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IngenierIngenierííaa GenGenééticatica II

20102010

Ingenier í í a a Gen Gen é é tica tica I I 2010 2010 Ingenier

IngenierIngenierííaa GenGenééticatica

¿Qué significa “clonar” un gen y obtener DNA “recombinante” en comparación con clonar por ej. una planta y la recombinación homóloga?

Diferencias entre recombinación homóloga y recombinación ilegítima

Herramientas originales: endonucleasas de restricción (+ ligasas) y retrotranscriptasas; luego PCR

HayHay 44 clasesclases dede recombinacirecombinacióónn

Recombinación homóloga: intercambio de material genético entre dos moléculas de ADN que comparten una alta identidad entre sí. Es lo que ocurre durante la meiosis (crossing-over), la recombinación entre fagos o la conjugación bacteriana por ejemplo (¿lo recuerdan?)

Recombinación sitio específica: implica el intercambio de material genético en sitios muy específicos (con una secuencia determinada); son ejemplos la integración del fago Lambda para generar el profago y los rearreglos cromosomales que general la diversidad de anticuerpos.

Transposición: Lo veremos en una clase dedicada

Recombinación ilegítima: un número importante de casos de intercambio de ADN que no pueden incluirse en alguna de las categorías anteriores.

Plásmidos

casos de intercambio de ADN que no pueden incluirse en al guna de las categorías anteriores.
casos de intercambio de ADN que no pueden incluirse en al guna de las categorías anteriores.
casos de intercambio de ADN que no pueden incluirse en al guna de las categorías anteriores.
Se producirían 4 tipos de células que tenemos que diferenciar: a)Sin plásmido b)Varios plásmidos en
Se producirían 4 tipos de células que
tenemos que diferenciar:
a)Sin plásmido
b)Varios plásmidos en = célula
c)Recombinantes (distintas)
d)No recombinantes
= célula c)Recombinantes (distintas) d)No recombinantes a) Sin plásmido Diluci Diluci ó ó n n y

a) Sin plásmido

DiluciDilucióónn yy selecciseleccióónn

b)b) plpláásmidossmidos enen == ccéélulalula LaLa proporciproporcióónn dede bacteriasbacterias queque incorporanincorporan unun plpláásmidosmido eses bajabaja

HayHay incompatibilidadincompatibilidad

es es baja baja Hay Hay incompatibilidad incompatibilidad b) plásmidos en = célula vs colonias superpuestas
es es baja baja Hay Hay incompatibilidad incompatibilidad b) plásmidos en = célula vs colonias superpuestas

b) plásmidos en = célula vs colonias superpuestas

c) Muchos

recombinantes

distintos

incompatibilidad incompatibilidad b) plásmidos en = célula vs colonias superpuestas c) Muchos recombinantes distintos

d) ¿Cómo eliminar los plásmidos

vacíos (no recombinantes)?

¿Cómo eliminar los plásmidos vacíos (no recombinantes)? Vectores plasmídicos Antiguos (pBR322) Vectores

Vectores plasmídicos Antiguos (pBR322)

(no recombinantes)? Vectores plasmídicos Antiguos (pBR322) Vectores plasmídicos modernos d) ¿Cómo eliminar los
Vectores plasmídicos modernos
Vectores
plasmídicos
modernos

d) ¿Cómo eliminar los plásmidos vacíos (no recombinantes)?

¿Cómo eliminar los plásmidos vacíos (no recombinantes)? C l o n a r u n g

Clonar un gen significa aislarloaislarlo y amplificarlo

s i g n i f i c a a i s l a r l
Células/tejido
Células/tejido

ARNm (clonoteca)

ADN (genoteca)

cDNA(metilación; adición de linkers, etc.)

