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Biologa del Desarrollo 2008

BIOLOGA DEL DESARROLLO 2008

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OBJETIVOS Aproximacin a la tcnica histolgica de rutina Obtencin de preparados de embriones de pollo para anlisis mediante microscopa ptica de campo claro Anlisis de las primeras etapas del desarrollo de embriones de pollo en preparados in toto y en cortes histolgicos

Esquema del prctico Dos de las tcnicas bsicas que permiten el estudio del embrin temprano de aves son: la observacin de embriones in toto (enteros) o de cortes histolgicos de embriones en diferentes estadios del desarrollo. La primera aproximacin nos permite visualizar la organizacin general del embrin, mientras que los cortes histolgicos hacen posible estudiar la organizacin interna en diferentes niveles y tiempos de desarrollo del embrin. En este prctico intentaremos brindar una visin general sobre la organizacin de uno de los modelos de estudio del desarrollo en aves. El pollo ofrece varias ventajas como modelo, entre ellas es de fcil obtencin y se puede disponer de embriones en diferentes estadios del desarrollo simplemente incubndolos a una temperatura dada por el perodo de tiempo correcto (ver grfica I). Sin embargo es de destacar que las primeras etapas del desarrollo (segmentacin) son difciles de observar ya que transcurren dentro del oviducto, y tambin es difcil obtener embriones en gastrulacin en forma reproducible ya que hay pequeas diferencias en el progreso de los embriones a travs de estas etapas. Por consiguiente se trabajar con embriones incubados durante tiempos de 30-38hrs, a 37C en un ambiente hmedo. Los embriones se disecarn a diferentes tiempos y se procesarn para microscopa ptica reservando algunos para obtener preparados in toto. Se podr identificar el estadio en el que se encuentren los embriones utilizando la tabla II y los atlas de embriologa que se proporcionarn en clase.
Grfica I. Influencia de la temperatura de incubacin sobre el tiempo de aparicin de varias de las estructuras en el embrin de pollo. (Tomado de "The Avian Embryo" Romanoff A.L. 1960)

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Tabla II: Estadios de Hamburger Hamilton

Edad 3.5-4.5 hr Caractersticas Membrana de la cascara se forma en el istmo del oviducto La pared germinal se forma del periblasto marginal 4.5-24.0 hr La cascara del huevo se forma en el tero Hoz Kller (Preprimitive streak) 6-7 hr 12-13 hr 18-19 hr 19-22 hr 23-25 hr 23-26 hr ca. 23-26 hr 26-29 hr 29-33 hr ca. 33 hr 33-38 hr 40-45 hr 45-49 hr 48-52 hr ca. 50-52 hr Lnea primitiva inicial (largo: 0.3-0.5 mm) Lnea primitiva intermedia Lnea primitiva definitiva (largo 1.88 mm) Proceso de la cabeza (notocorda) Pliegue ceflico 1 somite; formacin pliegues neurales 1-3 somites; celoma 4 somites; islas sanguneas 7 somites; vesculas pticas primarias 8-9 somites; pliegue amnitico anterior 10 somites; 3 vesculas cerebrales 13 somites; 5 neurmeros en el cerebro posterior 16 somites; telencfalo 19 somites; canal atrioventricular 20-21 somites; primordio de la cola

Modificado de: GROWTH Altman,P.L., Dittmer,D.S. (ed) Biological Handbooks, FASEB (1962)

Cronograma del prctico: Da 1: Extraccin, determinacin de estado de desarrollo y fijacin de embriones de pollo. Da 2: Inclusin Da 3: Corte Da 4: Tincin y Montaje Da 5: Observacin y anlisis de los preparados

