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Laboratrio de Botnica
Departamento de Cincias Naturais
BOTNICA
de
UESB
1- INTRODUO:
Anatomia Vegetal o ramo da cincia que estuda a estrutura da planta. Etimologicamente, anatomia significa cortar em pedaos. Diferente do que ocorre em grande parte dos animais, isto , da condio do organismo ser completo desde jovem; as plantas crescem por adio de novas unidades mediante atividade dos meristemas caulinares e radiculares. Assim sendo, a estrutura interna repetitiva ao longo dos diversos rgos. Como os rgos vegetais so freqentemente muito reduzidos, para o estudo da estrutura da planta, seja de suas partes internas como superficiais, utiliza-se uma importante ferramenta, infelizmente ainda to pouco popularizada o microscpio. Diante desta problemtica, o minicurso Tcnicas bsicas em Anatomia Vegetal se prope divulgar a utilizao do microscpio e algumas metodologias em Anatomia Vegetal, que alm de bela, auxilia sobremaneira os estudos em
diversas outras reas de estudo da planta, como fisiologia, taxonomia e ecologia. Este material um complemento terico do referido minicurso.
Alm de cortes, pode-se utilizar macerados de tecidos para se preparar lminas permanentes, semi-permanentes e temporrias. Esta tcnica, que consiste na dissoluo da lamela mdia da parede celular e separao das clulas, permite uma melhor visualizao das clulas individualizadas e inteiras (no cortadas).
Figura 2: esquemas de um rgo cilndrico e de um rgo laminar, respectivamente, com uma clula em evidncia, com 3 paredes em evidncia. no caso do rgo cilndrico, a paredes anticlinais das clulas podem tambm ser denominadas de paredes radiais.
O plano de diviso celular tambm pode ser expresso, de acordo com a orientao da parede formada entre duas clulas filhas. Assim, em uma diviso periclinal, a parede formada entre as duas clulas filhas se encontra paralela superfcie do rgo, originando uma clula acima e outra abaixo. Em uma diviso anticlinal, a parede formada entre as clulas filhas perpendicular superfcie do rgo, e as clulas se posicionam lado a lado. Em uma diviso oblqua, a parede formada entre as clulas filhas forma um ngulo prximo a 45 com a superfcie do rgo. clula em anfase, sofrendo diviso anticlinal
Figura 3: micrografia de um nectrio floral de Triumfetta semitriloba em formao, mostrando 2 planos diferentes de diviso celular.
4.2- FIXAO:
Consiste em submeter a amostra do vegetal a uma soluo que mata as clulas e previne a sua deteriorao. As amostras devem ficar completamente submersas no fixador, assim como nas demais solues utilizadas no processamento do material. Existem diversos tipos e fixadores para diferentes objetivos. O FAA (Johansen, 1940) (quadro 1) talvez seja o fixador mais utilizado, por ser relativamente eficiente e de baixo custo, e com este fixador que vamos trabalhar em nosso minicurso.
Para fixao de peas inteiras em FAA, recomenda-se 48h de fixao. Para uma infiltrao mais rpida, devemos submeter ao vcuo as amostras plenamente submersas no fixador. Para este fim, utiliza-se um dessecador acoplado a uma bomba de vcuo. Em se tratando de botes florais, pode-se fazer um pequeno corte em sua regio apical, tomando os devidos cuidados para no danificar as estruturas que se pretende analisar. Em se tratando de cortes a mo de material fresco, medida que obtemos os cortes com lmina de barbear, colocamos estes em um vidro de relgio contendo FAA. Depois de colocarmos o ltimo corte no fixador, espera-se uma hora. Aps este tempo, substitui-se o fixador por gua destilada, ficando nesta por cinco minutos. Aps este tempo, troca-se a gua por outra, fincando por mais cinco minutos, e novamente se repete a operao. Os cortes estaro prontos para a prxima etapa, que o alvejamento. FAA - formaldedo, cido actico glacial e lcool etlico (Johansen, 1940) Para cada 100mL de soluo: 5mL de formaldedo comercial (37%) 5mL de cido actico glacial 90mL de lcool etlico 50% Quadro 1: receita do FAA
4.4- SECCIONAMENTO
Consiste na obteno de cortes. Conforme j descrito nesta apostila, os cortes podem ser paradrmico, transversal, longitudinal e oblquo, e cabe ao anatomista a escolha racional dos cortes a serem feitos, de acordo com a sua necessidade. Para a obteno dos cortes, utilizamos lmina de barbear (Gillette). Como bem sabemos, essas lminas apresentam dois fios e uma linha de fraqueza entre os fios. Para uma utilizao mais segura e econmica, recomenda-se que se quebre a lmina em duas metades, dobrando-a na altura da linha de fraqueza, antes de desembrulh-la. Os cortes podem ser obtidos de material fresco ou fixado. No primeiro caso, seccionamos a amostra e colocamos em gua (para preparados temporrios de material fresco) ou em FAA (ou outro fixador), para preparados semi-permanentes ou permanentes. Para seccionarmos material fixado e estocado em lcool etlico 70%, primeiramente devemos colocar as peas em gua destilada e deixar nesta
por uma hora. Aps este tempo, iniciamos ento o seccionamento, tomando cuidado para no deixar secar as amostras.