ADN (genoteca) cDNA(metilación; adición de linkers, etc.) Restricción Completa o parcial Fraccionamiento Vectores

Restricción Completa o parcial

adición de linkers, etc.) Restricción Completa o parcial Fraccionamiento Vectores (cDNA: plásmidos, fago λ

Fraccionamiento

Vectores (cDNA: plásmidos, fago λ Genómico: fago λ, cósmido, BAC, PAC, YAC, TAC)

Restricción

“screening” de las colonias buscadas

TAC) Restricción “screening” de las colonias buscadas Ligación Transformación, empacado in vitro , etc

Ligación

Transformación, empacado in vitro, etc

buscadas Ligación Transformación, empacado in vitro , etc Amplificación y conservación a largo plazo “Genomic
buscadas Ligación Transformación, empacado in vitro , etc Amplificación y conservación a largo plazo “Genomic

Amplificación y conservación a largo plazo

“Genomic Libraries” Genotecas

•Se parte de ADN genómico •frec. postivos indep. expresión

•puede contener promotores e intrones

•problema para expresar en sistemas heterólogos

•usos: análisis genómico, clonado posicional, estudios sobre promotores, etc

?
?

“cDNA Libraries” clonotecas

•Retrotranscripción del ARN

•Dependiente

•sin promotores o intrones

•posible expresar si se coloca promotor adecuado

•usos: estudios de regiones codificantes, análisis de funciones génicas

Representación en una genoteca

Q

= (1 – 1/n) N

P

= 1 – Q

P

= 1 – (1 – 1/n) N

(1 – 1/n) N = 1 – P

Q: probabilidad de que un clon no esté representado

P: probabilidad de incluir una dada secuencia

N: número de clones analizados (screened)

n: relación entre el tamaño del genoma

ln

(1 – 1/n) N = ln (1 – P)

y el del clon promedio

N

= ln (1-P) / ln (1-1/n)

“Genomic Libraries” Genotecas

N = ln (1-P) / ln (1-1/n)

P: probabilidad de incluir una dada secuencia N: número de clones analizados (screened)

n: relación entre el tamaño del genoma y el del clon promedio (Número total de clones necesarios para cubrir el genoma sin superposición )

“cDNA Libraries” clonotecas

N = ln (1 – P) / ln (1 – m/T)

P: probabilidad de que cada ARN esté representado N: número de clones independientes analizados

m: número de moléculas de un ARNm raro en una célula

T: número total de moléculas de ARNm por célula

Vectores para genotecas

Vector

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comentarios

YAC (yeast

230 - 1700 kb (largo de un cromosoma de levadura) Promedio: 400-700 kb

Se propaga en Saccharomyces cerevisiae

artificial

chromosome)

 

Elementos esenciales:

 

centrómero; telómeros que marcan el final del cromosoma; origen de replicación que funciona durante la replicación del ADN Fue una importante herramienta para mapear genomas complejos

Problemas: quimeras, inestabilidad (rearreglos)

Vectores para genotecas

Vector

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comentarios

BAC (bacterial

Hasta 300 kb Promedio:100 kb

Plásmido conteniendo el origen de replicación del F; Una copia por bacteria

artificial

chromosome)

Bacteriofago

Máximo cerca de 100 kb

Versión reducida de genoma de fago genoma de P1 de 110 kb empaquetamiento eficiente sitio PAC de reconocimiento y clivaje replicón de P1 y replicón lítico inducible sitio loxP para Cre

P1

PAC (P1-

   

derived artificial

Similar al BAC

Combinación de características de BAC y PAC

chromosome)

TAC (Transformable

 

Con origen P1 (copia única en E. coli) y origen Ri (copia única en Agrobacterium tumefaciens)

artificial

Similar al P1

chromosome)

Con los bordes del T-DNA, para transformar plantas

Vectores para genotecas

Vector

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Fago lambda

Hasta 20-30 kb

Genoma del fago ~ 48kb empaquetamiento eficiente, puede llevar 78- 105% del genoma del fago En general se usa el vector de reemplazo Brazos predigeridos se pueden comprar Bueno para estudiar genes individuales

Cósmido

35-45 kb

Plásmido contiene sitio cos del λ; usa el empaquetamiento de éste Se propaga en E. coli como un plásmido; Útil para subclonar insertos de YAC, BAC, PAC, etc.

