DIAGNSTICO DEL DENGUE, LOS AVANCES Y DESAFOS

Departamento de Virologa, la OPS / OMS para Enfermedades Virales, 'Pedro Kour' 'T ropical Instituto de Medicina, Autopista Novia del Mediod' a, Km. 6, Ciudad Habana, Cuba Recibido 17 de julio 2002, recibido en forma revisada 10 de marzo 2003; aceptado 12 de marzo 2003 Editor correspondiente: Jane Zuckerman, Londres, Reino Unido  Palabras claves: Dengue; Dengue hemorrgico fiebre; Diagnstico Resumen El diagnstico del dengue fue uno de los temas debatidos en el simposio El La amenaza mundial del dengue - Buscando desesperadamente soluciones ", organizada durante el 10 Congreso Internacional de Enfermedades Infecciosas, celebrada en Singapur en 2002. En este trabajo, se presenta una revisin se centra en los principales avances, problemas y desafos del diagnstico del dengue. IgM capture ELISA, aislamiento del virus en lneas celulares de mosquitos y los mosquitos viven, el dengue anticuerpos monoclonales especficos y PCR han representado importantes avances en el dengue diagnstico. Sin embargo, un adecuado mtodo rpido de diagnstico precoz y accesible til tanto para la vigilancia epidemiolgica y de diagnstico clnico sigue siendo necesario. Por otra parte, herramientas que sugieren un pronstico que permite una mejor gestin tambin son necesarias. Por ltimo, infraestructura de laboratorios, conocimientos tcnicos y la capacidad de investigacin debe ser la mejora en los pases endmicos con el fin de influir positivamente en la vigilancia del dengue, manejo de casos clnicos y el desarrollo de nuevos enfoques de lucha contra el dengue. El propio ttulo del simposio "La Global Amenaza de dengue-Buscando desesperadamente soluciones organizado durante el 10 Congreso Internacional de Enfermedades Infecciosas en Singapur en 2002, pone de relieve los efectos devastadores de la fiebre del dengue (FD) y dengue hemorrgico / sndrome de choque por dengue (DH / SCD), as nuestra actual incapacidad de controlar y evitar esta enfermedad. Hoy en da, DF y DH / SCD se consideran los ms importantes enfermedades virales transmitidas por artrpodos en trminos de la morbilidad y la mortalidad. Ms de 2,5 mil millones personas estn en riesgo de infeccin y ms de 100 pases han transmisin del dengue endmico. DH ha sido reportado en 60 de ellas. La carga de la enfermedad de dengue hemorrgico y el DF no est muy bien documentado, sin embargo slo en 1998, ms de 1,2 millones de casos fueron reportados a la Organizacin Mundial, con el sudeste de Asia, el oeste de Pacifico y, ms recientemente, las Amricas es el ms

regions.2 afectados, La emergencia y re-emergencia de dengue puede atribuirse a una serie de causas subyacentes. Estos incluyen los cambios demogrficos y sociales como el crecimiento demogrfico y urbano no planificado zacin, lo que puede dar lugar a grandes, llena humanos poblaciones que viven en centros urbanos con sustancial estndar de vivienda y aguas inadecuadas, aguas residuales y sistemas de gestin de residuos. Cuando estos factores se combinan con un mayor movimiento de individuos a las de las zonas endmicas, el deterioro de efectividad de medidas el control de mosquitos, y la finalidad limitada financiera y los recursos humanos dedicados a la publicidad de la infraestructura de salud, el dengue puede poner un pieen el poblacin.4-6 infecciones por el virus del dengue puede ser asintomtico, o puede dar lugar a fiebre indiferenciada, DF o DH / DSS. das. Los bebs y nios pequeos generalmente se desarrollan una enfermedad febril indiferenciada que se puede acompaada de una erupcin maculopapular. Mayores chil63 nios y adultos pueden desarrollar ya sea un febril leve sndrome de Down o la fiebre del dengue clsico, charac65 racterizado por fiebre, cefalea, mialgias, artralgias y erupcin cutnea. Sin embargo, tres o cuatro das despus de la inicio de la fiebre y, en general, cuando la fiebre baja, Algunos pacientes presentan manifestaciones hemorrgicas (en por lo menos una prueba de torniquete positiva), trombocitopenia y hemoconcentracin. Tambin puede hepatomegalia se observa. Los pacientes generalmente se recuperan despus de fluidos y la terapia de electrolitos. En los casos graves, shock se observa, que se caracteriza por signos de circulacin fallas (dbil y rpido el pulso, hipotensin o nar75 de remo de la presin del pulso, piel fra y pegajosa y agitacin). El shock es seguido de muerte en 5-10% de los casos si la rehidratacin es insuficiente o de78 mpuesto. extravasacin de plasma es la principal caracterstica de DHF/DSS.7-10 Ambos sndromes, DF y DH / SCD, causados son por cualquiera de los cuatro serotipos del dengue que be82 tiempo a la familia Flaviviridae. Los virus del dengue son esfricos, los virus con envoltura de lpidos que contienen una cadena positiva genoma de ARN de aproximadamente 10 200 nucletidos que codifican tres estructurales pro86 protenas (cpside, membrana y envoltura) y siete protenas no estructurales (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). La protena de envoltura (E) juega un papel clave en varios procesos importantes includ90 cin la unin al receptor, la sangre de hemaglutinacin de clulas, induccin de una respuesta inmune protectora, mem92 brana y la fusin de virus assembly.11, 12 En la actualidad, la infeccin secundaria por un dengue diferentes Serotipo 94 es considerado el ms importante individ95 factor de riesgo para la UAL DHF/DSS.13-15 La presencia de 96 que circulan no neutralizantes, una reaccin cruzada anti97 rganos en un individuo previamente inmunolgico permite mejora de la infeccin, favoreciendo el aumento de entrada del virus en la clula diana a travs de de la celda Fc receptor.16 Parece que las respuestas de clulas T tambin desempean un papel importante en la patognesis de la la enfermedad grave. Ambos CD4 + y CD8 + Tse han detectado en personas naturalmente inmunizados y citotxicos CD4 + especficas del dengue de clulas T clones

