VALIDACION DEL METODO BUTIROMETRICO DE GERBER POR COMPARACION CON EL METODO DE REFERENCIA DE RSE GOTTLIEB PARA LA DETERMINACION DE MATERIA

GRASA EN LECHE.
Manuel Pinto C., Erwin Carrasco R., Bernardo Fraser L., Carolina Barriga I. Instituto de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile. Casilla 567. Valdivia. Chile. mpinto@uach.cl

Recepcion originales 12 de Enero del 2000

ABSTRACT
Validity of Gerber butyrometric method compared with Rse Gottlieb method for milk fat determination. Key words: Validity Gerber, Rse Gottlieb, milk fat. A validity methodology of the Gerber method through a comparison study to the Rose Gottlieb reference method is presented. The analysis of Gerber (G) and Rse Gottlieb (RG), in a total of 100 raw milk samples, with a range of 1.80 and 5.50% (m/m) of fat, were carried out according to oificial FILIDF 152 A: 1997 and FIL-IDF ID: 1996 rules respectively. The regression equation found (RG = 0.9998 G + 0.0278) presented a gradient not significantly different to 1.000 (0.9846 < b < 1.0149) and an intercept not significantly differing from 0 (-0.0274 < a < 0.0830). The residual standard deviation was Sy,x = 0.0853 and the accuracy of the method was therefore + 0.17g/100 g (+ 1.987 Sy,x) at present conditions. Gerber method exactuess, expressed as repeatability, presented a repeatability standard deviation of Sr= 0.0308 and a repeatability of r = 0.087 g/100 g, according to FIL-IDF 128: 1985; thus allowing to estimate both the method reproducibility (R = 2 r) and confdence nterval, including the mean precisin and accuracy (random error and systematic error). On the other hand, the analysis of media values indicated the acceptance of the nule hypotesis, t 0.05 = -0.1645 (P = 0.86) and a correlation coefficient of r = 0.9972. It is concluded that Gerber Method for milk, carried out according to FIL-IDF 152A: 1997 rule, with a milk volume of 10.77 ml presented acceptable validity parameters, in lineal, precision and accuracy terms.

RESUMEN
Palabras Claves: Validacin Gerber, Rse Gottlieb, grasa lctea.

Se presenta una metodologa de validacin del mtodo de Gerber mediante un estudio comparativo frente al mtodo de referencia de Rse-Gottlieb. Los anlisis de Gerber (G) y Rse-Gottlieb (RG) en un total de 100 muestras de leche cruda, con un rango entre 1,80 y 5,50%(m/m) de materia grasa, se realizaron segn las normas oficiales FIL-IDF 152A: 1997 y FIL-IDF ID: 1996, respectivamente la ecuacin de regresin obtenida (RG= 0,9998G + 0,0278), present una pendiente que no difiere significativamente de 1,000 (0,9846 < b < 1,0149) y un intercepto que no difiere significativamente de 0 (-0,0274 < a < 0,0830). La desviacin estndar residual fue S =0,0853 y la exactitud del mtodo fue, por lo tanto, de0, 17g/100g. (1,987 S y,x) en las presentes condiciones. La precisin del mtodo de Gerber, expresada como repetibilidad, present una desviacin estndar de repetibilidad Sr=0,0308 y una repetibilidad de r=0,087g/ l00g, segn FIL-IDF 128:1985. Esto nos permite estimar la reproducibilidad del mtodo (R=2r) y el intervalo de confianza, que incluye el error de precisin y el error de exactitud de la media (error de azar y error sistemtico). Por otra parte, el anlisis de los valores medios indic la aceptacin de la hiptesis nula, t 0.05= -0,1645 (P=0,86) y un coeficiente de correlacin r =0,9972. Se concluye que el mtodo de Gerber, aplicado a leche, realizado en conformidad con la norma FIL-IDF 152 A: 1997, con un volumen de leche de 10,77ml, present parmetros de validacin aceptables, en trminos de linealidad, precisin y exactitud.

