Cultivo in vitro de yemas de Minirosa (Rosa spp.

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Castro W., Velsquez G.
ESCUELA POLITCNICA DEL EJRCITO Departamento de Ciencias de la Vida, Facultad de Biotecnologa, Laboratorio de cultivo de tejidos vegetales

Sangolqu-Ecuador
RESUMEN En el presente trabajo se estudi el cultivo in vitro de minirosa (Rosa spp.). La metodologa utilizada durante este estudio consisti en dos tratamientos el primero consisti en tomar explantes de tallo con yema axilares de minirosa, los cuales fueron desinfectados con una solucin al 1% de detergente ms tres gotas de Tween 20 durante 10 minutos, se utiliz una solucin germicida de savlon al 5 % durante 10 minutos, despus se sumergi los explantes en cloro al 1 % con cuatro gotas de Tween 20 durante 10 minutos. El segundo tratamiento diferenci en que primero se sumergi en el clora al 1 % con Tween durante 10 minutos y despus en la solucin germicida de savlon al 1 % durante 10 minutos. Para la siembra se utiliz medio MS enriquecido con: 3 mg/L de BAP, 1 mg L-1 de kinetina y 0,5 mg L-1 de ANA, 100 mg L-1 de mioinositol, 0,1 mg L-1 de tiamina, 2 mg L-1 de glicina, 30g L-1 de azcar y 6,5 g L-1 de agar y pH ajustado a 5,7-5,8. Despus de dos semanas de incubacin en luz natural y a 23 C de temperatura y a 62% de humedad ambiental se observ la aparicin de callos (41,66 % de los explantes) y de brotes (16,66 % de los explantes) en varios medios de cultivo. INTRODUCCIN Las roas Miniatura son rosales pequeos, 3040 cm. Son reflorecientes y con ramilletes formados generalmente por 3-11 flores diminutas, simples a plenamente dobles. Su Floracin es de primavera a otoo y presentan tambin hojas muy pequeas. Hay muchsimas variedades. Cada vez se estn plantando ms (Marchandier, H. & Sigaud,P. 2005). Son adecuados para rocallas, borduras, pequeos espacios y tambin para su cultivo en macetas y jardineras. Las minirosas crecen muy bien en casi cualquier lugar fuera del trpico, en climas calurosos y secos prosperan y florecen tanto que tienden a tener una vida ms corta, sobre todo si no se les permite un descanso en verano. Si se les priva de agua entrarn en estado de reposo y perdern las hojas en verano, pero florecern de nuevo en otoo (Sierra,R. 2002). La Rosa ha sido sometida a lo largo de la Historia a una intensa seleccin e hibridaciones con el objetivo de crear nuevas variedades y formas. Es la planta ms "trabajada" que existe. La minirosa ha conquistado una popularidad que difcilmente puede disputarle cualquier otra flor. De hecho, est considerada como la reina de las flores. Adems de su aroma, suave y exquisito, las minirosas tienen el atractivo de sus hermosas flores, y una apariencia elegante que la hace ser la planta

ms cultivada en parques y jardines de todo el mundo, convirtindola en una especie de gran importancia econmica a nivel mundial (Marchandier, H. & Sigaud,P. 2005). El objetivo del presente trabajo fue establecer in vitro yemas de minirosa (Rosa spp.) utilizando medio MS enriquecido con ciertos reguladores de crecimiento METODOLOGA Muestreo Como material experimental se utilizaron explantes de tallo con yema axilares de minirosa. Desinfeccin del explante La metodologa utilizada durante este estudio consisti en dos tratamientos el primero consisti en tomar explantes de tallo con yema de minirosa, los cuales fueron desinfectados con una solucin al 1% de detergente ms tres gotas de Tween 20 durante 10 minutos, se utiliz una solucin germicida de savlon al 5 % durante 10 minutos, despus se sumergi los explantes en cloro al 1 % con cuatro gotas de Tween 20 durante 10 minutos. El segundo tratamiento diferenci en que primero se sumergi en el clora al 1 % con Tween durante 10 minutos y despus en la solucin germicida de savlon al 1 % durante 10 minutos. Siembra e Incubacin Despus de realizados los tres lavados dentro de la cmara para retirar los residuos de cloro y de germicida, se desinfect los materiales con alcohol al 90 % y se utiliz todas las medidas aspticas, se coloc la muestra sobre la superficie estril y se retir las partes del explante quemadas por el cloro al 1 %, dejando expuesta la yema lateral de la minirosa. Para la siembra se utiliz medio MS enriquecido con: 3 mg/L de BAP, 1 mg L-1 de kinetina y 0,5 mg L-1 de ANA, 100 mg L-1 de mioinositol, 0,1 mg L-1 de tiamina, 2 mg L-1 de glicina, 30g L-1 de azcar y 6,5 g L-1 de agar y pH ajustado a 5,7-5,8. La siembra s e realiz de manera que la yema quede de manera vertical con el medio de cultivo. RESULTADOS: Como se muestra en la figura 1 los resultados del estudio fueron diversos, se obtuvo generacin de callos (41,66%) y de brotes (16,66%), adems de necrosis (16,66%) y contaminacin bacteriana (24,99%). En las tablas 1 y 2 se muestran el resumen de resultados segn el tratamiento 1 y 2 en los doce explantes totales y en la tabla 3 se muestran los porcentajes de los resultados del estudio segn el tratamiento.