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EXTRACCIN DE EMBRIONES Los huevos se sacan de la incubadora y se los sostiene sin girarlos entre las manos, de forma tal que queden con el extremo romo hacia arriba. Se comienza la diseccin rompiendo levemente la cscara golpeando con la parte de atrs de una pinza en la parte superior del huevo, de manera tal que luego se pueda insertar una pinza y retirar de a poco la cscara. Sobre la yema del huevo se observar el disco en el cual se desarrolla el embrin. Para retirar este disco se pueden seguir dos procedimientos: 1. Se retira la mayor parte posible de clara para que el disco embrionario no se desplace (se va a ir derramando a medida que se saque ms cscara). Luego con una tijera se recorta las membranas extraembrionarias en tres o cuatro cortes por alrededor del disco embrionario. De esta forma el embrin quedar libre, podr ser levantado con una cuchara y colocado en PBS. Luego, bajo lupa, se puede separar el embrin y colocarlo directamente en fijador. 2. Se vuelca el contenido del huevo en una placa de Petri intentando que no se rompa la yema y que el embrin quede expuesto. Se prepara un anillo de papel de filtro cuyo orificio interno sea apenas mayor que el embrin. Utilizando pinzas se apoya este anillo sobre el embrin, de forma tal que ste se observe centrado en el orificio y quede rodeado por el papel de filtro. Presionando levemente se logra que el papel se adhiera a las paredes del saco vitelino. A continuacin se procede a cortar dicha membrana, cuidando especialmente el realizar esto todo alrededor del papel de filtro. Utilizando una pinza adecuada se levanta la corona de papel de filtro con el embrin adherido (el aro de papel de filtro oficia de bastidor). ste se coloca en una placa de Petri con PBS para lavar los restos de vitelo que puedan quedar. Luego de esto podemos observar al embrin bajo lupa, el cual deber mantenerse en PBS para evitar su desecacin. A continuacin se procede a colocarlo en fijador.

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TECNICA HISTOLGICA DE RUTINA

Una tcnica histolgica comprende el conjunto de procedimientos a los que se somete una muestra para su anlisis microscpico. La elaboracin de preparaciones histolgicas pasibles de ser observadas tanto por microscopa fotnica como electrnica, obedece a una serie de principios generales que son comunes para ambas. En este repartido nos referiremos fundamentalmente a la tcnica histolgica de rutina, empleada en la realizacin de preparados para su observacin al microscopio ptico. Para obtener una preparacin histolgica es necesario procesar el material siguiendo las etapas que se detallan a continuacin: 1 2 3 4 5 6 7 Obtencin del material biolgico. Fijacin. Inclusin. Corte (microtoma). Coloracin. Montaje. Identificacin y archivo.

1 - Obtencin del material biolgico Los fragmentos de rganos tejidos a observar, deben ser extrados inmediatamente despus de la muerte del animal, mediante tcnicas quirrgicas (ej. biopsia). Una vez muerto el animal, se inicia un proceso de autlisis que conduce a la prdida de la estructura propia de la materia viviente, por consiguiente es de fundamental importancia proceder con rapidez, colocando la pieza lo ms pronto posible en el lquido fijador. 2 - Fijacin Tiene por objetivo preservar la estructura celular y tisular, de modo que sta se mantenga lo ms similar posible a la observada en el animal vivo. La efectividad de cada lquido fijador estar dada por su capacidad para lograr esta preservacin. FIJAR significa inmovilizar, y esto puede lograrse empleando medios fsicos, qumicos una combinacin de ambos.

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* Medios fsicos
) CONGELACION: con CO2; el material puede estar previamente

fijado o no. b) CRIOSTATO: enfriamiento rpido a -20C. c) CALOR: se hierve la pieza en un lquido especial durante ms o menos un minuto (biopsias extemporneas). d) DESECACION. * Medios qumicos a - ACIDOS MINERALES OXIDANTES FIJADORES c - ACIDOS ORGANICOS REDUCTORES d - REDUCTORES ORGANICOS b - SALES METALICAS

a - Acido crmico, cido smico. b - Bicloruro de mercurio, bicromato de potasio. c - Acido actico, cido tricloractico, cido pcrico. d - Formol, acetona, alcohol etlico, alcohol metlico.

