Quim. Nova, Vol. 30, No.

2, 304-307, 2007 INFLUNCIA DO MTODO DE EXTRAO NOS TEORES DE METILXANTINAS EM ERVA-MATE (Ilex paraguariensis A. ST.-HIL., AQUIFOLIACEAE)

Artigo

Simone C. B. Gnoatto e Valquiria L. Bassani Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Ipiranga, 2752, 90610-000 Porto Alegre RS, Brasil Geraldo C. Coelho Departamento de Biologia e Qumica, Universidade de Iju, CP 560, 98700-000, Iju RS, Brasil Eloir P. Schenkel* Departamento de Cincias Farmacuticas, Universidade Federal de Santa Catarina, CP 476, 88040-900 Florianpolis SC, Brasil Recebido em 4/11/05; aceito em 23/6/06; publicado na web em 28/11/06

INFLUENCE OF THE EXTRACTION METHODOLOGY ON THE METHYLXANTHINES CONTENT OF MAT (Ilex paraguariensis A. ST.-HIL., AQUIFOLIACEAE). Ilex paraguariensis A. St. -Hil. is a native species of southern South America. The caffeine content in Ilex paraguariensis leaves has been considered an important quality parameter for mat-derived products. In this work different extraction methods for the determination of these methylxantines are compared. The influence of the extraction conditions on the methylxanthine yields was evaluated. Extraction by decoction with acidic aqueous solution (H2SO4 4N) presented the higher efficiency in the theobromine extraction. The extraction in a Soxhlet with acidic aqueous solution and decoction with acidic aqueous solution showed the highest caffeine yield. For the concomitant theobromine and caffeine quantification, the decoction with acidic aqueous solution is suggested. Keywords: mate; Ilex paraguariensis; methylxanthines.

INTRODUO Ilex paraguariensis A. St. -Hil. uma espcie nativa das regies subtropicais e temperadas da Amrica do Sul, onde popularmente conhecida como erva-mate. Utilizada no preparo do chimarro, faz parte dos hbitos culturais da Argentina, do Uruguai, Paraguai e Brasil. Neste contexto, a erva-mate assume um papel scioeconmico importante, na medida em que , basicamente, produzida em pequenas propriedades rurais, alcanando uma produo anual de 500.000 t1. A propriedade estimulante da erva-mate, relacionada com a presena de metilxantinas, conhecida e explorada h sculos2. A cafena 1 foi isolada de folhas de Ilex paraguariensis em 1843 por Stenhouse2. J Oehrli3 relatou, pela primeira vez, em 1927, a presena de teobromina 2. A presena de teofilina 3 na erva-mate controversa. Mazzafera4 observou a ocorrncia desta substncia em pequenas quantidades, enquanto que outros pesquisadores no detectaram sua presena5-8.

2002, quando foi estabelecido apenas um valor mximo para os produtos declarados como descafeinados (Brasil, 2002) 10 . A controversia em relao exigncia quanto ao teor mnimo de cafena pode estar relacionada com a variabilidade das populaes e plantas de Ilex paraguariensis, mas tambm ao mtodo de extrao aplicado na sua determinao. At o presente, nenhum estudo comparativo sistemtico entre os mtodos foi relatado. Neste contexto, no presente trabalho foi delineado um estudo comparativo da eficincia de extrao de cafena e teobromina em sete mtodos extrativos. Foi avaliada a influncia de alguns parmetros, dentre eles: o pr-tratamento com base, o tipo de solvente e a temperatura sobre a extrao das metilxantinas. PARTE EXPERIMENTAL Material vegetal Partes areas de Ilex paraguariensis foram coletadas em Mato Leito, RS, Brasil. Uma exsicata da planta foi depositada no Herbrio do Instituto de Botnica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul sob o nmero ICN-(7787), Porto Alegre, Brasil. As partes areas foram processadas de acordo com o processamento tradicional, abrangendo o sapeco (processo que consiste no ato de submeter folhas e ramos da erva-mate recm-podada ao das chamas de forma direta ou indireta, a fim de eliminar o excesso de umidade9), a secagem e a moagem, processamento esse realizado na ervateira Fino Mate, em Mato Leito/RS, originando a matria-prima analisada pelos sete mtodos descritos a seguir. Equipamentos e reagentes Para os processos de extrao do material vegetal e anlise em camada delgada foram utilizados solventes de grau analtico (Merck). A anlise cromatogrfica em camada delgada foi realizada em pla-

Figura 1. Estrutura qumica das metilxantinas; 1: cafena, 2: teobromina, 3: teofilina