han demostrado tener tanto serotipo especfico y especificidades de reaccin cruzada de serotipo. En este modelo, infeccin previa con el serotipo de dengue una re108 resulta en la presencia en la serie de reactividad cruzada anticuerpos y clulas T de memoria. Una vez infectado por un serotipos diferentes, complejos de anticuerpos para el virus de plomo a la activacin del complemento y mejora las infecciones 111cin de las clulas monoctica. Los ataques contra el dengue 112 monoctica clulas infectadas por virus por las clulas T 113 resultados en la liberacin de citoquinas, lisis de las clulas, y 114 la liberacin de enzimas intracelulares y activa 115tores, dando lugar a fugas de plasma y 116 posteriores shock.17, 18 117 Recientemente, Mongkolsapaya et al., Han reportado 118 la presencia de muchos T especficas de dengue-las clulas de 119 baja afinidad por el virus infectante y de mayor parafina 120dad para los dems. Ellos sugieren que una profunda 121 la activacin de clulas T y la muerte puede contribuir a los 122 trastornos sistmicos observados durante el dengue hemorrgico. Se 123 Tambin proponemos que el pecado original antignico en los 124 T respuestas de las clulas puede suprimir o retrasar viral eli-125 mination.19 126 La patognesis del DH / SCD no est muy bien de las Naciones Unidas-127 derse ni las condiciones de acogida que favorezcan el 128 enfermedad grave, sin embargo, los nios, las mujeres, indi-129 individuos con enfermedades crnicas como el asma y 130 diabetes, y los blancos parecen estar en mayor riesgo. 131 Por ltimo, los informes recientes sostienen el riesgo de DH / SCD es de 132 mayor si el intervalo es mayor entre la enseanza primaria y 133 secundario del dengue infection.12-23 134 Entre los numerosos temas tratados en el simposio 135 fueron los nuevos avances y desafos en el rea 136 de diagnstico de dengue. 137

Aplicaciones e implicaciones de dengue 138 diagnstico

El diagnstico preciso y eficiente del dengue es im-140 portante para el cuidado clnico, apoyar la vigilancia, 141 estudios de la patognesis y la investigacin de vacunas. Diag-142 nstico es tambin importante para la confirmacin de casos (143 DF o DH / SCD), para diferenciar el dengue de otros 144 enfermedades como la leptospirosis, la rubola y otras 145 infecciones por flavivirus, y por la clnica el hombre-146 gestin y evaluacin de los pacientes con graves 147 disease.24, 25 148 En conjunto con clnicas y epidemiolgicas de 149

vigilancia, la deteccin precoz de dengue circu-150 cin o un aumento en la actividad del dengue ofrece a 151 las autoridades de salud informacin til sobre el tiempo, loca-152 cin, el serotipo del virus y la enfermedad severity.7 El uso 153 de dengue buenas herramientas de diagnstico es fundamental para labo-154 de confirmacin en el laboratorio los DH / SCD, incluido el nmero-155 mero de muertes caso, determinar qu cepas son 156 involucrados, y para derivar estimaciones de la incidencia total de 157 siguientes epidemics.7 ,26-31 158 Por ltimo, el diagnstico del dengue es de gran importancia 159 para la investigacin de acogida, virus y vectores carac-160 tics, para determinar las condiciones epidemiolgicas 161 que influyen en la patognesis de la enfermedad, y para 162 la evaluacin de vacunas (fase 1-3 estudios) . Los protocolos actuales para el diagnstico de infecciones por dengue

165 el diagnstico del dengue se podra realizar a travs de 166 de aislamiento del virus, genoma y la deteccin de antgenos y 167 pruebas serolgicas. La serologa es actualmente la ms 168 aplica extensamente en el diagnstico de rutina. Por supuesto, 169 clnicas, geogrficas y datos epidemiolgicos 170 asociados con el paciente permanezca crtica consid171 ciones cuando se evala un resultado de laboratorio.

