L A B O R A T R I O

Laboratrio de Botnica
Departamento de Cincias Naturais
BOTNICA

de

UESB

Tcnicas Bsicas em Anatomia Vegetal

Prof. Dr. Carlos Andr Espolador Leito

1- INTRODUO:
Anatomia Vegetal o ramo da cincia que estuda a estrutura da planta. Etimologicamente, anatomia significa cortar em pedaos. Diferente do que ocorre em grande parte dos animais, isto , da condio do organismo ser completo desde jovem; as plantas crescem por adio de novas unidades mediante atividade dos meristemas caulinares e radiculares. Assim sendo, a estrutura interna repetitiva ao longo dos diversos rgos. Como os rgos vegetais so freqentemente muito reduzidos, para o estudo da estrutura da planta, seja de suas partes internas como superficiais, utiliza-se uma importante ferramenta, infelizmente ainda to pouco popularizada o microscpio. Diante desta problemtica, o minicurso Tcnicas bsicas em Anatomia Vegetal se prope divulgar a utilizao do microscpio e algumas metodologias em Anatomia Vegetal, que alm de bela, auxilia sobremaneira os estudos em

diversas outras reas de estudo da planta, como fisiologia, taxonomia e ecologia. Este material um complemento terico do referido minicurso.

2- TIPOS DE LMINAS E PLANOS DE CORTE:

Para se analisar a planta ao microscpio, necessrio o preparo de lminas temporrias, permanentes ou semi-permanentes. Em qualquer desses casos, deve-se realizar cortes extremamente finos e com a espessura o mais uniforme possvel, conferindo transparncia ao material. Quando se corta uma planta viva com uma lmina de barbear e se faz o exame imediato ao microscpio, com o corte montado com gua, lmina e lamnula, tem-se um corte a fresco montado em lmina temporria. As lminas semi-permanentes so montadas, geralmente, em gelatina glicerinada ou em glicerina 50% em soluo aquosa, lmina e lamnula. Os cortes devem ser fixados, para no estragarem. As lminas permanentes tambm devem ser feitas com material fixado. O processamento bem mais complexo, e as lminas so montadas em blsamodo-canad ou resina similar (Permount, Enterlan), lmina e lamnula. Para obteno de cortes, pode-se utilizar uma lmina de barbear ou um micrtomo. Neste ltimo caso, obtm-se cortes seriados bem finos e de espessura precisa, destinados montagem de lminas permanentes e semi-permanentes. Existem 4 tipos principais de corte, de acordo com o plano em que se d a seco: Corte paradrmico: aquele onde realizada a separao da epiderme, geralmente objetivando-se a observao de contedo de vacolo, plos ou estmatos neste tecido. Este tipo de corte s pode ser realizado manualmente. Corte longitudinal: onde o eixo de simetria do rgo encontra-se no plano (corte longitudinal radial fig. 1A) ou paralelo ao plano de corte (corte longitudinal tangencial fig. 1B). O corte longitudinal radial resulta em duas metades iguais do rgo, diferente do corte longitudinal tangencial. Tratandose de rgos cilndricos, os cortes longitudinais so retangulares. Corte transversal: onde o eixo de simetria do rgo encontra-se perpendicular ao plano de corte (fig. 1C). Tratando-se de rgos cilndricos, os cortes transversais so circulares. Corte oblquo: onde o eixo de simetria do rgo atravessa o plano de corte, porm no em ngulo reto, sendo como um corte transversal, s que inclinado (fig. 1D). Tratando-se de rgos cilndricos, os cortes oblquos so elpticos.

Figura 1: diferentes planos de corte em um rgo cilndrico.

Alm de cortes, pode-se utilizar macerados de tecidos para se preparar lminas permanentes, semi-permanentes e temporrias. Esta tcnica, que consiste na dissoluo da lamela mdia da parede celular e separao das clulas, permite uma melhor visualizao das clulas individualizadas e inteiras (no cortadas).