4.5- ALVEJAMENTO
Os cortes feitos a mo, por mais finos que sejam, so incomparavelmente mais espessos que cortes obtidos em micrtomo. Para anlise de material fresco em lmina montada apenas com gua, onde o objetivo ver a cor natural dos tecidos, devemos observar os cortes imediatamente aps obt-los. Entretanto, quando o nosso objetivo a confeco de lminas semipermanentes ou permanentes de material corado, a cor natural dos tecidos muitas vezes prejudica o resultado final do preparado. Para amenizar este problema, descoramos os cortes mo, aps a fixao e lavagem em gua destilada. Como soluo alvejante, utilizamos o hipoclorito de sdio comercial (gua sanitria) a 5%, at obteno de resultado satisfatrio, cujo tempo varia de acordo com a amostra. Recomendo de 6 a 24h no alvejante. Esta etapa merece um cuidado especial, pois os cortes tendem a desmanchar no hipoclorito de sdio. Muitas vezes devemos interromper o alvejamento antes da completa clarificao dos cortes, para mantermo-los ntegros. Aps o alvejamento, os cortes devem ser lavados em gua destilada em cinco trocas de cinco minutos cada.
4.6- COLORAO
Uma vez clarificado, o material deve ser corado. Aqui, ser ensinado uma dupla colorao, isto , empregaremos dois corantes. Um deles vermelho, denominado safranina O (ou T), que ir corar alguns componentes do tecido. Posteriormente, as amostras sero contra-coradas com fast green, corante verde e metacromtico que tem afinidade por outros constituintes do tecido que, em geral, no se cora com a safranina. A safranina um corante muito utilizado em anatomia vegetal, e muitas fezes pode ser substitudo pela fucsina bsica, outro corante vermelho, porm mais rosado. O Color Index (C.I.) da safranina 40240 e a estrutura qumica deste corante encontra-se na figura 4. No nosso procedimento, utilizaremos a safranina em soluo aquosa, a 1% (Johansen, 1940). Apesar de poucas gotas (2 a 5) serem o suficiente, so necessrias horas para corar o material. O tempo de colorao varia de acordo com a particularidade da amostra. Por limitaes de tempo, neste minicurso utilizaremos 6h de tempo de colorao, porm indico de 12 a 24h para material variando de duro a macio, respectivamente. Como as amostras devem ficar muito tempo neste corante, a gua onde ele se encontra diludo vai evaporando, necessitando que se acrescente algumas gotas dgua eventualmente. Depois do tempo necessrio, voc vai perceber que a soluo vai ficando clara, decorrente da perda do corante para os cortes.
Este corante ir corar praticamente todos os constituintes teciduais, porm s vai pegar em alguns componentes, devendo-se remover o excesso para que no borre adiante. Para remover este excesso, devemos lavar os cortes em gua destilada realizando trs trocas de cinco minutos cada, e submetemos os cortes a uma soluo de cido actico glacial a 25%, por um perodo de 6 a 12h. Posteriormente, os cortes so novamente lavados em gua destilada, em trs trocas de cinco minutos.
H2N
NH2+ Cl-
H3C
CH3
Conforme j mencionado, faremos uma contra-colorao com fast green. Como este corante preparado em uma soluo livre de gua, devemos desidratar o material antes de corarmos com fast green. Para este fim, faremos trocas de cinco minutos em diversas solues etlicas progressivas: etanol 50%; etanol 70%; etanol 85%; etanol 95%; etanol absoluto I e etanol absoluto II. Aps este ltimo, faremos a colorao com fast green (C.I. 42053). Como o prprio nome diz, trata-se de um corante de ao rpida. Geralmente obtemos o resultado desejado com menos de um minuto de colorao. Recomenda-se que tenhamos lcool etlico absoluto mo e em frasco destampado, para estarmos prontos para interromper o processo de colorao com agilidade. Apesar de verde, torna-se azul em solues alcalinas. Utilizaremos uma receita feita em leo de cravo, conforme descrita no quadro 2. A estrutura qumica deste corante encontrase na figura 5.
Fast green em leo de cravo (Johansen, 1940 modificado) Para cada 100mL de soluo: 0,5g de fast green 50mL de leo de cravo 50mL de lcool etlico absoluto Adicionar lentamente o leo de cravo sobre o lcool em agitao. Depois, adicionar o corante Quadro 2: receita do fast green em leo de cravo.
C2H5 N
SO3-
CH2
O3S
HO
2Na+
N+
CH2
C2H5
Figura 5: Estrutura qumica do fast green
SO3-
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5- REFERNCIA BIBLIOGRFICA
Johansen, D. A. (1940). Plant microtechnique. McGraw-Hill., New York, USA.
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