BACTERIILE LACTICE

Bacteriile lactice sunt microorganisme Gram pozitive, capabile s produc cantitate mai mare sau mai mic de acid lactic, prin degradarea diverselor substraturi:
-

hexoze: bacteriile care degradeaz 95% din glucoz n acid lactic sunt denumite homolactice; acidul malic: transformarea acidului malic in acid lactic, cunoscut sub numele de fermentaie malolactic este un proces cu mari implicaii compoziionale i organoleptice n vin.

Alte substraturi degradate de bacteriile lactice sunt: pentozele, acidul tartric, acidul citric, glicerolul. MORFOLOGIA BACTERIILOR LACTICE Structura general a celulei bacteriene se apropie de aceea a celulei vegetale. Forma bacteriilor este un caracter destul de stabil, de aceea constituie unul dintre criteriile fundamentale ale clasificrii acestor microorganisme. Bacteriile lactice se prezint la microscop de forme variate. Astfel se disting: coci, de form rotunjit sau oval i bacili sau bastonae, de form cilindric, mai mult sau mai puin groase, uneori sinuoase. Cocii au diametrul de la 0,4 pana la 1,0m, iar bacilii au grosimea de 0,5 m i 2-5 m sau mai mult n lungime. Atunci cnd dou celule de coci, rezultate n urma unei diviziuni, se separ imediat, apar la microscop drept coci izolai; cnd rmn alipite un anumit timp, apar ca grupri celulare caracteristice: diplococi (celule alipite cte dou),streptococi (celule n irag), sarcini (celule n aglomerri cubice), stafilococi ( celule n aglomerri neregulate). Bacilii, ca i cocii, pot rmne alipii dup diviziune, formnd diplobacili sau streptobacili, nlnuiri prezentnd aspect de filamente mai mult sau mai puin lungi, mai mult sau mai puin sinuoase. Lungimea filamentelor depinde de condiiile de cultur, n special pH-ul mediului, temperatur, prezena alcoolului, viteza de multiplicare i agitaia lichidului. STRUCTURA CELULEI DE BACTERII LACTICE

Bacteriile sunt celule procariote. Ele se deosebesc esenial de celulele eucariote (celulele vegetale i animale) att prin talia net inferioar, ct i prin organizarea lor, caracterizat de absena membranei ce separ nucleul de citoplasm i prin mecanismul lor de diviziune. Marea varietate a bacteriilor se datoreaz mai curnd diferenelor n ceea ce privete metabolismul i fiziologia lor dect deosebirilor morfologice. Structura tuturor celulelor bacteriene este foarte asemntoare i cuprinde trei elemente principale: nveliul celular, citoplasma i nucleul. NVELIUL CELULAR nveliul celular cuprinde peretele i membrana. Celula este delimitat de membrana citoplasmatic, dublat spre exterior de perete. Constituia membranei este relativ constant, n schimb a peretelui este mai variabil i permite diferenierea unor grupe mari de bacterii. ntre perete i membran, spaiul periplasmic este un gel mai mult sau mai puin fluid n care se deplaseaz proteina. Peretele care dubleaz membrana citoplasmaticpoate fi el nsui nconjurat de un nveli exterior. De natur organic vscoas, ea este perfect delimitat, constituind capsula. Importana sa este adesea legata de condiiile de cultur. La unele specii sau sue, capsula polizaharidic, adesea groas, particip la rezistena bacteriei contra unor agresiuni. PERETELE CELULAR Peretele este scheletul rigid al celulei; el d celulei forma sa caracteristic sferic sau cilindric. Foarte solid, el rezist la presiunea osmotic intracelular enorm, care poate varia ntre 5 i 20 atmosfere. Plasat ntr-un mediu hipotonic, far el, celula se sparge; de aceea este un element esenial. Comportamentul celulelor n timpul testului colorat se explic prin structura peretelui: la Gram (+), peptiloglicanul este gros i este singurul constituent, la cele Gram(-), el este mai subire i acoperit de membrana exterioar. Substraturile nutritive, ionii minerali, vitaminele, apa traverseaz liber peretele, la fel ca i produii metabolismului bacterian. De asemenea, peretele asigura alte funcii importante n viaa celulei: este suportul antigenelor specifice i receptorilor bacteriofagilor. Constituentul principal i caracteristic al peretelui celulei bacteriene este peptidoglicanul, care este o macromolecul enorm ce nconjoar celula printr-o reea de

lanuri polizaharidice i peptidice. Lanurile polizaharidice, lineare, paralele sunt reunite ntre ele prin puni peptidice. MEMBRANA CITOPLASMATIC Membrana celulei bacteriene are aceeai structur fundamantal ca i celelalte membrane biologice, fiind un dublu strat fosfolipidic n care sunt inserate proteine. Membrana citolpasmatic este unul dintre elementele vitale ale celulei bacteriene. Alterarea sa ncetinete schimbul cu mediul i mpiedic meninerea pH-ului intracelular. n special, mecanismele generatoare de energie care se deruleaz la nivel membranar sunt inhibate i viabilitatea celulelor este afectat. Lipidele membranare constituie totalitatea lipidelor bacteriene (95-99%). Ele cuprind puini acizi grai liberi dar mai ales glicerofosfolipide. Acizii grai din constituia lipidelor au lanuri carbonate de 10-20 atomi de carbon. Majoritatea sunt acizi cu 16-18 atomi de carbon, saturai sau nu. La bacteriile lactice exist i un acid ciclopropanic n C19 acidul lactobacilic. Acizii grai posed o caten lung hidrocarbonat i o funcie acid carboxilic terminal. Lungimea catenei, nesaturarea ei, conformaia cis sau trans a dublelor legturi i, pentru bacteriile Gram pozitive, ramificarea izo sau anteizo caracterizeaz aceste molecule. Sinteza acizilor grai este realizat prin condensri succesive ale malonil-CoA pe acidul acetic pentru catenele cu nume par de atomi de carbon i pe acidul propionic pentru catenele cu numr impar de atomi de carbon. Acizii nesaturai sunt sintetizai la bacteriile anaerobe prin aciunea unei dehidrataze asupra acidului hidroxidecanoic format prin adiia unei uniti malonil asupra acidului octanoic. Prelungirea progresiv a acestui acid conduce la acidul cis-vaccenic (C18), el nsui precursor al acidului lactobalilic (C19). Aceast ultim trecere dela un acid nesaturat la acidul ciclopropanic corespunztor se realizeaz prin metilarea dublei legturi. Fosfolipidele cele mai abundente sunt constituite dintr-o molecul de glicerol la cere o funcie alcool primar i funcia alcool secundar sunt esterificate de acizii grai. Cealalt funcie alcool primar este esterificat de acidul fosforic, el nsui esterificat de o nou molecul de glicerol. Bacteriile lactice conin, de asemenea, difosfatidil glicerol i esteri aminai ai fosfatidil glicerolului cu alanina i lizina. Coninutul n fosfolipide al