Diagnstico serolgico

173 Dengue infeccin en un husped no inmune previamente 174 produce una respuesta primaria de anticuerpos char175 teriza por un lento y bajo ttulo de anticuerpos re176 sponse. IgMantibody es la primera inmunoglobulina 177 isotipo a aparecer. IgG anti-dengue aparece en un 178 ttulos bajos al final de la primera semana de la enfermedad 179 inicio, y se incrementa lentamente. Por el contrario, durante un 180 infeccin secundaria (infeccin del dengue en un previ181 ously flavivirus del dengue o inmune del husped), el anticuerpo 182 ttulos de lugar con gran rapidez y el anticuerpo reacciona 183 lneas generales, con muchas flaviviruses.36 Los altos niveles de IgG 184 son detectables incluso en la fase aguda y 185 aumenten drsticamente durante las dos semanas siguientes. 186 La cintica de la IgMresponse son ms variadas, 187 que aparecen tarde durante la fase febril de la enfermedad, 188 a menudo precedida por IgG. Algunos anti-dengue IgMfalse 189 reacciones negativas se observan en la enseanza secundaria in190 fecciones. Segn Panamericana de la Salud Orga191

nizacin (OPS) directrices, 7 das por cinco de la enfermedad, 192 80% de los casos han IgMantibody detectables, y por 193 das seis a diez, 93-99% de los casos han detectable 194 IgMthat pueden persistir por ms de 90 das. 195 IgMdetection de Lucha contra el dengue por medio ligado a enzimas 196 inmunoensayo (ELISA) representa uno de los 197 avances ms importantes y se ha convertido en un in198 herramienta valiosa para el diagnstico del dengue rutina. Specif199 camente, MAC-ELISA (ELISA de captura de anticuerpos IgM) di200 nostico se basa en la deteccin de IgM especfica de dengue anticuerpos en el suero problema mediante la captura de ellos nos-201 cin IgMantibody anti-humana antes de la envolvente en un 202 slidos phase.37-39 En general, el 10% de falsos negativos y 203 1,7% de reacciones positivas falsas se han observado. 204 Diferentes formatos, tales como ELISA de captura, la captura de 205 ultramicroELISA, dot-ELISA, AuBioDOT IgMcapture 206 varilla de medicin y se han developed.37 40-43 en suero, 207 sangre en papel filtro, 7,44,45 y ms recientemente la saliva 208 tiles para IgMdetection si las muestras se toman 209 dentro del marco de tiempo apropiado (despus de cinco das 210 de aparicin de la fiebre). Diferentes comerciales kits46-53 211 para anti-dengue IgMand deteccin de IgG estn disponibles, 212 con cifras variables de sensibilidad y especificidad 213 (Ver Tabla 1). 214 En un caso sospechoso de dengue, la presencia 215 de IgMantibody anti-dengue reciente sugiere-216 perfeccin. IgMdetection no es til para el dengue 217 serotipo debido a la reactividad cruzada determinacin 218 del anticuerpo mantuvo an durante la primaria en-219 perfeccin. En una serie de muestras de suero de dengue 220 pacientes en Nicaragua, Panam y Costa Rica, 221 un serotipo especfico IgMresponse se observ en 222 slo el 15% y 16% de casos de dengue hemorrgico y el DF, respectivamente, 223 y en 17% y el 14% de la primaria y secundaria 224 casos (Guzmn MG, datos no publicados). Dengue 225 IgMantibodies tambin una reaccin cruzada en cierta medida, con 226 otros flavivirus, como la encefalitis japonesa 227 y encefalitis de San Luis y amarillo fever.54, 55 228 En un intento de cuantificar IgMantibodies a AR-229 boviruses de importancia mdica a partir de tres virus de la 230 familias (Togaviridae, Flaviviridae y Bunyaviri 231dae), algunos investigadores han utilizado una norma-232 Ized combinado MAC-ELISA usando virus prototipo, 233 bien caracterizado sueros de humanos y, en general 234 monoclonales conjugados reactiva grupo-anticuerpo. 235 Este sistema ha dado lugar a un buen enfoque para 236 la deteccin rpida de muestras de suero humano para diversos 237 arboviruses.56 238

