Lic.

en Biotecnologa

martinezmauro@hotmail.com

Lic. en Biotecnologa

martinezmauro@hotmail.com

Lugar de Trabajo:

Centro de Investigacin y Desarrollo en Fermentaciones Industriales

Lic. en Biotecnologa

martinezmauro@hotmail.com

La utopa est en el horizonte. Camino dos pasos, ella se aleja dos pasos. Yo camino diez pasos y ella est diez pasos ms lejos. Entonces para qu sirve la utopa? Sirve para eso, para caminar. Eduardo Galeano (extrada del libro Patagonia de Pie. Ecologa vs Negociados).

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com NDICE I. INTRODUCCIN .................................................................................................... 6 I.A. Contaminacin con Hidrocarburos............................................................................ 6 I.A.1 Hidrocarburos Policclicos Aromticos (PAH). ...................................................... 6 I.B Biorremediacin de sitios contaminados con PAH: ................................................... 7 I.B.1 Bioaumento como estrategia para mejorar la biodegradacin de PAH: .................. 8 I.B.2 Seleccin de inoculantes para suelos contaminados con PAH: ............................... 9 I.B.3 El fenantreno como modelo: ................................................................................. 12 I.B.4 Degradacin bacteriana del fenantreno: ................................................................ 13 I.C Dilucidacin de rutas metablicas ............................................................................ 15 I.C.1 Bsqueda de metabolitos intermediarios. .............................................................. 15 1.C.2 Utilizacin de mtodos protemicos..................................................................... 16 II. OBJETIVOS ........................................................................................................... 18 II.A Objetivo General ................................................................................................. 18 II.B Objetivos Especficos .......................................................................................... 18 III. MATERIALES Y MTODOS ............................................................................... 19 MATERIALES ............................................................................................................... 19 III.A.1 Cepa utilizada ................................................................................................. 19 III.A.2 Medios de Cultivo: ......................................................................................... 19 III.A.3 Reactivos......................................................................................................... 20 III.B METODOLOGA .................................................................................................. 20 III.B.1 Caracterizacin metablica de la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA: .................................................................................................................................... 20 III.B.1.i Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando fenantreno como nica fuente de carbono y energa ................................................................ 21 III.B.1.ii Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando glucosa como nica fuente de carbono y energa ................................................................ 21 III.B.1.iii Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando cido naftoico como nica fuente de carbono y energa .................................................. 21 III.B.2 Estudio de la cintica de degradacin de fenantreno en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA: ................................................................................. 21 III.B.2.i Preparacin del inculo............................................................................ 22 III.B.2.ii Ensayo ..................................................................................................... 22 III.B.2.iii Determinacin de la concentracin de fenantreno y cido naftoico en MML ....................................................................................................................... 22 III.B.3 Estudio de la capacidad de degradacin de cido naftoico en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA:........................................................................ 23 III.B.3.i Preparacin del inculo............................................................................ 23 III.B.3.ii Ensayo ...................................................................................................... 23 III.B.3.iii Determinacin de la concentracin de cido naftoico .......................... 23 III.B.4 Estudio del efecto de cido Naftoico en la cintica de degradacin de Fenantreno en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA.......................... 23 III.B.5 Estudio del proteoma de la cepa. ........................................................................ 24 III.B.5.1 Preparacin de cultivos en biorreactor ......................................................... 24 III.B.5.1.a Crecimiento en fenantreno 0.84g/l como nica fuente de carbono y energa .................................................................................................................... 24 III.B.5.1.b Crecimiento en Glucosa 2g/l como nica fuente de Carbono y Energa ................................................................................................................................ 25 III.B.5.2 Lisado Celular .............................................................................................. 26

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com III.B.5.3 Electroforesis Bidimensional 2-D ................................................................ 26 III.B.5.4 Anlisis de las Imgenes de los Geles: ........................................................ 27 III.B.5.5 Identificacin de Protenas:.......................................................................... 27 IV. RESULTADOS ...................................................................................................... 29 IV.A Caracterizacin metablica de la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA: 29 IV.A.1 Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando glucosa como nica fuente de carbono y energa .............................................................................. 29 IV.A.2 Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando fenantreno como nica fuente de carbono y energa. ............................................................... 31 IV.B Estudio de la cintica de degradacin de fenantreno en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA: .................................................................................. 33 IV.C. Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando cido naftoico como nica fuente de carbono y energa .................................................................... 35 IV.C.1 Estudio de la capacidad de degradacin de cido naftoico en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA ......................................................................... 37 IV.C.2 Estudio del efecto de cido naftoico en la cintica de degradacin de Fenantreno en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA.......................... 38 IV.D Estudio del proteoma de la cepa S. paucimobilis 20006FA: ............................. 41 V. DISCUSIN ........................................................................................................... 44 VI. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................. 51

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com I. INTRODUCCIN

I.A. Contaminacin con Hidrocarburos. La contaminacin con hidrocarburos se produce por su liberacin accidental o intencionada en el ambiente, provocando efectos adversos sobre el hombre y sobre el medio ambiente de forma directa. La refinacin del petrleo y su transporte son los mayores contribuyentes de la concentracin de hidrocarburos en el ambiente, ya que provocan descargas accidentales (Kanaly y Harayama, 2000). Los derrames de petrleo y los desechos producen diversos efectos sobre el suelo, provocando la alteracin del sustrato original en que se implantan las especies vegetales dejando suelos inutilizables durante aos (Instituto Argentino del Petrleo, 1991). Entre los hidrocarburos ms importantes desde el punto de vista toxicolgico se encuentran los Hidrocarburos Policclicos Aromticos (PAH), los cuales se bioacumulan en la cadena alimentaria suponiendo un riesgo para la salud humana (Olie y col., 1977). I.A.1 Hidrocarburos Policclicos Aromticos (PAH). Los PAH son un grupo qumico que contienen dos o ms anillos bencnicos fusionados en arreglos lineales, angulares, o ramificados (Cerniglia y col., 1992; Cheung y col., 2001). Las propiedades fsico-qumicas de los PAH varan en funcin del nmero de anillos y, por tanto, por su peso molecular. La reactividad qumica, la solubilidad en agua y la volatilidad disminuyen con el aumento del peso molecular. Como resultado, los PAH se diferencian en su transporte, distribucin y destino en el medio ambiente y sus efectos sobre los sistemas biolgicos. La Agencia de Proteccin Ambiental (EPA) ha identificado 16 PAH como contaminantes prioritarios. Esto se debe

fundamentalmente a la peligrosidad intrnseca de los PAH, debido a la toxicidad aguda

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com y a la toxicidad de tipo teratognico, mutagnico y carcinognico que presentan (La Voie y Rice, 1988). Entre los menos fciles de degradar se encuentran los PAH de alto peso molecular. Las principales fuentes de produccin de PAH son la combustin incompleta de materia orgnica, la produccin de gas, instalaciones de tratamiento de madera, y la incineracin de desechos (Kanaly y Harayama, 2000; Kim y col., 2003). Tambin los PAH se forman de manera natural durante reacciones geolgicas trmicas asociadas con los combustibles fsiles, la produccin minera, y durante la quema de vegetacin en los bosques y los incendios forestales (Juhasz y col., 2000; Wilson y Jones, 1993). I.B Biorremediacin de sitios contaminados con PAH: Las estrategias de remediacin requieren mtodos fiables para identificar y vigilar la contaminacin, como as tambin, procedimientos eficaces para atenuar o eliminar los contaminantes. Las estrategias de remediacin fsico-qumicas

convencionales tales como vertederos, reciclaje, pirlisis, excavacin, incineracin, utilizadas para remediar sitios contaminados son ineficientes, costosas y tambin pueden conducir a la formacin de productos intermediarios ms txicos que los contaminantes originales. Durante las dos ltimas dcadas, la biorremediacin se ha convertido en una alternativa ms segura, ecolgica, econmica y viable para la restauracin de los sitios contaminados (Dua y col. 2002). Casi todos los seres vivos estn dotados con algn nivel mnimo de habilidades tales como la desintoxicacin, mineralizacin, transformacin y/o inmovilizacin de contaminantes. Sin embargo, los microorganismos y en particular, las bacterias y los hongos, han sido extensamente estudiados y utilizados para llevar a cabo las actividades de desintoxicacin (Watanabe y Baker, 2000; Rieger y col., 2002; Peng y col., 2008; Seo y col., 2009). Las bacterias contienen una enorme diversidad metablica que les