De acordo com a literatura, o teor de metilxantinas na ervamate extremamente varivel, sendo apontado teores de cafena desde 0,16 at 1,4%7. A legislao em Vigilncia Sanitria estabeleceu, em determinado momento (Brasil, 1998)9, a exigncia de um teor mnimo de cafena de 0,5%, exigncia essa revogada em
*e-mail: schenkel@ccs.ufsc.br

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cas de gel de slica (placas aluminizadas Merck, 60 F254), como eluente foi utilizada a mistura de solventes CH2Cl2:EtOH (90:5, v/ v), em cmara saturada. A deteco foi realizada atravs da observao da extino de fluorescncia sob luz UV254. A anlise por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) foi realizada em cromatgrafo lquido de alta eficincia Waters 600E, equipado com vlvula de injeo Rheodyne de volume fixo (20 L), detector UV Waters 486 de comprimento de onda varivel e com integrador Waters 747 (Milford, USA). Foram utilizadas pr-coluna RP-18 (3040 m) e coluna Shim-Pack CLC-ODS (M) RP-18 (5 m, 250 x 4 mm d.i.). Os solventes usados foram metanol para HPLC (Lichrosolv, Merck, USA) e gua purificada por meio do sistema Milli-Q (Millipore Corp., Bedford, USA). Cafena, teobromina e teofilina, grau analtico, de procedncia Sigma/Aldrich (St. Louis, USA), foram utilizadas como substncias de referncia. PROCESSOS DE EXTRAO Mtodo I: Mtodo de Baltassat et al.12, modificado. A uma amostra de 2 g da matria-prima foram adicionados 20 g de areia purificada. Essa mistura foi colocada em macerao por 2 h com 10 mL de uma soluo aquosa 25% (v/v) de NH4OH. A mistura foi submetida extrao em um extrator tipo Soxhlet, com 200 mL de uma mistura clorofrmio:isopropanol (3:1, v/v), durante 4 h. Mtodo II: similar ao mtodo I, exceto quanto alcalinizao, que foi excluda. Mtodo III: A uma amostra de 2 g da matria-prima foram adicionados 20 g de areia purificada. Essa mistura foi colocada em macerao por 2 h com 10 mL de uma soluo aquosa 25% (v/v) de NH4OH. A mistura foi submetida extrao em um extrator tipo Soxhlet, com 200 mL de gua, durante 4 h. Mtodo IV: similar ao mtodo III, excluindo-se a fase de alcalinizao. Mtodo V: Uma amostra de 2 g da matria-prima, adicionada de 20 g de areia purificada, foi colocada em um extrator tipo Soxhlet e submetida extrao com 200 mL de H2SO4 4 N (aquoso) durante 4 h. O extrato resultante foi filtrado e neutralizado com uma soluo de NH4OH 25% (v/v) e submetido extrao, subseqentemente, com quatro pores de 50 mL de uma mistura de clorofrmio: isopropanol (3:1, v/v) que foram reunidas. Mtodo VI: Segundo Reginatto et al.7, uma amostra de 2 g da matria-prima foi mantida em ebulio, durante 10 min com 150 mL de H2SO4 4 N (aquoso). O extrato foi filtrado e o filtrado tratado como no mtodo V. Mtodo VII: Uma amostra de 2 g da matria-prima foi mantida em ebulio, durante 10 min, com 150 mL de gua. O extrato resultante foi filtrado e submetido extrao, subseqentemente, com quatro pores de 50 mL de uma mistura de clorofrmio:isopropanol (3:1, v/v) que foram reunidas. As diferenas entre as metodologias utilizadas esto descritas na Tabela 1. Avaliao do teor de metilxantinas Condies cromatogrficas A fase mvel foi constituda por uma mistura de metanol:gua (4:6, v/v) em fluxo de 1,1 mL/min. A deteco foi realizada em 280 nm.

Tabela 1. Diferenas entre os mtodos utilizados para a extrao de metilxantinas da erva-mate Mtodo Alcalinizao Processo Acidificao Solvente prvia extrativo extrao final I II III IV V VI VII SIM NO SIM NO NO NO NO Soxhlet Soxhlet Soxhlet Soxhlet Soxhlet Decoco Decoco NO NO NO NO SIM SIM NO Clorofrmio: isopropanol Clorofrmio: isopropanol gua gua gua* gua* gua*