bacteriilor variaz n funcie de stadiul de cretere i de condiiile de cultur. Glicolipidele, n general glicozide ale digliceridelor, se formeaz prin legtur ozidic la nivelul funciei alcool primare a unei gliceride cu un mono sau dizaharid glucoz, fructoz, ramnoz. Proteinele sunt de dou feluri: proteine intriseci (70%), care fac parte complet din membran i proteine periferice (30%). Primele sunt integrate n lipide prin partea lor hidrofob. Partea lor hidrofil iese la suprafa la interior sau la exterior. Proteinele periferice sunt legate prin interaciuni slabe de proteinele integrate sau de lipide. La interiorul dublului strat, proteinele sunt relativ mobile lateral. Fluiditatea membranei este legat de constituia sa n acizi grai. Astfel, de exemplu, bacteriile se pot adapta la o diminuare a temperaturii crescnd proporia de acizi grai nesaturai. CITOPLASMA Citoplasma conine enzimele metabolismului bacterian, dar reprezint i sediul sintezei proteinelor. Ansamblul metabolismului, reacii de degradare i de sintez se realizeaz n mod programat, n funcie de schimburile cu mediul exterior pentru a produce energia necesar creterii. La microscopul electronic cu transmisie, interiorul unei celule bacteriene apare granulos. Acest aspect este dat de ribozomi, care au un rol esenial n sinteza proteinelor, ei asigurnd traducerea codului genetic. Ribozomii sunt formai din dou subuniti de talie diferit, 50 S i 30 S. Ribozomul asamblat are o constant de sedimentare de 70 S (Svedberg). Subunitatea 30 S conine o molecul de ARN ribozomal 16 S (1542 nucleotide) i 21 molecule de proteine diferite. Masa molecular a acestui ansamblu este de 900 Da. Subunitatea 50 S conine dou molecule de ARN ribozomal, molecula 23 S i molecula 5 S de 2904 i 120 nucleotide. Ea conine, de aemenea, 35 proteine i are o mas molecular de 1600 kDa. NUCLEUL I MATERIALUL GENETIC Cromozomul bacterian este reprezentat de o singur molecul de ADN, de form circular i de talie diferit, n funcie de specie: 2400 kilobaze la Lactobacillus plantarum, 1400 kilobaze la Leuconostoc oenos, 1200 kilobaze la Pediococcus pentosaceus. Cromozomul nu este separat de citoplasm printr-o membran. El este localizat n partea central a celulei dar pare ataat n mai multe de membrana

citoplasmatic, n special la nivelul mezozomului. Pot exista mai multe nuclee n celul deoarece diviziunea nucleului i a celulei nu sunt sincrone. Secvena nucleotidic dup care sunt asamblate cele patru nucleotide caracterizate de cele patru baze A, T, G i C constituie suportul genetic care este decodat n timpul traducerii. Cromozomul codific majoritatea informaiilor privind funciile vitale ale celulei, dar o serie de funcii, mai mult sau mai puin vitale, sunt determinate de plasmide, mici molecule de ADN circulare, complet independente de cromozom. Ele sunt n numr i talie variabile dup speciile i suele de bacterii i determin, n general, funcii ca alimentaia anumitor zaharuri, hidroliza proteinelor, rezistena la fagi, la antibiotice, la metale grele etc. Plasmidele se divizeaz dup acelei principiu de replicare ca i cromozomul sau n moduri mai specifice dar n orice caz n mod total independent. Una dintre caracteristicile plasmidelor este instabilitatea lor astfel nct anumite caractere fenotipice pot fi pierdute spontan n cursul generaiilor, dar adesea exist mai multe copii pe celul ale unor plasmide CLASIFICAREA BACTERIILOR LACTICE Taxonomia are drept scop identificarea, descrierea i clasarea microorganismelor. Clasificarea se face dup mai multe niveluri ierarhice, nivelul cel mai nalt fiind regnul, n timp ce nivelul de baz este specia. Taxonomia opereaz cu caractere fenotipice sau moleculare. Fenotipul cuprinde ansamblul caracterelor morfologice, fiziologice, biochimice, imunologice i compoziia unor constitueni celulari. Progresele biologiei moleculare furnizeaz n prezent noi criterii de clasificare bazate pe analiza genomului. Taxonomia molecular presupune clasificarea microorganismelor dup similitudinea genomului lor. Taxonomia fenotipic este utilizat, n mod clasic, pentru clasificarea microorganismelor pn la nivel de specie, n timp ce taxonomia molecular permite o difereniere a suelor, deosebit de util n contextul folosirii n industria vinicol a unor sue de bacterii sau de levuri selecionate. Bacteriile lactice aparin diviziunii bacteriilor Gram pozitive, care se mpart n doua

subdiviziuni, numite Phylum, n funcie de procentajul guaninei i citozinei n raport cu ansamblul bazelor moleculei de ADN. Cele dou subdiviziuni sunt: Clostridium, pentru care (G +C) % este mai mic de 50 % i Actinomycetes, la care (G +C) % este mai mare de 50 %. Majoritatea genurilor din care fac parte bacteriile lactice aparin subdiviziunii Clostridium. Subdiviziunea Actinomycetes cuprinde i ea o serie de genuri de bacterii lactice importante pentru industria alimentar. Bacteriile lactice ale vinului aparin genurilor Lactobacillus, Leuconostoc i Pediococcus. Cele trei genuri: Lactobacillus, Leuconostoc si Pediococcus sunt foarte apropiate din punc de vedere filogenetic. Totui, morfologia i gruparea celulelor lor permit diferenierea clar a acestora, dar unele specii ale fiecrui gen prezint numeroase caractere metabolice identice: unele specii de Lactobacillus i Leuconostoc au aceeai capacitate de a asimila numeroase substraturi. Diferenierea speciilor de bacterii lactice se bazeaz pe morfologia lor i pe caracterul homofermentativ sau heterofermentativ al acestora. Bacteriile homofermentative produc peste 85% din acidul lactic pornind de la glucoz. Bacteriile heterofermentative produc, n afar de acid lactic, CO2, alcool etilic i acid acetic. Dintre coci, speciile genului Pediococcus sunt homofermentative, iar cele ale genului Leuconostoc sunt heterofermentative. Lactobacilii pot prezenta ambele componente i sunt mparii n trei grupe: strict homofermentativi (grupa I, care n-a fost niciodat identificat n vin); heterofermentativi facultativ (grupa a II-a); heterofermentativi obligatoriu (grupa a III-a).Principalele specii de bacterii lactice ntlnite n must i vin Lactobacilii homofermentativi strict nu fermenteaz pentozele i formeaz, pornind de la o molecul de glucoz, dou molecule de acid lactic pe calea Embden-Meyerhoff. La heterofermentativii facultativ, din glucoz rezult, de asemenea, dou molecule de acid lactic, dar pentozele sunt metabolizate n acid lactic i acid acetic pe calea heterofermentativ a pentozofosfailor. Bacteriile heterofermentative obligatoriu nu posed fructozo-1,6-difosfat-aldolaza, caracteristic pentru calea Embden-Meyerhoff. Ele metabolizeaz glucoza pe calea pentozofosfailor n CO2, acid lactic, acid acetic i alcool atilic; pentozele sunt transformate n acid lactic i acid acetic, ca i n cazul bacteriilor din grupa a II-a.

Tabelul 5.1.
Coci Homofermentativi Heterofermentativi Pediococcus damnosus Pediococcus pentosaceus Leuconostoc oenos Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc gracile Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum Lactobacillus hilgardii Lactobacillus fructivorans Lactobacillus brevis

Bacili

Heterofermentativi (grupa a II-a) Heterofermentativi (grupa a III-a)

facultativ obligatoriu

n ultimii ani, pentru specia Leuconostoc oenos s-a propus o nou denumire: Oenococcus oeni, pentru moment singura specie a genului Oenococcus. Determinarea genului bacteriilor lactice izolate din vin
Morfologie Aranjarea celulelor Fermentarea glocozei Izomerul acidului lactic Genul Celule rotunjite Coci Perechi sau iraguri Heterofermentativ D Leuconostoc Tetrade Homofermentativ L sau D, L Pediococcus Celule alungite Bacili Perechi sau lnioare Heterofermentativ sau homofermentativ L, D sau D, L Lactobacillus

(Oenococcus) DEZVOLTAREA BACTERIILOR LACTICE N VIN

REPRODUCEREA BACTERIILOR LACTICE Bacteriile lactice, asemenea tuturor bacteriilor, se nmulesc prin sciziparitate, dintr-o celel mam formndu-se dou celule fiice identice. Multiplicarea unei celule bacteriene presupune, pe de o parte, diviziunea materialului nucleic, pe de alt parte un ansamblu de sinteze pentru formarea noiler nveliuri celulare i a elementelor citolpasmice, n special ribozomii i enzimele. Materialul genetic se transmite de la celula mam la celulele fiice dup replicarea cromozomului n doi cromozomi fii, aceasta fcndu-se dup modul semiconservativ,fiecare cromozom fiu cuprinznd o caten a cromozomului parental. Cealalt caten este sintetizat de ADN-polimeraz, care utilizeaz nucleotidele purtnd bazele A, T, G i C dup regula apariiei bazelor complementare, rezultnd astfel o caten complementar. Acest proces asigur conservarea patrimoniului genetic n descenden, cei doi nuclei fii fiind strict identici cu nucleul celulei mam.

