UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS

MTODOS DE SEPARAO E IDENTIFICAO DE SUBSTNCIAS VEGETAIS VISANDO A OBTENO DE MARCADORES QUMICOS

MARISA DE OLIVEIRA LOPES

ALFENAS-MG 2011

1. Introduo

A quimiotaxonomia fornece dados de grande validade para a reestruturao de sistemas de classificao como tambm na rea farmacutica, onde esse conhecimento, aliado etnofarmacologia, tem permitido a descoberta de novos frmacos de origem natural, que tm sido utilizados sem alteraes estruturais ou como modelo para a sntese de novas substncias ativas. Alm disso, fornece dados para a padronizao da matria-prima at o produto final, garantindo a qualidade de medicamentos fitoterpicos. A padronizao uma das exigncias da ANVISA para a produo de fitomedicamentos, e tem como objetivo controlar tanto a matria-prima vegetal como os prprios medicamentos. Dessa forma, o extrato padronizado utilizado em testes clnicos tem que ser exatamente igual ao que vai chegar ao mercado. Este controle contribui, sem dvida, para o trip eficcia, segurana e qualidade. Portanto, a obteno de marcadores qumicos um processo que auxilia a garantir a qualidade e a concentrao do princpio ativo no extrato. 2. Desenvolvimento da quimiotaxonomia Indcios do uso de plantas medicinais e txicas foram encontrados nas mais antigas civilizaes, indicando que o homem primitivo, ao procurar plantas para seu sustento, foi descobrindo espcies com ao txica ou medicinal, dando incio a uma sistematizao emprica das formas vegetais de acordo com o uso que podia fazer delas. Os sistemas mais antigos baseavam-se em caractersticas morfolgicas externas, agrupando as espcies em divises naturais, dentre os quais o mais conhecido o de Linnaeus. Com o passar do tempo, os estudos de Darwin e Wallace trouxerem os sistemas filogenticos, baseados na teoria da evoluo e estes refletem a histria evolutiva dos txons, arranjando-os de acordo com as afinidades existentes entre eles. Destes, o que mais se destacou na metade do sculo XX, foi o de Engler. A maioria dos livros didticos brasileiros ainda est baseada neste sistema, cuja ltima edio, pstuma, foi apresentada por Melchior e colaboradores em 1964. Atualmente, os sistemas usuais, elaborados com base em dados morfolgicos, fitoqumicos, micromorfolgicos (ultra-estruturais) entre outros, so sempre questionados, sofrendo alteraes a cada nova descoberta. Cada espcie vegetal possui centenas de caractersticas morfolgicas externas e internas, alm de caractersticas embriolgicas, qumicas e genticas, utilizadas para classific-la nos diferentes txons. As caractersticas morfolgicas externas possibilitam a classificao de uma espcie vegetal em qualquer nvel hierrquico. No entanto, algumas vezes so necessrias observaes complementares da organizao interna, estudos embriolgicos e/ou anlise dos metablitos secundrios para estabelecer fidedignamente tal classificao. A observao de que a ocorrncia destes metablitos secundrios restrita a determinados grupos de plantas abriu um amplo campo de estudos, a quimiotaxonomia.