3- NOMEAO DAS PAREDES CELULARES

As paredes das clulas so designadas de acordo com o seu plano relativo no corpo do vegetal, tomando-se como parmetros o eixo de simetria ou a superfcie do rgo. A parede da clula paralela, ou no plano da superfcie do rgo, denominase parede periclinal (fig. 2). Assim, referimos parede periclinal mais externa como periclinal externa, e a mais interna como periclinal interna. As paredes perpendiculares superfcie, isto , paralelas ao eixo de simetria do rgo, so denominadas paredes anticlinais (fig. 2). No caso de rgos cilndricos, como essas paredes localizam-se nos planos radiais, elas tambm podem ser denominadas de paredes radiais (fig. 2). Por fim, as paredes perpendiculares superfcie e ao eixo de simetria do rgo so denominadas paredes transversais (fig. 2). Estas podem ser descriminadas em transversal superior e transversal inferior.

Figura 2: esquemas de um rgo cilndrico e de um rgo laminar, respectivamente, com uma clula em evidncia, com 3 paredes em evidncia. no caso do rgo cilndrico, a paredes anticlinais das clulas podem tambm ser denominadas de paredes radiais.

O plano de diviso celular tambm pode ser expresso, de acordo com a orientao da parede formada entre duas clulas filhas. Assim, em uma diviso periclinal, a parede formada entre as duas clulas filhas se encontra paralela superfcie do rgo, originando uma clula acima e outra abaixo. Em uma diviso anticlinal, a parede formada entre as clulas filhas perpendicular superfcie do rgo, e as clulas se posicionam lado a lado. Em uma diviso oblqua, a parede formada entre as clulas filhas forma um ngulo prximo a 45 com a superfcie do rgo. clula em anfase, sofrendo diviso anticlinal

clula em metfase, sofrendo diviso periclinal levemente oblqua

Figura 3: micrografia de um nectrio floral de Triumfetta semitriloba em formao, mostrando 2 planos diferentes de diviso celular.

4- METODOLOGIAS EM ANATOMIA VEGETAL:

So inmeras as tcnicas para o estudo anatmico vegetal, desde cortes frescos em lminas montadas com gua, para a observao ao microscpio de luz, tcnicas sofisticadssimas e dispendiosas, tais como preparados de himunocitoqumica visualizadas ao microscpio eletrnico de transmisso. So vrias as fontes literrias com diversas metodologias para todas as etapas necessrias para o preparo de lminas, inclusive no nosso idioma. No caso deste material, centraremos em tcnicas simples e baratas, que j trazem resultados interessantes. Assim sendo, ser abordado aqui o preparo de lminas temporrias e permanentes, preparadas com cortes mo. Conforme veremos a seguir, para o preparo de amostras apara anlise ao microscpio de luz utilizamos, freqentemente, protocolos longos que demandam vrios dias. Alm disso, as amostras vegetais muitas vezes so de difcil aquisio, necessitando de viagens ou a espera de um determinado perodo do ano, tais como poca da florao, produo de sementes, brotamento de folhas, etc. Uma vez que a anlise do material ser feita mediante o emprego de um microscpio, muitas deformidades decorrentes de erros no processamento, ainda que imperceptveis a olho nu, sero no apenas evidentes como inconvenientes, condenado o trabalho. Portanto, sugiro que cada etapa do processamento das amostras seja feita com muita calma, ateno e capricho, pois no h nada pior que constatar que dias de trabalho foram em vo em decorrncia de um erro em uma nica etapa.

4.1 - COLETA DAS AMOSTRAS:

Para melhores resultados, o indicado remover, com uma lmina de barbear, a parte do vegetal a ser estudada sem feri-la. Para o estudo de cortes a mo, recomenda-se que a amostra j removida seja colocada em um recipiente com gua para evitar murcha. Da se tira amostras menores para seccionamento com lmina de barbear. Caso o pesquisador esteja longe do laboratrio, recomenda-se levar um recipiente contendo fixador. Neste caso, ao ser removida, a amostra deve ser imediatamente submetida ao fixador.

