Jessica Zapata Organizacin Celular y Molecular II - 2006

SECUENCIACIN
Introduccin Mtodos clsicos de secuenciacin
Maxam y Gilbert Mtodo de Sanger

Automatizacin del mtodo de Sanger Aplicaciones de la secuenciacin

INTRODUCCIN
SECUENCIACIN
Es el proceso mediante el cual se determina el orden de nucletidos de un fragmento dado de ADN

Watson y Crick

Enlaces Fosfodiester

Enlaces de Hidrogeno

INTRODUCCIN
Los esfuerzos para resolver la secuencia de los cidos nucleicos empieza a darse a partir de los aos 70 Hoy son el pilar del proyecto genoma humano y gran parte de la genmica que se realiza

MTODOS CLSICOS DE SECUENCIACIN

Mtodo Qumico Maxam y Gilbert
Propiedades qumicas bases del ADN. Consiste en varios pasos:
Marcaje Tratamiento Ruptura Separacin Visualizacin Anlisis

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

MARCAJE
Los fragmentos de ADN deben ser marcados radiactivamente con [32P]ATP en los extremos 5

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

TRATAMIENTO

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

Dimetil sulfato: Metila el N 7 debilitando el enlace entre C8 y C9 de la Guanina

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

Formato de piperidina: Debilita el enlace glicosdico las purinas con el azucar.

+ + + +

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

Hidracina: Abre el anillo pirimidinico el cual se cierra nuevamente en un anillo de 5. + lcali solo acta con la C.

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

RUPTURA

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

EJEMPLO: Dimetilsulfato 32 P
5*NNGACGTACTTA3 5*NNGACGTACTTA3 5*NNGACGTACTTA3 5*NNGACGTACTTA3 5*NNGACGTACTTA3 5*NNGACGTACTTA3 5*NNGACGTACTTA3

5*NNGACGTACTTA3 5*NNGACGTACTTA3 5*NNGACGTACTTA3 5*NNGACGTACTTA3 5*NNGACGTACTTA3 5*NNGACGTACTTA3

5*NN3 5*NNGAC3 5*NNGAC3 5*NN3 5*NN3 5*NN3

5ACGTACTTA3 5TACTTA3 5TACTTA3 5ACGTACTTA3 5TACTTA3 5ACGTACTTA3

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

MTODOS CLSICOS DE SECUENCIACIN

Mtodo Enzimtico Sanger
Especificidad de la DNA polimerasa Consiste en:
PCR: DNA molde, DNA pol, dNTPs, primers, ddNTPs

Terminacin de cadena de Sanger

Se denomina as por ser necesario los dideoxirribonucletidos.

DNA molde DNA pol Primers dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

ddATP

ddTTP

ddCTP

ddGTP

Terminacin de cadena de Sanger

SIMILITUDES Maxam-Gilbert y Sanger

Marcado

Separacin

A C G T

COMO SE OBSERVA

5CTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCT... 3

COMO SE OBSERVA

5' CCTCAAGTCGAGGTTATCAGATCTGCAACTCATAT 3'

AUTOMATIZACIN DEL MTODO SANGER

ATTGC A

Capillary Liquid polymer

.. Laser

Zappo
Beam splitter Detectors Window

Heat plate Sequencing reaction

AUTOMATIZACIN DEL MTODO SANGER

APLICACIONES
Deteccin de mutaciones Secuenciacin de ADNs fsiles Diagnstico de enfermedades genticas Identificacin de especies y control de cruces entre animales Proyecto genoma humano

DETECCIN DE MUTACIONES
Localizar mutaciones descritas y nuevas Delecin de 3 bases en el gen CFTR en la fibrosis qustica

SECUENCIACIN DE ADN FSIL

Aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias intactas presentes en especimenes de museo y descubrimientos arqueolgicos.

DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES GENTICAS

Diagnstico de enfermedades hereditarias Diagnostico prenatal

PROYECTO GENOMA HUMANO

Descripcin completa del genoma humano a travs de la secuenciacin del ADN. Capacidad de diagnstico en individuos con riesgo de ser portadores del gen de alguna enfermedad.