Os primeiros trabalhos publicados abordando a quimiotaxonomia datam do final do sculo XVII. Grew (1673) relacionou certos grupos de plantas com os respectivos usos teraputicos. A seguir, muitos autores contriburam para o desenvolvimento desses conceitos. Entre eles, destacam-se Helen Abbott (1886, 1887), que previu a importncia da qumica na taxonomia. O interesse na utilizao da qumica (quimiotaxonomia ou quimiossistemtica) e da bioqumica (sistemtica bioqumica ou taxonomia molecular) em sistemtica vegetal tem aumentado rapidamente nos ltimos anos, principalmente devido ao desenvolvimento de mtodos analticos aprimorados que possibilitaram a anlise de um grande nmero de plantas com maior rapidez e relativa facilidade. Os processos so selecionados de acordo com a natureza dos compostos em estudo. Para compostos volteis, por exemplo, a cromatografia gasosa associada espectrometria de massas tem fornecido resultados excelentes tanto quantitativos quanto qualitativos. Atualmente, os produtos do metabolismo secundrio considerados mais apropriados aos estudos quimiotaxonmicos so alcalides, aminocidos no proticos, poliacetilenos, iridides e compostos fenlicos, especialmente flavonides e taninos hidrolisveis. Todos estes compostos so de ocorrncia restrita, sendo amplamente utilizados como marcadores quimiotaxonmicos. 3. Conceito de marcador qumico Marcador qumico definido pela RDC n 48 da ANVISA de 16 de maro de 2004 como sendo Componente ou classe de compostos qumicos (ex: alcalides, flavonides, cidos graxos, etc.) presente na matria-prima vegetal, idealmente o prprio princpio ativo, e preferencialmente que tenha correlao com o efeito teraputico. Utilizado como referncia no controle de qualidade da matria-prima vegetal e dos medicamentos fitoterpicos. 4. Extrao Em anlises fitoqumicas, quando no se conhece previamente o contedo do material a ser analisado, costuma-se submeter o material vegetal a sucessivas extraes, com solventes de polaridade crescente, conseguindo-se assim, uma extrao fracionada, em que as diferentes fraes contm compostos de polaridade tambm crescentes. Como a composio qumica das plantas extremamente complexa, muito frequentemente ocorre a extrao concomitante de vrios tipos de substncias, farmacologicamente ativas ou no, desejadas ou no. Por isso deve-se primeiramente definir, com a maior preciso possvel, o que se deseja obter. De acordo com essa definio e levando-se em considerao os fatores envolvidos no processo extrativo, pode-se escolher o mtodo e o solvente que sero empregados. Constituem os mtodos de extrao slido/lquido: 4.1 Extraes a frio: Turbolizao, Macerao e Percolao. 4.2 Extraes a quente em sistemas abertos: Infuso e Decoco.

4.3 Extraes a quente em sistemas fechados: Extrao sob refluxo e Extrao em aparelho Soxhlet. 5. Estudos qumicos no desenvolvimento tecnolgico e produo de fitoterpicos Compreendem as etapas de identificao dos constituintes mais importantes do vegetal, isolamento e elucidao estrutural das substncias responsveis ou no pela ao biolgica. Esses conhecimentos permitem identificar a espcie vegetal e, conjuntamente com ensaios de atividade biolgica, analisar e caracterizar fraes ou substncias bioativas. Permitem tambm o estabelecimento de marcadores qumicos, que so indispensveis para o planejamento e o monitoramento das aes de transformao tecnolgicas e para os estudos de estabilidade dos produtos intermedirio e final. Nesse sentido, o conhecimento da estrutura qumica tem especial relevncia no caso de substncias facilmente degradveis por fatores tais como luz, calor e solventes, atrelados ao processo tecnolgico. Tal o caso dos polifenis ou dos taninos presentes em Mikania spp. e em Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek, do bisabolol na Chamomilla recutita (L.) Rauschert e da Achillea millefolium (L.), das cumarinas em Mikania glomerata Spreng., assim como de inmeros compostos heterocclicos e polifuncionais de distribuio abundante na natureza. 5.1 Anlise fitoqumica preliminar - Identificao atravs de constituintes qumicos caractersticos Para algumas substncias, em certos vegetais, podem-se realizar reaes de caracterizao diretamente sobre os tecidos do material vegetal, entretanto, na maioria das vezes, para se proceder caracterizao de um determinado grupo de substncias presentes em um vegetal, deve-se primeiro extrair essas substncias com um solvente adequado, para, ento, caracteriz-las no extrato. A identidade baseada nos constituintes qumicos caractersticos da espcie exige conhecimentos fitoqumicos prvios. Esses dados devem objetivar o estabelecimento de reaes qumicas de caracterizao desses constituintes ou de um perfil cromatogrfico para a espcie, bem como o isolamento, a purificao e a elucidao estrutural das substncias principais. Essas substncias devem, preferencialmente, possuir uma relao com a atividade teraputica e/ou com a identificao da espcie. As reaes qumicas permitem verificar a presena de grupos de substncias, por exemplo, flavonides, alcalides, esterides, entre outros, sendo mtodos simples, de rpida execuo e baixo custo. Estas reaes so, geralmente, inespecficas, ocorrendo atravs de grupos funcionais ou estruturas comuns a vrias substncias. Algumas reaes so consideradas especficas, ocorrendo somente com algumas estruturas tpicas de uma nica classe de substncias. Porm, essas reaes so pouco eficazes como nico mtodo de identificao. Algumas das principais reaes de caracterizao dos metablitos secundrios so:

Cumarinas: Observao sob luz ultravioleta (360 nm) - a maioria possui fluorescncia azul-brilhante ou verde. Em soluo alcalina, as cumarinas desenvolvem cor amarelada, devido ao rompimento do anel lactnico. Polifenis: Como so substncias redutoras, oxidam-se com facilidade e resultam em substncias coradas. So usados oxidantes, como o FeCl3 para a caracterizao de polifenis em geral, onde a positividade evidenciada pela colorao azul ou verde-azulada. Para determinar a classe especfica a que pertencem os polifenis necessita-se de reaes particulares a cada grupo, dentre as quais citam-se: Flavonides: O teste da cianidina ou Shinoda (HCl concentrado e magnsio em p) detecta o maior nmero destes compostos que contenham um ncleo -benzopirona, desenvolvendo a cor laranja a vermelha. Taninos: Podem ser caracterizados por reaes de colorao ou de precipitao. O lcool deve ser removido antes destas reaes para evitar interferncias. Precipitao com gelatina, sais de alcalides e metais pesados ainda so utilizados. A Reao de Stiasny (HCl concentrado e formol) diferencia taninos hidrolisveis dos condensados, ocorrendo precipitao destes ltimos e, no sobrenadante pode-se detectar os hidrolisveis atravs de reao com FeCl3, desenvolvendo cor azul. Antraquinonas: A reao caracterstica para este grupo a de Borntragr e o material analisado deve ser totalmente oxidado porque os derivados antraquinnicos ocorrem nos vegetais em vrios nveis de oxidao. Isso conseguido aquecendo-se o material vegetal com mistura de KOH 0,5 M e perxido de hidrognio diludo. O meio dessa reao apolar e, por isso, ela direcionada para a deteco de agliconas antraquinnicas e, anteriormente procede-se a hidrlise. Alcalides: As reaes gerais para alcalides baseiam-se na formao de complexos insolveis (precipitados). Como resultados falso-positivos so bastante comuns para essas reaes, previamente anlise o material deve ser submetido a extraes cido-base. As reaes gerais empregam os reagentes de Dragendorff (iodobismutato de potssio), Mayer (iodo-mercurato de potssio), Wagner (iodo-iodeto de potssio) e Bertrand (cido slico-tngstico) Triterpenos e esterides: A reao de Liebermann-Buchard (anidrido acticoc. sulfrico concentrado) empregada para a deteco de esterides e triterpenos; os primeiros desenvolvem colorao mutvel com o tempo, enquanto que os ltimos desenvolvem colorao estvel. Saponinas: Emprega-se o teste de formao de espuma, estvel na presena de cidos minerais diludos.

5.2 Fracionamento, isolamento e purificao de substncias Os processos de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao isolamento de substncias ativas podem ser monitorados por ensaios direcionados para a avaliao da atividade biolgica. Mais recentemente, tambm vem sendo utilizado o monitoramento das fraes por cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrofotmetro de ultravioleta e espectrmetro de massas (CLAE/UV/EM) ou de ressonncia magntica