4.2- FIXAO:
Consiste em submeter a amostra do vegetal a uma soluo que mata as clulas e previne a sua deteriorao. As amostras devem ficar completamente submersas no fixador, assim como nas demais solues utilizadas no processamento do material. Existem diversos tipos e fixadores para diferentes objetivos. O FAA (Johansen, 1940) (quadro 1) talvez seja o fixador mais utilizado, por ser relativamente eficiente e de baixo custo, e com este fixador que vamos trabalhar em nosso minicurso.

Para fixao de peas inteiras em FAA, recomenda-se 48h de fixao. Para uma infiltrao mais rpida, devemos submeter ao vcuo as amostras plenamente submersas no fixador. Para este fim, utiliza-se um dessecador acoplado a uma bomba de vcuo. Em se tratando de botes florais, pode-se fazer um pequeno corte em sua regio apical, tomando os devidos cuidados para no danificar as estruturas que se pretende analisar. Em se tratando de cortes a mo de material fresco, medida que obtemos os cortes com lmina de barbear, colocamos estes em um vidro de relgio contendo FAA. Depois de colocarmos o ltimo corte no fixador, espera-se uma hora. Aps este tempo, substitui-se o fixador por gua destilada, ficando nesta por cinco minutos. Aps este tempo, troca-se a gua por outra, fincando por mais cinco minutos, e novamente se repete a operao. Os cortes estaro prontos para a prxima etapa, que o alvejamento. FAA - formaldedo, cido actico glacial e lcool etlico (Johansen, 1940) Para cada 100mL de soluo: 5mL de formaldedo comercial (37%) 5mL de cido actico glacial 90mL de lcool etlico 50% Quadro 1: receita do FAA

4.3- ESTOCAGEM DAS AMOSTRAS

Peas inteiras fixadas em FAA podem ser estocadas, por tempo teoricamente indeterminado, em lcool etlico 70%. Aps 48h, as amostras em devem ter o fixador substitudo por lcool etlico 70%.

4.4- SECCIONAMENTO
Consiste na obteno de cortes. Conforme j descrito nesta apostila, os cortes podem ser paradrmico, transversal, longitudinal e oblquo, e cabe ao anatomista a escolha racional dos cortes a serem feitos, de acordo com a sua necessidade. Para a obteno dos cortes, utilizamos lmina de barbear (Gillette). Como bem sabemos, essas lminas apresentam dois fios e uma linha de fraqueza entre os fios. Para uma utilizao mais segura e econmica, recomenda-se que se quebre a lmina em duas metades, dobrando-a na altura da linha de fraqueza, antes de desembrulh-la. Os cortes podem ser obtidos de material fresco ou fixado. No primeiro caso, seccionamos a amostra e colocamos em gua (para preparados temporrios de material fresco) ou em FAA (ou outro fixador), para preparados semi-permanentes ou permanentes. Para seccionarmos material fixado e estocado em lcool etlico 70%, primeiramente devemos colocar as peas em gua destilada e deixar nesta

por uma hora. Aps este tempo, iniciamos ento o seccionamento, tomando cuidado para no deixar secar as amostras.

4.5- ALVEJAMENTO
Os cortes feitos a mo, por mais finos que sejam, so incomparavelmente mais espessos que cortes obtidos em micrtomo. Para anlise de material fresco em lmina montada apenas com gua, onde o objetivo ver a cor natural dos tecidos, devemos observar os cortes imediatamente aps obt-los. Entretanto, quando o nosso objetivo a confeco de lminas semipermanentes ou permanentes de material corado, a cor natural dos tecidos muitas vezes prejudica o resultado final do preparado. Para amenizar este problema, descoramos os cortes mo, aps a fixao e lavagem em gua destilada. Como soluo alvejante, utilizamos o hipoclorito de sdio comercial (gua sanitria) a 5%, at obteno de resultado satisfatrio, cujo tempo varia de acordo com a amostra. Recomendo de 6 a 24h no alvejante. Esta etapa merece um cuidado especial, pois os cortes tendem a desmanchar no hipoclorito de sdio. Muitas vezes devemos interromper o alvejamento antes da completa clarificao dos cortes, para mantermo-los ntegros. Aps o alvejamento, os cortes devem ser lavados em gua destilada em cinco trocas de cinco minutos cada.