* Cualidades de un buen fijador Rpida penetracin. Penetracin homognea. No producir retraccin de los tejidos. Revelar los organelos celulares. Evitar la desaparicin de las sustancias solubles (ej. glucgeno). Cuidar la actividad de ciertas enzimas. Permitir la observacin de elementos celulares visibles con coloraciones vitales. - No crear artefactos. - Asegurar a clulas y tejidos una conservacin e imagen fiel. * El fijador: Da a la pieza un color que no es el real. En general se usa a temperatura ambiente. Para enzimas debe actuar lentamente y a una temperatura de 0 a 4C. Lo ideal es que los fijadores acten a pH neutro.

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Desde el punto de vista qumico los buenos fijadores son, por lo general, molculas que poseen por lo menos dos cualidades esenciales: son pequeas de modo de poder acomodarse entre las molculas de la materia viviente y forman fcilmente enlaces, particularmente con los grupos carboxilo y amino de las protenas. * Formas de fijacin a - INMERSION: se sumerge la pieza en un determinado volumen de lquido fijador. En este caso existen una serie de reglas prcticas que son importantes: - El volumen del lquido fijador debe ser de 20 a 40 veces mayor que el del fragmento a fijar. - El tiempo de fijacin debe regularse empricamente ya que depende de factores diversos, como por ej. el tamao de la pieza, la constitucin del tejido, el poder de penetracin del lquido fijador, el objetivo final de la tcnica a emplear, la temperatura de fijacin, etc. - El fijador debe estar en contacto con todas las superficies disponibles de la pieza. En el caso de rganos huecos, la cavidad tambin debe rellenarse con fijador. b - INYECCION: se realiza utilizando el sistema vascular del rgano por otras vas. c - PERFUSION: el fijador se gotea a travs de una cnula insertada en el sistema vascular del animal anestesiado, a temperatura corporal, de manera que la propulsin del lquido fijador se lleve a cabo con el propio flujo sanguneo del organismo viviente.

* Fijadores qumicos Generalmente se emplean fijadores simples o primarios, y mezclas fijadoras. Fijadores simples: los ms utilizados son el formol, el tetrxido de osmio (OsO4) y el glutaraldehdo. Todos ellos se emplean en solucin acuosa con medios que permiten regular el pH de la solucin (buffers).

Glutaraldehdo

tetrxido de osmio

formaldehdo

Las mezclas fijadoras: son en su mayora soluciones acuosas de fijadores primarios combinados entre s, y en los cuales se incluyen sustancias qumicas

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que favorecen la penetracin del fijador, o regulan el pH del lquido fijador, contienen determinados mordientes que favorecen la coloracin subsiguiente. 3 - Inclusin Luego que una pieza ha sido fijada se debe proceder a impregnarla con una sustancia plstica, que sea fcilmente manejable y que, por su mayor dureza, permita obtener cortes finos (3 a 10 ). Dicha sustancia debe penetrar ntimamente en el tejido u rgano, de manera homognea, formando con el material una masa de consistencia pareja. Esta operacin se denomina IMPREGNACIN IMBIBICIN. El paso siguiente es la INCLUSIN, que consiste en colocar la pieza en el interior de un bloque de la misma sustancia, tratando de ubicar los tejidos u rganos en posicin adecuada (orientarlos), para obtener cortes en el plano deseado. Los productos empleados para la inclusin se denominan genricamente masas de inclusin. Para que estas sustancias penetren ms fcilmente en los tejidos, deben estar en solucin fundidas. Al enfriarse, dichas masas plsticas recobran su consistencia, posibilitando la realizacin de los cortes finos. ACUOSOS (gelatina, agua, etc.) MEDIOS DE IMPREGNACIN E INCLUSIN

ANHIDROS (parafina, celoidina, ceras, resinas, etc.)