n urma sintezei poriunilor de membran i a peretelui, n mijlocul celulei se formeaz un sept care separ treptat celula mam n dou celule fiice, n care se repartizeaz materialul genetic i ceilali constitueni celulari. Atunci cnd septul este complet format, cele dou celule fiice se despart. Diviziunea celulei i diviziunea nucleului nu sunt sincrone, replicarea fiind mai rapid. n plus, ciclul de replicare poate ncepe chiar nainte de terminarea ciclului precedent, din acest motiv celulele bacteriene n faz de cretere activ conin mai mult de un cromozom ntr-o celul. n cursul diviziunii, plasmidele, mult mai mici dect cromozomul, nu sunt ntotdeauna corect repartizate ntre celule dup replicarea lor, de unde rezult instabilitatea lor n cursul generaiilor. FACTORII CARE INFLUENEAZ DEZVOLTAREA BACTERIILOR LACTICE pH-ul. Este un factor primordial al calitii vinului. Aciditatea real are un efect selectiv i realizeaz o dubl triere: a speciilor de bacterii i a constituenilor susceptibili de a fi descompui. Se numete pH-prag valoarea pH-ului ncepnd de la care bacteriile se dezvolt i pot fi atacate diverse substraturi. Suele apte de a produce o fermentaie malolactic pur se caracterizeaz prin valorile pH-ului prag de asimilare a acidului malic i zaharurilor. Pentru coci, bacteriile cele mai convenabile pentru aceast transformare, pH-ul-prag pentru acid malic este inferior celui pentru zaharuri. n zona cuprins ntre cele dou valori pH, bacteriile degradeaz acidul malic fr a fermenta cantiti importante de zaharuri, deci fr a produce aciditate volatil. Cu ct acest interval este mai mare, cu att sua este mai convenabil pentru vinificare. Dimpotriv, n cazul bacililor, pH-ul-prag pentru zaharuri este mai mic dect cel pentru acidul malic. Acetia din urm nu garanteaz o fermentaie malolactic fr riscul de a produce aciditate volatil. Bacteriile lactice prezint un pH optim i valori limite care influeneazcreterea. pHul optim pentru multiplicarea bacteriilor lactice este cuprins ntre 4,2 i 4,5, valori mult mai mari fa de cele ntlnite n vin. La valori ale pH-ului cuprinse ntre 3,0 i 4,0 bacteriile lactice se dezvolt cu att mai uor iar fermentaia malolactic se declaneaz cu att mai repede cu ct valoarea este mai mare. pH-ul limit absolut are valoarea aproximativ de 2,9, valoare sub care fermentaia malolactic, n mod natural, nu mai este posibil. n aceste condiii, bacteriile lactice nu

pot ndeplini principala lor misiune n vin degradarea acidului malic n vinurile foarte acide, adic exact acolo unde este cea mai mare nevoie de ele. Oprirea creterii, determinat de aciditatea mediului, intervine atunci cnd pH-ul intracelular atinge o limit. Fraciunea acizilor, care penetreaz liber sub form nedisociat, este disociat n interiorul celulei, antrennd o diminuare a pH-ului. Prin urmare, activitatea enzimelor intracelulare este mai mult sau mai puin inhibat dup pHul lor optimal de activitate. Limita inferioar tolerat pentru pHi variaz n funcie de specie, fiind cuprins ntre 4,7 (Lactobacillus plantarum) i 5,5 (Leuconostoc mesenteroides). Mecanismele de adaptare a bacteriilor lactice la aciditate nu sunt cunoscute, dar ele particip activ la selecia natural a speciilor de vin. Vinurile cu pH ridicat prezint o microflor lactic nu doat mai abudent dar i mult mai variatdect vinurile acide. Aceste vinuri sunt mai fragile pe plan microbiologic deoarece, printre aceste bacterii, unele sunt bacterii de contaminare. Aa cum faciliteaz creterea lor, pHul ridicat favorizeaz i supravieuirea bacteriilor n vin, putnd aprea alterri ale vinului la mai multe luni sau chiar mai muli ani dup vinificare. Temperatura. n mediul de cultur n laborator, bacteriile lactice izolate din vin sunt mezofile, multiplicndu-se la temperaturi cuprinse ntre 15 i 45C, dar temperatura optim de cretere este cuprins ntre 20 i 37C. n condiiile unui mediu alcoolizat, cum este vinul, intervalul celor mai convenabile temperaturi pentru bacterii este mai mic, fiind cuprins ntre 20-23C, iar cnd tria alcoolic a vinului este mai mare de 13-14% vol, temperatura optim de cretere a bacteriilor lactice scade. Pe msura scderii temperaturii, viteza de cretere devine mai lent, ncetnd complet atunci cnd temperatura este mai mic de 15C. Pentru declanarea fermentaiei malolactice, vinul trebuie pstrat la o temperatur de aproximativ 20C. Temperaturile excesive, de peste 25C, inhib formarea biomasei bacteriene, ncetinind fermentaia malolactic i cresc riscurile de deviaii i de cretere a aciditii volatile. La temperaturi mai mici de 18C, fermentaia malolactic se declaneaz mai greu, totui o fermentaie malolactic demarat poate continua, chiar dac ntr-un ritm mult mai lent, i la temperatur mai mic, de ordinul a 10-15C, deoarece biomasa bacterian era deja constituit atunci cnd temperatura a devenit improprie pentru creterea acesteia. Gerbaux V. a constatat ce la 12C fermentaia

malolactic nu s-a terminat nici n 80 de zile. Aerarea. O aerare moderat a vinului favorizeaz declanarea mai rapid a fermentaiei malolactice, dar rolul oxigenului asupra creterii bacteriilor lactice nu este foarte clar, acestea avnd un comportament diferit fa de oxigen, n funcie de specie. Unele pot fi indiferente la prezena oxigenului, unele se pot acomoda mai bine n absena sa, unele pot tolera oxigenul la presiunea parial din aer dar sunt incapabile sa-l utilizeze, altele pot necesita mici coninuturi n oxigen pentru o cretere mai bun. n plus, unele sue pot avea un comprtament variabil, n funcie de mediu. n mediu de cultur de laborator creterea este activ sub atmosfer inert CO2 + N2. Alcoolul etilic. Bacteriile lactice sunt sensibile la alcoolul etilic, ca majoritatea microorganismelor, de altfel. Multiplicarea lor este, n mod evident, jenat la coninuturi n alcool de peste 10% vol., dar rezultatele variaz foarte mult, n funcie de specie i de su. n general,cocii sunt mai sensibili la etanol dect bacilii. La o trie alcoolic de 13% vol., lactobacilii rezist n proporie de peste 50%, n timp ce cocii rezist numai n proporie de 14%. Unii lactobacili sunt foarte tolerani la alcool, fiind capabili s se dezvolte chiar ntr-un vin de desert, de 18 sau 20% vol., predispus astfel la alterarea prin ncrire lactic sau fermentaie propionic. Suele de Leuconostoc oenos, principala specie responsabil de fermentaia malolactic rezist pn la 13-14% vol. alcool. Tolerana bacteriilor lactice la alcool este foarte important, deoarece ele trebuie s se multiplice i s realizeze fermentaia malolactic ntr-un mediu bogat n alcool, n multe cazuri la coninuturi mai mari de 10% vol. Deasemenea, predispoziia vinurilor la alterri microbiene este legat de tolerana bacteriilor lactice la alcool, ceea ce pune mai bine n eviden necesitatea derulrii n bune condiii a fermentaiei alcoolice, n special pentru evitarea opririlor premature ale fermentaiei. Condiiile de nutriie ale bacteriilor. Bacteriile lactice au axigene nutriionale mult mai mari dect levurile, n special fa de aminoacizi, mai ales c ele nu au, ca levurile, capacitatea de a sintetiza elementele de care au nevoie. n general, n vin se gsesc cantiti suficiente de diverse vitamine din grupa B, care acioneaz ca factori de cretere, dar o suplimentare este binevenit. Auxotrofia (adic posibilitatea de a sintetiza factorul de cretere sau aminoacidul lips) nu exist la bacteriile lactice ale vinului, crora le sunt absolut indispensabile o baz azotat, patru