*aps essa extrao inicial, as metilxantinas foram extradas da fase aquosa com a mistura clorofrmio:isopropanol(3:1,v/v) Curva padro Curvas padro de cafena e teobromina (provenincia Sigma, grau p.a.) foram obtidas por meio da anlise de solues metanlicas destes padres nas concentraes de 0,34; 0,85; 3,39; 5,01; 8,48; 16,96 e 42,40 g/mL para cafena e 0,32; 0,81; 1,62; 3,23 e 4,85 g/mL para teobromina. Todas as solues padres foram previamente filtradas em membrana hidroflica GV (Durapore) com dimetro nominal de poro de 0,45 m e injetadas no cromatgrafo, em triplicata. As reas dos picos foram medidas, sendo determinados a mdia, o desvio-padro e o desvio-padro relativo para cada um dos pontos. As mdias dos valores das reas referentes a cada concentrao foram plotadas em grfico de concentrao versus rea, calculando-se o coeficiente de regresso linear da curva e a equao da reta. Limites de deteco e quantificao Os limites de deteco (LD) e de quantificao (LQ) da cafena e da teobromina foram determinados de acordo com o estabelecido pela ICH11, baseando-se no desvio-padro (DP) do intercepto do coeficiente angular (S) da curva de calibrao, por meio das Equaes 1 e 2. (1) (2) Amostras As solues extrativas obtidas em cada mtodo foram filtradas e diludas at a concentrao necessria para a anlise por CLAE, dentro da faixa de linearidade avaliada para o mtodo (cafena: 0,3442,4 g/ mL; teobromina: 0,32 4,85 g/mL). As reas dos picos correspondentes cafena e teobromina foram medidas e as concentraes calculadas por meio das correspondentes curvas padro. Cada mtodo extrativo foi repetido trs vezes. De cada uma destas solues extrativas foram retiradas trs amostras, totalizando nove amostras por mtodo extrativo, que foram analisadas em triplicata por CLAE. RESULTADOS E DISCUSSO Na anlise qualitativa para metilxantinas foi detectada a presena da cafena e da teobromina, mas no da teofilina, o que est de acordo com resultados anteriores obtidos em nosso grupo de trabalho e j relatados7,15. Para as anlises qualitativa e quantitativa foi utilizada a CLAE, com metodologia j validada para anlise de metilxantinas em extratos de Ilex paraguariensis7,8. No sistema

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cromatogrfico empregado, os padres teobromina e cafena apresentaram, respectivamente os tempos de reteno de 4,8 e 9,4 min. A Figura 2 apresenta exemplos dos cromatogramas das substncias de referncia e das solues extrativas.

Figura 2. (a) Perfil cromatogrfico dos padres de teobromina (tr = 4,8 min) e cafena (tr = 9,4 min); (b) perfil cromatogrfico de metilxantinas presentes em Ilex paraguariensis, extrao pelo Mtodo I

clorofrmio:isopropanol) mostrou-se o mais eficiente. A explicao para este fato est provavelmente relacionada com a ocorrncia das metilxantinas nos vegetais sob a forma de complexos13,14. Os diferentes teores obtidos nos mtodos I e II indicam que a alcalinizao libera as metilxantinas de seus complexos, deixando-as na forma livre, de maior solubilidade. A comparao entre os mtodos I e III denota a maior solubilidade da forma livre, de caractersticas bsicas, na mistura clorofrmio:isopropanol (3:1) em relao gua. A acidificao utilizada nos mtodos V (extrao em Soxhlet) e VI (extrao por decoco) conduziu aos maiores rendimentos, o que est provavelmente relacionado com a descomplexao e com a protonao das metilxantinas, o que as torna muito mais solveis em gua. Comparando esses dois ltimos resultados, o mtodo V levou a rendimentos maiores que o mtodo VI, o que est associado, provavelmente, ao maior tempo de extrao empregado no mtodo V (4 h), bem como continua renovao do solvente, j que essa extrao foi realizada em Soxhlet. A comparao entre os mtodos IV (extrao em Soxhlet; gua) e VII (extrao por decoco; gua) indica a superioridade da decoco em relao extrao por Soxhlet, quando no h a ao do cido sulfrico. Esse aumento do rendimento pode estar relacionado com o efeito da temperatura sobre a complexao, mas tambm com o aumento da solubilidade da cafena com o aumento da temperatura na decoco. Influncia dos mtodos de extrao sobre os teores de teobromina A teobromina uma substncia de baixa solubilidade, tanto em clorofrmio quanto em gua. Nos experimentos realizados utilizando-se extrao em Soxhlet, foi observado um aumento no rendimento quando o solvente escolhido foi clorofrmio:isopropanol com prvia alcalinizao da amostra (mtodo I). Esses resultados indicam que a alcalinizao, da mesma forma que para cafena, libera a teobromina da forma conjugada na planta, deixando-a livre para extrao com o solvente empregado, contudo, sua reduzida solubilidade determina rendimentos baixos, principalmente quando o solvente gua (mtodo III). Os rendimentos obtidos pelos mtodos V (extrao em Soxhlet) e VI (extrao por decoco), ambos em meio cido comprovam a importncia da acidificao para a extrao da teobromina, da mesma forma que para a cafena, o que est provavelmente relacionado com a descomplexao e com a protonao das metilxantinas e conseqente aumento da solubilidade em gua. Cabe destacar a diferena de rendimento entre esses dois mtodos, o que indica a maior eficincia da decoco para a extrao da teobromina, que pode ser explicado pela influncia da alta temperatura (prxima a 100 C) sobre a solubilidade dessa metilxantina. As diferenas de teores com os diferentes mtodos so claramente visualizadas pela observao da relao cafena:teobromina, que passa de 14 no mtodo IV para 1,4 no mtodo VI, sendo este ltimo o que apresenta a maior eficincia na extrao da teobromina. CONCLUSO Pode-se concluir que a eficincia na extrao de metilxantinas depende da sua solubilidade nos solventes empregados. A gua quente mostrou ser o melhor solvente para o material vegetal sem tratamento prvio (mtodo VII). A extrao por decoco mostrou-se mais eficiente que a extrao por Soxhlet. O melhor resultado foi obtido com a acidificao e por decoco (mtodo VI), por conjugar bons rendimentos para ambas as metilxantinas. A utilizao de soluo cida leva, provavelmente, protonao das molculas de cafena e teobromina,