Clnicamente, la seroconversin de diagnstico se define 239 como un aumento de cuatro veces (o cada) de los anticuerpos en 240 pares suero por inhibicin de la hemaglutinacin (HI), comple cin de fijacin (CF), la neutralizacin de reduccin de placas 242 tcnica (PRNT) o ELISA.7, 24,25,57,58 Debido a la 243 la presencia de antgenos de reaccin cruzada compartida por fla244 la mayora de viviruses, diagnstico especfico no es posible en 245 casos. Cuando el diagnstico serolgico especfico es re246 quired, PRNT se utiliza, ya que este ensayo es el ms 247 herramienta especfica para la determinacin serolgica de 248 de dengue antibodies.59 249 Con el fin de determinar la presencia y cantidad 250 de dengue-anticuerpos neutralizantes, varios proto251 cols han desarrollado; Vero y las lneas de clulas BHK21 252 y carboximetilcelulosa (CMC) y agarosa 253 son de uso frecuente, mientras que algunos investigadores utilizan 254 peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) staining.60-64 Cur255 rently, algunos laboratorios utilizan PRNT en sus estudios. 256 A fin de aplicar PRNT, Shu et al. en 257 2002 estandarizados una NS1 indi258 serotipo especfico rect ELISA para diferenciar primaria y secundaria 259 infecciones por el virus del dengue y obtuvo una buena cor260 relacin entre IgG anti-NS1 serotipo especfico 261 (determinado por ELISA) y PRNT results.65, 66 A 262 el contrario, Cardoso et al., 2002, demostr que 263 la respuesta de IgG contra la protena premembrane 264 era especfico de flavivirus. No hay reaccin cruzada fue observ cuando los sueros fueron sometidos a pruebas de 265 personas 266 infectados con el virus del dengue o japons encephali267 tis virus. Estos autores recomiendan el uso 268 de la protena de premembrane seroepidemiolgica 269 studies.67 270 HI es la aceptada technique68 serolgicas how271 nunca, ya que lleva mucho tiempo, se ha convertido en ELISA 272 la tcnica ms utilizada para las pruebas serolgicas

273 estudios. 274 ELISA para la deteccin de IgG anti-dengue es actualmente 275 utilizado para la clasificacin de casos basados en el tipo 276 de la infeccin, primaria o secundaria. Algunos protocolos 277 diluciones de suero para uso ttulo de IgG anti-dengue. En oth278 res, una proporcin de IgM / IgG superior a 1,78 es consid279 rarse un marcador de la infeccin primaria, y menos se con280 considerado un marcador de secundaria infection.38 ,69-72 281 relativamente poco tiempo, algunos investigadores han 282 demostrado la utilidad de IgA anti-dengue de283 proteccin como un indicador de infeccin reciente. Talarmin 284 et al. determin la presencia de anticuerpos anti-dengue 285 IgMand anticuerpos IgA en 178 sueros de pacientes 286 con DF.74 cifras del 100% de sensibilidad y speci287 ficity se obtuvieron. anticuerpos IgA se detectaron 288 al da seis despus de la aparicin de la fiebre hasta el da 289 25. En promedio, se detectaron en IgMantibodies 290 das 3,8 y 4,6 das y la IgA. Por otra parte, 291 Groen et al.75 sugieren tambin el valor diagnstico de 292 IgA srica de deteccin utilizando una inmunofluorescencia 293 ensayo (IFA), sin embargo, un mayor porcentaje de IgA 294 de deteccin se observ en las muestras de suero de fase aguda 295 de los casos secundarios (62%) en comparacin con pri296 mary casos (17%). Se obtuvieron resultados similares por Balmaseda et al. cuando se aplica un mtodo de ELISA 297 a la deteccin de IgA anti-dengue en El sera.76 298 Por otra parte, Koraka et al. observaron significativamente 299 niveles ms altos de IgE especfica del virus del dengue en el suero 300 de DH / SCD, que en los casos DF y no pa 301-dengue pacientes. La medicin de estos anticuerpos es 302 propuesto como un pronstico marker.77 303 Deteccin de virus 304

viremia del dengue es corto, se observa generalmente de dos a 305 tres das antes del inicio de la fiebre y dura cuatro 306 a cinco das despus. Por lo tanto, las muestras para el virus de iso-307 mento deben ser tomadas en los primeros cuatro a cinco das de 308 la enfermedad. 309 El suero es la muestra de eleccin para la rutina de diag-310 tico, sin embargo el virus del dengue tambin puede ser detectado 311 en el plasma, los leucocitos y en los tejidos obtenidos en 312 la autopsia como el hgado, el bazo, los ganglios linfticos, pulmn, 313 thymus.26 ,78-81 Debido a que el virus del dengue es lbil al calor, 314 manejo adecuado de las muestras y del sistema 315 la entrega al laboratorio se requiere para el xito de 316 aislamiento del virus. Para el almacenamiento a corto plazo, las muestras de 317