(CLAE/RMN). Essa combinao possibilita direcionar as operaes de fracionamento para o isolamento daqueles compostos considerados de maior interesse em funo dos dados espectrais obtidos. 5.2.1 Partio por solventes Pode-se iniciar o fracionamento de um extrato vegetal atravs da partio por solventes orgnicos de polaridade crescente ou atravs da partio cido-base. A partio implica uma dissoluo seletiva e distribuio entre as fases de dois solventes imiscveis. Esse fenmeno pode ser aplicado com vistas separao de componentes de uma mistura. A concentrao de cada um dos componentes em cada fase est relacionada com o coeficiente de partio ou distribuio apresentado por cada substncia. Os melhores rendimentos de extrao so obtidos quando o volume total de solvente a ser utilizado na partio dividido em alquotas. Esse fracionamento por partio, que um mtodo de extrao lquido/lquido, realizado em um funil de separao. 5.2.2 Mtodos cromatogrficos Os mtodos cromatogrficos so os procedimentos de separao e isolamento mais amplamente utilizados atualmente. Servem, tambm, para fins de identificao e anlise de misturas e de substncias isoladas; nesse caso, chama-se cromatografia analtica, enquanto a cromatografia que visa ao isolamento de compostos dita cromatografia preparativa. A cromatografia lquida divide-se em quatro modalidades, de acordo com o processo no qual se baseia a separao dos componentes da mistura a ser processada: a) Cromatografia de partio: separao dos componentes de uma mistura com base nos seus coeficientes de partio entre dois solventes imiscveis que constituem as fases mvel e estacionria; b) Cromatografia de adsoro: baseia-se na adsoro dos componentes de uma soluo sobre a fase estacionria slida constituda por partculas finas de adsorventes polares ou apolares o componente que for mais fortemente atrado pelo adsorvente ser deslocado pela fase mvel de forma mais lenta; c) Cromatografia de troca inica: aplicada na separao de substncias contendo grupamentos ionizveis, como aminocidos e alcalides, baseia-se no intercmbio de ons entre a fase mvel e resinas contendo grupos funcionais do tipo cido sulfnico (resina aninica ou trocadora de ctions) ou amnio quaternrio (resina catinica ou trocadora de nions); d) Cromatografia de excluso ou de filtrao molecular: baseia-se no tamanho das molculas do soluto que passam atravs da fase estacionria, constituda por um gel poroso as molculas maiores no conseguem penetrar nos poros e so arrastadas pela fase mvel, enquanto as molculas de menor tamanho, capazes de entrar nos poros da fase estacionria so retidas por mais tempo no interior da coluna. Para este tipo de cromatografia utilizam-se gis derivados do dextrano, como o produto comercialmente conhecido como Sephadex.

A cromatografia lquida em coluna uma das tcnicas mais utilizadas para a separao ou isolamento de constituintes de extratos vegetais por ser bastante verstil, uma vez que se podem utilizar colunas de diferentes tipos e dimenses, bem como diversas combinaes de diversas fases mveis e estacionrias. A cromatografia gasosa (CG) serve para separar componentes a partir de misturas de compostos volteis. Atravs de reaes qumicas com derivados do silano, como o trimetilsilano, substncias no-volteis podem ser transformadas em produtos de baixo ponto de ebulio. Nas aplicaes analticas, possvel o acoplamento com um sistema de espectrometria de massas (CG/EM), que extremamente til na separao e identificao de estruturas, como por exemplo, de componentes de leos volteis. A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE ou HPLC) utiliza colunas contendo o suporte/fase estacionria formado por partculas extremamente finas (3 a 10 m), esfricas ou irregulares, homogneas e densamente compactadas, que oferecem grande resistncia ao fluxo da fase mvel, ou seja, requer uma presso alta e fluxo livre de pulsao, para que a fase mvel flua a uma velocidade razovel atravs da coluna, o que torna a CLAE uma tcnica mais cara. Separaes cromatogrficas em que a fase mvel apolar e a fase estacionria polar so denominadas de separaes em fase normal, enquanto sistemas com fase mvel polar e fase estacionria apolar constituem as separaes em fase reversa. A cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica amplamente utilizada para fins de anlise, tanto de extratos vegetais brutos quanto para avaliar o resultado de um processo de separao. Eventualmente, utiliza-se tambm a CCD para fins preparativos, usando-se nesse caso, camadas suporte de maior espessura, que comportam uma quantidade maior de amostra. Semelhantemente cromatografia em coluna, pode-se escolher entre dezenas de tipos de suportes, tanto de fase normal como reversa, dependendo da polaridade dos componentes da amostra a analisar. 5.3 Elucidao estrutural Entre os mtodos fsicos de anlise empregados atualmente na determinao estrutural, a espectrometria de massas, a espectroscopia no ultravioleta (UV), no visvel e no infravermelho, bem como a ressonncia magntica nuclear (RMN) de hidrognio e Carbono 13 constituem os mais amplamente empregados. As tcnicas bsicas sofreram muitas alteraes nos ltimos anos. Tais mudanas foram essencialmente frutos da revoluo da informtica (programas de computador, nveis de automao, formas de integrao de dados obtidos), dos novos magnetos supercondutores e da sofisticao dos experimentos que podem ser realizados, resultando na deduo de uma estrutura coerente. A interpretao de cada um desses espectros pode fornecer diferentes informaes qualitativas e quantitativas a respeito da estrutura da substncia em anlise. Geralmente, graas ao conjunto de dados espectrais que o pesquisador consegue elucidar completamente a estrutura de uma substncia desconhecida. Essas informaes servem tambm como instrumentos importantes para a avaliao da qualidade de fitoterpicos, tanto do ponto de vista qualitativo como quantitativo.