4.6- COLORAO
Uma vez clarificado, o material deve ser corado. Aqui, ser ensinado uma dupla colorao, isto , empregaremos dois corantes. Um deles vermelho, denominado safranina O (ou T), que ir corar alguns componentes do tecido. Posteriormente, as amostras sero contra-coradas com fast green, corante verde e metacromtico que tem afinidade por outros constituintes do tecido que, em geral, no se cora com a safranina. A safranina um corante muito utilizado em anatomia vegetal, e muitas fezes pode ser substitudo pela fucsina bsica, outro corante vermelho, porm mais rosado. O Color Index (C.I.) da safranina 40240 e a estrutura qumica deste corante encontra-se na figura 4. No nosso procedimento, utilizaremos a safranina em soluo aquosa, a 1% (Johansen, 1940). Apesar de poucas gotas (2 a 5) serem o suficiente, so necessrias horas para corar o material. O tempo de colorao varia de acordo com a particularidade da amostra. Por limitaes de tempo, neste minicurso utilizaremos 6h de tempo de colorao, porm indico de 12 a 24h para material variando de duro a macio, respectivamente. Como as amostras devem ficar muito tempo neste corante, a gua onde ele se encontra diludo vai evaporando, necessitando que se acrescente algumas gotas dgua eventualmente. Depois do tempo necessrio, voc vai perceber que a soluo vai ficando clara, decorrente da perda do corante para os cortes.

Este corante ir corar praticamente todos os constituintes teciduais, porm s vai pegar em alguns componentes, devendo-se remover o excesso para que no borre adiante. Para remover este excesso, devemos lavar os cortes em gua destilada realizando trs trocas de cinco minutos cada, e submetemos os cortes a uma soluo de cido actico glacial a 25%, por um perodo de 6 a 12h. Posteriormente, os cortes so novamente lavados em gua destilada, em trs trocas de cinco minutos.

H2N

NH2+ Cl-

H3C

CH3

Figura 4: Estrutrura qumica da safranina O

Conforme j mencionado, faremos uma contra-colorao com fast green. Como este corante preparado em uma soluo livre de gua, devemos desidratar o material antes de corarmos com fast green. Para este fim, faremos trocas de cinco minutos em diversas solues etlicas progressivas: etanol 50%; etanol 70%; etanol 85%; etanol 95%; etanol absoluto I e etanol absoluto II. Aps este ltimo, faremos a colorao com fast green (C.I. 42053). Como o prprio nome diz, trata-se de um corante de ao rpida. Geralmente obtemos o resultado desejado com menos de um minuto de colorao. Recomenda-se que tenhamos lcool etlico absoluto mo e em frasco destampado, para estarmos prontos para interromper o processo de colorao com agilidade. Apesar de verde, torna-se azul em solues alcalinas. Utilizaremos uma receita feita em leo de cravo, conforme descrita no quadro 2. A estrutura qumica deste corante encontrase na figura 5.

Fast green em leo de cravo (Johansen, 1940 modificado) Para cada 100mL de soluo: 0,5g de fast green 50mL de leo de cravo 50mL de lcool etlico absoluto Adicionar lentamente o leo de cravo sobre o lcool em agitao. Depois, adicionar o corante Quadro 2: receita do fast green em leo de cravo.