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com permite utilizar compuestos qumicos complejos como fuente de carbono y de energa (Rieger y col., 2002; Daz y col., 2004; Nojiri y Tsuda 2005; Seo y col., 2009). La biodegradacin de PAH se basa en la ruptura de compuestos orgnicos a travs de la biotransformacin originando metabolitos menos txicos o inocuos para el medio ambiente o con el fin de realizar una mineralizacin generando H2O, CO2 (aerbica) o CH4 (anaerbico) como productos finales. El alcance y la velocidad de biodegradacin depende de muchos factores, incluyendo: pH, temperatura, oxgeno, la poblacin microbiana, el grado de aclimatacin, accesibilidad de nutrientes, la estructura qumica del compuesto, edad de la contaminacin, propiedades de transporte celular y particin qumica en el medio de crecimiento (Singh y Ward, 2004; VzquezNuez y col., 2009; Haritash y Kaushik, 2009). Adems, los procesos fsico-qumicos que controlan la particin entre la fase slida y lquida, y la posterior accesibilidad del soluto para los microorganismos pueden afectar la eficacia de la biorremediacin de suelos contaminados con PAH (Mihelcic y col., 1993). Debido a su alta hidrofobicidad, los PAH tienden a interactuar con la fase no acuosa del suelo y con la materia orgnica. Como consecuencia, se convierten en compuestos difcilmente disponibles para la degradacin microbiana, muchos microorganismos que degradan PAH, slo pueden hacerlo cuando estos se encuentran disueltos en el agua (Johnsen y col., 2005). La biodisponibilidad es para los microorganismos un factor importante de seleccin de especies, de este modo bacterias del mismo suelo pueden ser seleccionadas por sus diferentes capacidades para manejar la biodisponibilidad de PAH (Mueller y Shann, 2006). I.B.1 Bioaumento como estrategia para mejorar la biodegradacin de PAH: Una estrategia muy utilizada para incrementar la biodegradacin de hidrocarburos es el bioaumento. La estrategia de bioaumento consiste en el aumento de

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com las capacidades metablicas de la comunidad microbiolgica indgena por la introduccin de microorganismos, a fin de incrementar la velocidad o la extensin de la degradacin de un contaminante (El Fantroussi y Agathos, 2005). Generalmente, se lleva a cabo a travs de la introduccin de poblaciones bacterianas (cepas individuales o consorcios bacterianos) en exceso, activos y con capacidades degradadoras que puedan llevar al contaminante a la mineralizacin, de tal modo que proporciona una reparacin del sitio contaminado ms rpida de lo que se produce por medio la utilizacin de los microorganismos indgenas (Thompson y col., 2005; Gentry y col., 2004).

I.B.2 Seleccin de inoculantes para suelos contaminados con PAH: Cuando la microbiota natural no posee la capacidad para degradar eficientemente los compuestos contaminantes, la estrategia de bioaumento, es una va posible para mejorar el xito del proceso (Serrano y col., 2009). El uso de los microorganismos autctonos para la biorremediacin de suelos contaminados es de gran inters, ya que se espera que estos microorganismos se encuentren ms adaptados al entorno del suelo y sean capaces de establecerse luego de la entrada de un contaminante, que los microorganismos forneos que puedan llegar a introducirse como inculos microbianos para llevar a cabo la biorremediacin (Amezcua-Allier y col., 2010). Aunque, la eficacia del bioaumento es una materia en discusin, ya que se han reportado resultados tanto positivos como negativos en su utilizacin, esta metodologa sigue siendo muy prometedora para la remediacin de suelos con PAH. Por una parte, el bioaumento ha demostrado su eficacia para la recuperacin de sedimentos contaminados con PAH carentes de potencial de degradacin intrnseca (Major y col., 2008; Juhasz y Naidu, 2000), mientras que otros estudios demostraron que el bioaumento no ha podido

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com mejorar significativamente la biodegradacin en comparacin con la atenuacin natural (Tam y Wong, 2008; Coppotelli y col., 2008). Los inculos para el bioaumento suelen ser producidos en biorreactores, siendo la transferencia de estos cultivos al sitio contaminado la etapa crtica del proceso (Tyagi y col., 2010). Los inculos microbianos al ser introducidos en los ambientes contaminados frecuentemente sufren un alto estrs en sus condiciones de crecimiento. En estudios a campo, la poblacin introducida comienza a disminuir poco despus de ser aadida, debido a varios factores abiticos y biticos de estrs (Mrozika y Piotrowska-Segetb, 2010). Las parmetros que dificultan el crecimiento microbiano incluyen las fluctuaciones o temperaturas extremas, contenido de agua, el pH, el potencial redox, el agotamiento de los nutrientes, la biodisponibilidad del contaminante, o la ausencia de los principales co-sustratos, la competencia entre la comunidad indgena y la biomasa introducida, el uso de otros sustratos orgnicos con preferencia a los contaminantes, la predacin, y tambin las concentraciones de los contaminantes (Gentry y col., 2004; Goldstein y col., 1985; Tyagi y col., 2010). Por lo que el factor clave e imprescindible para el xito de la bioaumentacin es la seleccin adecuada de la cepa bacteriana para este propsito (Thompson y col., 2005). La seleccin de una cepa para ser utilizada en el bioaumento, no slo debera basarse por su habilidad para la degradacin, sino tambin por las caractersticas ecolgicas relativas a la adaptacin al hbitat en la cual se la quiera introducir. La seleccin debe cumplir con las siguientes consideraciones: i) deben ser fcilmente manipulables, ii) tener habilidades catablicas excepcionales, iii) tolerancia al estrs ambiental y a crecer en presencia de co-contaminantes (por ejemplo, metales pesados), iv) no ser riesgosas para la salud y v) en el caso de la biorremediacin de PAH deberan

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com tener propiedades promotoras de la biodisponibilidad para hacer ms asequibles los contaminantes al ataque bacteriano (Singer y col., 2005; Thompson y col., 2005; Mrozika y Piotrowska-Segetb, 2009; Coppotelli y col., 2010). La aplicacin de tcnicas moleculares, puede ayudar a identificar los organismos potencialmente remediadores y descubrir lo que hace que algunas especies sean ms persistentes que otras, logrando mejorar el conocimiento sobre la diversidad microbiana en los ambientes naturales, conduciendo al desarrollo de una coleccin de organismos bien caracterizados con altas capacidades de degradacin y tolerancia a una amplia gama de productos qumicos del medio ambiente y al estrs fsico (Wessels Perelo, 2010). Un esfuerzo considerable se ha centrado en la bsqueda y aislamiento de microorganismos capaces de degradar PAH que utilicen a los mismos como fuente de carbono y de energa (Zhao y col., 2008). El gnero Sphingomonas puede ser considerado como miembro clave entre los gneros bacterianos degradadores de PAH del suelo, ya que ha sido frecuentemente aislado de sitios contaminados con este tipo de hidrocarburos (Bastiaens y col., 2000; Coppotelli y col., 2008). En nuestro grupo de trabajo se ha estudiado ampliamente la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA, la misma fue aislada a partir de microcosmos de suelo contaminados artificialmente con 2 g/Kg de fenantreno e incubados a temperatura ambiente (20 2 C), seleccionada de acuerdo a su capacidad para degradar un amplio rango de PAH (fenantreno, dibenzotiofeno y antraceno), e identificada mediante la secuenciacin del gen16s ribosomal como Sphingomonas paucimobilis (99%). En estudios previos utilizando la estrategia de bioaumento, se ha demostrado que la cepa se establece rpidamente en el suelo contaminado con fenantreno y que incrementa la degradacin del mismo durante los primeros 20 das de haber sido

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com inoculada. Luego de este lapso de tiempo, se observ un retardo en el descenso de la concentracin de fenantreno (Coppotelli y col., 2008). Se ha hipotetizado que este retardo en la degradacin de fenantreno se debe a una acumulacin de intermediarios metablicos y no a una escasa biodisponibilidad del fenantreno, ya que ms tarde la degradacin contina hasta alcanzar los niveles del control. Al estudiar la degradacin de fenantreno en medio liquido se observ que cepa produce dos intermediarios mayoritarios cido 1-hidroxi-2-naftoico y cido saliclico, demostrando que el fenantreno es degradado por la cepa utilizando la ruta de degradacin va salicilato (Coppotelli y col., 2010). Tambin, se demostr que la cepa tiene dos mecanismos bien diferenciados para hacer al fenantreno ms biodisponible: i) excrecin de surfactante, facilitando la toma del fenantreno por la cepa. ii) capacidad de adherirse a los cristales de fenantreno, aumentando la biodisponibilidad del mismo. (Coppotelli y col., 2010). Tambin, se ha comprobado que la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA posee propiedades ecolgicas importantes para ser utilizada como inoculante en suelo: i) habilidad para crecer en ambientes oligotrficos, ii) produccin de biosurfactantes, iii) capacidad de adherirse a superficies y de producir biofilms, iv) capacidad de crecimiento rpido en un rango amplio de temperatura, concentracin salina y pH, v) movilidad celular y quimiotaxis (Coppotelli y col., 2010).