Fósmido

Similar al cósmido

Contiene sitio cos del λ y el origen de replicación del plásmido F; Bajo nro de copia, más estable

Vectores para clonotecas

Vector

Tamaño inserto

comentarios

 

20-30 kb

Capacidad máxima no limita a ARNm (8kb) empaquetamiento eficiente Bueno para estudiar genes individuales En general se usa el vector de inserción Más representativo que clonotecas de plásmidos Subclonados y pasos siguientes más complicados que con clonotecas de plásmidos

(reemplazo)

Fago lambda

10-15 kb

(inserción)

Plásmidos

10-15kb

Fácil de transformar E coli, pero no tan eficiente como lambda a gran escala Menos representativo que clonotecas de fagos Subclonados y pasos siguientes se simplifican

bacterianos

λZAP Library (Stratagene)

λ ZAP Library (Stratagene) Escisión del plásmido pBluescript • Primer huésped: cepa XL1-Blue MRF’: plásmido F’

Escisión del plásmido pBluescript

• Primer huésped: cepa XL1-Blue MRF’: plásmido F’ provee el pili del F, el receptor del fago f1; esta cepa es supresora de forma tal que los fagos helper f1 que llevan una mutación ambar pueden empaquetar DNA •El λ ZAP contiene las señales de iniciación y terminación para el empaquetamiento por el f1 flanqueando al pBluescript •Segundo huésped: SOLR, cepa no supresora, fago f1 no se propaga; cepa resistente al fago λ previene la propagación del mismo.

SOLR, cepa no supresora, fago f1 no se propaga; cepa resistente al fago λ previene la
SOLR, cepa no supresora, fago f1 no se propaga; cepa resistente al fago λ previene la
Cósmidos BACmidos o BAC El fago P1 como vector
Cósmidos
Cósmidos

BACmidos o BAC

Cósmidos BACmidos o BAC El fago P1 como vector

El fago P1 como vector

Cósmidos BACmidos o BAC El fago P1 como vector

Cromosomas artificiales de levaduras (YAC)

Cromosomas artificiales de levaduras (YAC) Aislamiento y Amplificación in vivo (clonando) e in vitro (PCR)
Cromosomas artificiales de levaduras (YAC) Aislamiento y Amplificación in vivo (clonando) e in vitro (PCR)
Cromosomas artificiales de levaduras (YAC) Aislamiento y Amplificación in vivo (clonando) e in vitro (PCR)

Aislamiento y Amplificación in vivo (clonando) e in vitro (PCR)

Conozco los vectores ¿Qué hay de los insertos?

Puedo preparar insertos específicos utilizando PCR y “primers” cuando la secuencia es conocida o utilizar regiones conservadas y “primers degenerados”. Puedo agregarle sitios de restricción a los “primers” o emplear vectores T. Ventajas? Desventajas/cuidados?

Puedo agregarle sitios de restricción a los “primers” o emplear vectores T. Ventajas? Desventajas/cuidados?
05_02.jpg
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05_02_2.jpg
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05_02_3.jpg
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Construcción de Clonotecas

Síntesis de la primer cadena

RNAm

de Clonotecas Síntesis de la primer cadena R N A m CH 3 CH 3 CH
de Clonotecas Síntesis de la primer cadena R N A m CH 3 CH 3 CH
de Clonotecas Síntesis de la primer cadena R N A m CH 3 CH 3 CH
de Clonotecas Síntesis de la primer cadena R N A m CH 3 CH 3 CH

CH 3

CH 3

CH 3

AAAAAAAA TTTTTTTT GAGCTC

Primer cadena de cDNA

+ Linker-primer, transcriptasa reversa + 5-methyl dCTP, dATP, dGTP, dTTP

linker-primer: transcripción reversa, sitio de restricción (XhoI)

5-methyl dCTP: proteje sitios internos

Síntesis de la segunda cadena

Segunda cadena de cDNA

AAAAAAAA CTCGAT AATTC TTTTTTTT GAGCTC G CH 3 CH 3 CH 3 Primer cadena de
AAAAAAAA
CTCGAT
AATTC
TTTTTTTT
GAGCTC
G
CH 3
CH 3
CH 3
Primer cadena de cDNA
+ RNase H + DNA polymerase I; dNTPs
AATTC
RNase H: remueve mRNA en híbridos DNA-RNA
DNA Polymerase I: sintetiza 2da cadena
Al degradar el ARN, la RNAsa H deja residuos de ARN que funcionan
como primers para iniciar la síntesis de ADN
DNA Polymerase 1 rellena los gaps por nick translation
G