vitamine i 18 aminoacizi. Nevoile de energie ale bacteriilor lactice sunt asigurate de zaharurile reziduale existente n vin la sfritul fermentaiei alcoolice. Bacteriile lactice nu posed proteaze, proteinele nefiind o surs de azot pentru ele. n ultimii ani, s-au obinut noi adjuvani oenologici de origine levurian, care au un important efect de simulare a fermentaiei alcoolice i fermentaiei malolactice. Aceste preparate obinute prin autoliza celulelor levuriene, constituite din macromolecule n special, manoproteine antreneaz, pe de o parte, o scurtare a fazei de laten a certerii bacteriene i, pe de alt parte, o cretere important a cantitii de biomas produs, de 21- 47%, dup coninutul mediului n zaharuri reductoare. Rolul de activator al macromoleculelor levurilor fa de creterea bacteriilor din specia Oenococcus oeni se datoreaz dublei lor aciuni: de detoxifiere a mediului i de mbogire a lui n nutrieni asimilabili de ctre bacteriile lactice. Anhidrida sulfuroas. Folosirea SO2 n faza prefermentativ este o practic larg rspndit n industria vinicol, iar rolul su inhibitor asupra bacteriilor i fermentaiei malolactice este cunoscut de mult vreme. Bacteriile sunt mult mai sensibile la aciunea SO2 dect levurile. Mult vreme s-a crezut c numai SO2 liber are aciune antibacterian, forma combinat fiind inofensiv. Acest lucru este valabil n cazul levurilor, datorit formrii acidului aldehidosulfuros, dar nu i n cazul bacteriilor lactice, n special al celor heterofermentative, care n cursul dezvoltrii lor nrt-un mediu dulce, n prezena acidului aldehidosulfuros sunt capabile s metabolizeze acetaldehida, elibernd astfel acidul sulfuros. Prin acest mecanism, SO2 combinat devine activ asupra bacteriilor, dei are un efect antibacterian de 5-10 ori mai slab dect SO2 liber, dar trebuie s se in seama de faptul c este de 9-10 ori mai abundent n vin. Aciunea inhibitoare a SO2 asupra bacteriilor lactice este direct proporional cu doza utilizat. Gerbaux V. a prezentat datele unei experiene privind influena SO2 asupra fermentaiei malolactice, adoptnd trei niveluri de sulfitare: martor, 40mg/l i 80 mg/l, stabilite n faza prefermentativ. Dup fermentaia alcoolic, vinul a fost nsmnat cu o cultur de bacterii liofilizate. La temperatura de 18C, n varianta martor, fermentaia malolactic s-a ncheiat ntr-o lun, varianta sulfitat cu 40 mg/l a prezentat o ntrziere

de 15 zile, iar varianta sulfitat cu 80 mg/l, fermentaia malolactic s-a ncheiat dup 115 zile. Eficacitatea aciunii antiseptice i antioxidante a SO2 depinde n mare msur de pH. Forma activ, SO2 molecular, depinde de concentraia n SO2 liber i pH. Utiliznd formula lui Sudraud i Chauvet, se calculeaz procentajul de SO2 molecular n funcie de pH. De exemplu, la pH 3,2 acest procent este de 3,91 %, la pH 3,5 este de 2,00 % iar la pH 3,8 este de numai 1,01 %. Aceste cifre demonstreaz clar influena pH-ului, mai ales c este nevoie de patru ori mai mult SO2 liber la pH 3,8 dect la pH 3,2 pentru a obine aceeai eficacitate. Mecanismul de aciune al SO2 a fost studiat la levuri, dar este foarte probabil ca el s fie de acelai tip la bacterii. Astfel, SO2 penetreaz sub form molecular n celul prin difuzie. n citoplasm, unde pH-ul este mai ridicat, el disociaz i reacioneaz cu molecule biologice eseniale: proteine enzimatice la nivelul punilor disulfur, coenzime, vitamine, ceea ce are drept rezultat oprirea creterii i, n final, moartea celulei. n plus, efectului asupra creterii celulare, i se adaug aciunea inhibitoare a SO2 asupra activitii enzimei malolactice a celulelor de Leuconostoc. Speciile de bacterii lactice au sensibiliti diferite la aciunea SO2, cocii fiind mai puin rezisteni dect bacilii. O doz de 5 mg/l SO2 liber este suficient pentru a elimina un mare numr de bacterii, 100 mg/l le distrug complet. Eficacitatea aciunii antibacteriene a SO2 depinde i de momentul sulfitrii. Astfel, o doz de 10 mg/l SO2 liber adugat n faza de laten diminueaz populaia bacterian cu 75%; sub form de combinaie sulfitic, aceeai doz ntrzie multiplicarea i blocheaz fermentaia malolactic; adugat n timpul fazei exponeniale, aceeai doz are o eficacitate sczut.

Tabel Aciunea bactericid direct a diverselor forme de SO2 Speciile de bacterii pH Procentul de celule rmase variabile dup cteva minute de Anhidrid Pediococcus cerevisiae 3,0 3,2 sulfuroas 0 0 contact. Doza utilizat: 30 mg/l Acid piruvic Acid aldehidosulfuros 0 0 sulfuros 0 48

Leuconostoc oenos

3,4 3,0 3,2 3,4 3,0 3,2 3,4 3,0 3,2 3,4

15 0 0 0 10 23 33 5 6 8

75 33 56 70 66 88 82 13 100 75

75 63 79 87 96 76 85 35 37 68

Streptobacterium

Lactobacillus hilgardii

Fig. 5.1. a Pediococcus cerevisiae

b Leuconostoc oenos

Ali factori care influeneaz dezvoltarea bacteriilor lactice. O component important a vinurilor roii, n care fermentaia malolactic este un proces esenial, este fraciunea polifenolic. Cercetrile efectuate pn n prezent arat c aciunea polifenolilor asupra creterii bacteriilor lactice nu este uniform, unii avnd un efect inhibitor, alii, dimpotriv avnd un efect simulativ. Cercetrile au fost efectuate, n majoritatea cazurilor, asupra speciei Leuconostoc oenos, dar se presupune c rezultatele sunt valabile i pentru celelalte bacterii lactice din vin. Taninurile oenologice, att cele provenite din struguri, ct i cele din lemnul de stejar, au un efect antibacterian recunoscut, de aceea n vinurile taninoase, obinute prin maceraii lungi sau prin adaosuri de tanin exogen i n cele pstrate n barrique, fermentaia malolactic demareaz cu ntrziere. Favoriznd creterea bacteriilor, acidul galic i antocianii stimuleaz fermentaia malolactic. Cei doi constitueni sunt metabolizai de bacterii. Transformarea antocianilor pare s inplice activitatea -glucozidazei, care elibereaz fraciunea aglicon i glucoza,