podrn mantenerse a 4 C, sin embargo por ms tiempo de almacenamiento de baja 318 Se recomiendan temperaturas (-70 C). 319 la inoculacin de mosquitos es el sistema ms sensible 320 Para aislar el virus del dengue y de adultos y larvas 321 los mosquitos pueden ser utilizados. En general, Toxorhynchites 322 los mosquitos son preferibles debido a su gran 323 tamao y porque no son hematfagos. 324 El macho adulto es el Aedes aegypti y Aedes albopictus 325 los mosquitos tambin son tiles para el virus de isolation.82-86 326 la inoculacin de mosquitos para detectar el dengue es tambin 327 til en el control de la calidad de las vacunas. Jirakan-328 Al janakit et. inoculados Toxorhynchites splendens 329 con la tetravalente vacuna viva atenuada 330 de dengue y demostr que no existan interferencias entre los 331 serotipos se produjo en 332 infectados mosquitoes.87 Debido a la habilidad tcnica y amoldadas a 333entretenimiento necesarios para la inoculacin de mosquitos directa, 334 cultivo de clulas es preferible para el diagnstico de rutina, de-335 Pese a la mayor sensibilidad de los mtodos que emplean 336 los mosquitos. Estaba claro desde los primeros informes de 337 su uso que las culturas de clulas de mosquitos eran ideales para 338 aislamiento del virus del dengue. Diferentes lneas celulares y 339 clones se han estudiado, sin embargo, una lnea celular cul-340 rado de Aedes albopictus (C6/36) se ha convertido en 341 la clula husped de eleccin para la rutina del virus del dengue isola-342 cin, aunque la lnea celular de Aedes pseudoscutellaris 343 AP61 tambin ha tenido xito used.88-96 344 Rodrguez et al.97 utiliz una rpida centrifugacin 345 tcnica para aislar el virus del dengue cultivadas en 346 clulas C6/36 y obtuvo un 16,6% ms de 347 aislamientos con el mtodo convencional. De an ms im-348 tancia, este mtodo fue til para aislar los 349 virus en muestras de tejido procedentes de 350 casos mortales de dengue.79 Estos autores comunicaron la recov352 cubrimiento de 42,8% de los aislamientos virales de estos tejidos 353 muestras. 354 cultivos celulares de mamferos, como las clulas Vero, LL355 CMK2 clulas y otros tambin han sido empleados con 356 efficiency.24 menos, 25,98 357 El ms antiguo y menos sensible mtodo de iso358 lando el virus es a travs de la intracerebral inoc359 mento de ratones lactantes, este slo se utiliza cuando 360 no hay otros mtodos disponibles. Aunque muchos 361 animales presentan sntomas o signos que indican EN362 encefalitis, un gran nmero de animales que no presenten 363 seales de illness.99, 100 en trminos de aislamiento del virus, 364 el uso de lneas celulares de mosquitos representa la ms 365 importante contribucin al dengue diagnstico. 366 de identificacin del virus se realiza por regla general us367

usando tcnicas de inmunofluorescencia con serotype368 anticuerpos monoclonales especficos anti-dengue en 369 mosquitos squash cabeza, las clulas infectadas o en el cerebro tis370 demanda de los ratones. Anticuerpos monoclonales especficos 371 disponibles en la American Type Culture Collection 372 y en la Organizacin Mundial de la Salud Colaboradores 373 centros han simplificado la identificacin de estos 374 virus. En general, las muestras se prob por primera vez por IFA 375 utilizando un anticuerpo policlonal y los positivos 376 se vuelva a probar con los cuatro serotipos especficos 377 monoclonal antibodies.101-104 Algunas cepas no son 378 identifica fcilmente porque de virus poco concentra379 cin, por lo que algunos investigadores han recomendado 380 uno o dos pasajes a travs de un sistema de cultivo celular 381 con el fin de aumentar el virus concentration.104 382 La citometra de flujo ha sido recientemente reportado como 383 un mtodo til para la identificacin de dengue 1. Se al384 mnimos que el virus sea identificado diez horas antes de lo 385, donde un AMI anti-NS1 anticuerpos monoclonales son 386 used. Deteccin del antgeno