Agregamos adaptadores

AAAAAAAACTCGAT G TTTTTTTTGAGCTC CTTA CH 3 CH 3 CH 3 +XhoI
AAAAAAAACTCGAT
G
TTTTTTTTGAGCTC
CTTA
CH 3
CH 3
CH 3
+XhoI

CH 3

CH 3

CH 3

AAAAAAAAC

TTTTTTTTGAGCT

Adaptador EcoRI y linker XhoI: clonado direccional

GAGCT Adaptador EcoRI y linker Xho I: clonado direccional También puedo combinar cDNA y PCR PCR

También puedo combinar cDNA y PCR

I: clonado direccional También puedo combinar cDNA y PCR PCR 3) Diseño de iniciadores ( primers

PCR

clonado direccional También puedo combinar cDNA y PCR PCR 3) Diseño de iniciadores ( primers )

3) Diseño de iniciadores (primers) específicos

Hoy en día, esta parte, se hace por PCR
Hoy en día, esta parte, se
hace por PCR

ConstrucciConstruccióónn dede ggenotecasenotecas dede insertosinsertos ggrandesrandes enen vectoresvectores lambdalambda

Vector Charon 40 (capacidad: 9 - 23 kb)

cos

L

arm

Polystuffer

R arm

cos

 
   

SOURCESOURCE DNADNA FORFOR CLONINGCLONING

 

BamHI

   

BamHI

(1) Nae 1 (2) PEG precipitation (3) Phenol, chloroform extraction (4) Ethanol precipitation (5) BamHI

GrowGrow cellcell (e.g.(e.g. hybridhybrid cells:cells: J640J640--51)51)

Grow Grow cell cell (e.g. (e.g. hybrid hybrid cells: cells: J640 J640 - - 51) 51)
 

BamHI

IsolateIsolate chromosomeschromosomes byby flowflow--sortingsorting

Isolate Isolate chromosomes chromosomes by by flow flow - - sorting sorting
 

PurifyPurify chromosomeschromosomes usingusing describeddescribed protocolprotocol

Purify Purify chromosomes chromosomes using using described described protocol protocol
 

PartialPartial digestdigest withwith MboIMboI // dephosphorylatedephosphorylate

 

L

arm

 

Polystuffer

R arm

cos

BamHI

   

BamHI

cos

       

Plaqueo y screening defagos conteniendo fragmentos de interés

 

Ligar

  Ligar
       
 

Ba

Ba

 

Empacar y amplificar en E. Coli K802 (rec A-)

Ba   Empacar y amplificar en E. Coli K802 (rec A-) “Screening” de los clones de

“Screening” de los clones de interés

¿Cómo clonar una aguja en un pajar (un gen entre 30.000 o 10 3 nucleótidos entre 10 9 ) ?

Por abundancia relativa

Por su producto de expresión: clonotecas de cDNA de expresión

Por PCR o hibridización si hay información sobre la secuencia del gen blanco, o hay genes homólogos o tenemos información sobre la secuencia proteica.

Por hibridización si contamos con fragmentos del gen o de los homólogos

Por ensayos funcionales:

•Complementación funcional en levaduras

•Microinjección

Screening por complementación funcional en levaduras

Saccharomyces cerevisiae es un sistema eucariota simple

Fácil de cultivar y manipular genéticamente

Contamos con mutantes, vectores de expresión, protocolos de transformación, etc

Screening por complementación funcional en levaduras

etc Screening por complementación funcional en levaduras Mutante de levadura deficiente en una función de interés
etc Screening por complementación funcional en levaduras Mutante de levadura deficiente en una función de interés

Mutante de levadura deficiente en una función de interés

Una clonoteca del organismo de interés en un vector apto para levaduras

cDNA se expresa por un promotor de levaduras, inducible

Screening por complementación funcional en levaduras

Screening por complementación funcional en levaduras El mutante se complementa cuando el gen se expresa Necesitamos

El mutante se complementa cuando el gen se expresa

Necesitamos de un vector apropiado

cuando el gen se expresa Necesitamos de un vector apropiado Ejemplo: clonado de un canal de

Ejemplo: clonado de un canal de potasio

un vector apropiado Ejemplo: clonado de un canal de potasio Mutante transformante Medio rico en potasio

Mutante

transformante

Medio rico en potasio

Medio no inductor

Medio inductor

Medio pobre en potasio

Medio rico en potasio Medio no inductor Medio inductor Medio pobre en potasio ¿Cómo clonaron el

¿Cómo clonaron el centrómero?