Na determinao estrutural, o espectro de absoro de uma substncia no UV, uma vez determinado o esqueleto carbonado e o tipo de composto, indica a presena de certos grupos funcionais, bem como a posio dos substituintes no esqueleto da molcula. Assim, por exemplo, os espectros UV de flavonides proporcionam informaes sobre a presena e a posio de grupamentos hidroxila no sistema de anis, ao mesmo tempo em que possibilitam a diferenciao entre os vrios tipos de flavonides. O espectro infravermelho (IV) de uma substncia orgnica corresponde ao conjunto de bandas de absoro apresentadas pela amostra submetida radiao infravermelha e estas bandas correspondem s mudanas na energia vibracional dos compostos orgnicos. A energia seletivamente absorvida da radiao IV provoca alteraes transitrias nas ligaes interatmicas, que podem sofrer estiramentos ou deformaes nos ngulos de ligao. As freqncias em que ocorrem as vibraes dependem da natureza das ligaes em particular, mas so tambm afetadas pela vizinhana qumica e pela molcula como um todo. A presena de insaturaes (conjugadas ou no), sistemas aromticos e grupos funcionais especficos pode ser verificada atravs da presena de bandas caractersticas, que tm grande importncia na anlise estrutural. Se o espectro IV de uma substncia desconhecida superponvel com o espectro IV de uma amostra autntica conhecida, isso pode servir como uma prova de identidade, que muitas vezes preconizada para a identificao de frmacos pelas farmacopias. As quinonas constituem uma classe de metablitos em que o espectro IV pode ser particularmente til na elucidao estrutural, j que compostos com grupamento carbonila costumam apresentar uma banda intensa entre 1650 e 1800 cm-1, sendo possvel, atravs da localizao exata dessa banda, caracterizar o tipo de grupo carbonlico presente na molcula. O espectro de massas (EM) de uma substncia pode fornecer importantes informaes relacionadas com a sua estrutura, como a massa molecular e padres de fragmentao. O peso molecular permite estabelecer a frmula molecular da substncia, enquanto o padro de fragmentao pode ajudar a caracterizar a presena, bem como a localizao de certos grupos funcionais e cadeias laterais. O espectrmetro de massas pode ser acoplado a um aparelho de cromatografia gasosa (CG/EM), que permite tanto a identificao como a quantificao de componentes de baixo peso molecular, mesmo em misturas complexas. Essa tcnica muito utilizada para a anlise de leos volteis. A espectroscopia de ressonncia magntica nuclear (RMN) uma das ferramentas mais valiosas para a determinao estrutural de compostos orgnicos, contribuindo para o estabelecimento do esqueleto da molcula. Para a obteno de espectros de ressonncia, submete-se a amostra a um campo magntico externo, de forma que determinados ncleos que apresentam um momento magntico nuclear (ncleos com nmero de massa mpar como 1H, 13C, 31P, por exemplo) podem entrar em ressonncia com a radiofreqncia aplicada, absorvendo energia eletromagntica em freqncias caractersticas para cada ncleo, conforme sua vizinhana qumica. Os dados obtidos com esse mtodo espectroscpico so muito importantes para a elucidao estrutural de praticamente todas as classes de produtos naturais, incluindo os metablitos secundrios vegetais. Os espectros de RMN de hidrognio e carbono 13 so