388 IFA y radioinmunoensayo (RIA) han detectado 389 antgenos virales de dengue, sin embargo, la baja sensibilidad 390 de estas pruebas no ha permitido su aplicacin en 391 de diagnstico habitual purposes.79, 106 392 En los ltimos aos, algunos sistemas han sido sensibles estandarizadas 393 en un tpico formato de ELISA. En 1995, Ma394 lergue y Chungue aplic un estreptavidina-biotina 395 amplificada fluorognicos ELISA para la deteccin y 396 identificacin de los antgenos de dengue 3 en el suero. Esta 397 ELISA demostr una sensibilidad del 90% y la especificidad de 398 98% con respecto al virus de la isolation.107 Ms tarde, Kit399 tigul et al. demostr que el antgeno del dengue 400 se puede detectar con una frecuencia mayor en periph401 ral las clulas mononucleares de sangre (CMSP) en comparacin con 402 sueros (53,8% frente al 18,9%). Estos investiga403 res tambin hizo uso de un ELISA.108 biotina-estreptavidina 404 Ms recientemente, la atencin se ha centrado en NS1 deteccin de antgenos. Young y sus compaeros de trabajo estndar de 405Ized una captura ELISA NS1 y demostraron los 406 presencia de altos niveles de NS1 en la fase aguda 407 suero de los pacientes que sufren de infecciones secundarias-408 cin. Sugirieron que los de deteccin de antgeno NS1 409 podra ser til para el diagnstico precoz y tambin como 410 marcador de viremia.109 Resultados similares se obtuvieron 411 por Alcon et al.110 Por ltimo, Libraty et al., demonio-412

trado la eficacia de la deteccin NS1 como un pre-413 Dictor de DH. NS1 los niveles en plasma correlacionan con 414 los niveles de viremia, y fue mayor en pacientes de 415 DH en aquellos con DF.111 416 Un producto comercial basado en dos pruebas ELISA para anti-417 gen de deteccin (equipo azul) e identificacin (equipo rojo) 418 Tambin se ha producido recientemente. De acuerdo con los 419 fabricante, la sensibilidad y la especificidad es del 84% 420 y 89% para el kit de color azul y el 91% y 93% para el rojo 421 Kit (Kit de GLOBIO Azul y Rojo para la deteccin del antgeno, 422 GLOBIO Corp., Beverly, MA, EE.UU.). 423 Inmunohistoqumica tcnicas (utilizando horsera-424 plato peroxidasa o etiquetas de la fosfatasa alcalina) 425 han demostrado su utilidad para el dengue anti-426 deteccin de generacin en formalina-fijo incluido en parafina 427 muestras de tejido, aunque esta tecnologa no es 428 ampliamente utilizado para el diagnstico del dengue en zonas endmicas 429 countries.112-114 430

Genoma de deteccin de 431

En los ltimos aos, la PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) 432 se ha convertido en una herramienta importante para el diagnstico de 433 el dengue, para el laboratorio de deteccin incluyendo entomo-434 vigilancia epidemiolgica, y para epidemiolgica molecular-435 lgica studies.115 Tambin ha demostrado su utilidad como una re-436 herramienta de bsqueda en la patognesis, medicamento antiviral, y 437-aspiradora Los estudios de cine. 438 amplificacin del ADN es precedida por una marcha atrs 439 reaccin de transcripcin, la produccin de la DNA de los 440 ARN diana. El dengue se ha detectado ARN 441 por PCR en suero, plasma, las clulas infectadas, en-442 las larvas de mosquitos infectados, criaderos de mosquitos, frescos 443 y los tejidos incluidos en parafina y fijados en formalina-444 tissue.29 ,30,115-117 445 Varios protocolos de PCR se han desarrollado, 446 muchos de ellos aplicar una combinacin de cuatro serotipo 447 pares de oligonucletidos especficos de imprimacin en un solo re-448 accin de un tubo o usar un flavivirus del dengue universal o 449 par de primers de oligonucletidos seguido por un segundo-450 amplificacin ond con el serotipo especfico oligonucletidos-451 tidos. Estos procedimientos tambin varan en la ge-452 ubicacin econmica de los cebadores (E, NS1, E/NS1, PRM / E, 453 NS5, NS5 / 3?) Y, en su especificidad y sensibilidad 454dad. Algunos protocolos permiten la deteccin de menos de 455 50-100 del virus del dengue pfu.118-135 En las Amricas, 456 el protocolo desarrollado por Lanciotti et al.112 cuenta con 457