En microscopa ptica el ms empleado es la parafina. Para microscopa electrnica se utilizan las resinas (araldita, epon, spurr, etc.). En general, estas sustancias son insolubles en agua y escasamente solubles en alcohol, por lo que es necesario antes de la impregnacin, deshidratar la pieza y luego embeberla con un solvente del medio de inclusin. Los pasos a seguir son: a - Deshidratacin. b - Diafanizacin aclaramiento. c - Impregnacin con el medio de inclusin. d - Inclusin definitiva de la pieza. a - Deshidratacin En este paso la sustancia ms comnmente utilizada es el alcohol etlico. La pieza es sometida a baos sucesivos en alcoholes de graduacin creciente, de modo que la deshidratacin se realice paulatinamente, evitando la retraccin de los tejidos. Eventualmente pueden emplearse otros alcoholes (metlico, butlico, etc.). b - Diafanizacin

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Consiste en la impregnacin del material con un solvente del medio de inclusin. El producto empleado en este paso se denomina lquido intermediario, y debe ser miscible tanto con alcohol como con medio de inclusin. Los productos ms usados son: xilol, benzol, toluol, cloroformo y acetona. Cuando la sustitucin del alcohol por el intermediario es total, las sustancias empleadas comunican a la pieza su alto ndice de refraccin, tornndola brillante. c - Impregnacin con el medio de inclusin Luego de la diafanizacin, la pieza puede colocarse directamente en el medio de inclusin, someterse previamente a un pasaje con una mezcla proporcional de lquido intermediario y medio de inclusin. En la inclusin con parafina, estos pasajes se llevan a cabo en el interior de una estufa graduada entre 58 y 60 C (temperatura a la que se funde la parafina). Comnmente se realizan 2 3 baos sucesivos con parafina, de modo de eliminar en cada uno de ellos, los vestigios de lquido intermediario, e ir embebiendo progresivamente la pieza en el medio de inclusin. d - Inclusin definitiva de la pieza Para la confeccin del bloque se utilizan moldes (barras de Leuckart, caja de plstico papel, moldes de silicona, etc.), donde se coloca el medio de inclusin fundido. Con una pinza se orienta la pieza de tejido en la posicin adecuada; se identifica el material, y se deja enfriar a temperatura ambiente en la heladera, en caso de trabajar con parafina. Cuando se trabaja con resinas, estas generalmente se llevan a la estufa hasta completar su polimerizacin. Todos los pasos que acabamos de mencionar, variarn su duracin segn de que material se trate y segn el tamao de la pieza.

4 - Corte (Microtoma) Fijar el bloque que se desea cortar en la platina por la cara opuesta a la cara de corte, cuidando que quede firme. Colocar la platina con el bloque en el micrtomo. Tallar con hoja de afeitar una cara de corte que posea un margen de 2 3 mm de parafina a cada lado de la pieza. Es conveniente procurar que los bordes superior e inferior de dicha cara sean paralelos para facilitar la recoleccin de cortes seriados. Tambin se debe tratar de tallar una cara lo mas pequea posible. Esto disminuye la resistencia que ofrece el bloque a la cuchilla como tambin la aparicin de pliegues en los cortes realizados, permitiendo adems evitar posibles melladuras de la cuchilla. Cuando se ha concluido con el tallado se procede a la colocacin de la cuchilla en el micrtomo.