INTRODUCCION
El mtodo butiromtrico de Gerber, que fuera propuesto por el Dr. Nicolais Gerber en 1895, es un mtodo emprico que permite la determinacin del contenido de materia grasa en leche, en gramos de grasa por 100 gramos de leche o 100 ml de leche dependiendo de la capacidad de la pipeta usada, y tiene como referencia el mtodo gravimetrico de Rse Gottlieb (Fleischmann, 1945). La Organizacin Internacional de Estandarizacin, en su norma ISO N2446: 1976, sobre la determinacin de materia grasa en leche por el mtodo de Gerber (mtodo de rutina), recomienda realizar comparaciones peridicas de ste mtodo con el mtodo gravimtrico de referencia de Rse Gottlieb, para asegurar su validacin. Lo anterior adquiere relevancia especial en aquellos casos en que el mtodo de Gerber se utiliza para calibrar equipos instrumentales para la determinacin de materia grasa en leche, tales como MilkoTester MKIII (Buxade y Bergmann, 1972) o Milko-Scan (Kernof et al., 1982, ABD et al., 1986). Estudios comparativos tendientes a la validacin del mtodo de Gerber, con respecto al mtodo de referencia de Rse Gottlieb, se presentan en Holanda (Radema y Mulder, 1951), Alemania (Schwarz, 1954), Inglaterra (Crocker et al., 1955), Africa del Sur (Laboschagne y Vogt, 1960), y Yugoslavia (Slanovec et al., 1971), entre otros. Se proponen mecanismos de ajustes para deducir el volumen ptimo de leche a utilizar en la determinacin de materia grasa por el mtodo de Gerber (Brouwer, 1965). En un trabajo anterior de Pinto et al., en 1973, qued demostrado que los valores de materia grasa expresados en % (m/m), encontrados por el mtodo de Gerber utilizando un

volumen de leche de 11,00 ml, da valores superiores con respecto al mtodo de referencia de Rse Gottlieb, encontrndose diferencias significativas, para valores de materia grasa promedio en el pas. Fue necesario realizar un proceso de validacin del mtodo y se encontr que el volumen ptimo de leche a utilizar en el mtodo de Gerber es de 10,77 ml ( volumen vertido en agua destilada a 20C), con el cual se logra una perfecta concordancia con los valores obtenidos por el mtodo de referencia ( Pinto et al., 1976). El estudio mencionado contribuy en la elaboracin de la Norma Chilena Oficial NCh N1016/Of.79. Determinacin del contenido de materia grasa : Mtodo de Gerber (Instituto Nacional de Normalizacin, 1979). Dada la recomendacin de la norma ISO N2446 mencionada anteriormente y considerando que el mtodo de referencia FIL-IDF 1 A: 1969 ha incorporado cambios importantes, en el tiempo transcurrido hasta su versin actual, FIL-DF ID: 1996, es altamente recomendable revisar el mtodo de Gerber. El presente trabajo tiene por objetivo realizar los estudios de validacin del mtodo de Gerber, en trminos de linealidad, precisin y exactitud con respecto al mtodo de referencia de Rse Gottlieb.

MATERIALES Y METODOS
Todos los reactivos utilizados son de grado analtico. Las metodologas de anlisis son las estipuladas en las normas estndares para Gerber y Rse Gottlieb, FIL-IDF 152A: 1997 y FIL- IDF ID: 1996 respectivamente. La pipeta para leche (10,77 0,02) y los butirmetros (O- 6%), fueron calibrados previamente, segn las normas internacionales correspondientes ISO N2446: 1976 y FILIDF 105: 1981. Se realiz previamente un estudio acerca de la robustez del mtodo de Gerber, centrando la atencin en el material volumtrico utilizado, especialmente pipetas para leche y butirmetros (Ros, 1999). Se prepararon 100 muestras de leche con un rango de concentracin en materia grasa de 1,80 a 5,50 % (m/m), a partir de adiciones de crema a leche descremada (ISO N2446: 1976), con incrementos de 0,5 %, rango de contenido graso en leche de productores de las regiones VIII, IX, y X (Pinto et al., 1998). Las muestras se preservaron con dicromato de potasio (1mg/ml de leche) y fueron mantenidas en refrigeracin hasta el inicio de los anlisis; luego fueron analizadas en triplicado por el mtodo de Gerber y en duplicado por el mtodo de Rse Gottlieb. El estudio de validacin del mtodo de Gerber, con respecto al mtodo de referencia de Rse Gottlieb, incluye los anlisis estadsticos relacionados con la precisin (repetibilidad - error de azar; reproducibilidad), exactitud de la media -error sistemtico; ecuacin de regresin lineal - pendiente, intercepto. La metodologa usada para estas determinaciones son las recomendadas por la Organizacin Internacional de Estandarizacin (International Standard ISO N5725:1986) y la Federacin Internacional de Lechera (FIL-IDF N128: 1985)