aceasta fiind metabolizat de bacterii. Unii subprodui ai metabolismului levurian, ca acidul capric, acidul lauric, acidul palmitoleic sunt inhibitori ai creterii bacteriilor lactice. De asemenea, chiar acidul lactic i acidul succinic exercit o uoar inhibiie a bacteriilor lactice. 80-100 mg/l anioni organici coninui n vin fac mediul mai puin favorabil pentru fermentaia malolactic. n ultimii ani, cunoate o extindere n industria vinicol lizozina, o enzim extras din albuul de ou, avnd o aciune litic asupra peretului celulei bacteriei lactice. Spre deosebire de SO2, eficacitatea lizozimei crete o dat cu pH-ul iar incidena organoleptic este nul. Lizozima poate fi folosit pentru inhibarea fermentaiei malolactice la vinurile albe (n doze cuprinse ntre 250-500 mg/l), pentru evitarea ncririi lactice, n cazul finalurilor de fermentaie dificile i pentru stabilizarea vinurilor roii dup fermentaia malolactic (n doz de 125-250 mg/l). Un alt factor care influeneaz creterea bacteriilor lactice este antagonismul levuri/bacterii. Acest antagonism se manifest att printr-o competiie nutriional ct i prin producerea de ctre levuri a unor compui inhibitori pentru bacteriile lactice alcool etilic, SO2, acizi grai. Aadar, pe ansamblu, n vin exist factori care simuleaz i factori care inhib activitatea bacteriilor lactice. Factorii care condiioneaz creterea bacteriilor lactice n vin
FACTORI LIMITATIVI Temperatura vinului < 15C Aciditate ridicat pH < 3 Trie alcoolic ridicat > 12% vol. Prezena SO2 > 50 mg/l Aerare foarte intens Coninut insuficient n nutrieni sau calitate slab a nutrienilor Absena factorilor de cretere (unii pesticide, aminoacizi, vitamine) Prezena inhibitorilor (produi secundari ai fermentaiei alcoolice, compui fenolici) nsmnare natural insuficient (crame noi) Volume mici FACTORI FAVORIZANI Temperatura vinului ntre 16 i 18C Aciditate slab pH > 3,2 Trie alcoolic sczut < 12C Absena SO2 Prezena CO2 Coninutul favorabile Prezena factorilor de cretere Prezena activatorilor (macromolecule selecionate, levuriene, din struguri) nsmnarea pied de cuve Volume mari Maceraie carbonic, maturare pe drojdii, maceraie pelicular cu bacterii i calitatea nutrienilor

Termovinificare, deburbare intens Contaminri virale: bacteriofagi

Aciunea bacteriofagilor. Bacteriofagii sunt virusuri care atac bacteriile, pentru a se multiplica. Bacteriofagii pstreaz caracteristicile generale ale virusurilor, avnd o structur foarte simpl. n timp ce bacteriile posed att ADN ct i ARN, bacteriofagii conin un singur tip de acid nucleic, care poate fi ori ADN, ori ARN. Un bacteriofag este alctuit dintr-o poriune numit cap care se continu cu o coad la sfritul creia se afl o plac bazal prevzut cu nite proeminene numite spiculi sau fibrile. Parazitarea bacteriilor de ctre bacteriofagi se produce dup un mecanism care reprezint ciclul de via al bacteriofagului. Acest proces implic dou ci : o cale lisogen i o cale litic. Calea lisogen include mai multe momente: m1 fixarea bacteriofagului n celula bacteriei i infectarea ADN-ului; m2 circulaia ADN-bacteriofagului n celula bacteriei; m3 integrarea ADN-ului fagic n interiorul cromozomului bacterian; m4 diviziunea celular; m5 producerea de noi copii de AND viral cu cromozomul bacterian. Calea litic include, de asemenea, mai multe momente: m1 inducia; m2 sinteza proteinelor virale necesare formrii de noi virusuri; m3 nmulirea rapid a ADN viral liber i ncapsidarea lui n noi particule virale; m4 perforarea celulei bacteriene i eliberarea unui numr mare de noi bacteriofagi, care reiau ciclul de distrugere a bacteriilor. Prezena receptorilor la suprafaa bacteriei determin posibilitatea asocierii ntre fag i bacterie. Bacteriofagul trebuie s infecteze o bacterie pentru a se multiplica. n interiorul celulei, el utilizeaz propriul su genom drept cod i echipamentul enzimatic al celulei pentru a asigura sintezele. Din punct de vedere al agerivitii fa de bacterii, bacteriofagii sunt de dou tipuri: temperai bacteriofagi al cror genom rmne integrat sub form de profag n cromozomul bacterian, este replicat i transmis celulelor fiice, rmnnd n stare de laten, i stabilind astfel un echilibru cu bacteria gazd, care va fi spart la un moment dat; viruleni bacteriofagi care se multiplic n numeroase copii eliberate n mediu

dup liza celulei gazd, fiecare virus infectnd n continuare alt bacterie, pn la distrugerea total a culturii de bacterii. Bacteriofagii pot ndeplini fie rol pozitiv fie rol negativ, n funcie de bacteriile pe care le atac. Principalele consecine oenologice ale unui atac de bacteriofagi asupra bacteriilor lactice sunt termenele mai lungi de realizare a fermentaiei malolactice i creterea riscului de dezvoltare a unor populaii nedorite de Pediococcus. Evoluia populaiei de bacterii lactice n timpul vinificaiei Populaia iniial de bacterii lactice n must este cuprins, de regul, ntre 10 2 - 104 celule/ml. Numrul depinde n primul rnd, de condiiile de maturare a strugurilor, cel puin pentru primele cantiti de struguri care intr n fluxul de vinificare. Atunci cnd strugurii se maturizeaz n condiii de cldur i precipitaii puine, bacteriile lactice sunt prezente chiar pe strugurii proaspei, dar sunt foarte rare pe strugurii splai de ploi. Flora iniial, destul de slab, este completat de bacteriile care provin de pe echipamentele i utilajele tehnologice. n musturile obinute din struguri cu o stare avansat de maturare, n care pH-ul este, n general, mai ridicat, nivelul populaiei este, de asemenea mai mare. De exemplu, cnd pH-ul este mai mare de 3,6 populaia de bacterii lactice atinge 104 celule/ml. Bacteriile lactice izolate de pe srtuguri, nainte de recoltare, aparin speciilor Lactobacillus plantarum, Lactobacillus hilgardii i Lactobacillus casei. Specia Leuconostoc oenos, care mai trziudevine cea mai important, este puin prezent la debutul vinificaiei. Mustul de struguri, imediat dup introducerea n cistern, conine o microflor foarte variat, constituit n general din 8 specii de lactobacili i coci obinuii: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus brevis, Pediococcus damnosus, Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc oenos. n primele zile ale fermentaiei alcoolice, att levurile ct i bacteriile se multiplic, dar primele, mai bine adaptate i mai numeroase, n special atunci cnd se folosesc levuri selecionate, invadeaz rapid mediul, n timp ce creterea bacteriilor este limitat, atingnd maximum 104 105 celule/ml. Acest nivel depinde mult de pH i de doza de sulfitare aplicat mustuielii, factori care exercit o puternic aciune selectiv asupra

microflorei bacteriene lactice. Marea diversitate a speciiolr prezente n mod natural n must tinde s se reduc selectiv n cursul fermentaiei alcoolice, meninnduse doar suele cele mai rezistente la mediul alcoolizat i care aparin, n general, speciei Leuconostoc oenos. n timpul fermentaiei alcoolice, atunci cnd acesta este n plin derulare i pn la sfritul ei, populaia de bacterii lactice regreseaz pn la 102 103 celule/ml, nivel care se menine o perioad mai lung de timp, denumit faza de laten, a crei durat este variabil. n condiii optime ea dureaz numai cteva zile, dar se poate prelungi pn la cteva sptmni sau chiar luni, cnd condiiile de mediu sunt defavorabile bacteriilor, ceea ce are drept consecin o mare ntrziere a demarrii fermentaiei malolactice, uneori chiar pn n primvara urmtoare. Mustul n plin fermentaie prezint un mediu ostil bacteriilor lactice, la aciunea selectiv a pH-ului i a SO2 adugndu-se aciunea inhibitoare a alcoolului. n aceste condiii, se produce o selecie natural progresiv a speciilor de bacterii lactice. Astfel, dispar pe rnd lactobacilii homofermentativi, cei heterofermentativi, apoi pediococii i Leuconostoc mesenteroides, lsnd locul exclusiv speciei Leuconostoc oenos. n anumite situaii, cnd fermentaia alcoolic se deruleaz cu dificultate, pot supravieui n numr foarte mic, de ordinul a 10 102 celule/ml i alte specii de contaminare, care se pot nmuli mai trziu, dup vinificare, dac vinul nu este protejat antiseptic, producnd diverse maladii. Dup faza de laten urmeaz faza de cretere, cnd populaia bacterian ajunge pn la 107 celule/ml, durata ei depinznd, n mod esenial, de compoziia fizico-chimic a mediului. Faza de cretere este urmat de faza staionar, a crei durat depinde de nivelul populaiei i, n final, faza de declin. Metabolizarea acidului malic ncepe n timpul fazei de cretere a populaiei bacteriene, cnd densitatea acesteia ajunge la 106 celule/ml i continu pn la dispariia sa total, putnd dura cteva sptmni sau chiar luni, n funcie, n primul rnd, de temperatur. n unele cazuri, cnd condiiile de mediu sunt foarte favorabile, iar cantitatea de acid malic este sczut, fermentaia malolactic se poate ncheia chiar nainte de sfritul fazei de cretere. n aceste condiii, populaia bacterian poate depii 108 celule/ml. Dup fermentaia malolactic, dac vinul nu este sulfitat, rmne o populaie

