UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL

TRABALHO DE BIOLOGIA MOLECULAR

Aplicao da Biologia Molecular nas cincias forenses

Bruna Ferreira Mathiuzzo - RGM: 88766 8 2B Cntia Nunes Wanderley RGM: 87215-6 3B Daniel Viana RGM: 85026-8 - 3B Janice Creisieli Rosa RGM: 85553 7 3B Leandro Bernal RGM: 87234-2- 3B

SO PAULO 2011

Introduo

As Cincias Forenses no so uma cincia especfica, mas sim um grupo de diversas reas que convergem para um mesmo fim, resolver crimes. Todas as informaes que advm destas sub-reas podero ser utilizadas como prova em tribunal. Ela dividida em inmeras reas, porm a que nos convm citar a biologia e gentica forense: consiste em tcnicas e conhecimentos sobre gentica e biologia molecular que auxiliam a justia a resolver crimes. Os avanos nas tecnologias de DNA surtiram um enorme impacto no campo da cincia forense. Com uma incrvel sensibilidade e um alto poder de discriminao, a anlise de DNA tem sido uma poderosa ferramenta para a identificao humana e investigaes criminais. O uso da biologia molecular - um dos ramos atuais da gentica forense - para elucidar crimes no novidade em outros pases. J no Estado do Rio de Janeiro, as aplicaes mais comuns dos exames de DNA priorizam a identificao dos desaparecidos, investigao de paternidade, alm do levantamento do perfil gentico das populaes. No Rio, bilogos se dedicam s anlises do DNA humano em duas instituies: o Instituto de Pesquisa e percias em Gentica Forense da Polcia Civil (IPPGF) e o Laboratrio de Diagnsticos por DNA da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ).

Aplicao da biologia molecular nas cincias forenses

O avano da cincia e tecnologia a nvel forense teve seu ponto culminante em meados dos anos 80, quando as tcnicas de identificao fundamentadas na anlise direta do cido desoxirribonuclico (DNA), tornaram-se uma das mais poderosas ferramentas para a identificao humana e investigaes criminais. A determinao de identidade gentica pelo DNA pode ser usada para demonstrar a culpabilidade dos criminosos, exonerar os inocentes, identificar corpos e restos humanos em desastres areos e campos de batalha, determinar paternidade com confiabilidade praticamente absoluta, elucidar trocas de bebs em berrios e detectar substituies e erros de rotulao em laboratrios de patologia clnica. O primeiro mtodo de utilizao da anlise do DNA para identificar indivduos foi desenvolvido em meados da dcada de 1980 por Sir Alec Jeffreys, da Universidade de Leicester e, apesar do seu enorme poder potencial, houve srias reservas quanto o seu uso real, pois no incio, havia muitas dvidas quanto reprodutibilidade e confiabilidade dos mtodos. Com o conhecimento atual, ao menos duas grandes vantagens devem ser citadas sobre a tipagem molecular: o DNA possui uma alta estabilidade qumica mesmo aps um longo perodo de tempo e est presente em todas as clulas nucleadas do organismo humano, o que facilita a obteno do mesmo. As primeiras tcnicas forenses de identificao humana eram convenientes apenas para anlise de DNA de evidncias biolgicas que contivessem clulas nucleadas. Atualmente, com a implementao do seqenciamento do DNA mitocondrial, essa limitao tem sido superada. Se antes, impresses digitais e outras pistas eram usadas para desvendar crimes; hoje, so inmeros os espcimes biolgicos, dos quais o DNA pode ser extrado. Podemos encontr-lo em pequenas amostras de sangue, ossos, smen, cabelo, dentes, unhas, saliva, urina, entre outros fluidos, e anlises cuidadosas desse material ajudam a identificar criminosos. As aplicaes da Biologia Molecular no laboratrio criminal centralizam-se, em grande parte, na capacidade da anlise do DNA em identificar um indivduo a partir de cabelos, manchas de sangue e fluidos corporais, entre outros itens recuperados no local do crime. Essas tcnicas so conhecidas como datiloscopia gentica, embora o termo mais preciso e utilizado para design-las seja perfil de DNA. O perfil de DNA se baseia no fato de que gmeos idnticos so os nicos indivduos que possuem cpias idnticas do genoma humano, mas este, em indivduos diferentes, contm 3