I.B.3 El fenantreno como modelo: El fenantreno es un PAH tricclico que presenta dos regiones: Bay y K (Figura 1), altamente reactivas donde se pueden formar las principales especies carcinognicas, generalmente epxidos (Correia y col. 2007; Amezcua-Allier y col., 2010), y por esta razn, es comnmente utilizado como sustrato modelo en estudios sobre el metabolismo de los PAH carcinognicos. Adems, la degradacin de PAH de alto peso molecular

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com puede ser llevada a cabo a travs de los intermediarios de fenantreno (Cerniglia, 1992). El fenantreno, se encuentra en altas concentraciones en zonas contaminadas tales como sedimentos, suelos superficiales y sitios de desechos (Moody y col., 2001). La degradacin bacteriana de fenantreno ha sido estudiada ampliamente. Se han aislado una variedad de cepas bacterianas con la capacidad de utilizar fenantreno como fuente de carbono y de energa, entre ellas se encuentran: Acidovorax, Arthrobacter, Brevibacterium, Burkholderia, Comamonas, Mycobacterium, Pseudomonas y

Sphingomonas (Pinyakong y col., 2003; Prabhu y Phale, 2003; Seo y col., 2006).

Figura 2. Estructura qumica de la molcula de fenantreno.

I.B.4 Degradacin bacteriana del fenantreno: La degradacin bacteriana del fenantreno comienza con la incorporacin de dos tomos de oxgeno en su estructura en una reaccin catalizada, por una enzima dioxigenasa (Habe y Omori, 2003). La dioxigenacin de la molcula de fenantreno es llevada a cabo en los carbonos 9 y 10 en las bacterias Gram positivas (Vila y col., 2001). En cambio, en las bacterias Gram negativas la dioxigenacin se realiza en los carbonos 3,4 o 1,2. El dihidrodiol resultante se convertir por la accin de la dihidrodiol deshidrogenasa en 3,4-dihidroxifenantreno, el cual ser objeto del meta clivaje, y en los pasos posteriores se convierte en cido 1-hidroxi-2-naftoico. El cido 1-hidroxi-2naftoico es el intermediario principal durante la degradacin microbiolgica de fenantreno (Balashova y col., 2001; Mallick y col., 2007; Peng y col., 2008). El cido 1-

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com hidroxi-2-naftoico puede ser degradado por dos vas diferentes reportadas hasta ahora. En una de las rutas, el cido 1-hidroxi-2-naftoico sufre descarboxilacin oxidativa para formar 1,2-dihidroxinaftaleno, que posteriormente es metabolizado por la ruta de degradacin de naftaleno va salicilato y catecol. En la otra ruta, el cido 1-hidroxi-2naftoico es metabolizado a travs de la va cido ftlico y cido protocatecuato (Kiyohara y Nagao, 1978; Evans y col., 1965; Seo y col., 2007) (Figura 2). Tanto el catecol y el cido protocatecuato generan metabolitos terminales que ingresan al Ciclo de Krebs, para generar energa en forma de ATP necesaria para los procesos celulares que llevan a cabo los microorganismos (Habe y Omori 2003).

Figura 2. Rutas propuestas para la degradacin de fenantreno por bacterias (Pinyakong, 2000)

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com I.C Dilucidacin de rutas metablicas Como se ha dicho anteriormente, una amplia gama de microorganismos contribuyen de manera importante a la oxidacin de hidrocarburos aromticos en los hbitats del medio ambiente (Cerniglia, 1992). En muchos casos, se encuentra suficiente informacin para esbozar, al menos en parte, las vas catablicas de inters. Dependiendo de los hidrocarburos aromticos y los microorganismos estudiados, se han reportado las vas metablicas que llevan a la completa mineralizacin o a la transformacin parcial de las sustancias intermediarias de acumulacin. Por lo tanto, la biodegradacin bacteriana de los PAH debe ser acompaada con el conocimiento de las vas metablicas, los mecanismos bioqumicos y de las enzimas implicadas en el metabolismo celular, ya que estas ayudarn en el abordaje de la evaluacin del riesgo para determinar su impacto potencial. En el intento de estudiar este aspecto de la contaminacin ambiental, se utilizan estrategias tradicionales que incluyen la elucidacin de la estructura qumica de los metabolitos y la caracterizacin, molecular y bioqumica, de los genes que codifican las enzimas claves involucradas en la degradacin microbiana de los hidrocarburos aromticos. Sin embargo, el desarrollo reciente de tcnicas de alta resolucin analtica y tcnicas de genmica funcional, en particular la protemica se han convertido en crucialmente importantes para el estudio de mecanismos de degradacin de hidrocarburos aromticos por los microorganismos (Kim y col., 2010). I.C.1 Bsqueda de metabolitos intermediarios.

La metabolmica estudia la coleccin cuantitativa total de compuestos de bajo peso molecular (metabolitos) presentes en una clula u organismo que participan en las

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com reacciones metablicas necesarios para el crecimiento, el mantenimiento y el funcionamiento normal del mismo (Goodacre y col., 2003; Bolten y col., 2007). La informacin detallada de diferenciacin metabolmica es tambin uno de los requisitos previos ms importantes para una mejor comprensin del metabolismo de las bacterias y de los contaminantes ambientales. Adems, varios metabolitos son txicos para los microorganismos a travs del agotamiento de los equivalentes de reduccin o cofactores (Chang y Zylstra, 1999; Kim y col., 2004). Entender cmo un metabolito puede interactuar con un determinado receptor o enzima, requiere el conocimiento de los metabolitos producidos y de su persistencia en el medio ambiente. La rpida adaptacin metablica de los microorganismos a los cambios ambientales es muy comn y es de esperar, que cambios similares ocurran tambin en las bacterias degradadoras de PAH. Una informacin cuantitativa y comparativa de los diferentes metabolitos producidos, proporcionar una mejor comprensin del metabolismo de las bacterias degradadoras de PAH, y contribuir a mejorar el conocimiento sobre las rutas metablicas implicadas en la biorremediacin de ambientes contaminados (Seo y col., 2009). 1.C.2 Utilizacin de mtodos protemicos. Ya que las protenas son consideradas los principales efectores de la respuesta biolgica de un microorganismo frente a condiciones ambientales especficas, con el fin de confirmar la va de degradacin un microorganismo puede seguir, el anlisis del proteoma (protenas totales de un microorganismo en un determinado momento) resulta de importancia crucial, proveyendo informacin para la identificacin y cuantificacin de enzimas bacterianas responsables del metabolismo de los hidrocarburos policclicos aromticos (Loh y col., 2008; Kim y col., 2009), de modo que estas estrategias tambin

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com contribuirn a la identificacin de nuevas funciones involucradas en las complejas rutas metablicas relacionadas con la degradacin de PAH con aplicaciones en la biorremediacin ambiental.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

II.

OBJETIVOS

II.A Objetivo General El presente trabajo propone establecer la va metablica de degradacin del fenantreno de la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA, a travs del estudio de los metabolitos producidos y de las protenas expresadas durante la degradacin.

II.B Objetivos Especficos Estudiar en biorreactores batch la cintica de degradacin de PAH de la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA Elucidar el flujo del carbono mediante el estudio de los productos

intermediarios de degradacin de fenantreno y la influencia de stos sobre la degradacin del PAH Estudiar el proteoma de la cepa en cultivos con fenantreno como nica

fuente de carbono y energa.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

III.

MATERIALES Y MTODOS

MATERIALES III.A.1 Cepa utilizada La cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA (DQ400860) fue crecida en caldo R3 a 28 C y en agitacin a 150 rpm y alcuotas de 1 ml fueron almacenadas con glicerol al 20 % v/v a 80C para su preservacin (Coppotelli y col., 2008). III.A.2 Medios de Cultivo: Caldo R2 (Reasoner y Geldreich, 1985) Composicin en g/L de agua destilada. 0.5 g de Extracto de levadura 0.5 g de Proteosa peptona 0.5 g de cido Casamino 0.5 g de Glucosa 0.5 g de Almidn 0.3 g de cido Pirvico 0.3 g de K2HPO4 0.05 g de MgSO4 El pH se ajusta a 7,2 con una solucin de NaOH HCl 10%, y se esteriliza en autoclave a 121 C durante 15 min. Agar R2 Se agregan 15 g/L de agar (Difco) al medio de cultivo caldo R2. Caldo R3 (Reasoner y Geldreich, 1985). Composicin en g/L de agua destilada. 1 g de Extracto de levadura 1 g de Proteosa peptona N3

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com 1 g de cido Casamino 1 g de Glucosa 1 g de Almidn soluble 0.5 g de Piruvato de sodio 0.6 g de K2 HPO4. 0.1 g de MgSO4 .7H2O El pH se ajusta a 7,2 con una solucin de NaOH HCl 10%, y se esteriliza en autoclave a 121 C durante 15 min Agar R3 Se agregan 15 g/L de agar (Difco) al medio de cultivo caldo R3. Medio Mineral Lquido (MML) (Vecchioli y col., 1990) Composicin en g/l de agua destilada. 5 g de NaCl 1 g de K2HPO4 1 g de (NH4)H2PO4 1 g de (NH2)2SO4 0.2 g de MgSO4 3 g de KNO3 El pH se ajusta a 7,0 con una solucin de NaOH HCl 10%, y se esteriliza en autoclave a 121 C durante 15 min. III.A.3 Reactivos Fenantreno (Carlo Erba, Francia), cido 1-hidroxi-2-naftoico (Sigma- Aldrich, USA). III.B METODOLOGA III.B.1 Caracterizacin metablica de la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA:

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com III.B.1.i Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando fenantreno como nica fuente de carbono y energa. Los cultivos se realizaron en Medio Mineral Lquido (MML) suplementado con 0,05 g/L de extracto de levadura y 0,84g/L de fenantreno. Los cultivos se incubaron a 28C en agitacin constante (250rpm). La cintica de crecimiento se realiz determinando el nmero de UFC en R2-agar a distintos tiempos.