bacterian destul de numeroas, de pn la 105 celule/ml, numrul fiind cu att mai mare cu ct cantitatea de acid malic a fost mai mic i durata fermentaiei malolactice mai scurt. n aceste condiii, sulfitarea practicat la sfritul fermentaiei malolactice are drept scop accelerarea fazei de declin a bacteriilor, deoarece bacteriile rmase pot metaboliza alte substraturi, punnd n pericol stabilitatea biologic a vinului. Pentru asigurarea stabilitii biologice a vinului se impune eliminarea ntregii ncrcturi microbiene, imediat dup fermentaia malolactic. Msura cea mai simpl i cea mai frecvent const n ajustarea dozei de SO2 liber pn la 30 40 mg/l. Dei aceast doz este foarte eficient, eliminnd aproape n totalitate microorganismele vii, n vin rmn celulele moarte care prin descompunere pot comunica defecte de gust i miros. De aceea, se recomand i alt metod pentru stabilizarea biologic a vinurilor, constnd n microfiltrarea cu membrane de porozitare 0,4 0,5 m, care elimin tate microorganismele, vii i moarte, din vin. Fenomene de antagonism n care sunt implicate bacteriile lactice Predominana speciei Leuconostoc oenos la sfritul fermentaiei alcoolice i n timpul fermentaiei malolactice este rezultatul mai multor interaciuni ntre microorganismele vinului: pe de o parte, ntre levuri i bacterii, pe de alt parte ntre diferitele specii de bacterii. Interaciunile ntre levuri i bacterii implic mai multe mecanisme bazate pe competiia nutriional i pe aciunile unor produi ai metabolismului celor dou familii de microorganisme. Competiia dintre levuri i bacterii este inegal nc de la obinerea mustului. Datorit superioritii lor numerice mai ales atunci cnd mustul este nsmnat cu levuri selecionate i rezistenei mai mari la aciunea SO2, levurile pun rapid stpnire pe mediu. n timpul creterii rapide, la nceputul fermentaiei, levurile epuizeaz rapid mediul n unii aminoacizi, genernd carene nutriionale care ngreuneaz multiplicarea bacteriilor. Acest dezavantaj este totui tranzitoriu, deoarece n cteva zile mediul este mbogit din nou n aminoacizi, care sunt excretai de levuri sau eliberai dup autoliza lor. La sfritul fermentaiei alcoolice, graie metabolismului levurian, mediul prezint o bogie i o diversitate n aminoacizi care garanteaz nutriia bacteriilor. Curbele de evoluie a

levurilor i bacteriilor demonstreaz clar ansamblul acestor fenomene: inhibarea bacteriilor n timpul fazei de cretere a levurilor i simularea lor n tipmul fazei de dfeclin a levurilor. n primele 3 4 zile de fermentaie, alcoolul nu este un inhibitor pentru bacteriile lactice; de altfel, n concentraii mici, pn la 5-6 % vol., el este un activator al creterii bacteriene. n aceste condiii, ali produi ai metabolismului levurian sunt implicai n inhibarea creterii bacteriilor lactice, acetia fiind acizii hexanoic, octanoic, decanoic i dodecanoic, care altereaz membrana bacterian. Antagonismul dintre levuri i bacteriile lactice se manifest i la sfritul fermentaiei alcoolice, dar de aceast dat n favoarea bacteriilor lactice, populaia levurian fiind n declin iar cea bacterian n cretere. Bacteriile accelereaz faza de declin a levurilor, prin activiti enzimatice responsabile de hidroliza peretelui levurian, antrennd liza ntregii celule. Autoliza celulelor de levuri elibereaz o serie de macromolecule peptide, polizaharide, manoproteine care au o important aciune stimulatoare asupra bacteriilor lactice, ameliornd fermentescibilitatea malolactic a vinului, prin efectul lor adsorbant asupra acizilor grai, reazilnd o veritabil detoxifiere a mediului. Succesiunea speciilor bacteriene n timpul fermentaiei alcoolice poate fi explicat prin sensibilitile diferite ale bacteriilor la interaciunile cu levurile, dar i prin existena simultan a unor interaciuni ntre bacteriile lactice. Ca i alte microorganisme, ele pot, ntr-adevr, sintetiza i elibera diverse substane cu activitate antimicrobian. Aceste substane sunt simple peroxidul de hidrogen, unii acizi organici sau mai complexe. Astfel, bacteriile pot produce bacteriocine, o clas de molecule proteice a cror activitate bactericid are n general un spectru de aciune ngust. Studiile fundamentale i aplicate asupra bacteriocinelor au artat c exist o gam larg de substane produse de o mare varietate de lactobacili i coci. Pn n prezent au fost puse n eviden dou bacteriocine: brevicina, elaborat de o su de Lactobacillus brevis i cazeicina, elaborat de o su de Lactobacillus casei. Brevicina are un spectru larg de activitate, inhibnd, n afar de Lactobacillus brevis, sue de Leuconostoc oenos i Pediococcus damnosus. Cazeicina, dimpotriv, este activat doar asupra speciei Lactobacillus casei. Brevicina este o mic molecul proteic

termostabil i stabil ntr-o gam larg de pH. Cazeicina este mai puin stabil i de o greutate molecular net superioar (40-42 kDa). Rammelsberg M. i Radler F., au observat o activitate a unei sue de Lactobacillus plantarum fa de numeroase bacterii din specii variate, lactobacili i coci, n special Leuconostoc oenos. S-a demonstrat i producerea unei proteine bactericide fa de mai multe sue de Lactobacillus hilgardii, Pediocaccus pentosaceus i Leuconostoc oenos. Aceast bacteriocin, produs n cantitate mare n sucul de struguri de ctre o su de Pediococcus pentosaceus este stabil n condiiile de aciditate i la coninuturile n alcool etilic din vin. Scopul lucrrii Lucrarea are ca scop monitorizarea desfurrii procesului de fermentaie malolactic, prin ndeplinirea urmtoarelor obiective: - estimarea degradrii acidului malic prin cromatografie pe hrtie (metoda Michaud) i prin dozare enzimatic; - dozarea enzimatic a acidului lactic produs n urma fermentaiei malolactice - monitorizarea evoluiei populaiei bacteriene n decursul fermentaiei malolactice prin metode de numrare directe (cu camera Thoma) i indirecte (prin examen cultural) Introducere Fermentaia malolactic este un proces de dezacidifiere biologic a vinului i const n degradarea acidului malic din vin n acid lactic i CO2, conform urmtoarei reacii: HOOC CH2 CHOH COOH acid malic CH3 CHOH COOH + CO2 acid lactic dioxid de carbon

