1

Uso de marcadores moleculares em anlise gentica de entomofauna forense.

Paulo Roberto Queiroz MSc. Biologia Molecular UnB PhD. Biologia Animal - UnB
2

Marcador Representa todo e qualquer fentipo de um gene expresso (isoenzimas), ou de um segmento do DNA que corresponde a regies (expressas ou no) do genoma.

Aplicao de Tcnicas Moleculares

Existncia de vestgios tais como: Exvia ou puprio; Insetos incompletos ou danificados; Precrio estado de conservao; Estgio de vida (ovos ou larvas); Proximidade morfolgica; Insetos em fase imatura.
4

Aplicao de Tcnicas Moleculares

1. Identificao de espcies.

2. Identidade molecular do inseto. 3. DNA fingerprinting. 4. Filogenia entre os indivduos. 5. Variabilidade populao. gentica de uma
5

PCR
Polymerase Chain Reaction Reao em Cadeia de Polimerase Mullis, K. B. and Faloona, F. A. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology, 155, 335-350.
6

Vantagens do PCR * Facilidade; * Versatilidade; * Rapidez; * Sensibilidade * Usar quantidades reduzidas de DNA. Permite analisar um n elevado de organismos ao mesmo tempo.
7

Termociclador

Eletroforese

Fo to do

cu m

en t

a o

Tcnica de PCR - mtDNA

Vantagens do mtDNA
1-Facilidade de isolamento e amplificao; 2-Elevado nmero de cpias; 3-Isolamento de tecidos mal conservados; 4-Seqncias muito conservadas. 5-Organizao gnica uniforme.
9

10

11

Mitochondrial DNA cytochrome oxidase I gene: potential for distinction between stages of some forensically important fly species (Diptera) in western Australia Michele L. Harvey, Ian R. Dadour, Silvana Gaudieri Forensic Science International 131 (2003) 134-139
12

13

14

C. rufifacies C. dubia

L. sericata

C. rufifacies

L. sericata

15

DNA-based identification of forensically important Chrysomyinae (Diptera: Calliphoridae) Jeffrey D. Wells, Felix A. H. Sperling Forensic Science International 120 (2001) 110115
16

17

The mitochondrial genome of the blowfly Chrysomya chloropyga (Diptera: Calliphoridae) Ana Carolina M. Junqueiraa, Ana Cludia Lessingera, Tatiana Teixeira Torresa, Felipe Rodrigues da Silvab, Andr Luiz Vettorec, Paulo Arruda, Ana Maria L. Azeredo Espin Gene 339 (2004) 7 15
18

19

20

Tcnica de PCR-RFLP
1-Obteno dos insetos; 2-Extrao de DNA; 3-PCR de uma regio especfica do mtDNA; 4-Digesto com enzima de restrio; 5-Eletroforese em agarose; 6-Comparao dos perfis moleculares.
21

Metodologia do PCR-RFLP

mtDNA

22

DNA typing for identification of some species of Calliphoridae: An interest in forensic entomology Yvan Malgorn, Raphael Coquoz Forensic Science International 102 (1999) 111 119
23

24

RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA DNA polimrfico Amplificado ao Acaso Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. e Tingey, S.V. (1990). DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 18 (22), 6531-6535.
25

Aplicaes do RAPD * Obteno de fingerprints genmicos; * Anlise da estrutura e diversidade gentica de populaes naturais; * Estabelecimento de relaes filogenticas entre diferentes espcies;
26

RAPD
mix de reao 5GGT CCA AAT G3 DNA + mix de reao Termociclador

Tampo de extrao

Gel
27

Random amplified polymorphic DNA (RAPD) typing of necrophageous insects (diptera, coleoptera) in criminal forensic studies: validation and use in practice Mark Benecke Forensic Science International 98 (1998) 157168
28

29

RAPD Chrysomya albiceps

B1 B2

B3 B4 B5

B6

D1 D2 D3

D4 D5 C+

C-

???
30

DNAmt Chrysomya albiceps

31

Chrysomya megacephala

Phaenicia cuprina

Chrysomya albiceps

32

Perspectivas... Bar Codes

33

Bar codes descritos para Arthropoda - Diptera

Espcies 432

Seqncia 1590
Sequence Length Distribution

http://www.barcodinglife.com/views/projectmenu.php?&
34

Biological identifications through DNA barcodes Paul D. N. Hebert , Shelley L. Ball and Jeremy Alina Cywinska, R. deWaard

Proc. R. Soc. Lond. B (2003) 270, 313321

35

36

37

Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator Paul D. N. Hebert, Erin H. Penton, John M. Burns, Daniel H. Janzen, and Winnie Hallwachs PNAS October 12, 2004 vol. 101 no. 41.
38

39

DNA Barcode: GBDP45905

DNA Barcode: GBDP45805

DNA Barcode: GBDP46705

DNA Barcode: GBDP46205

DNA Barcode: GBDP46305

ID#: ID#: AY597844 AY597854

ID#: ID#: ID#: AY597855 AY597856 AY597843

40

FIM!

41