30/06/2011 cogí el material de vidrio que voy a utilizar el día

siguiente y cubrir la solicitud de autoclave para tenerlas listas al día
siguiente.

Martes 31/06/2011 hice una dilución de la muestra de mosto midiendo 50

ml de agua y 50 ml de mosto en una probeta y poniéndolos en un vaso de
precipitados. Todo el material de vidrio utilizado en esta práctica fue
previamente autoclavado.

Luego llevé la muestra al equipo de filtrado, con su filtro de membrana

cuidadosamente colocado y lo filtré. Cuando acabo el proceso de filtrado
cogí el filtro con unas pinzas esterilizadas a la llama, y lo coloqué con
cuidado en la placa de KF agar. Luego llevé la placa, en posición invertida, a
la estufa de 37ºC durante 48 horas.

Jueves 02/06/2011 saqué la placa de KF agar de la estufa y observé si hay

crecimiento de colonias en la superficie del agar. No observé ningún
crecimiento por lo que determiné que hay 0 ufc en 100 ml de muestra.

No es necesario hacer confirmación por lo que acabo la práctica aquí.

- 2 Pruebas Bioquímicas.

Cepa bacteriana: micrococos Luteus 245

Prueba del Indol: martes 31/05/2011 cultivo mi cepa bacteriana,
micrococos luteus 245, en un tubo de caldo de triptona, rico en tiptófano.
Cogí mi cepa de la gradilla ``última resiembra´´ almacenada en la nevera, y
con una asa de siembra curva esterilizada a la llama y enfriada en las
paredes arrastré un poco de masa bacteriana y sembré en el tubo de caldo
de triptona. Incubo a 37ºC durante 24 horas.

Miércoles 01/06/2011 observé que hay turbidez en el tubo de caldo de

triptona y añadí reactivo de Kovacs al tubo para determinar si es indol
positiva o negativa. Como el color que toma la muestra es amarillo, se
determina que es indol negativo.

Rojo de metilo: martes 31/05/2011 cultivo mi cepa bacteriana, micrococos

luteus 245, en un tubo de MRVG. Cogí mi cepa y con un asa de siembra
curva esterilizada a la llama y enfriada en las paredes del tubo, arrastré un
poco de masa bacteriana y sembré en el tubo de MRVG. Incubo a 37ºC
durante 48 horas.

Jueves 02/06/2011 observé que hay turbidez y dividí en dos partes iguales
el MRVG del tubo en otro tubo esterilizado en autoclave. A uno de los tubos
le añadí unas gotas de rojo de metilo que es un indicador de pH. Si cambia a
rojo quiere decir que hay fermentación de glucosa y que es positivo, si el
color es amarillo quiere decir que es negativo en la prueba de rojo de
metilo. En mi el color fue amarillo por lo que es negativo.
Voges-Proskauer: martes 31/05/2011 cultivo mi cepa bacteriana,
micrococos luteus 245, en un tubo de MRVG. Cogí mi cepa y con un asa de
siembra curva esterilizada a la llama y enfriada en las paredes del tubo,
arrastré un poco de masa bacteriana y sembré en el tubo de MRVG. Incubo
a 37ºC durante 48 horas.

Jueves 02/06/2011 observé que hay turbidez y dividí en dos partes iguales
el MRVG del tubo en otro tubo esterilizado en autoclave. Al otro tubo de
MRVP le añadí 0.75 ml de reactivo A (α-naftol) y 0.25 ml de reactivo B (KOH
40%), sin cambios. Es negativo en VP.

Citrato: jueves 02/06/2011 cultivo mi cepa bacteriana, micrococos luteus

245, en un tubo con agar Citrato de Simmons en slant. Cogí mi cepa y con
un asa de siembra curva esterilizada a la llama y enfriada en las paredes del
tubo, arrastré un poco de masa bacteriana y sembré en zig-zag en el agar
Citrato de Simmons. Incubo a 37ºC durante 24 horas.

Viernes 03/06/2011 observo los resultados. El tubo de citrato de Simmons

no ha sufrido cambios por lo que el resultado es negativo en citratos.

Manitol-movilidad: martes 31/05/2011 cultivo mi cepa bacteriana,

micrococos luteus 245, en un tubo de medio manitol. Cogí mi cepa y con un
asa de siembre recta esterilizada a la llama y enfriada en las paredes del
tubo, arrastré un poco de masa bacteriana y sembré en el tubo de manitol
por picadura. Incubo a 37ºC durante 24 horas.
Miércoles 01/06/2011 retiro el tubo de la estufa y observo que hay
crecimiento en la zona de la picadura, lo que indica que existe movimiento
lateral y por tanto es movilidad positivo y además observo que hay un ligero
cambio de pH de rojo a anaranjado-amarillo, lo que indica que es manitol
positivo.