III.B.1.ii Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando glucosa como nica fuente de carbono y energa. Los cultivos se realizaron en MML suplementado con 0,05 g/L de extracto de levadura y 2 g/L de glucosa. Los cultivos se incubaron a 28C en agitacin constante (250 rpm). La cintica de crecimiento se realiz determinando el nmero de UFC en R2-agar a distintos tiempos.

III.B.1.iii Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando cido naftoico como nica fuente de carbono y energa. Para estudiar la capacidad de la cepa S. paucimobilis 20006FA de crecer en Ac. Naftoico se utilizaron tres concentraciones diferentes del mismo 0.05 g/L, 0.14 g/L y 0.3 g/L. Para ello, se incubaron, por triplicado, erlenmeyers de 250 ml de capacidad conteniendo 100 ml de MML y cido naftoico en las concentraciones deseadas suplementado con 0.05 g/L de extracto de levadura. Los cultivos se incubaron en agitacin a 250rpm, a 30C durante 96 horas. La cintica de crecimiento se realiz determinando el nmero de UFC en R2-agar a distintos tiempos. III.B.2 Estudio de la cintica de degradacin de fenantreno en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA:

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com III.B.2.i Preparacin del inculo. En todos los ensayos se inocul el medio con S. paucimobilis 20006FA. Para esto se deja crecer la misma over night en R3A a 28C. A continuacin, se realizan tres lavados con solucin fisiolgica. Sabiendo que 2.23 unidades de DO580 equivalen a 1x1010 UFC/ml, se mide la densidad ptica y se calcula el volumen necesario para obtener la concentracin inicial deseada en cada frasco. III.B.2.ii Ensayo. Se adicionan frascos de 55 ml de capacidad con 500 ul de una solucin de fenantreno estril en acetato de etilo (16,8 g/L), de modo de lograr una concentracin final de fenantreno en cada frasco de 0.84g/L, se deja evaporar el solvente.. A continuacin, se agregan 10 ml de MML suplementado con 0.05g/L de extracto de levadura a cada frasco. Seguidamente se inocula cada frasco con 1x10 8 UFC/ml de la cepa. Se utilizaron controles abiticos sin inculo. Los cultivos se incubaron en agitacin constante a 200 rpm y a 28C. Se realizaron determinaciones despus de 72 h y despus de 161h de realizada la inoculacin. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. III.B.2.iii Determinacin de la concentracin de fenantreno y cido naftoico en MML. Con el objetivo de determinar y cuantificar el fenantreno degradado y el cido naftoico producido. Se realizaron extracciones exhaustivas, para ello se agregaron 5 ml de acetato de etilo a cada frasco y se los dej agitando durante 15 minutos. Posteriormente, se trasvas todo el contenido del frasco en un tubo, una vez visualizadas las dos fases (orgnica y acuosa), se extrajo la fase orgnica utilizando micropipeta. La misma fue guardada en frascos color caramelo a -20C. Este procedimiento de extraccin fue repetido tres veces. La determinacin de las concentraciones de los qumicos en los extractos de acetato de etilo fue analizada por Cromatografa lquida de alta presin (HPLC) en fase reversa, utilizando un cromatgrafo Waters con una columna C18 Symetry Waters (15 cm x 4,6 mm de dimetro, tamao de grano de 5 m tamao de

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com los poros 100 ). Un gradiente lineal de 15 mM de cido fosfrico en una solucin de agua Nanopure y metanol (20:80 a 15:95, vol/vol) durante 15 min y se utiliz un caudal de 1 ml/min (Coppotelli y col., 2010). III.B.3 Estudio de la capacidad de degradacin de cido naftoico en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA: III.B.3.i Preparacin del inculo. Ver seccin III.B.2.i. III.B.3.ii Ensayo. Con la finalidad de estudiar la capacidad de degradacin de cido naftoico en dos concentraciones, se adicionan frascos de 55 ml de capacidad con una solucin 0,75 g/L de cido naftoico en acetato de etilo, de modo de lograr una concentracin final de cido naftoico en cada frasco de 0,05g/L y de 0,14 g/L, y se dej evaporar el solvente. A continuacin, se agregaron 10 ml de MML suplementado con 0.05g/L de extracto de levadura a cada frasco. Seguidamente se inocula cada frasco con 1x108 UFC/ml de la cepa. Se utilizaron controles abiticos sin inculo. Los cultivos se incubaron en agitacin constante a 200 rpm y a 28C, durante 24 horas. Este ensayo fue realizado por triplicado. III.B.3.iii Determinacin de la concentracin de cido naftoico. Ver seccin III.B.2.iii. III.B.4 Estudio del efecto de cido Naftoico en la cintica de degradacin de Fenantreno en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA III.B.4.i Preparacin del inculo. Ver seccin III.B.2.i. III.B4.ii Ensayo. Se prepararon dos frascos con diferentes concentraciones de cido naftoico, uno correspondiente a 0,05 g/L y otro con 0,14g/L, ambos suplementados con 0,84g/L de fenantreno. Para ello se adicionaron frascos de 55 ml de capacidad con una solucin en acetato de etilo 0,75 g/L de cido naftoico y con una solucin de acetato de etilo 20 g/l de Fenantreno, de modo de lograr una concentracin final de cido naftoico

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com en cada frasco de 0,05g/L y de 0,14 g/L respectivamente y de 0,84g/l de fenantreno. Seguidamente se inocul cada frasco con 1x108 UFC/ml. Se utilizaron controles abiticos sin inculo. Los cultivos se incubaron en agitacin constante a 200 rpm y a 28C, durante 24 horas. Este ensayo fue realizado por triplicado. III.B.4.iii Determinacin de la concentracin de Fenantreno y cido Naftoico. Ver seccin III.B.2.iii. Los valores promedio fueron comparados mediante el anlisis de varianza simple a un nivel de p= 0,05. Todos los anlisis estadsticos fueron realizados utilizando el software 5.0 Systat en sistema Windows. III.B.5 Estudio del proteoma de la cepa . III.B.5.1 Preparacin de cultivos en biorreactor: III.B.5.1.a Crecimiento en fenantreno 0.84g/l como nica fuente de carbono y energa III.B.5.a.i Preparacin del inculo. Ver seccin III.B.2.i III.B.5.a.ii Preparacin del biorreactor. Se utiliz un bioreactor L.H. (Incelltech 210) de 2 litros de capacidad con 1500 ml de MML suplementado con 0.05g/L de extracto de levadura, este se esteriliz a 121C durante 30 minutos. El fenantreno fue agregado al medio en forma de cristales de modo de alcanzar una concentracin de 0.84g/L. El fenantreno fue previamente esterilizado utilizando lmpara UV durante 30 minutos. Posteriormente, se realiz la inoculacin de modo tal de obtener una concentracin de 2x108 clulas/ml dentro del biorreactor. La agitacin del mismo se mantuvo constante durante todo el ensayo a 250 rpm, con aireacin 25 L/h y temperatura de incubacin constante 28C (2C). A diferentes tiempos se midi el pH del cultivo. Los cultivos se realizaron por duplicado.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com III.B.5.a.iii Cosecha del biorreactor. El cultivo fue cosechado en la fase estacionaria de crecimiento (96 h). y fue filtrado para eliminar los cristales de fenantreno remanentes. El filtrado se centrifug a 6000 rpm durante 10 minutos, y el pellet se lav tres veces con agua bidestilada estril. Las clulas resuspendidas en agua bidestilada, se concentraron hasta llegar a una DO580 mayor a 20 unidades, y se mantuvieron a -80C para la posterior determinacin de protenas presentes. III.B.5.a.iv Recuento de viables. Para seguir y monitorear el crecimiento celular en el biorreactor, se tomaron muestras a diferentes tiempos y se determin el nmero de UFC en placas de Petri con R2-agar. Estas se incubaron durante 7 das. III.B.5.1.b Crecimiento en Glucosa 2g/l como nica fuente de Carbono y Energa III.B.5.1.b.i Preparacin del inculo. Idem seccin III.B.2.i III.B.5.1.b.ii Preparacin del biorreactor. Se utiliz un bioreactor L.H. (Incelltech 210) de 2 litros de capacidad con 1500 ml de MML suplementado con 0.05g/L de extracto de levadura, este se esteriliz a 121C durante 30 minutos. La glucosa se esteriliz por separado en agua destilada y luego fue adicionada al biorreactor de modo tal que la concentracin final de glucosa en el biorreactor sea de 2g/l. Posteriormente, se realiz la inoculacin de manera que el biorreactor exhiba una concentracin de 2x10 8 clulas/ml. La agitacin del biorreactor se mantuvo constante durante todo el ensayo a 250 rpm, con aireacin 25L/h y temperatura de incubacin constante 28C (2C). A diferentes tiempos se midi el pH del cultivo. Los cultivos se realizaron por duplicado. III.B.5.1.b.iii Cosecha del biorreactor. El cultivo fue cosechado en la fase estacionaria de crecimiento (96 h). El cultivo se centrifug a 6000 rpm durante 10 minutos, y el pellet se lav tres veces con en agua bidestilada estril. Las clulas resuspendidas en