C2H5 N

SO3-

CH2

O3S

HO

2Na+

N+

CH2

C2H5
Figura 5: Estrutura qumica do fast green

SO3-

4.6- MONTAGEM DAS LMINAS

Depois de corados com fast green, os cortes so lavados com etanol absoluto por duas trocas de cinco minutos, depois vo para uma soluo contendo 50% de etanol e 50% de lcool butlico tercirio por cinco minutos, depois para o lcool butlico absoluto por cinco minutos, e finalmente para uma soluo contendo 50% de lcool butlico tercirio e 50% de xilol, por cinco minutos. Esta soluo, alm de ter afinidade com o blsamo-do-canad, tambm confere um tom mais azulado ao material corado com fast green. Da soluo contendo lcool butlico tercirio e xilol, pegamos os cortes com um pincel e colocamos sobre uma pequena gota de blsamo-do-canad, previamente pingada sobre uma lminas histolgica devidamente limpa. importante que essa gota seja pequena, pois o blsamo-do-canad de difcil limpeza e suja muito as mos. Se colocarmos em excesso, teremos demasiado trabalho posteriormente. Sobre a gota contendo o(s) corte(s), colocamos uma lamnula, tomando cuidado para no fazer bolhas de ar no blsamo. Deixe este se acomodar sob a lamnula, por uns 2 minutos. Depois, ponha as lminas montadas sobre uma chapa aquecedora a cerca de 50C, com um peso de chumbo sobre as lamnulas. Recomendo aqueles pesos de balanceamento de roda de carro, que se consegue facilmente em oficinas especializadas, a custo zero. Existem uns pesos que parecem uma barra de chocolate, sendo fcil de segment-los em unidades menores e esteticamente apresentveis. As lminas devem permanecer nesta chapa por uns quatro dias. Se ficar tempo demais, o blsamo se torna escuro. Aps tirar as lminas, voc perceber que o blsamo ainda est mole. Quando esfriar, aps cerca de uma hora, estar razoavelmente seco. Ento, procedemos limpeza do excesso de blsamo, caso tenha. Para este fim, utilizamos uma gilete. Por questes de economia, recomendo que se utilize as giletes usadas no seccionamento das amostras, uma vez que possuem fio suficiente para remoo do blsamo. Neste processo, costuma voar fragmentos de blsamo, que tendem a grudar (com o tempo) onde caem. Por isso, recomendo que se tenha a mo um pincel grande, para limpeza desses fragmentos. Depois de limpas, s etiquetar as lminas. Existem estojos prticos, relativamente baratos, para acomodao de laminrio, com capacidade para 50 ou 100 lminas. Esses estojos possuem ranhuras onde encaixamos as lminas, ficando estas a 90 em relao superfcie. Como o blsamo nunca endurece totalmente, tendendo sempre a escorrer, recomendo que se guarde o estojo contendo as lminas, na posio vertical (como um livro numa estante), ficando assim as lminas na horizontal, evitando que se escorra o blsamo. Obs- Geralmente recomenda-se, aps colorao com fast green, que os cortes sejam lavados em etanol absoluto, depois subemtidos ao etanol com xilol, e depois ao xilol puro. Eu, particularmente, no fao assim, pois o xilol deforma demais os cortes. Por isso eu no uso o xilol puro.

10

4.7- SNTESE DO PROTOCOLO

1- Obteno dos cortes; 2- Fixao no FAA por 1h; 3- Lavagem em gua destilada (3x 5min); 4- Alvejamento em hipoclorito de sdio 5% por 6 a 24h; 5- Lavagem em gua destilada (5x 5min); 6- Colorao com safranina O 1% em soluo aquosa por 12 a 24h; 7- Lavagem em gua destilada (3x 5min); 8- Remoo do excesso de safranina com cido actico glacial 25% por 6 a 24h; 9- Lavagem em gua destilada (3x 5min); 10- lcool etlico 50% por 5min; 11- lcool etlico 70% por 5min; 12- lcool etlico 85% por 5min; 13- lcool etlico 95% por 5min; 14- lcool etlico absoluto I por 5min; 15- lcool etlico absoluto II por 5min; 16- Fast green 0,5% em leo de cravo e lcool absoluto 1:1 por segundos; 17- Lavagem em lcool etlico absoluto (2x 5min); 18- lcool etlico / lcool butlico tercirio 1:1 por 5min; 19- lcool butlico tercirio por 5min; 20- lcool butlico tercirio / xilol 1:1 por 5min; 21- Montar as lminas com blsamo-do-canad e lamnula; 22- Deixar em chapa aquecedora a 50C com um peso sobre a lamnula por 4 dias; 23- Deixar a lmina esfriar e tirar o excesso de blsamo com uma gilete; 24- Etiquetar a lmina.

5- REFERNCIA BIBLIOGRFICA
Johansen, D. A. (1940). Plant microtechnique. McGraw-Hill., New York, USA.

11