RESULTADOS Y DISCUSION
Los valores promedio y los parmetros estadsticos bsicos de comparacin entre los mtodos de Gerber y Rse Gottlieb se presentan en el Cuadro 1. Cabe destacar que a nivel de valores promedios para el total de muestras analizadas (n=100), no se encontr diferencia significativa (P<0,05), situacin esperable dado que dicho valor Gerber (3,5%m/m) est dentro del intervalo 3,26-4,25 %, que no presenta porcentaje de correccin con respecto al mtodo de referencia, segn lo establecido en la Norma Chilena Oficial NCh N 1016/1 (Instituto Nacional de Normalizacin, 1998). Otro valor que cabe destacar es el coeficiente de variacin o desviacin estndar relativa (DER), con los valores de 0,6 y 0,21 para Gerber y Rse Gottlieb, respectivamente. Al respecto, se debe sealar que el mtodo de referencia presenta un valor de repetibilidad del 0,02% en cambio en el mtodo de rutina se acepta un valor de 0,087%.

Cuadro 1: Parmetros estadsticos bsicos en la determinacin de materia grasa en leche de vaca por los mtodos de Gerber y Rse Gottlieb. Table 1: Basic statistical parameters in milk fat determination by Gerber and Rse Gottlieb mehtods. Anlisis estadstico Resultado segn mtodo de determinacin (%) Gerber n = 100 1) Promedio Error estndar 2) Rango 3) DE 4) Coeficiente variacin (DER) 5) Desviacin promedio
* Diferencia no significativa (P < 0,05)

Rse-Gottlieb n = 100 3,528 0,113* 4,01 1,132 0,21 0,96

3,501 0,112 4,00 1,129 0,60 0,95

La Federacin Internacional de Lechera (FIL-IDF 128: 1985) establece la precisin de un resultado en trminos de repetibilidad y reproducibilidad, los cuales define de la siguiente manera: Repetibilidad (r). Es el grado de acercamiento entre resultados de anlisis independientes, obtenidos por un mismo mtodo, sobre una misma muestra, en un mismo laboratorio y analista, usando el mismo equipo y dentro de un corto intervalo de tiempo. En terminos estadsticos se define como r = (2 2 )Sr = 2,8Sr. Reproducibilidad. Es el grado de acercamiento entre resultados de anlisis, obtenidos por un mismo mtodo, sobre la misma muestra en diferentes laboratorios y analistas, usando

diferentes equipos. En trminos estadsticos se define como R = 2,8S R = 2,8(2Sr). La precisin del mtodo de Gerber, expresada como repetibilidad, present una desviacin estndar Sr = 0,0308 y una repetibilidad r = 0,087 g/100 g de leche, lo cual permite estimar la reproducibilidad del mtodo (R = 2r), resultando igual a 0,174 g/ l00 g de leche. Luego un intervalo de confianza de 0,202, para la diferencia entre muestras individuales, indica que si la diferencia entre los duplicados de valores dados por el mtodo de Rse Gottlieb y el mtodo de Gerber estn dentro del intervalo mencionado se puede suponer, con un 95% de nivel de confianza, que el mtodo de Gerber se encuentra correctamente calibrado y que la composicin de las muestras son normales. En la determinacin del intervalo de confianza intervienen variables como la varianza de repetibilidad, varianza de reproducibilidad y desviacin estndar de los residuos, variables relacionadas estrechamente con la exactitud del mtodo.(PINTO et al., 1998; FIL-IDF 128:1985). La frecuencia de las diferencias existentes entre los valores promedios, segn el mtodo de Gerber, con respecto al mtodo de Rse Gottlieb se presenta en el Cuadro 2. Se puede observar que la mayor frecuencia se present en el intervalo -0,010 a 0,065 con un 40% de los valores dentro de dichos lmites. Por otro lado, es posible observar en la Figura 1, que la mxima diferencia entre ambos mtodos, para muestras individuales, es similar al intervalo de confianza calculado ( 0,202), con un 95% de confianza. Cuadro 2: Frecuencia de las diferencias entre los mtodos de Gerber y Rse Gottlieb. Table 2: Gerber and Rse Gottlieb frequency differences. Clase Lmite inferior -0,310 -0,235 -0,160 -0,085 0,010 0,065 0,140 0,215 0,290 Lmite superior -0,310 -0,235 -0,160 -0,085 -0,010 0,065 0,140 0,215 0,290 + Punto medio -0,2725 -0,1975 -0,1225 -0,0475 0,0275 0,1025 0,1775 0,2525 Frecuencia Frecuencia relativa 0 2 7 6 34 40 8 3 0 0 0,000 0,020 0,070 0,060 0,340 0,400 0,080 0,030 0,000 0,000 Frecuencia acumulada 0 2 9 15 49 89 97 100 100 100

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 1: Histograma de frecuencia de las diferencias entre los mtodos de Gerber y Rse Gottlieb en la determinacin de materia grasa en leche de vaca. Figure 1: Frequency chart of difference between Gerber and Rse Gottlieb methods in the determination of milk fat content.