Aislamiento por estría: martes 31/05/2011 cultivo mi cepa bacteriana,

micrococos luteus 245, en una placa de agar nutritivo. Cogí mi cepa y con
asa de siembra curva esterilizada a la llama y enfriada en la pared de la
placa, sembré en zig-zag en el primer cuadrante de la placa. Luego, volví a
esterilizar el asa a la llama, enfrio y partiendo de la zona de siembra del
primer cuadrante, siembro el segundo cuadrante. Vuelvo a esterilizar el asa
a la llama, enfrío y partiendo de la zona de siembre del segundo cuadrante,
siembro el tercer cuadrante. Repito el proceso con el cuarto cuadrante.
Incubo a 37ºC durante 24 horas.

Miércoles 01/06/2011 retiro la placa de la estufa y observo los resultados.

Hay gran crecimiento de colonias en los cuadrantes 1 y 2 con mal
aislamiento de colonias y un par de colonias bien aisladas en el cuadrante 3.

Todas estas técnicas las he realizado asépticamente teniendo un

mechero de alcohol cerca del espacio de trabajo.
Tinción de Gram: martes 31/05/2011 preparo un frotis bacteriano que
luego miraré en el microscopio. Para ello, cogo un portaobjetos y lo coloco
en una cubeta de tinciones. Coloco sobre el portaobjetos una gota de agua
destilada y luego con una asa de siembra curva arrastro un poco de masa
bacteriana de mi cepa, micrococos luteus 245, y lo deposito en el agua
destilada. Secamos el frotis a la llama.

Una vez preparado el frotis, añado una gota de violeta cristal y lo dejo
actuar durante 2 minutos. Pasados los dos minutos quitamos el exceso de
violeta cristal sin utilizar agua.

A continuación añadí 1 gota de lugol sobre el frotis y lo dejé actuar 1

minuto. Pasado el tiempo quitar el exceso de colorante sin utilizar agua.

Luego decoloro con alcohol de 96° durante 1 minuto. Lavo con agua para
arrastrar el exceso de alcohol que pueda quedar en el portaobjetos.

Tiño con safranina 1 minuto más y lavo con agua abundante para arrastrar
el exceso de colorante de contraste.

Lo dejo secar al aire y lo examino al microscopio. Una vez enfocada la

muestra con el objetivo de 40x observamos que tipo de bacteria hay en el
portaobjetos.

Los resultados obtenidos son que en el microscopio hay bacterias gram -, ya

que el color de las bacterias era rojo y además hay una combinación de
cocos y bacilos, lo que indica que hay contaminación en la cepa bacteriana,
ya que, el micrococos luteus 245 forma tétradas de cocos gram negativos.

- 3 Análisis de superficies:

No pude realizar esta práctica porque en la hoja de medios se me olvidó

pedir el CGA.
 Carlos Carballo Rodríguez

Pruebas Bioquímicas:
Realizadas los días 17, 20,24,25 de enero de 2011 a partir de la cepa
bacteriana Microccocus Luteus 245.

Citrato de Simmons: siembra de la cepa en agar citrato de Simmons,

incubar a 37ºC durante 24 horas. Resultado: poco crecimiento, no hay
cambio de color. NEGATIVO.

MRVP: siembra de la cepa en medio MRVP, con turbidez luego de 24 horas

a 37ºC. Dividir medio en 2 partes y añadir a una de ellas rojo de metilo.
Resultado: no cambia a rojo, sino a amarillo NEGATIVO. En el otro tubo
echar 0.75 ml de α-naftol y 0.25 ml de KOH. Resultado: no hay cambios
NEGATIVO.

Indol: siembra de la cepa en caldo de triptona, incubar a 37ºC durante 24

horas. Aparición de turbidez y adicción de reactivo de Kovacs para confirmar
la prueba. Resultado: color amarillo NEGATIVO.

Manitol-movilidad: siembra de la cepa en medio manitol por picadura;

incubar a 37ºC durante 24 horas. Resultado: no hay crecimiento en la zona
de la picadura ni cambio de pH en el medio de cultivo NEGATIVO tanto en
manitol como en movilidad.

ADNasa: siembra de la cepa en medio ADNasa, incubando a 37ºC durante

24 horas. Resultado: hay crecimiento en el medio de cultivo POSITIVO.

McConkey: siembra de la cepa en medio McConkey, incubando a 37ºC

durante 24 horas. Resultado: no hay crecimiento en medio McConkey, es
lactosa NEGATIVO.

KIA: siembra de la cepa en medio hierro de kliger, incubando a 37ºC

durante 24 horas. Resultado: producción de gas (agar roto) y aparición de
sulfhídrico (zonas negras en el medio) POSITIVO.
CARLOS CARBALLO RODRIGUEZ (LACC 1)