Din aceast reacie reiese c prin decarboxilarea acidului malic, care este un acid dicarboxilic (cu dou funcii acide), se formeaz acid lactic, care este acid monocarboxilic (cu o singur funcie acid) i CO2. Odat cu ndeprtarea uneia din funciile acide, se reduce i jumtate din aciditatea imprimat de acidul malic. Plusul de calitate care apare dup desvrirea fermentaiei malolactice nu se datoreaz numai reducerii aciditii, ci i formrii acidului lactic, care impresioneaz mai plcut papilele gustative, spre deosebire de acidul malic, care imprim o aciditate crud i o anumit nuan de verdea. Dac se deruleaz n condiii optime, fermentaia malolactic prezint efecte importante

asupra calitii vinului i anume: reduce aciditatea vinului i mrete uor pH-ul; crete stabilitatea biologic a vinului, asigurnd evitarea unei eventuale fermentaii malolactice nedorite n vinurile mbuteliate; modific aroma i gustul vinului, mrindu-i complexitatea. Bacteriile lactice produc mici cantiti de acetoin, din care o parte poate fi oxidat n diacetil, substan cu miros specific de unt. Creterea concentraiei de diacetil reprezint una dintre cele mai importante contribuii ale bacteriilor lactice la aroma vinului. n concentraii mari, aceasta confer vinului o arom puternic de unt, n timp ce n concentraii mici, diacetilul contribuie la aroma de nuci, de drojdii sau de caramel. Ca urmare a scderii aciditii, culoarea vinurilor roii seci se modific, devenind mai puin aprins. Aroma vinurilor fermentate malolactic se modific i ea. Astfel gustul acerb, dur, determinat de aciditate i taninuri dispare treptat, fiind nlocuit de un gust mai fin i mai catifelat datorat eliberrii de ctre bacteriile lactice n vin a unor polizaharide, aminoacizi, acizi nucleici. n ansamblu, vinurile dup fermentaia malolactic devin mai armonioase, mai pline i mai evoluate. Declanarea i desvrirea procesului de fermentaie malolactic se datoreaz bacteriilor lactice din genurile: Lactobacillus, Leuconostoc i Pediococcus. Fermentaia malolactic evolueaz diferit n vinurile albe i roii. Dac la vinurile roii seci, fermentaia malolactic trebuie privit ca o operaie integrat n tehnologia de elaborare a vinurilor roii, la vinurile albe demidulci i dulci trebuie privit ca un promotor de defecte, putnd conduce la borire sau manitare. Parte experimental I. Estimarea acidului malic prin cromatografie pe hrtie Principiul metodei Se bazeaz pe solubilitatea diferit a acizilor fa de anumii solveni, cnd acetia strbat prin capilaritate un suport solid-hrtia. Antrenarea i separarea acizilor organici din vin se face cu ajutorul amestecului butanoln-acid acetic-ap, iar punerea n eviden prin intermediul albastrului de bromfenol. Dup

apariia petelor de acizi, ce apar galbene pe un fond albastru, se observ urmtoarea poziionare: acidul tartric aproape de linia de start; acidul malic n centru; acidul lactic i succinic la partea superioar. Prin comparare cu soluii etalon de acid malic se poate aprecia coninutul de acid malic n vin. Reactivi soluie albastru de bromfenol n n-butanol 0,1 %; acid acetic-ap 1:1 (volume); acid malic 0,5 g/100 ml: ntr-un balon cotat de 100 ml se aduc 0,5 g acid malic, 85 ml ap i alcool etilic 96 % vol pn la semn. Mod de lucru Pe o fie de hrtie cromatografic, cu nlimea de circa 20 cm i limea corespunztoare numrului de probe de vinuri i de probe etalon, se traseaz o linie cu creionul la 4 cm de marginea inferioar pe care se puncteaz la 3 cm de marginea lateral poziiile unde urmeaz s depunem probele, distanate cu 2 sau 3 cm. Cu ajutorul unei micropipete se depune 1 l din soluiile etalon cu 1, 2, 3, 4 i 5 g/l acid malic, apoi 1 i 3 l din probele de vinuri (dup fiecare depunere de 1 l pata se usuc, dup care urmeaz o nou depunere). n acest caz petele de pe hrtie trebuie s aib un diametru de circa 5 mm. n funcie de concentraia n acizi a vinului se depun circa 5 pete pentru fiecare prob, avnd grij ca hrtia s fie uscat cnd se depune o nou pat de vin. ntr-o capsul Petri cu diametrul corespunztor se aduce solventul format din 50 ml butanol cu indicator i 20 ml acid acetic diluat (1:1), se plaseaz cilindrul de hrtie i se acoper etan cu un clopot de sticl. Cnd solventul a ajuns la circa 2 cm de marginea superioar (circa 3 ore) se scoate hrtia i se usuc n aer liber sau n ni. Se apreciaz coninutul de acid malic, respectiv evoluia fermentaiei malolactice n vinuri. II. Dozarea enzimatic a acidului L-malic Principiu Acidul L-malic este oxidat la oxaloacetat de ctre NAD+ n prezena L-malat dehidrogenazei (L-MDH):

L-MDH (1) L-malat + NAD+ Oxaloacetat + NADH + H+ Dac reacia este catalizat de enzima glutamat-oxaloacetat-transaminaz (GOT), oxaloacetatul este transformat n L-aspartat n prezena L-glutamatului. L-MDH (2) Oxaloacetat + L-glutamat L-aspartat + 2-oxoglutarat Compoziia kitului 1. Sticla 1 cu 30 ml soluie, format din: tampon glicilglicin (pH 10); acid L-glutamic (440 mg). 2. Sticla 2 cu 210 mg NAD, liofilizat. 3. Sticla 3 cu 0,4 ml suspensie glutamat-oxaloacetat-transaminaz (GOT), 160 U. 4. Sticla 4 cu 0,4 ml soluie L-malat dehidrogenaz, 2400 U. 5. Soluie de control pentru analiza acidului L-malic. Se folosete nediluat. Soluiile ce urmeaz a fi folosite se pregtesc astfel: 1. Se folosete coninutul sticlelor 1, 3 i 4 nediluat. 2. Se dizolv coninutul sticlei 2 cu 6 ml ap bidistilat. n procedeul de lucru am utilizat o lungime de und de 365 nm, cuve de sticl cu lungimea de 1 cm, o temperatur cuprins ntre 20-25 0 C, iar citirea la spectrofotometru se face fa de aer (fr cuv) Pipetare Blank Prob Soluia 1 1,000 ml 1,000 ml Soluia 2 0,200 ml 0,200 ml Suspensie 3 0,010 ml 0,010 ml Prob 0,100 ml Ap bidistilat 1,000 ml 0,900 ml Se amestec i se citesc absorbanele soluiilor (A1) dup aproximativ 3 minute. Se ncepe reacia prin adugarea: Soluie 4 0,010 ml 0,010 ml Apoi se amestec i se ateapt pn la terminarea reaciei (aprox. 5-10 minute), dup care se citesc absorbanele blankului i ale probei (A2). Se determin diferenele de absorbane (A2-A1) att pentru blank, ct i pentru prob. Apoi se scade diferena obinut pentru blank din diferena obinut pentru prob i se obine A. A = (A2-A1) proba - (A2-A1) blank

Pentru obinerea unor rezultate precise, diferenele de absorban obinute trebuie s fie de cel puin 0,100 uniti absorban. Pentru calcularea coninutului de acid L-malic din vin, se utilizeaz urmtoarea formul: c = 2,977 / A acid mmol-1 x cm-1] A = diferena de absorban n cazul n care probele au fost diluate, rezultatele trebuie nmulite cu factorul de diluie III. Dozarea enzimatic a acidului L-lactic Principiu Acidul L-lactic este oxidat la piruvat de ctre NAD+ n prezena enzimei L-lactat dehidrogenaz (L-LDH). Compoziia kitului 1. Sticla 1 cu 30 ml soluie, format din: tampon glicilglicin (pH 10); acid L-glutamic (440 mg). 2. Sticla 2 cu 210 mg NAD, liofilizat. 3. Sticla 3 cu 0,7 ml suspensie glutamat-piruvat-transaminaz (GPT). 4. Sticla 4 cu 0,7 ml soluie L-lactat dehidrogenaz, 3800 U. 5. Soluie de control pentru analiza acidului L-lactic. Se folosete nediluat. Soluiile ce urmeaz a fi utilizate se pregtesc astfel: 1. Se folosete coninutul sticlelor 1, 3 i 4 nediluat. 2. Se dizolv coninutul sticlei 2 cu 6 ml ap bidistilat. n procedeul de lucru am utilizat o lungime de und de 365 nm, cuve de sticl cu lungimea de 1 cm, o temperatur cuprins ntre 20-25 0 C, iar citirea la spectrofotometru se face fa de aer (fr cuv). Pipetare Blank Prob Soluia 1 1,000 ml 1,000 ml Soluia 2 0,200 ml 0,200 ml Suspensia 3 0,020 ml 0,020 ml Prob 0,100 ml Ap bidistilat 1,000 ml 0,900 ml Toate aceste soluii se amestec i dup aproximativ 5 minute se citesc absorbanele soluiilor (A1). Apoi se mai adaug i ultima soluie.
L-m alic