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com agua bidestilada, se concentraron hasta llegar a una DO 580 mayor a 20 unidades, y se mantuvieron a -80C para la posterior determinacin de protenas presentes. III.B.5.1.b.iv Recuento de viables. Idem seccin III.B.1.a. III.B.5.2 Lisado Celular Para la preparacin del lisado celular de la cepa S. paucimobilis 20006FA, a las clulas cosechadas a partir de los cultivos de en glucosa y fenantreno. se les agregaron 2,5 l de cctel de inhibidores de proteasas y 2,5 l de PMSF 100 mM. Los cultivos celulares se prepararon a partir de 25 ml de los cultivos cosechados y se rompieron utilizando un Homogeneizador de Alta presin y perlas. Luego de la ruptura los restos celulares se centrifugaron a 10.000 g durante 10 min, se lavaron dos veces con agua bidestilada, y se resuspendieron en agua bidestilada. Las protenas fueron solubilizadas durante 1 h en buffer de rehidratacin (urea 7M, tiourea 2 M, Tritn X-100 al 2% (p/v), DTT 65mM (Amersham Biosciences), PMSF 1mM, 4-(2-aminoetil)-Bencenosulfonilo fluoruro [AEBSF] 4mM y azul de bromofenol 0.002% (w/v)), luego se realiz una se centrifugacin a 8000g durante 10 minutos, reteniendo el sobrenadante. La concentracin de protenas se determin mediante el Ettan 2-D Kit de Quant (Amersham Biosciences) (Perez Vidakovics y col 2007). III.B.5.3 Electroforesis Bidimensional 2-D Para el isoelectroenfoque (IEF), se utilizaron tiras de IPG de 18 cm en el rango de pH 4-7 (Immobiline DryStrips, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Las muestras se mezclaron con el buffer de rehidratacin recin preparado, conteniendo una concentracin final de protenas de 300g en 350l. Las protenas solubilizadas fueron cargadas en la tira de gradiente de pH 4-7 como fue descrito en Sanchez, y colaboradores (1999). El IEF se realiz en una unidad Multiphor II de electroforesis

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com (Amersham Biosciences), utilizando el siguiente programa: 500 V de 0.01 h (1 Vh), 3500 V de 1,30 h (gradiente, 3000 Vh), 3500 V de 5,40 h (20 kVh), lo que resulta en una tensin total de 23 kVh. Las tiras focalizadas fueron almacenadas a -80 C hasta su posterior uso. Para su preparacin para la segunda dimensin, las tiras IPG fueron incubadas (15 min) en 10 ml de buffer de equilibrio (50 mM Tris-Cl, pH 8,8; 6M de urea, 30% (v / v) de glicerol, 2% (p / v) SDS, 20 mM DTT, y 0.002% (p / v) de azul de bromofenol) seguida de una incubacin (15 min) en la misma solucin, pero sustituyendo el DTT por 300 mM de acrilamida. Despus del paso de reduccin/alquilacin, las tiras IPG se colocaron en la parte superior de un gel al 10% SDS-PAGE y se sella con un solucin 0,5% de agarosa en buffer de electroforesis. La electroforesis se realiza a corriente constante (25 mAmp por gel) a 20C hasta que la migracin frontal en el gel llegara al final del mismo, utilizando una unidad de electroforesis PROTEAN II xi 2-D (Bio-Rad, Hercules, CA) conectado a un bao de refrigeracin II Multitemp (GE Healthcare). Las protenas se visualizaron por tincin con Coomasie blue G 250 (Kodak) (Gorg y col., 1988) III.B.5.4 Anlisis de las Imgenes de los Geles: Los geles 2-D teidos con Coomasie Blue

se documentaron utilizando un

escner ChemiDoc XRS (Bio rad, USA), y el anlisis de imgenes se realiz con el software Proteome Weaver (Definiens, Munich, Alemania). Cada condicin de crecimiento evaluada (glucosa o fenantreno) se realiz por al menos dos rplicas independientes de geles. III.B.5.5 Identificacin de Protenas: Los spots seleccionados para su anlisis mediante espectrometra de masas fueron recortados del gel con un tip de micropipeta y se colocaron en un eppendorf con 50 l de agua bidestilada para su envo a la Unidad de Protemica de la Universidad

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com Complutense de Madrid (Madrid, Espaa), donde fueron digeridos con tripsina, para su posterior anlisis mediante espectrometra de masas tipo MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight) y obtencin de la huella peptdica (PMF). La identificacin de los fragmentos proteicos se realiz utilizando el algoritmo MASCOT (Matrix Science, Boston, MA) y la base de datos NCBInr.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

IV.

RESULTADOS

IV.A Caracterizacin metablica de la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA:

Acorde con los resultados obtenidos por Coppotelli y colaboradores (2008), se observ que la cepa tiene la capacidad de utilizar glucosa (C 6H12O6) y fenantreno (C14H10) como nica fuente de carbono y energa. En primer lugar, se determin la concentracin de glucosa en la cual la cepa fue capaz de alcanzar valores de biomasa mayores a 1x1010 clulas/ml, para su posterior estudio del proteoma. Se analizaron diferentes concentraciones de glucosa (datos no mostrados), determinando que la menor concentracin de glucosa capaz de obtener esos valores de biomasa fue de 2 g/L. A partir de la concentracin de glucosa obtenida, se calcularon los carbonos equivalentes de fenantreno, obtenindose que la concentracin es de 0,84 g/L.

IV.A.1 Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando glucosa como nica fuente de carbono y energa.

Con el objetivo de determinar la capacidad de la cepa de crecer utilizando glucosa como nica fuente de carbono y energa, se realiz una cintica de crecimiento en biorreactor en MML suplementado con Glucosa 2 g/L. El crecimiento fue monitoreado por recuento de viables en R2A (figura 1). Como se puede observar el crecimiento alcanz valores de 1,58x1010 UFC/ml, despus de las 46 horas de incubacin.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

1,00E+11 1,00E+10
UFC/ml

1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 0 10 20 30 40 50

Tiempo de incubacin (horas)

Figura 1. Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 2 g/L de glucosa a 28C y 250 rpm. Se grafican los valores promedios y su respectiva desviacin estndar de un ensayo realizado por triplicado.

Durante el tiempo de incubacin se midi el pH del sobrenadante del cultivo, los resultados arrojados muestran una disminucin del mismo de dos unidades luego de 40 horas incubacin (figura 2).

7 6,5 6 5,5
pH

5 4,5 4 3,5 3 0 10 20 30 40 50

Tiempo (horas)

Figura 2. Valores de pH a travs del tiempo durante el crecimiento de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 2 g/L de glucosa a 28 C y 250 rpm.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com IV.A.2 Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando fenantreno como nica fuente de carbono y energa.

Se determin la cintica de crecimiento de la cepa S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,84 g/L de fenantreno. El crecimiento fue monitoreado por recuento de viables en R2A (figura 3). Durante el crecimiento de la cepa en fenantreno se observ la aparicin de productos coloreados amarillo/naranjas (foto 1). Luego de 66 horas de incubacin, el crecimiento alcanzado por la cepa fue de 2,35x10 08 UFC/ml, con una velocidad especfica de crecimiento () de de 0,1308 h -1, mostrando la capacidad de duplicarse al menos 3 veces en 17 horas en presencia de fenantreno.

Foto 1. Cultivos en biorreactor de la cepa S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,84 g/L de fenantreno. A) Cultivo luego de dos horas de incubacin. B) Cultivo luego de 96 horas de incubacin

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

1,00E+09

1,00E+08
UFC/ml

1,00E+07

1,00E+06 0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tiempo de Incubacin (horas)

Figura 3. Cintica de Crecimiento de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,84 g/L de fenantreno a 28 C y 250 rpm. Se grafican los valores promedio y su respectiva desviacin estndar de un ensayo realizado por triplicado.

Durante el tiempo de incubacin se midi el pH del sobrenadante del cultivo, los resultados arrojados muestran una disminucin del mismo de una unidad luego de 44 horas incubacin (figura 4).