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Siempre es aconsejable asentar la cuchilla antes de cortar. Esto se realiza con una banda de cuero tensada y lubricada (asentador), sobre la cual se desliza el filo de la cuchilla. Se debe avanzar con el lomo de dicha cuchilla hacia adelante (el filo queda hacia atrs), y procurando asentar de forma homognea todo el filo de la cuchilla. Al finalizar se debe limpiar la cuchilla con un pao humedecido en xilol a favor del filo. La cuchilla se coloca en el micrtomo con una inclinacin de unos 15 a 25 respecto de la cara del bloque (el ngulo vara segn el tipo de material, cuanto ms duro, menor es el ngulo). La cara del bloque se orienta paralela al filo de la cuchilla. Regular el micrtomo para el espesor de cortes que se desea (ptimo de 3 a 5 m). Desgastar el bloque hasta que la cara de corte salga entera y comiencen a observarse muestras del material incluido. La tira de cortes se recoge tomando al primero de ellos con una pinza roma y al ltimo con un pincel humedecido. As se los lleva hasta un bao de agua tibia cuya temperatura sea algo menor al punto de fundicin de la parafina empleada en la confeccin del bloque. Esto permite estirar los cortes realizados, y su recoleccin sobre porta objetos de vidrio previamente albuminados. La cara brillante de la cinta de cortes es la que se coloca en contacto con el agua. La aparicin de pliegues puede solucionarse aumentando un poco la temperatura del agua. El medio de montaje sirve para pegar los cortes al vidrio. Generalmente se usa Albmina de Mayer, la cual disminuye la tensin superficial y aumenta la capilaridad permitiendo la adhesin. Para levantar los cortes del bao, se sumerge el portaobjetos albuminado inclinndolo por debajo de los cortes que, con un pincel una aguja, se orientan sobre l a medida que lo retiramos del agua. Se centran los cortes en el vidrio, se dejan escurrir 2 3 minutos y se ponen a secar.

5 - Coloracin La coloracin debe ser contrastada. La afinidad del colorante con determinada estructura va a depender de condiciones fsico-qumicas. Cada estructura presenta distinta apetencia por los diferentes colorantes.

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- Tincin Es la unin molecular entre colorante y tejido. - Impregnacin Es la precipitacin de sales metlicas pesadas sobre determinadas estructuras. - Coloracin directa La solucin de colorante acta directamente sobre el tejido la clula. - Coloracin indirecta Se necesita una sustancia mordiente que puede estar en el colorante separada. - Coloracin en bloque Se realiza previo a la inclusin del material. - Coloracin progresiva Se deja actuar un colorante durante un tiempo determinado y luego se detiene su accin (generalmente con agua). - Coloracin regresiva Se sobrecolorea la preparacin y luego se trata con un diferenciador (diferente para cada colorante), siempre controlando al microscopio. La accin del diferenciador se detiene con el lavado. - Colorante cido La sustancia activa es un cido que tiene un grupo bsico inactivo incoloro. Tie estructuras predominantemente bsicas (por ej. citoplasma). - Colorante bsico La sustancia activa es una base que tiene un grupo cido inactivo. Tie estructuras de naturaleza cida (por ej. ncleo). - Colorante neutro Mezcla de colorantes cidos y bsicos con grandes complejos moleculares poco solubles en agua, pero s solubles en alcohol. Dan una coloracin intermedia. Se utilizan en citologa hematolgica. La coloracin de rutina se realiza con Hematoxilina y Eosina. HEMATOXILINA - Se extrae de la pulpa del Palo Campeche (rbol centroamericano). - Viene en polvo en cristales de color amarillo pardo. - Es soluble en agua y en alcohol, pero por s sola no colorea, necesitando entonces de un oxidante y de un mordiente. Oxidantes Iodato de soldio Iodato de potasio Permanganato de potasio Agua oxigenada Mordiente - Alumbre de potasio

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Hematoxilina + oxidante = Hematena La Hematena por s sola no colorea, sino que necesita un mordiente. Se forma entonces un complejo Laca - Hematoxilina - Colorante, que s colorea. EOSINA - Las eosinas son xantenos cidos colorantes de ftalena. - Las ms comunes son: - Eosina amarilla (yellow), es la ms usada. - Eosina B (azul). - Floxina. - Eritrocina (est halogenada con iodo en lugar de bromo). - Zafranina. - Rosa de Bengala. - El nombre Eosina proviene de aurora (naranja). - Su punto de solubilidad es del 44 % en agua y del 7 % en alcohol. - Se puede usar un acentuador del color (por ejem. cido actico al 0.2 % cido tnico). - D una buena coloracin citoplasmtica de fondo.