Figura 1: en la figura se muestran los resultados de la induccin de brotes de mini rosa; A generacin de brote; B necrosis; C generacin de callo con contaminacin bacteriana; D explante sin crecimiento; E generacin de brote con contaminacin bacteriana; F generacin de callo. Tabla 1: resumen de resultados de los explantes tratamiento 2 Tabla 2: resumen de resultados de los explantes con el con el tratamiento 1.

Tratamiento 1 Resultado: Numero de frascos: Sin crecimiento 1 Callo 3 Brote 1 Necrosis 1

Tratamiento 2 Resultado: Numero de frascos: Brote 1 Brote contaminado 1 Callo contaminado 2 Necrosis 1 Sin crecimiento 1

Tabla 3: resumen de los resultados en el estudio en porcentajes.

Resultados Sin crecimiento Generacin de callo Tratamiento 1 Generacin de brote Necrosis Generacin de brote Generacin de brote con contaminacin Tratamiento 2 Generacin de callo con contaminacin Necrosis Sin crecimiento

Porcentaje de frascos 8,33 % 25,00 % 8,33 % 8,33 % 8,33 % 8,33 % 16,66 % 8,33 % 8,33 % 100 %

DISCUSIN El material vegetal de partida ms indicado para el cultivo in vitro de la minirosa (rosa spp.), son las yemas axilares, debido a su tamao, tasa de supervivencia y crecimiento, adems de la facilidad de aislamiento. No se debe descuidar la asepsia de modo que los explantes deben ser transferidos a los medios de cultivo previamente desinfectados. En este estudio en comparacin a los realizados anteriormente, se observ un nivel mucho menor de contaminacin ya que nicamente tres de los frascos sufrieron contaminacin bacteriana y esta no fue en un alto porcentaje (24,99). Segn Rivera, 2002 con esta especie se ha conseguido en esta fase xitos de ms del 90% y en el caso de aparecer contaminaciones por bacterias u hongos, se puede tratar en distintos sub cultivos mediante antibiticos y fungicidas hasta su desaparicin. En el desarrollo de este trabajo no se observ la presencia de contaminantes fngicos, lo que supone que las medidas aspticas y la calidad de trabajo del operador fueron las adecuadas. Ello constituye un ejemplo de cmo los contaminantes fungosos que no se encuentran asociados al explante inicial pueden ser prevenidos y controlados. Es importante citar que en tres francos se observaron explantes viables que dieron origen a brotes, sin embargo, se debe tener en cuenta que a futuro puede presentarse ennegrecimiento del tejido y necrosis, para evitar estos inconvenientes es recomendable disminuir la intensidad de luz, agregar antioxidantes al medio y al explante, sub cultivar con frecuencia, incrementar las sales de calcio, reducir el nivel de nitrato en el

medio y sumergir el explante en medio lquido por un da (Swartz, H. y Lindstrom, J. 1986). La formacin de callos en algunos de los explantes se debe a la presencia conjunta de ANA y BAP en el medio MS que se da como una respuesta morfo gnica de los explantes (Oriza., et al. 2000). La necrosis y la oxidacin de los explantes tiene un porcentaje alto sobre todo al no incluir al medio de cultivo sustancias que los pueda contrarrestar como carbn activado al igual que el acido ctrico y el acido ascrbico respectivamente (Vega., et al, 2007). CONCLUSIONES Se determin que la contaminacin microbiana disminuy considerablemente en comparacin con la obtenida en estudios anteriores, de modo que las medidas aspticas tomadas por los operadores fueron las correctas. No se obtuvo contaminacin fngica en ninguno de los explantes sembrados, lo que permiti que en tres de los frascos se originen brotes (16,66) y en cuatro callos (41,66) a partir de los explantes de mini rosa, en los otros casos, los explantes sembrados sufrieron un nivel de necrosis (16,66) de modo que no lograron originar brotes. El medio a ms de permitir la generacin de brotes a partir de las yemas axilares de los explantes de mini rosa permite tambin la generacin de callo debido a la presencia conjunta de BAP y ANA. Para la obtencin de resultados favorables en el cultivo in vitro, es necesario tomar

condiciones extremadamente aspticas, como tambin utilizar correctamente protocolo de desinfeccin y el mtodo siembra en la cmara, de modo que explantes logren ser viables y libres contaminacin. BIBLIOGRAFA

as el de los de

Marchandier, H. y Sigaud, P. 2005. Los lamos en la investigacin biotecnolgica . Unasylva 221, v. 56, p. 38-39. Oriza, C. Buenda, L. Orozco, J. Lechuga, A. & F, Cruz. 2000. Induccion de callo en la planta Stevia rebaudiana (BERTONI) HEMSL. Productora de edulcorante Sierra, R. 2002. El lamo tembln: bases para su cultivo, gestin y conservacin . Editorial Aedos. Primera Edicin. Espaa. Swartz, H. J. y Lindstrom, J.T. 1986. Small fruit and grape tissue culture from 1980 to 1985: Commercialization of the technique . 201-220 p. Vega C., Bermejo J., Villegas G., Quezada G., Aguilar M., Conde E., 2007. propagacin masiva de Polylepis tomentella Weddell ssp. nana mediante tcnicas de cultivo in vitro