muitos polimorfismos, que so posies onde a seqncia de nucleotdeos difere em cada membro da populao. Para ser considerado um polimorfismo, o alelo raro de um determinado loco deve estar presente em mais de 1% dos indivduos da populao. Assim, com esta grande variao no nmero e no tipo de variaes, fica possvel identificar uma pessoa com base no seu padro de polimorfismos. A tipagem do DNA para finalidades forenses baseada nos mesmos princpios fundamentais e usa as mesmas tcnicas que so rotineiramente empregadas em uma ampla variedade de situaes mdicas e genticas, tais como: o diagnstico e o mapeamento gentico. O DNA resistente a muitas condies que destroem a maioria dos outros compostos biolgicos, como as protenas. Alm disso, somente poucas clulas nucleadas, que contenham pequenas quantidades de DNA, so necessrias para a identificao de um indivduo. Por essas razes, as anlises diretas do DNA freqentemente do resultados teis em situaes em que os mtodos mais antigos, como os que empregavam grupos sangneos e enzimas, fracassavam. Com uma incrvel sensibilidade e poder de discriminao, a anlise de DNA tem sido a figura-chave e promete grandes progressos no campo da cincia forense. Por possuir um alto poder de discriminao, a tipagem do DNA tem fornecido aos investigadores uma grande chance de excluir suspeitos que no esto relacionados cena do crime. O nmero de tribunais que tm aceitado evidncias baseadas no DNA cresce a cada dia, levando-nos a crer que, em um futuro no muito distante, esta tecnologia ser empregada em todo o Sistema Legal. Porm, para que no ocorra nenhum tipo de erro e para a preciso dos resultados, regras rgidas de coleta e processamento das amostras devem ser adotadas. Nas ltimas dcadas, muitas tcnicas foram desenvolvidas, objetivando a identificao gentica precisa de indivduos. Dentre elas, as mais significativas so: RFLP, VNTR, PCR e STR, sendo a PCR mais conhecida.

Fundamentos da Tcnica de PCR

Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao servio da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califrnia, recebeu o prmio Nobel da Qumica pelo desenvolvimento de um mtodo que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta tcnica faz parte integrante da moderna biotecnologia 4

molecular, tendo trazido um enorme progresso a reas como o diagnstico de doenas, medicina forense entre muitas outras para alm da Investigao em Biologia. A tcnica de PCR (polymerase chain reaction - reao em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicao de DNA que ocorre in vitro. Durante o PCR so usadas elevadas temperaturas de forma a separar as molculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo ento a ligao de oligonucleotdeos iniciadores (primers), tambm em cadeia simples e geralmente constitudos por 15 a 30 nucleotdeos, obtidos por sntese qumica. Para amplificar uma determinada regio so necessrios dois iniciadores complementares das seqncias que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3', de modo a permitir a atuao da DNA polimerase durante a sntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar. Para realizar PCR so necessrias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampo salino contendo a polimerase, oligonucleotdeos
2+

iniciadores,

os

quatro

desoxirribonucletideos constituintes do DNA e o cofator Mg . Esta mistura submetida a vrios ciclos de amplificao que consistem em: Desnaturao do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96C), de modo a separar as duas cadeias. Associao dos iniciadores por ligaes de hidrognio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associao, a mistura de reao arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65C, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da seqncia a amplificar). Extenso dos iniciadores atravs da sntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72C) O processo envolvendo estes trs passos pode ser repetido vrias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possvel aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentrao de DNA pr-existente (figura 2). Em teoria, se for possvel levar a cabo 25 ciclos de amplificao seguidos, a concentrao de DNA aumentaria 225 vezes embora, na prtica, devido a alguma ineficincia no processo de amplificao, esse aumento fique por um milho de vezes. Como na tcnica de PCR se encontram envolvidos vrios ciclos de amplificao, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contnua e automatizada, os vrios ciclos de aquecimento e arrefecimento. Para tal ser concretizvel, as DNA polimerases utilizadas devero ser termoestveis, tendo tal sido conseguido com o isolamento da DNA polimerase da estirpe termoflica Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) que atua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da especificidade da reao. De referir 5

ainda que o produto de PCR possa ser visualizado aps eletroforese em gel e o seu tamanho ser estimado por comparao com padres lineares de DNA.