7 6,5 6 5,5
pH

5 4,5 4 3,5 3 0 10 20 30 40 50

Tiempo (horas)

Figura 4. Valores de pH a travs del tiempo durante el crecimiento de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,84 g/L de fenantreno a 28 C y 250 rpm.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com IV.B Estudio de la cintica de degradacin de fenantreno en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA: Para determinar y cuantificar la degradacin de fenantreno y la generacin de cido naftoico, se prepararon cultivos de la cepa en MML con fenantreno como nica fuente de carbono y energa. A diferentes tiempos se realizaron extracciones del fenantreno residual presente en cada frasco y se determinaron las concentraciones del mismo y de cido naftoico por Cromatografa Lquida de Alta Presin (HPLC).

Tiempo (horas) 0 2 5 7 21 24 26 30 47 54 72 96 144 161

% de Degradacin de Fenantreno 8,63 7,23 11,68 20,05 12,18 15,36 36,90 27,00 34,92 36,55 38,83 44,80 46,57 49,11

Tabla 1. Degradacin de fenantreno durante el tiempo de incubacin.

La tabla 1 muestra los porcentajes de degradacin de fenantreno por la cepa S. paucimobilis 20006FA. La determinacin de fenantreno residual se muestra en la figura 5. La acumulacin de cido naftoico se muestra en la figura 6.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

0,900 0,800
Fenantreno (g/L)

Fenantreno (g/L) Control abitico

0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 50 100 150 200

Tiempo de incubacin (horas)

Figura 5. Concentracin de fenantreno a lo largo del tiempo de incubacin en los cultivos de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,84 g/L de fenantreno. Se grafica el valor promedio de tres rplicas con su respectiva desviacin estndar.

0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 0 50 100 150 200

cido naftoico (g/L)

Tiempo de incubacin (horas)

Figura 6. Concentracin de cido 1-hidroxi-2-naftoico a lo largo del tiempo de incubacin en los cultivos de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con con 0,84 g/L de fenantreno. Se grafica el valor promedio de tres rplicas con su respectiva desviacin estndar.

Como se puede observar, la degradacin de fenantreno llega hasta el 49,11% a las 161 horas de incubacin. Los niveles de cido naftoico se hacen detectables a partir de las 26 horas, alcanzando una concentracin mxima de 0.166 g/L a las 161 horas de incubacin.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com IV.C. Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando cido naftoico como nica fuente de carbono y energa: Se determin la capacidad de la cepa de crecer en MML suplementado con cido naftoico, empleando tres concentraciones diferentes 0,05 g/L; 0,14 g/L y 0,3 g/L. Las concentraciones elegidas rondaron los valores obtenidos durante la degradacin de fenantreno.

1,00E+09

1,00E+08
UFC/ml

1,00E+07

1,00E+06 0 10 20 30 40 50 60

Tiempo de Incubacin (horas)

Figura 7. Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,05 g/L de cido naftoico a 28 C y 250 rpm. Se grafican los valores promedios y su respectiva desviacin estndar de tres ensayos independientes, cada uno con tres rplicas.

En los cultivos de la cepa S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,05 g/L de cido naftoico, se pudo observar que la misma fue capaz de utilizar el cido naftoico como nica fuente de carbono y energa (figura 7). Se observ un lento crecimiento con una fase de latencia de aproximadamente 6 horas y una fase

exponencial que dur 10 horas. Se ha podido observar que durante el crecimiento de la cepa se produce la aparicin de productos de degradacin amarillos.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07
UFC/ml

1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 0 20 40 60 80 100 120

Tiempo de Incubacin (horas)

Figura 8. Cintica de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,14 g/L de cido naftoico a 28 C y 250 rpm. Se grafican los valores promedios y su respectiva desviacin estndar de tres ensayos independientes, cada uno con tres rplicas.

Cuando S. paucimobilis 20006FA fue crecida en MML suplementado con 0,14 g/L de cido naftoico (figura 8), se pudo observar que la fase de latencia se increment considerablemente hasta las 30 horas aproximadamente. Durante esta fase de latencia se pudo divisar una disminucin del recuento celular en dos rdenes de magnitud, seguida por una fase exponencial posterior a las 31 horas de incubacin. Cabe destacar que el tiempo de incubacin en este caso fue de 110 horas, casi el doble del tiempo de incubacin para la concentracin de 0,05 g/L de cido naftoico. La cosecha mxima alcanzada por la cepa en ambas concentraciones de cido naftoico no presenta diferencias significativas (p 0,05) con respecto la cosecha mxima alcanzada durante el crecimiento de la misma en presencia de fenantreno como nica fuente de carbono y energa. A partir de los datos obtenidos de las cinticas de crecimiento en cido naftoico, se determinaron las velocidades especfica de crecimiento () de la cepa en ambas concentraciones, los resultados obtenidos muestran que la cepa creciendo en 0,05 g/L de

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com cido naftoico posee una =0,148 h-1 y creciendo en 0,14 g/L de cido naftoico una =0,115 h-1. Cuando S. paucimobilis 20006FA fue inoculada en MML suplementado con 0,3 g/L de cido naftoico, la cepa fue incapaz de crecer y de aumentar su densidad celular, lo que indicara que el cido naftoico en concentraciones altas es txico para las clulas.

IV.C.1 Estudio de la capacidad de degradacin de cido naftoico en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA

Luego de determinar que la cepa posee la habilidad de crecer y utilizar cido naftoico como nica fuente de carbono y energa, en concentraciones de 0,05 g/L y 0,14 g/L, se evalu el porcentaje de cido naftoico degradado por S. paucimobilis 20006FA durante 24 horas de incubacin. En resultados arrojados por las determinaciones por HPLC, se pudo observar que el mayor porcentaje de degradacin correspondi al cultivo de la cepa en MML suplementado en 0,05 g/L de cido naftoico (tabla 2), mientras que la degradacin ocurri en menor medida cuando la cepa fue crecida en MML suplementado con 0,14 g/L de cido naftoico. Este resultado guarda estrecha relacin, con el hecho de que la cepa tiene mayor facilidad de crecimiento en bajas concentraciones de cido naftoico.
Concentracin Porcentaje de cido Naftoico Degradacin de (g/l) Naftoico (%) 0,05 0,14 94,40 10,45 44,94 8,12

Tabla 2. Degradacin (%) de cido naftoico por la cepa S. paucimobilis 20006FA, luego de 24 horas de incubacin.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com IV.C.2 Estudio del efecto de cido naftoico en la cintica de degradacin de Fenantreno en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA: Con el objetivo de comprobar si el retardo en la degradacin de fenantreno se debe a una acumulacin de cido naftoico que inhibe el crecimiento de la cepa, como han hipotetizado anteriormente Coppotelli y colaboradores (2008), se hizo crecer a la cepa en MML suplementado con cido naftoico en las concentraciones 0,05 g/L y 0,14 g/L, adicionados con 0,84 g/L de fenantreno. Se determinaron las concentraciones remanentes de fenantreno y cido naftoico luego de 24 y 96 horas de incubacin, por HPLC. La degradacin se compar con un control abitico (sin inculo). En las figuras 9 y 10, se muestra la degradacin de fenantreno en presencia de cido naftoico. Durante la degradacin, los cultivos se tornaron color amarillo/naranja (foto 2).

Foto 2. 3: Cultivo de la cepa S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,05 g/L de cido naftoico y 0,84 g/L de fenantreno. C: Control abitico

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 Control Abitico A 24hs A 96hs

Figura 9. Concentracin de fenantreno en los cultivos de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementados con cido naftoico (0,05g/L) y fenantreno (0,84 g/L). Se grafica el valor promedio y la desviacin estndar de tres rplicas por cultivo.

0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 Control Abitico B 24hs B 96hs

Figura 10. Concentracin de fenantreno en los cultivos de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementados con cido naftoico (0,14 g/L) y fenantreno (0,84 g/L). Se grafica el valor promedio y la desviacin estndar de tres rplicas por cultivo.

Como se puede observar, la degradacin de fenantreno se pudo llevar a cabo en presencia de cido naftoico en las dos concentraciones estudiadas. En ambos cultivos la degradacin de fenantreno alcanzada fue de 12,81 %( 2,64%) a las 24 horas y de 47,87 % ( 1,20%) a las 96 horas de incubacin. Al comparar estos resultados con los obtenidos en ausencia de cido naftoico, se puede ver que la degradacin de fenantreno no se vio afectada significativamente (figura 11).

Fenantreno (g/L)

Fenantreno (g/L)

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

% de Degradacin de Fenantreno

60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 Fenantreno (0,84 g/L) y cido naftoico (0,14 g/L) Fenantreno (0,84 g/L) y cido naftoico (0,05 g/L) Fenantreno (0,84 g/L)

24 horas

96 horas

Tiempo de Incubacin (horas)

Figura 11. Comparacin de la degradacin de fenantreno (%) en presencia y ausencia de cido naftoico por la cepa S. paucimobilis 20006FA.