Hibridación

diferencial

Hibridación diferencial Identificaci Identificaci ó ó n: n: Por su producto de expresión: clonotecas de cDNA

IdentificaciIdentificacióón:n:

Por su producto de expresión:

clonotecas de

cDNA de

expresión

su producto de expresión: clonotecas de cDNA de expresión Si se dispone de anticuerpos: El producto

Si se dispone de anticuerpos:

El producto de expresión se identifica por reconocimiento antígeno-anticuerpo

se identifica por reconocimiento antígeno-anticuerpo Tambien podríamos producir proteína recombinante, aunque

Tambien podríamos producir proteína recombinante, aunque probablemente necesite ser optimizado para máxima producción

podríamos producir proteína recombinante, aunque probablemente necesite ser optimizado para máxima producción

Screening con sondas marcadas

Screening con sondas marcadas
Screening con sondas marcadas
Screening con sondas marcadas
Screening con sondas marcadas
El resultado de un screening secundario ¿Cómo llego del cDNA al clon genómico? Marco el

El resultado de un screening secundario

El resultado de un screening secundario ¿Cómo llego del cDNA al clon genómico? Marco el cDNA
¿Cómo llego del cDNA al clon genómico? Marco el cDNA
¿Cómo llego del cDNA
al clon genómico?
Marco el cDNA
Técnicas de reemplazo alélico = KnockKnock outout
Técnicas de reemplazo
alélico = KnockKnock outout
Gen X Inserción al azar es más frecuente que reemplazo alélico por recombinación homóloga neo
Gen X Inserción al azar es más frecuente que reemplazo alélico por recombinación homóloga neo
Gen X
Inserción al azar
es más frecuente
que reemplazo
alélico por
recombinación
homóloga
neo R resistencia a
geneticina (G418)
tk del virus herpes
simplex convierte el
análogo de T
ganciclovir en un
inhibidor de la
replicación del ADN
Selecc +
Selecc -
Técnicas de evaluación funcional = knockknock downdown
Técnicas de evaluación
funcional = knockknock downdown
en un inhibidor de la replicación del ADN Selecc + Selecc - Técnicas de evaluación funcional
en un inhibidor de la replicación del ADN Selecc + Selecc - Técnicas de evaluación funcional
¿Dónde están?
¿Dónde están?
Herramienta
Herramienta
¿Dónde están? Herramienta PCR con AttB AttB Seleccionar recombinantes Reemplazo alélico por integrasa/clonasa®
PCR con AttB AttB Seleccionar recombinantes
PCR con AttB
AttB
Seleccionar recombinantes
Herramienta PCR con AttB AttB Seleccionar recombinantes Reemplazo alélico por integrasa/clonasa® reemplaza

Reemplazo alélico por integrasa/clonasa® reemplazareemplaza laslas ERER enen loslos clonadosclonados modernosmodernos

CcdA and CcdB, which contribute to the plasmid's high stability by post- segregational killing of
CcdA and CcdB, which contribute to the plasmid's high stability by post-
segregational killing of plasmid-free bacteria. Like the quinolones, the CcdB
protein is a poison of the DNA-topoisomerase II complexes, while CcdA acts
as an antidote against CcdB
the CcdB protein is a poison of the DNA-topoisomerase II complexes, while CcdA acts as an
the CcdB protein is a poison of the DNA-topoisomerase II complexes, while CcdA acts as an
the CcdB protein is a poison of the DNA-topoisomerase II complexes, while CcdA acts as an
the CcdB protein is a poison of the DNA-topoisomerase II complexes, while CcdA acts as an