As curvas de calibrao da cafena e teobromina mostraram-se lineares nas faixas de concentrao empregadas, apresentando, respectivamente, coeficientes de regresso (r2) 0,9987 e 0,9996. A equao da reta obtida por regresso linear para cafena foi yc = 115984xc + 58362, e para teobromina, yt = 121341x + 2788,2, onde y representa a rea do pico (mV.s) e x representa a concentrao de cafena ou de teobromina (g/mL). O limite de deteco da cafena foi de 0,03 g/mL e o da teobromina, de 0,09 g/mL. No que se refere aos limites de quantificao, a cafena apresentou o limite de 0,09 g/mL e a teobromina, de 0,30 g/mL. As concentraes de cafena e teobromina obtidas em cada mtodo so apresentadas na Tabela 2, assim como a relao entre os teores de cafena e teobromina, para cada mtodo. Os valores apresentados so resultado da aplicao de ANOVA e Tukey. Tabela 2. Contedo de metilxantinas (%, teores mdios, n=3) em Ilex paraguariensis obtido por diferentes mtodos e relao cafena/ teobromina (C/T) Cafena (%)* Mtodo I Mtodo II Mtodo III Mtodo IV Mtodo V Mtodo VI Mtodo VII 0,69b 0,22c 0,25c 0,14d 0,79a 0,71b 0,67b Teobromina (%)* 0,07c 0,02d 0,02d 0,01e 0,16b 0,51a 0,07c C/T 09.8 11.5 12.5 14.0 04.9 01.4 09.5

* g de metilxantinas em 100 g de material vegetal (%, m/m). C/T = relao entre teores de cafena e teobromina. a, b, c, d, e letras diferentes, entre mtodos, indicam diferena estatstica com base em ANOVA e teste de Tukey (p<0,05). Influncia dos mtodos de extrao sobre os teores de cafena Comparando-se os mtodos de extrao I a IV, que tm em comum a forma de extrao (Soxhlet) e se diferenciam quanto alcalinizao prvia e o lquido extrator, o mtodo I (alcalinizao; extrao com

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proporcionando um aumento na solubilidade em gua de ambas as molculas, a qual incrementada pela elevao da temperatura. Em suma, o presente trabalho demonstra que a metodologia de extrao influencia diretamente o teor de metilxantinas em erva-mate. Os baixos teores de teobromina referidos em alguns trabalhos podem ser decorrentes das condies utilizadas no processo de extrao, geralmente adequadas para cafena, mas no para teobromina, como no caso da extrao com clorofrmio. importante ressaltar que o alto teor de teobromina verificado em erva-mate est de acordo com outros resultados obtidos em nosso grupo de trabalho7,15. Isso indica que a erva-mate no uma planta que apresenta apenas teores elevados de cafena, como refere a literatura de modo geral, mas tambm uma planta que possui elevados teores de teobromina. REFERNCIAS
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