Durante la incubacin de estos cultivos, mientras ocurra la degradacin de fenantreno, el cido naftoico se acumul hasta una concentracin aproximada de 0,152 g/L ( 0.040) luego de 96 horas de incubacin (figuras 12 y 13).
0,250

0,200
Naftoico (g/L)

0,150

Control Abitico A 24hs A 96hs

0,100

0,050

0,000

Figura 12. Concentracin de cido naftoico durante la degradacin de fenantreno por la cepa S. paucimobilis 20006FA. Determinacin luego de 24 y 96 horas de incubacin en MML suplementado con cido naftoico (0,05g/L) y fenantreno (0,84 g/L). Se grafica el valor promedio y la desviacin estndar de tres rplicas por cultivo.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

0,250

0,200
Naftoico g/L

0,150

Control Abitico B 24hs B 96hs

0,100

0,050

0,000

Figura 13. Concentracin de cido naftoico durante la degradacin de fenantreno por la cepa S. paucimobilis 20006FA. Determinacin luego de 24 y 96 horas de incubacin en MML suplementado con cido naftoico (0,14 g/L) y fenantreno (0,84 g/L). Se grafica el valor promedio y la desviacin estndar de tres rplicas por cultivo.

IV.D Estudio del proteoma de la cepa S. paucimobilis 20006FA:

Para dilucidar los mecanismos de biodegradacin de S. paucimobilis 20006FA, se estudi la induccin de protenas especficas en respuesta al crecimiento en fenantreno como nica fuente de carbono y energa. El anlisis comparativo del proteoma se realiz a travs de geles SDS-PAGE y 2-DE creciendo la cepa en fenantreno y glucosa (control). Las fracciones solubles de protenas de S. paucimobilis 20006FA analizadas en una dimensin mediante SDS-PAGE se muestran en la figura 14. A travs de anlisis de estos geles, se pudo observar una diferencia significativa en la expresin de protenas cuando la cepa fue crecida en fenantreno. Las protenas contenidas en las bandas A, B, E y G, fueron identificadas por medio de la huella peptdica o Peptide Mass Fingerprinting (PMF), utilizando un espectrmetro de masas tipo MALDI-TOF/TOF, los resultados de la identificacin se muestran en la tabla 3.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

PM (kDa)

1 2

66 kDa

45 kDa

A
30kDa

20.1 kDa

Figura 14. Electroforesis en gel de poliacrilamida (10% SDS-PAGE) de las fracciones solubles de protenas de S. paucimobilis 20006FA. Calle PM: marcador de peso molecular; calle 1: fraccin soluble de protenas durante el crecimiento en glucosa; calle2: fraccin soluble de protenas durante el crecimiento en fenantreno. Las protenas A, B, E y G fueron identificadas por medio de la huella peptdica.

Protei n PE PG PA PC

Protein description glutathione S-transferase ring hydroxilating dioxigenase/ extradiol dioxygenase

Species Sphingomonas chungbukensis Sphingomonas sp. LH128 Sphingomonas sp. CHY-1

Accession No. 2316034 158346882 4007416 52207942

Theroretical migration Mr (Da) 21518 18996 37010 33416 pI 5.52 4.97 5.10 5.40

4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase Sphingomonas chungbukensis

Tabla 3. Protenas identificadas en cultivos de S. paucimobilis 20006FA cultivada en presencia de fenantreno, correspondientes al gel en una dimensin.

Todas las protenas presentaron alta homologa con protenas pertenecientes a otras especies de Sphingomonas. Posteriormente, las fracciones solubles de protenas de S. paucimobilis 20006FA fueron analizadas en geles bidimensionales (2-DE) en el rango de pH 4-7 y en el rango de peso molecular de 6.5 a 200 kDa (figura 15). Aproximadamente 140 spots de protenas se detectaron en los geles 2-DE.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

PM (kDa)

PW (kDa)

Figura 15. Geles 2-DE de las fracciones solubles de protenas de S. paucimobilis 20006FA. (1) Crecimiento en glucosa y (2) Crecimiento en fenantreno. Primera dimensin: isoelectroenfoque, rango de pH 4-7. Segunda dimensin: SDS-PAGE 12%. Las protenas numeradas fueron identificadas por medio de la huella peptdica.

La expresin diferencial de protenas se pudo observar claramente, obtenindose los spots de inters, denominados: P6, P7, P8, P10, P11, P12, P14 y P17; los cuales se cortaron y se identificaron por medio de PMF, utilizando un espectrmetro de masas tipo MALDI-TOF/TOF. Los resultados de la identificacin se muestras en la tabla 4.
Theoretical migration MW (Da) 4007416 28971850 151128 2316027 4091975 110162116 52207942 158346887 37010 35759 34543 28142 27280 27695 33416 30953 pI 5.10 5.12 5.11 5.09 5.02 5.28 5.40 5.50

Spot N P6 P7 P8 P10 P11 P12 P14 P17

Protein description

Species

Sequence NCBI coverage Accession no. (%)

4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase putative 2-hydroxy-benzylpyruvate aldolase catechol 2,3-dioxygenase 2-hydroxypent-2,4-dienoate hydratase 4-oxalocrotonate decarboxylase dihydrodiol dehydrogenase extradiol dioxygenase 2 hydroxymuconic semialdehyde hidrolase

Sphingomonas chungbukensis Sphingomonas sp. P2 Sphingomonas agrestis Sphingomonas chungbukensis Sphingomonas chungbukensis Sphingomonas sp. CHY-1 Sphingomonas sp. CHY-1 Sphingomonas sp. LH128

42 15 82 32 57 25 56 26

Tabla 4. Protenas identificadas en cultivos de S. paucimobilis 20006FA cultivada en presencia de fenantreno.

kk

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

V.

DISCUSIN
En este trabajo se intenta elucidar la ruta de degradacin de fenantreno por la

cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA, a travs de la incursin en estrategias metabolmicas y protemicas. Para esto se prepararon cultivos de la cepa en MML suplementado con fenantreno y cido 1-hidroxi-2-naftoico como nica fuente de carbono y energa, y sobre ellos se estudi el crecimiento microbiano, la variacin en la concentracin de los metabolitos iniciales e intermediarios y la expresin diferencial de protenas con respecto a un cultivo suplementado con glucosa como nica fuente de carbono y energa. La informacin obtenida sobre las enzimas inducidas en presencia de fenantreno sumada a la evidencia de la acumulacin de cido 1-hidroxi-2-naftoico han sido utilizadas para proponer una ruta de degradacin de fenantreno en S. paucimobilis 20006FA (figura 16) El primer paso de la ruta propuesta comienza con dioxigenacin de la molcula de fenantreno llevada a cabo en los carbonos 3 y 4 por la extradiol dioxigenasa (P14). El dihidrodiol resultante se convertir por la accin de la dihidrodiol deshidrogenasa (P12) en 3,4-dihidroxifenantreno, el cual ser objeto de meta-clivaje, y en los pasos posteriores se convierte en cido 1-hidroxi-2-naftoico. El cido 1-hidroxi-2-naftoico se acumula durante la degradacin bacteriana de fenantreno llevada a cabo por S. paucimobilis 20006FA. Posteriormente, el cido 1-hidroxi-2-naftoico es degradado por la descarboxilacin oxidativa para formar 1,2-dihidroxinaftaleno, que posteriormente es metabolizado por la ruta de degradacin de naftaleno va salicilato y catecol, por accin de la 2-hidroxi-bencilpiruvato aldolasa (P7), luego del cual se clivar la molcula para formar muconato 2-hidroxi-cis,cis-semialdehdo por accin de la catecol 2,3dioxigenasa (P8).