Una alternativa confiable para estudiar el comportamiento entre los mtodos de Gerber y Rse Gottlieb es la regresin lineal como modelo matemtico. Alternativa utilizada por varios autores, entre los cuales cabe destacar a Radema y Mulder (1948), en Holanda (RG = 0,9615 G + 0,07), recomendando una pipeta de 10,77 ml para Gerber; Crocker et al., (1955) en Inglaterra (RG = 0,9652 G + 0,097 ), sugiriendo un volumen de pipeta de 10,94 ml en remplazo de la anterior de 11,04. En el presente trabajo se dedujo la siguiente ecuacin de regresin lineal RG = 0,9998 G + 0,0278, ulizando una pipeta para Gerber de 10,77 ml, en conformidad con la Norma Chilena Oficial NCh N1016/98 (Instituto Nacional de Normalizacin, 1998). Un estudio de las cualidades de la ecuacin de regresin lineal obtenida se presenta en el Cuadro 3. Cuando un mtodo de rutina (Gerber) est debidamente ajustado al mtodo de referencia (Rse Gottlieb), la desviacin estndar de las diferencias es aproximadamente igual a la desviacin estndar residual (S2x-y = S2 y,x)(Grappin, 1984). En el caso presente la desviacin estndar de las diferencias encontradas fue Sx-y = 0,0852, muy similar a la desviacin estndar residual Sy,x = 0,0853 (exactitud). Por otro lado el alto grado de asociacin entre los mtodos est reflejado por el coeficiente de correlacin obtenido (r = 0,9972). La Figura 2 explica en forma grfica el comportamiento lineal de los resultados de Gerber y de referencia. Se observa en el comportamiento de los residuales, en relacin a la lnea de regresin, una dispersin homognea incluso en los valores extremos de la curva (exactitud). La ecuacin de regresin obtenida (RG = 0,9998 G + 0,0278) fue analizada segn la norma estndar FIL-IDF 128: 1985. Se encontr que su pendiente no difiere

significativamente de 1,000 ( 0,9846 b 1,0149) y el intercepto no difiere significativamente de cero ( 0,0274 a 0,0830). Conocida la desviacin estndar residual (Sy,x = 0,0853), la exactitud del mtodo es, por tanto, de 0,17 g/l00g ( 1,987 x Sy,x) en las presentes condiciones. Por otro lado, la precisin del mtodo present una desviacin estndar de repetibilidad de Sr = 0,0308 y una repetibilidad de r = 0,087 g/100 g. Esto nos permite estimar la reproducibilidad del mtodo (R = 2 r), R = 0,174 g/ l00g. Se concluye que el mtodo de Gerber, aplicado a leche, realizado en conformidad con la norma FIL-IDF 152A: 1997 la cual se corresponde con la Norma Chilena Oficial NCh N1016/Of 98), realizado con la pipeta para leche de 10,77 0,02 ml (volumen vertido en agua destilada a 20C), presenta parmetros de validacin aceptables, en trminos de linealidad, precisin y exactitud.

Cuadro3: Tabla resumen anlisis de regresin. Table 3: Summary table lineal regresion analysis Modelo lineal Ec. Regresin lineal Coef. Correlacin de los mtodos (r) Coef. de Determinacin entre mtodos (R2) D.E. de Estimacin (Residual) SY,X D.E. de las diferencias SX-Y Y = a + bX RG =0,9998G + 0,0278 0,9972 0,9944 0,0853 0,0852

Figura 2: Regresin lineal del mtodo de referencia (Rse Gottlieb) v/s mtodo de Gerber en la

determinacin de materia grasa en leche de vaca. Figure 2: Reference method of lineal regresion (Rse Gottlieb) v/s Gerber method in determination of milk fat.

AGRADECIMIENTOS
Financiado por la Universidad Austral de Chile, proyecto DID-UACH N 199940 y FONDECYT N 1961046

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