As principais vantagens da tcnica de PCR so:

Velocidade e facilidade de utilizao: a clonagem de DNA por PCR pode ser realizada em poucas horas usando-se um equipamento relativamente simples, cuja funo fundamental a variao de temperatura em cada passo da tcnica. Uma reao de PCR consiste de 30 ciclos contendo as etapas de desnaturao, sntese e pareamento, com cada ciclo individual levando em geral 3 a 5 minutos em um termociclador automatizado, o que totaliza menos de trs horas para todo o processo. Evidentemente, algum tempo tambm necessrio para a construo e a sntese dos oligonucleotdeos que serviro como primers, mas isso foi simplificado pela disponibilidade de programas de computador para projetar primers e pela sntese comercial rpida dos oligonucleotdeos desejados. Sensibilidade: a PCR capaz de amplificar seqncias a partir de quantidades nfimas do DNA - alvo e, at mesmo, do DNA de uma nica clula. Esta vantagem torna a tcnica particularmente til na anlise forense, quando, em muitos casos, a quantidade de material biolgico, e, portanto de DNA extrado de algumas amostras, muito pequena, como em fios de cabelo ou traos de saliva em tocos de cigarro. Desta maneira, a tcnica possibilita a tipagem do DNA em amostras de prova que no poderiam ser analisadas atravs de outras tcnicas, como por exemplo, o Southern, uma vez que esta tcnica necessita de uma grande quantidade de DNA total. Alm disso, a pequena quantidade de DNA, necessria para a PCR, torna mais fcil guardar pores de amostras para repetir os testes no mesmo ou em outro laboratrio. Tal sensibilidade excelente tem fornecido novos mtodos para o estudo da origem molecular de doenas e tem encontrado numerosas aplicaes na cincia forense, no diagnstico, na anlise de ligaes genticas, utilizando a classificao de um nico tipo de esperma, e nos estudos paleontolgicos em que as amostras podem conter um nmero insignificante de clulas. No entanto, a sensibilidade extrema do mtodo implica que enormes cuidados devem ser tomados para evitar a contaminao da amostra com DNA de outras fontes. Robustez e possibilidade de anlise de amostras degradadas: a PCR pode permitir a amplificao de seqncias especficas a partir de material no qual o DNA est gravemente 6

degradado ou embebido em um meio onde o isolamento de DNA problemtico. Como o Southern utiliza DNA genmico total, necessrio que este DNA esteja em bom estado, ou seja, que as molculas estejam intactas. Mas em gentica forense, nem sempre as amostras biolgicas so novas e se encontram em um bom estado de conservao, o que compromete a integridade do genoma da clula a ser analisada. Uma vez que somente um fragmento do DNA isolado e amplificado pela PCR, uma enorme vantagem desta tcnica permitir a utilizao, com sucesso, de amostras que contenham DNA degradado. Assim, atravs da PCR, possvel a tipagem do DNA em amostras que de outra maneira no poderiam ser analisadas, como amostras antigas e j decompostas, restos mortais de vtimas de incndios ou acidentes e corpos em decomposio, por exemplo.

Concluso

A anlise do DNA um dos maiores progressos tcnicos da investigao criminal desde a descoberta das impresses digitais. Mtodos para determinar o perfil do DNA esto firmemente embasados na tecnologia molecular. Quando a determinao do perfil feita com cuidados adequados, os resultados so altamente reprodutveis. Os mtodos baseados na PCR so imediatos, requerem apenas uma pequena quantidade de material e podem fornecer identificao no-ambgua de alelos individuais. A tecnologia do perfil e os mtodos relacionados anlise de DNA progrediram a ponto de no colocar em dvida a admissibilidade dos dados sobre o DNA quando adequadamente coletados e analisados. No futuro, espera-se que as tcnicas de biologia molecular existentes sejam aprimoradas e que novos e melhores mtodos para anlise sejam desenvolvidos, a fim de que a grande maioria dos casos de investigaes forenses cveis e criminais tenha um desfecho que no possa ser questionado nos tribunais.