[g acid L-malic/l soluie prob]

unde: = coeficientul de extincie al NADH la lungimea de und utilizat = 3,4 [l x

Soluia 4 0,020 ml 0,020 ml Dup adugarea ultimei soluii amestecul se agit, iar dup aproximativ 30 minute se citesc absorbanele blankului i ale probei (A2), imediat una dup alta. Se determin diferenele de absorbane, (A2 A1) att pentru blank, ct i pentru prob, dup care se scade diferena obinut pentru blank din diferena obinut pentru prob i vom obine A. A = (A2 A1) proba - (A2 A1) blank Pentru calculul coninutului de acid L-lactic din vin, se utilizeaz urmtoarea formul: c = 2,018 / A acid trebuie nmulite cu factorul de diluie. III. Numrarea bacteriilor lactice cu ajutorul camerei de numrat Thoma Camera de numrat THOMA este o lam de sticl cu trei platforme, dintre care platforma central este denivelat fa de celelalte dou cu 0,10 mm. Pe platforma central este gravat o reea de linii perpendiculare care delimiteaz o anumit suprafa divizat de ctre linii perpendiculare de form ptratic. Suprafaa platformei este de 1 mm2, iar suprafaa unei microcelule este de 1/400 mm2. Mod de lucru Pentru determinarea numrului de bacterii lactice, pe platforma central se pune o pictur de de vin, dup care se acoper cu o lamel. Preparatul astfel obinut se fixeaz pe platina microscopului cu ajutorul unor cleme i apoi se examineaz cu obiectiv de 45x i ocular de 10x. ntr-un cmp microscopic se observ 16 microcelule, se numr celulele de bacterii lactice de pe 10 cmpuri microscopice diferite i se calculeaz numrul mediu de celule de bacterii lactice de pe fiecare microcelul. Cunoscnd suprafaa unei microcelule i denivelarea platformei, se poate calcula volumul microcelulei: V = 1/400 x 1/10 = 1/4000 mm3 n funcie de volumul unei microcelule i de gradul de diluie al probei, se calculeaz numrul de celule de bacterii / ml vin:
L -lactic

[g acid L-lactic/l soluie prob]

n cazul n care probele de vin au fost diluate, pentru ca rezultatele s fie corecte, acestea

N = n x 4000 x 1000 x k unde : N = numrul de celule de bacterii / ml vin; n = numrul mediu de celule de bacterii de pe microcelule; 4000 = inversul volumului, [mm3]; 1000 = factorul de transformare din mm3 n cm3; k = factorul de diluie; IV. Numrarea coloniilor de bacterii lactice prin examen cultural Din probele de vin i din diluiile decimale ale acestora, se inoculeaz cte 1 ml n cutii Petri sterile, i se face omogenizarea cu mediu MRS agar fluidificat i rcit la 45 0 C Dup nsmnare, cutiile se introduc n termostat la temperatura de 37 0 C, timp de 4872 ore. Dup termostatare, se numr coloniile de pe fiecere plac Petri i se estimeaz UFC/ml vin = n* d/ N unde n- numrul de colonii de bacterii lactice formate d- diluia probelor inoculate N- numarul de plci Petri luate n considerare Rezultate i discuii n cadrul primului experiment, de estimare a acidului malic prin cromatografie pe hrtie, s-au analizat mai multe probe de vin pentru a urmri desfurarea fermentaiei malolactice la diferite momente de timp. Fig. 1 Acid malic-Oporto-Merlot- Bbeasc neagr-Burgund-Cabernet SauvignonCadarc-Blauerzweigelt Cadarc-Blauerzweigelt 28.04.2007 Fig. 3 Acid malic-Oporto-Merlot-Burgund-Cabernet Sauvignon-SangioveseBlauerzweigelt 05.05.2007 19.04.2007 Fig. 2 Acid malic-Oporto-Merlot- Bbeasc neagr-Burgund-Cabernet Sauvignonnumrul total de bacterii lactice cu formula

Figura 1

Figura 2

Figura 3 n figura 1 se poate observa c singurul vin care i-a terminat fermentaia malolactic este cel obinut din soiul Cadarc, deoarece se separ doar acid tartric i acid lactic. n cazul vinului obinut din soiul Bbeasc neagr, putem spune c fermentaia malolactic este n plin desfurare, deoarece se separ att acid malic, ct i acid lactic. n figura 2, n care am urmrit stadiul fermentaiei malolactice a vinurilor dup 9 zile, putem constata c de data aceasta i vinul obinut din soiul Bbeasc neagr (inoculat cu bacterii lactice selecionate) i-a finalizat fermentaia malolactic. n acest caz se separ doar acid lactic, ceea ce nseamn c acidul malic s-a transformat integral n acid lactic. n figura 3 am urmrit desfurarea fermentaiei malolactice a unor probe de vin, dup ce acestea au fost nsmnate cu un preparat comercial INOFLORE R (ce contine specia Leuconostoc oenos) i au fost lsate la fermentat timp de 7 zile. Se poate observa c, n acest caz, doar o singur prob de vin i-a ncheiat procesul de fermentaie malolactic i anume, proba obinut din soiul Merlot, la care se separ doar acid tartric i acid lactic. n cadrul experimentului legat de dozarea enzimatic a acidului L-malic i L-lactic, am dozat coninutul de acid malic i lactic din mai multe probe de vin. La vinul obinut din soiul Bbeasc neagr, nainte de fermentaia malolactic, rezultatul este urmtorul: coninutul de acid malic Bbeasc neagr = 0,730 g/l La vinul obinut din soiul Bbeasc neagr, dup fermentaia malolactic, am obinut

urmtorul rezultat: coninutul de acid lactic Bbeasc neagr = 1,051 g/l De asemeni, am monitorizat evoluia populaiei bacteriene nainte de fermentaie malolactic, prin nsmnarea probelor de vin nefermentate malolactic pe mediu MRS agar i numrarea coloniilor de bacterii lactice. Astfel, s-au obinut urmtoarele rezultate, care pot fi observate i din figurile de mai jos: Bbeasc neagr numr mic de colonii de bacterii lactice Cabernet Sauvignon numr mediu de colonii de bacterii lactice Merlot, Cadarc- numr mare de colonii de baterii lactice Bbeasc neagr Cabernet Sauvignon

Merlot

Cadarc

Figura 4 Dezvoltarea coloniilor de bacterii lactice pe mediu MRS agar n cazul numrrii bacteriilor lactice din probele de vin, prin intermediul camerei Thoma, am obinut urmtoarele rezultate: Probele de vinuri Numrul de bacterii lactice Bbeasc neagr 5106 cel/ml Cabernet Sauvignon 7106 cel/ml Merlot 17106 cel/ml Cadarc 23106 cel/ml

Concluzii n concluzie, putem spune c momentul finalizrii fermentaiei malolactice difer n funcie de tipul de vin i de soiul de struguri din care a fost obinut vinul respectiv. Momentul

desvririi fermentaiei malolactice este influenat de temperatur, pH, aciditatea total, concentraia alcoolic, coninutul n bioxid liber i total al vinului. De asemeni, momentul terminrii fermentaiei malolactice, depinde i de varianta de fermentare: spontan sau dirijat (cu bacterii lactice selecionate). De remarcat, este faptul c vinul Bbeasc neagr, dei are o microflor indigen, destul de redus, reusete s fermenteze malolactic mult mai repede, comparativ cu celelalte vinuri. Acest lucru se ntmpl, deoarece a fost inoculat cu bacterii lactice selecionate, care au reuit sa degradeze total acidul malic. n varianta fermentaiei malolactice spontane (cu microflor indigen), acest vin nu reuete s fermenteze malolactic. Determinnd cu precizie, concentraiile de acid malic i lactic din vinuri i totodat printr-o utilizare judicioas a culturilor starter de bacterii malolactice, putem iniia i finaliza o fermentaie malolactic n condiii de siguran, mrind stabilitatea microbiologic a vinului i mbunataind profilul senzorial al acestuia.