sido ampliamente aplicada. Estos investigadores disearon cebadores consenso para C / prMgenes que amplifican un 460 511 pares de bases del producto. En una segunda ronda de PCR, utilizando 461 cartillas tipo especfico, los productos de ADN de diferentes 462 tamaos son amplificadas, permitiendo la diferenciacin de 463 serotipos. Las modificaciones a este protocolo, as como 464 nuevos protocolos tambin se han used.120, 125130134135 465 Cuando se aplica correctamente, la PCR tiene notables ad466 ventajas como herramienta para el diagnstico del dengue. El uso de 467 PCR permite la deteccin del dengue en almacenada sam468 pios durante largos periodos. Alvarez et al136 y ms tarde Sar469 IOL y otros demostraron la AL29 virus dengue 2 en el suero 470 y muestras de tejido de autopsia fromDHF / DSS casos que 471 haba sido almacenado por ms de 15 aos. Por otra parte, 472 fueron capaces de clasificar a los aislamientos de genmica 473 secuenciacin. Por otra parte, diferentes autores han 474 PCR aplicados a la vigilancia entomolgica. Comida 475 et al., 1998 y Kow et al. en 2001137.138 identificados 476 virus del dengue en Aedes aegypti y Aedes albopic477 Tus piscinas mosquito durante una vigilancia de un ao 478 perodo en Singapur, lo que permite la aplicacin de vec479 tor medidas de control. Aedes aegypti infectados fueron 480 detectado tan pronto como antes de las seis semanas, el recogni481 cin de un brote de dengue en 1995 y 1996. Estos 482 autores recomiendan este mtodo como una de las primeras warn483 cin del sistema para control de brotes de dengue. 484 PCR tambin permite la deteccin de concurrentes in485 fecciones por serotipos mltiples tanto en el suero sam486 pios y en los aislados de cultivo de tejidos o de mosquitos 487-141 inoculation.139 Laille et al., 1991, pudieron 488 para la deteccin de viremia doble por el dengue y el dengue 1 3 489 en seis pacientes DF durante el 1989 Nueva Caledonia 490 epidemic.139 Del mismo modo, Loroo-Pino et al. fueron capaces de 491 para demostrar que el 5,5% de los 292 muestras probaron 492 mostraron evidencia de infeccin por dengue concurrentes 493 con dos o ms serotypes.141 494 Una de las aplicaciones ms importantes de la PCR 495 es el estudio de la variabilidad de las cepas genticas con el fin de 496 identificar el origen de epidemias y revelar mark497 res de virulencia. En relacin con el nucletido la secuenciacin o anlisis de la enzima de restriccin, PCR 498 ha permitido la clasificacin de 499 serotipos de dengue en los genotipos (Cuadro 2) 0,142-150 Rico-Hesse y 500 compaeros de trabajo han desarrollado un mtodo para comparar 501 dengue 2 genomas directamente de plasma del paciente. 502 Encontraron algunos aminocidos y nucletidos 503 cambios en el gen de la protena E, as como dentro de los 504 la regin no traducida que pueden representar primaria 505 determinantes de la DHF.151, 152 En otros estudios, Kuno 506

et al. estableci la relacin gentica entre los 507 virus del gnero Flavivirus. Propusieron que los 508 dos ramas de la evolucin del virus de la puta-509 cin ancestro no-vector y el virus de transmisin vectorial 510 agrupaciones y desde el grupo surgido estos ltimos 511 transmitida por garrapatas y mosquitos transmitidas viruses.153 recientes 512 informes sugieren que dentro de la recombinacin serotipo 513 el virus del dengue occurs.154-157 Las consecuencias de la 514 estos resultados no estn bien definidos. 515 Por ltimo, los nuevos protocolos y metodologas PCR 516 han aparecido que permiten la deteccin rpida y 517 la cuantificacin de ARN. En 1999, Laue et al. 518 aplica un sistema totalmente automatizado de amplificacin proto-519 col (basado en el principio TaqMan) para medir 520 ADN especfica del virus de amplificacin. Este mtodo 521 demuestra una alta especificidad y sensibilidad, sino 522 elimina la posibilidad de contaminacin cruzada 523 y permite la deteccin de virus ms load.158 524 Recientemente, Callahan et al., 2001, aplic un TaqMan 525 RT / PCR para identificar los serotipos de dengue y 526 grupos, presentacin de informes una sensibilidad del 92,5% y 98,5% 527 respectivamente, y una especificidad del 100%, cuando se com-528 comparacin con el aislamiento del virus en clulas C6/36. Los resultados fueron 529 obtenidos en menos de dos hours.159 Wu et al., 2001, 530 aplica una isoterma de cido nucleico basada en la secuencia 531 amplificacin (NASBA) para amplificar el ensayo de cuatro 532 serotipos del dengue utilizando un conjunto de cebadores universales 533 y especficos de serotipo sondas de captura para escribir. 534 El cido nucleico se amplific sin termociclado 535 y el producto fue detectado por la sonda de hibridacin- mediante electroquimioluminiscencia.

mostr una sensibilidad del 538 de 100% en comparacin 539 de la celda C6/36 line.160 540 ha sido aadido a 541 la deteccin rpida del virus

98,5% y una especificidad con el aislamiento viral de Ms recientemente, un biosensor la tcnica NASBA permite del dengue slo en el ARN