os mais utilizados e a sua interpretao permite caracterizar o nmero e o tipo de tomos de H e C, em funo da localizao e do desdobramento dos sinais correspondentes absoro de energia eletromagntica. A grande variedade de tcnicas disponveis de RMN permite identificar a proximidade espacial ou mesmo a conectividade de alguns tomos em particular, auxiliando dessa maneira, na montagem do quebra-cabea constitudo pelas diferentes partes da molcula. Outras anlises, como a determinao da atividade ptica e a cristalografia por raio X, podem ser necessrias para o estabelecimento da estereoqumica de molculas apresentando centros de assimetria. De qualquer maneira, ser graas ao conjunto de informaes obtidas atravs da interpretao dos diferentes espectros que se conseguir estabelecer, de forma inequvoca, as estruturas de molculas desconhecidas. 6. Estudos de desenvolvimento de metodologias analticas controle de qualidade A avaliao do teor de substncias ou grupo de substncias ativas e do perfil qualitativo dos constituintes qumicos de interesse, presentes na matria-prima vegetal, produtos intermedirios e produto final se processam utilizando mtodos espectrofotomtricos, cromatogrficos, fsicos, qumicos ou fsico-qumicos. A anlise realizada utilizando-se marcadores qumicos, selecionados segundo alguns critrios como sua abundncia, facilidade de deteco e doseamento, preferencialmente aqueles com maior labilidade frente a uma determinada etapa tecnolgica. Alm do mais ele deve ser idealmente o prprio princpio ativo, e preferencialmente que tenha correlao com o efeito teraputico (RDC 48) como tambm devem ser evitadas substncias j isoladas, purificadas e disponveis comercialmente, para se evitar o risco de falsificaes e adulteraes nos produtos fitoqumicos e nas amostras. A validao dos mtodos utilizados deve seguir as normas estabelecidas pelo Guia para Validao de Mtodos Analticos e Bioanalticos, publicado pela ANVISA, atravs da RDC n 899 de 29 de maio de 2003. No caso de metodologia analtica descrita em farmacopias ou formulrios oficiais, devidamente reconhecidos pela ANVISA, a metodologia ser considerada validada. Quando no descritas, devem ser validadas seguindo os parmetros: Especificidade e Seletividade, Linearidade, Intervalo, Preciso, Limite de deteco, Limite de quantificao, Exatido e Robustez. 7. Estudos de atividade biolgica Essa etapa revela-se indispensvel no estabelecimento de estratgias de desenvolvimento tecnolgico, no qual a validao do processo tecnolgico exige a conservao da composio qumica e, sobretudo da atividade farmacolgica a ser explorada. Esse ltimo aspecto adquire especial importncia nos casos em que o monitoramento qumico do processo realizado considerando outras substncias que no as responsveis pelo efeito biolgico, ou seja, atravs de marcadores qumicos nobioativos, ou quando diversas substncias so responsveis pela ao farmacolgica.

Segundo Daolio (2006), qualidade um parmetro muito complexo quando se trabalha com espcies botnicas, pois a bioatividade de certas espcies est interligada sinergia de diversos compostos, sendo que este efeito negligenciado quando apenas um marcador analisado. Como conseqncia direta, os mtodos baseados em marcadores qumicos so incompletos, ou muitas vezes insatisfatrios, para o controle de qualidade de fitofrmacos. Alm do que, Rodrigues (2007) salienta tambm que nem sempre isolado o metablito secundrio presente em maior quantidade ou com maior bioatividade, mas sim aquele que a tcnica aplicada permitiu seu isolamento. Martins (2008) infere que a quantificao de marcadores qumicos, muitas vezes no suficiente para assegurar a autenticidade de matrias-primas ou garantir a eficcia e segurana dos medicamentos delas derivados, uma vez que muitos metablitos secundrios esto presentes em vrias e diferentes espcies. Adicionalmente, a presena concomitante de outros compostos pode envolver efeitos txicos indesejveis e os mesmos no sero detectados em mtodos que avaliam a presena de algumas substncias. Observa-se ento a crescente necessidade de tcnicas analticas de extratos de plantas que os avaliem em sua totalidade. 8. O desenvolvimento de novas metodologias Segundo observa Rodrigues (2007), a investigao qumica de uma espcie vegetal baseada apenas no isolamento e caracterizao estrutural dos seus componentes no mais suficiente e adequada s atuais condies exigidas pela cincia e pela necessidade de adequao dos fitomedicamentos aos parmetros de eficcia, segurana e qualidade. Surgem ento recentes desenvolvimentos, principalmente no aumento da sensibilidade e na capacidade analtica das tcnicas existentes, tornando possvel a utilizao de uma nova metodologia onde extratos complexos de plantas so avaliados em sua totalidade. 8.1 Perfil cromatogrfico e Quimiometria A utilizao de perfis cromatogrficos (ou fingerprints) para anlise de extratos vegetais vem sendo utilizado recentemente em diversos estudos com abordagens mais amplas, aplicando-se variadas tcnicas cromatogrficas e/ou espectroscpicas. O uso de mtodos cromatogrficos hifenados tem-se destacado, pois fornece, ao mesmo tempo, informaes analticas e espectroscpicas importantes para a identificao on-line das substncias presentes em diferentes extratos. O perfil cromatogrfico possibilita a representatividade dos mltiplos compostos qumicos presentes na amostra em uma nica anlise, desta forma estabelecendo um parmetro comparativo para o reconhecimento de semelhanas e diferenas entre extratos submetidos s mesmas condies de extrao e anlise. Desta maneira, a qualidade qumica de amostras vegetais pode ser assegurada por uma ferramenta