6 - Montaje La preservacin de las preparaciones histolgicas se realiza generalmente empleando un medio de montaje y colocando sobre ellas un cubre objeto de vidrio. El Blsamo de Canad es el medio de montaje clsico, aunque existen actualmente medios sintticos (por ej. Entellant), con los cuales se obtienen tambin muy buenos resultados. Es importante evitar la hidratacin del preparado para obtener una visualizacin ptima. Para ello debemos actuar con premura luego de pasar el preparado por el ltimo pasaje con xilol. - Escurrir brevemente el exceso de xilol. - Colocar una gota de medio de montaje sobre el corte sobre el cubre objeto. - Colocar el cubre objeto sobre el corte dejndolo caer en ngulo agudo y tratando de evitar la formacin de burbujas.
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- Presionar ligeramente con un pao limpio. - Eliminar el exceso de medio de montaje con un pao humedecido en xilol. 7 - Identificacin y archivo - Etiquetar rotulando con lpiz la preparacin. - Tambin se puede grabar el extremo del porta objeto con diamante.

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ANLISIS DE PREPARADOS HISTOLGICOS Y DE EMBRIONES IN TOTO

Cortes histolgicos de embriones de pollo en estados tempranos de desarrollo: Seccin transversal a nivel de la regin de prolongacin ceflica. Coloracin con Hematoxilina - Eosina (H.E.). Reconocer: placa neural (surco y pliegue), notocorda y/o prolongacin ceflica, ectodermo, endodermo, mesodermo lateral, celoma. Seccin similar, a nivel del Nodo de Hensen (H.E.). Reconocer: ectodermo, mesodermo, endodermo, clulas que formarn la notocorda. Seccin de embrin de pollo en gastrulacin, a nivel de la lnea primitiva (H.E.). Reconocer: surco primitivo, ectodermo, mesodermo, endodermo, pliegues primitivos. Seccin transversal de un embrin somtico de pollo, mostrando el complejo axial (H.E.). Reconocer: ectodermo, endodermo, tubo neural, notocorda, somites, mesodermo intermedio, mesodermo somtico + ectodermo: somatopleura mesodermo esplcnico + endodermo: esplacnopleura celoma embrionario y extraembrionario Preparados "in toto" de embriones de pollo (st: 8 - 9; 11; 11 - 12; 17 - 18) Identificar las siguientes estructuras: vesculas enceflicas: prosencfalo, mesencfalo y romboencfalo vesculas pticas vesculas ticas pliegue amnitico ceflico o amnios en formacin tubo neural somites notocorda nodo de Hensen lnea primitiva venas vitelinas anexos embrionarios

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FIJADORES
FORMOL AL 10 % EN SOLUCION SALINA

Formaldehdo al 40 % ........................................................... 100 ml. Cloruro de sodio...................................................................... 9 gr. Agua destilada.....................................................................900 ml. El llamado formol puro comercial, es gas formaldehdo al 40 % en agua. Algunas de las alteraciones que produce, pueden amortiguarse diluyndolo en suero fisiolgico en vez de agua, y entonces lo llamamos formol salino. Para esto tambin puede utilizarse buffer fosfato. PARAFORMALDEHIDO AL 4 %

Paraformaldehdo................................................................... 4 gr. PBS.................................................................................. 100 ml. Para que se disuelva hay que ponerlo a bao mara a 60C en agitador magntico con calor. En lugar de PBS puede usarse Buffer fosfato. BOUIN

Solucin acuosa saturada de cido pcrico..................................... 75 ml. Formol............................................................................... 25 ml. Antes de usar, agregar 0.5 ml de cido actico por cada 10 ml de solucin.