542 15 minutes.161 En un enfoque alternativo, un flu543 sistema orognico RT-PCR fue desarrollado para el 544 cuantificacin e identificacin de los virus del dengue conservacin y uso de serotipo especfico 3? 545 no codificante 546 secuencias. Este sistema es capaz de detectar 20 547 50 ufp / ml de suero y mostr una sensibilidad del 548 92,8% y una especificidad del 92,4% con respecto al virus de la 549 en la celda de aislamiento culture.162

casos de laboratorio de clasificacin

551 El uso de estas pruebas de diagnstico para el dengue permite 552 a la clasificacin de las sospechas de casos clnicos para be553 vienen casos probables o confirmados. Una IgM positiva 554 serologa, o un recprocos de anticuerpos HI 1280 o equiv555 valente ttulo de IgG por ELISA son los criterios que indican 556 dengue probable. Aislamiento del virus del dengue, 557 de dengue demostracin de antgenos o PCR positiva, y 558 a cuatro o ms veces el cambio en la IgG recproca en 559 pares de sueros, se utilizan para confirmar la infeccin del dengue. 560 Los dos probables y casos confirmados son reportables 561 para la salud authorities.7

Dengue diagnstico, donde estamos hoy? Los principales problemas

564 IgMcapture ELISA, aislamiento del virus en mosquitos de la clula 565 lneas y los mosquitos en directo, especfico del dengue-mono566 anticuerpos monoclonales, y la PCR han representedma567 jor los avances en el diagnstico del dengue. Sin embargo, algunos 568 problemas que an amerita la elaboracin oportuna de 569 nuevas soluciones: 570 El aislamiento del virus es mucho tiempo. 571 La RCP requiere equipo de laboratorio especfico y 572 instalaciones, as como una extensa evaluacin de la 573 protocolos diferentes en condiciones de campo. 574 deteccin IgMantibody requiere una sincronizacin adecuada 575 y es confundida por los falsos positivos y 576 la gran persistencia de IgMantibodies, commer577 kits social an es necesario una evaluacin crtica, y 578 de los costes y la disponibilidad de estos equipos y otros 579 reactivos deben ser abordados.

Qu hace falta para un mejor diagnstico?

582 El continuo desarrollo de la barata, sensi583 tiva pruebas, especfico y fcil que permite a principios de diagnstico del dengue sigue siendo necesario. En concreto, los 584 siguientes aspectos requieren la mayor atencin: para 585 desarrollar: 586 (A pruebas) para el diagnstico clnico temprano de las personas. 587 (B) Las pruebas serolgicas capaces de diferenciar el dengue 588 de otras infecciones por flavivirus y an ms 589 especficamente para determinar la infeccin del dengue 590 serotipo. 591 (C) protocolos de fcil y barata para genmica 592 caracterizacin y la carga vrica, incluidos los 593 que se pueden aplicar en el campo. 594 (D) Modificaciones de los protocolos existentes que simplifican 595 manipular las muestras y el transporte. 596 (E) antgenos recombinantes como herramientas para la prueba eval-597 EVALUACION y producir esos 598 para las pruebas serolgicas pruebas. 599 (F) Las herramientas que pueden sugerir un pronstico, lo que permite 600 una mejor gestin de seguimiento clnico. 601 Adems de estos elementos especficos, tambin es 602 necesarios para implementar mecanismos de mayor 603 la disponibilidad de reactivos, para el intercambio de reactivos de referencia 604 (Antgenos, anticuerpos monoclonales, cultivos celulares, 605 positivos y negativos los sueros de control), para el nor-606 lizacin de los protocolos en las regiones endmicas, para la im-607 demostrando la calidad y cantidad de la competencia de 608 prueba, y para aumentar el intercambio de informacin-609 cin y experiencias entre las zonas endmicas en-610 incluyendo el desarrollo de la investigacin colaborativa 611 projects.163 El papel de la Organizacin Mundial de la Salud-612 cin de Centros Colaboradores de todos estos aspectos es de 613 crucial. 614 Hay algunos otros problemas y necesidades que 615 no estn relacionados con el desarrollo tecno-616 rrollo. Por ejemplo, el laboratorio infraes-617 tura, la experiencia tcnica y capacidad de investigacin 618 es limitada en muchos pases donde el dengue es en-619 acadmico. Estos factores influyen negativamente sobre el dengue 620 vigilancia, manejo clnico de los casos, y 621 el desarrollo de nuevos enfoques para el dengue 622 de control. Aunque no se han publicado estimaciones de 623 de los crditos otorgados para el campo 624 de dengue

actividades y la investigacin, no se discute que los fondos 625 son escasos. Es urgente que los fondos se movilizarn 626 para aumentar la capacidad bsica de salud pblica y 627-im probar la infraestructura en los pases endmicos. Este 628 podra resultar en una disminucin de la morbilidad del dengue y 629 la mortalidad, mejorar el control, la prevencin de enfermedades 630 y un mejor conocimiento del dengue y de DH / DSS. 631 El resultado sera un aumento en las investigaciones de 632 dirigida hacia el diagnstico, desarrollo de vacunas 633 y la patogenia. Por ltimo, debemos abogar por 634 el desarrollo urgente de un caso rpido, 635 principios y accesible mtodo de diagnstico para el dengue 636 con el fin de salvar vidas.