analtica que envolve adequadamente sua complexidade, na qual se pode avaliar no somente a ausncia ou presena de marcadores qumicos, mas tambm a proporcionalidade existente entre os analitos detectados. Para que as informaes geradas nos perfis cromatogrficos possam ser adequadamente interpretadas, faz-se necessrio o uso de ferramentas multivariadas de anlise de dados, uma vez que os perfis cromatogrficos constituem sistemas complexos, cuja avaliao requer mtodos apropriados para que, atravs deles, possam ser atribudos resultados. A quimiometria uma rea da qumica onde o emprego de diversos mtodos estatsticos possibilita o planejamento, a seleo, e como conseqncia, a otimizao de experimentos e medidas com a finalidade de extrair o mximo de informao a respeito de dados qumicos. Os mtodos quimiomtricos de anlise so imprescindveis e fornecem, atravs de um sistema de compresso de dados e de clculos matemticos j bastante estabelecidos, a projeo de amostras de forma prtica e de fcil interpretao. Dentre as diversas tcnicas quimiomtricas podemos citar a Anlise Exploratria de Dados (PCA), o Reconhecimento de Padro no Supervisionado (HCA), o Reconhecimento de Padro Supervisionado (KNN e SIMCA), Modelos de Regresso ou Calibrao (PCR e PLS) entre outros. 8.2 Metabolic profile Essa nova abordagem utiliza de uma maneira geral, o fingerpriting das espcies em estudo. Como principal resultado, um grande nmero de amostras pode ser analisado juntamente com seu grande nmero de constituintes, gerando uma enorme quantidade de dados de elevada complexidade. Essa nova abordagem dividida em duas linhas principais, mas que se complementam: metabonomics e metabolomics e vem recebendo ateno especial nos ltimos anos. Conceitos de estratgias empregadas na anlise por metabolomics: Metabolic profile Perfil metablico em um sistema biolgico. Metabolite profile Identificao e quantificao de metablitos pr-definidos que geralmente apresentam alguma relao com uma via metablica especfica. Metabolic fingerprinting Anlise global, realizada de maneira rpida, de um conjunto de amostras que permita uma classificao. A identificao e a quantificao de metablitos no so empregadas nesta etapa. Metabolite target analysis Anlise qualitativa e quantitativa de um ou mais metablitos relacionados a reaes especficas. Metabolomics Identificao e quantificao de todos os metablitos em um sistema biolgico. Metabonomics avaliao de tecidos e fluidos biolgicos que apresentaram modificaes devido a doenas ou tratamentos teraputicos.

Referncias Bibliogrficas

DAOLIO, Cristina. Aplicao de tcnicas espectromtricas, cromatogrficas e quimiomtricas na avaliao da autenticidade de plantas utilizadas como Fitoterpicos. 2006. 162p. Tese de Doutorado Centro de Cincias Exatas e Tecnologia, Universidade Federal de So Carlos, 2006. MARTINS, Lcia Regina Rocha. Perfil cromatogrfico e anlise multivariada para o controle de qualidade de amostras comerciais do gnero Phyllantus (quebrapedra). 2008. 154 p. Tese de Doutorado Centro de Cincias Exatas e Tecnologia, Universidade Federal de So Carlos, 2008. RODRIGUES, Clemilson Martins. Caracterizao quali e quantitativa de metablitos secundrios em extratos vegetais. 2007. 199 p. Tese de DoutoradoInstituto de Qumica-Campus Araraquara, Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho, 2007. SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, F. X.; KIEMLE, D. J. Identificao espectromtrica de compostos orgnicos. 7 ed. LTC; Rio de Janeiro, 2007. SIMES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. orgs. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6 ed. Florianpolis: UFSC; Porto Alegre: UFRGS, 2007. SOLOMONS, T. W. G.; FRYHLE, C. B. Qumica Orgnica 1. 8 ed. LTC: Rio de Janeiro, 2005.