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com

P14
Fenantreno cis-3,4-Dihidroxi-3,4-dihidrofenantreno

P12 P14
2-Hidroxi-2H-benzo[h]cromeno-2-carboxilato 3,4-Dihidroxifenantreno

1-Hidroxi-2-naftaldehdo trans-4-(1'-Hidroxynaf-2'-il)-2-oxobut-3-enoato

1,2-Dihidroxinaftaleno

1-Hidroxi-2-naftoato

P14 P7
Salicilaldehdo trans-o-Hidroxibenzildenepiruvato Salicilato

P8

2-Hidroxi-cis,cis-muconato semialdehdo

Catecol

P17
cis-2-Hidroxipenta-2,4-dienoato

P10
4-Hidroxi-2-oxovalerato

P6
Piruvato + Acetaldehdo

Figura 16. Ruta de degradacin de fenantreno propuesta para la cepa S. paucimobilis 20006FA

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com Posteriormente, el accionar de la 2-hidroximuconico semialdehdo hidrolasa, 2-hidroxipent-2,4-dienoato hidratasa y 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa (P17, P10 y P6) darn lugar a la produccin de cido pirvico y acetaldehdo, que ingresarn al ciclo de los cidos tricarboxlicos. Estudios anteriores demostraron que S. paucimobilis 20006FA tiene una alta eficiencia en la degradacin de fenantreno (52.9%) cuando es crecida en Medio Mineral Lquido (MML) suplementado con fenantreno como nica fuente de carbono y energa. Sin embargo, luego de 20 das de tratamiento, slo ha podido mineralizar el 10% del fenantreno inicial (Coppotelli y col., 2010). La cepa produce dos intermediarios mayoritarios cido 1-hidroxi-2-naftoico y cido saliclico, demostrando que el fenantreno es degradado por la cepa utilizando la ruta de degradacin de fenantreno por va salicilato, como se ha descrito anteriormente para otras cepas del gnero Sphingomonas (Tao y col., 2007; Willumsen y Karlson, 1996). Se ha demostrado tambin que S. paucimobilis 20006FA posee la capacidad de crecer en presencia de salicilato de sodio como nica fuente de carbono y energa, indicando que la misma posee la ruta de degradacin completa de fenantreno (Coppotelli y col., 2010). En los cultivos de la cepa en fenantreno (0.84 g/L) se observ una degradacin del 49,11% ( 8,50%), a las 161 horas de incubacin (tabla 1), con la concomitante acumulacin de cido 1-hidroxi-2-naftoico que alcanz los niveles de 0.166 g/L luego del mismo tiempo de incubacin (figura 6), esta acumulacin provoc la aparicin de color amarillo/naranja en los cultivos. La aparicin de color en el medio de cultivo donde se acumula cido naftoico tambin fue observada por Tao y col. (2007). Este intermediario es usualmente acumulado en el metabolismo de la mayora de las bacterias Gram negativas durante la degradacin de PAH (Habe y Omori, 2003). Estudios en Sphingomonas sp. VKM B-2434 creciendo en fenantreno como nica

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com fuente de carbono y energa, tambin han demostrado que el cido naftoico es el principal metabolito de acumulacin durante la degradacin de fenantreno (Baboshin y col., 2007). Coppotelli y colaboradores (2008), sugirieron que la cepa podra producir un retardo en la degradacin de fenantreno en suelo debido a una acumulacin de intermediarios metablicos. Frente al hallazgo de que el metabolito que se acumula es el cido 1-hidroxi-2-naftoico, se estudi la capacidad de la cepa de crecer con ese compuesto como nica fuente de carbono y energa, en tres concentraciones que rondaron la concentracin alcanzada durante los cultivos en fenantreno, encontrndose que cuando la cepa es cultivada en bajas concentraciones de cido naftoico (0,05g/L), la misma es capaz de crecer mostrando una corta fase de latencia (6 horas) y una velocidad especfica de crecimiento de de =0,1487 h-1 (figura 7). En cambio, cuando la cepa es crecida en cido naftoico (0.14 g/L), se observa un incremento de la fase de latencia (30 horas) con una disminucin del recuento de clulas durante 20 horas (figura 8), lo que podra indicar que la concentracin de cido naftoico es txica para la cepa y sta necesita cierto tiempo para adaptarse y poder sobrevivir en esas condiciones. Cuando la cepa es crecida en MML suplementado con altas concentraciones de cido naftoico (0,3 g/L), no se detect crecimiento, lo que sugiere que el cido 1-hidroxi-2-naftoico en concentraciones altas es txico para la cepa. Efectos txicos sobre Pseudomonas putida PpG7 fueron observados previamente a altos niveles de salicilato (1000 mg/L), los cuales resultaron en un aumento de la fase de latencia y una disminucin de la induccin del transcripto para la primer enzima de la va de degradacin del fenantreno (Marlowe y col., 1999). Se sabe que varios metabolitos son txicos para los microorganismos a travs del agotamiento de los equivalentes de reduccin o cofactores (Chang y Zylstra, 1999; Kim y col., 2004). La citotoxicidad es la mayor responsable en

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com la inhibicin de la degradacin de PAH (Kazunga y col., 2001). La inhibicin durante la biodegradacin sobre diferentes PAH puede ocurrir probablemente, debido a la competencia de las enzimas involucradas en la oxidacin, el transporte, la acumulacin subproductos citotxicos resultantes de biodegradacin, y el bloqueo de la induccin enzimtica (Bouchez y col., 1995; Juhasz y col., 2002; Van Hamme y col., 2003). Cuando se estudi la capacidad de degradacin del cido naftoico (tabla 2) por la cepa se pudo ver un mayor porcentaje de degradacin (94,40 % 10,45 %), cuando la cepa fue crecida en 0,05 g/L de cido naftoico, esto podra deberse a que el estado fisiolgico y bioqumico de la misma se encuentra en su mxima capacidad, ya que a las 24 horas de incubacin, la cepa se encuentra en su fase exponencial de crecimiento. En cambio, cuando es cultivada en 0,14 g/L de cido naftoico la cepa se encuentra en una fase de latencia con disminucin del nmero de clulas, y se observa que slo pudo degradar el 44,94% ( 8,12 %) de cido naftoico. Si bien durante la degradacin de fenantreno se produce una disminucin del pH por la produccin de metabolitos cidos, al igual que en los cultivos en glucosa (figuras 2 y 4), se ha descartado este descenso de pH como causa de la inhibicin de la degradacin de fenantreno, ya que en otros trabajos se observ que la permeabilidad de la membrana contra molculas hidrofbicas puede ser aumentada en condiciones cidas, aumentando la concentracin de sustrato en el citosol y por lo tanto la velocidad de degradacin, sobre todo en los casos en que la degradacin esta limitada por una baja concentracin de sustratos (Kim y col., 2004). En nuestro caso, luego del descenso del pH producido durante las primeras 10 horas de incubacin, se pudo observar un incremento de la velocidad de degradacin de fenantreno a partir de las 20 horas de incubacin. Adems Xia y colaboradores (2005) observaron que Sphingomonas sp. ZX4 es efectiva en degradar fenantreno en un amplio rango de pH.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com Para estudiar la hiptesis de la inhibicin de la degradacin de fenantreno y la posible toxicidad celular producida por el cido naftoico se prepararon cultivos en MML suplementado con cido naftoico en las concentraciones 0,05 g/L y 0,14 g/L, adicionados con fenantreno 0,84 g/L, observndose que la degradacin de fenantreno, en las condiciones estudiadas, no se vio afectada por la presencia de cido naftoico, ya que no hay diferencias significativas en la degradacin de fenantreno en presencia y ausencia de este compuesto. Un hallazgo interesante fue que la concentracin de cido naftoico acumulada fue similar en ambos cultivos (0,152 g/L) (figuras 12 y 13), y estos valores no presentan diferencias significativas (p 0,05) a los alcanzados en los cultivos conteniendo fenantreno como nica fuente de carbono y energa. Marlowe y col. (2002) sostienen que las enzimas que participan en la degradacin de fenantreno pueden no participar en la degradacin de los intermediarios. Si no participan, una vez que el intermediario cido 1-hidroxi-2-naftoico se form, puede cesar la induccin de la va superior de degradacin de modo de inducir la va requerida para el metabolismo del intermediario. Este movimiento metablico requerira un perodo de aclimatacin que permita la sntesis de las enzimas necesarias para el metabolismo del intermediario. Una vez que el metabolismo del cido 1-hidroxi-2naftoico se inici, tiene que ocurrir la induccin de la parte superior de la va para mantener niveles suficientes de intermediario y permitir una ptima degradacin. En el caso de la produccin de cido 1-hidroxi-2-naftoico por la cepa S. paucimobilis 20006FA parece existir una delicada regulacin, estos mecanismos de induccin y represin de las vas catablicas superior e inferior para el fenantreno que logran mantener la concentracin del intermediario en niveles que no lleguen a resultar txicos para las clulas.

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com Otra posibilidad para explicar la constancia en la concentracin del intermediario hallada es que hay un incremento de intermediarios txicos que siguen a la inicial ruptura del anillo de fenantreno, resultando en una disminucin de la actividad celular. Pasado un tiempo, las clulas se adaptan a la toxicidad o metabolizan lentamente los intermediarios txicos de modo que la concentracin de estos decrece (Sikkema y col., 1995). Despus de recuperarse de la toxicidad, el metabolismo celular podra de nuevo aumentar. De modo que parece que la influencia de los intermediarios txicos podra influenciar la expresin gentica hasta que las clulas se recuperen o se adapten (Marlowe y col., 2002).

Lic. en Biotecnologa martinezmauro@hotmail.com VI. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS En est trabajo se logr elucidar al menos una de las rutas de degradacin de fenantreno en la cepa S. paucimobilis 20006FA y se ha incursionado en el estudio del cido 1-hidroxi-2-naftoico como posible metabolito regulador de esa ruta. En estudios futuros, con el objetivo de conocer los mecanismos por los que ocurre esa posible regulacin se realizar el anlisis del proteoma de la cepa a distintos tiempos durante la degradacin de fenantreno.