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SOLUCIONES AMORTIGUADORAS (buffer) PBS

Cloruro de sodio (NaCl) ............................................................ 8 gr. Cloruro de potasio (KCl) ......................................................... 0.2 gr. Fosfato de sodio (Na2PO4 dihidratado) ....................................... 1.14 gr. Fosfato dibsico de potasio (KH2PO4).......................................... 0.2 gr. Agua destilada........................................................................ 1 lt. pH 7.2 BUFFER FOSFATO Ambas se preparan diluyendo el PM en 500 ml 10

Solucin A Na2HPO4 0.2M Solucin B NaH2PO4 0.2M

Solucin de uso Solucin A ....................................................................... 81 ml. Solucin B........................................................................ 19 ml. Agua destilada.................................................................... 100 ml. Son 200 ml de solucin de uso 0.1 M a pH 7.2 7.4.

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INCLUSIN DEL MATERIAL EN PARAFINA Tiempos aproximados para una pieza pequea (1 x 2 mm) Alcohol 70.............................................................. 15 min. Alcohol 80.............................................................. 15 min. Alcohol 95.............................................................. 15 min. Alcohol 100.............................................................20 min. Cloroformo ..................................... 3 cambios de 10 min. c/u. Parafina I (en estufa a 58 - 60 C) ............................... 30 min. Parafina II (en estufa a 58 - 60 C)............................... 30 min. Parafina III (en estufa a 58 - 60C) .............................. 30 min. Confeccin de los bloques. * Puede detenerse el procesamiento del material y dejarlo de un da para otro en: alcohol 70 , cloroformo (pero endurece la pieza), parafina fuera de la estufa. * Los tiempos de deshidratacin e impregnacin se fijan empricamente teniendo en cuenta el tamao de la pieza y las caractersticas del tejido.

ALBUMINA DE MAYER (medio de montaje) Licuar una clara de huevo y dejar reposar 24 hs. (tambin se puede cortar con tijera colocarse en un recipiente con perlas de vidrio y agitar). Al da siguiente agregar idntico volmen de glicerina pura y una piedra de timol, que la preserva de la contaminacin con bacterias u hongos.

COLORANTES HEMATOXILINA DE MAYER - Alumbre de potasio................................................................. 50 gr. - Agua destilada .................................................................... 800 cc. Se disuelve al calor y se deja enfriar de un da para otro. - Hematoxilina...........................................................................1gr. Se agita y se espera 30 minutos. - Iodato de sodio potasio.......................................................200 mg. Se agita y se espera 10 minutos. - Acido ctrico............................................................................1 gr. (acenta la coloracin nuclear) Agitar. - Hidrato de cloral....................................................................50 gr. (conservador) Agitar, completar con agua destilada a 1 litro, filtrar y usar.

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EOSINA al 0.5 %

- Eosina ............................................................................... 1 gr. - Agua destilada .................................................................. 120 cc. Esta dilucin se realiza en caliente. Se deja enfriar y se agrega: - Alcohol 96 100 ................................................................. 80cc.

COLORACIN CON HEMATOXILINA DE MAYER - EOSINA - Deparafinar con xilol. - Hidratar: alcohol 100 ...................................................... 1 pasaje. alcohol 96 ....................................................... 1 pasaje. - Lavado: agua corriente ..................................................... 1 pasaje. agua destilada..................................................... 1 pasaje. - Coloracin: Hematoxilina ................................................ 7 a 10 min. - Virado: agua corriente .................................................. 10 a 15 min. - Lavado: agua destilada ......................................................1 pasaje. - Coloracin: Eosina............................................................... 2 min. - Lavado: agua corriente...................................................... 1 pasaje. - Deshidratacin: alcohol 96 .............................................. 2 pasajes. alcohol 100.............................................. 2 pasajes. - Intermediario: Xilol ........................................................ 2 pasajes. - Montaje.

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