UNMSM

INTRODUCCION
Los estafilococos son parte de la flora bacteriana normal de piel, mucosas y tracto respiratorio superior. Sin embargo en determinadas ocasiones son capaces de lesionar gravemente al husped dando lugar a diversos cuadros infecciosos, entre los cuales destacan: Absceso cutneo, Sndrome de piel escaldada, etc. Las toxinas estafiloccas responsables de la mayor parte de los efectos perjudiciales de estos grmenes sobre el husped son: Hemolisinas y leucocidina (actan sobre clulas sanguneas), Enterotoxinas (responsables de las toxiinfecciones alimentarias), Exfoliatina (responsable del sndrome de piel escaldada), Exotoxinas pirgenas (productoras de hipertermia), Enzimas estafiloccicas: Coagulasa, hialuronidasa y estafiloquinasa. En general, los estafilococos son microorganismos bastante sensibles a la mayora de los antimicrobianos tradicionales, son cocos GRAM positivos, de 0.5-1.5 m de dimetro, catalasa positiva, que se encuentran microscpicamente aislados, en pares, ttradas o formando racimos irregulares. Son inmviles, facultativamente anaerobios, no formadores de esporas, generalmente no capsulados o con limitada formacin de cpsula. El gnero Staphylococcus est ubicado junto a los gneros Micrococcus, Los micrococos son clulas bacterianas esfricas dispuestas en agrupaciones irregulares en racimos, en tetradas o paquetes. La mayora de las especies que abundan en los alimentos son aerobias, no son patgenas (desprovistas de coagulasa y hemolisina) y catalasa positivas. Es flora inocua, es frecuente despus del ordeo por su temperatura ptima elevada (25 a 30C). La importancia de los diferentes Micrococcus en alimentos se debe a las siguientes propiedades: Algunas especies son capaces de utilizar las sales de amonio otros compuestos nitrogenados sencillos como nica fuente de nitrgeno, la mayora de las especies son capaces de fermentar azcares produciendo una mediana cantidad de cido, algunas desdoblan las protenas con produccin de cidos (M freudenreichii), otras toleran concentraciones elevadas de sal, son capaces de crecer en medios con valores de humedad relativamente bajos; estas especies crecen en las salmueras, algunas son termodricas, resisten al tratamiento de comercial que se aplica a la leche (M. varians), otras producen pigmentaciones y coloraciones anormales en la superficie de los alimentos, por ejemplo M. luteus produce un pigmento amarillo, mientras que M. roseus produce un pigmento rosado, algunos micrococos son capaces de crecer a temperaturas prximas o inferiores a los 10C. Los Micrococcus abundan en polvo y agua, se encuentran frecuentemente en los utensilios y equipos insuficientemente lavados y desinfectados

LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA

UNMSM OBJETIVOS:
Aislar bacterias del gnero de Staphylococcus y Micrococcus. Determinar de forma cualitativa los gneros de Staphylococcus y Micrococcus.

AGAR BAIRD PARKER

Medio de alta especificidad diagnstica, selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos y otros materiales de importancia sanitaria, a la vez que los diferencia del resto de microorganismos que pueden existir en la flora normal.

Fundamento
Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos de muestras de alimentos que permite el crecimiento de estafilococos Gram positivos, presentndose a las colonias de Staphylococcus aureus con las siguientes caractersticas: negras, brillantes, convexas, y rodeadas de un halo brillante de 2 a 5 mm de dimetro. Este es un medio de cultivo preparado y completo, la peptona y el extracto de carne constituyen la fuente de carbono y nitrgeno, el extracto de levadura aporta vitaminas del complejo B. Adems se dice que es selectivo y diferencial debido al telurito de potasio y al cloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora acompaante. Los estafilococos que se han reportado como coagulasa positiva van a reducir el telurito a teluro y originan colonias de color grisceo-negro, y dan reaccin sobre la yema de huevo (permite demostrar la actividad lecitinsica) produciendo alrededor de la colonia una zona opaca que a menudo tiene una zona clara ms externa. Se pueden encontrar cepas no lipolticas, que presentan igual caractersticas de colonias pero sin la zona opaca y clara.

Composicin de Medio Baird Parker

Frmula (en gramos por litro) Peptona de casena 10.0 Extracto de carne 5.0 Extracto de levadura 1.0 Cloruro de litio 5.0 Agar 17.0 Glicina 12.0 Piruvato de sodio 10.0 pH final: 6.8 0.2 Siembra Dejar secar la superficie de la placa preparada ,extender 0.1 ml de la dilucin de la muestra , en este caso se utilizo el queso como muestra a analizar ,sembrando posteriormente por estriado. Incubacin 24-48 horas a 35-37 C, en aerobiosis. Caractersticas del medio debe ser: Ambar claro opalescente (sin el agregado de yema de huevo). LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA

UNMSM AGAR SANGRE

Medio enriquecido para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos. Con la adicin de sangre, el medio es til tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observacin de reacciones de hemlisis. Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio agar chocolate.

Fundamento
Es una combinacin de un agar base (agar nutritivo) con el agregado de 5 % de sangre ovina, tambin puede usarse sangre humana. El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. La infusin de msculo de corazn y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, an de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentracin final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar la capacidad hemoltica de los microorganismos patgenos (que es un factor de virulencia). Observando los halos hemolticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemlisis que posee: alfa: halos verdosos beta: halos incoloros gamma: inexistencia de halos.

Composicin de Medio Agar Sangre

Frmula (en gramos por litro) Infusin de msculo de corazn 375.0 Peptona 10.0 Cloruro de sodio 5.0 Agar 15.0 pH final: 7.3 0.2

Siembra
Dejar secar la superficie de la placa preparada ,extender 0.1 ml de la dilucin de la muestra , en este caso se utilizo el queso y el hisopado nasofarngeo como muestra a analizar ,sembrando posteriormente por estriado.

Incubacin
El tiempo, temperatura y atmsfera de incubacin, dependern del microorganismo que se quiera aislar. En este caso para Staphylococcus colocamos a una temperatura de 37 despus de 24 horas a 37C, y se observan colonias medianas, blancas, cremosas, brillantes, pasada las 24 horas (48-72 horas), se pueden ver esas colonias blancas ahora de color amarillo.

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar. Medio preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza.

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UNMSM AGAR MANITOL SALADO

Es un medio selectivo para el aislamiento de Staphylococccus, extremadas concentracin de sal (7,5% NaCl) esta inhibe el desarrollo de bacterias halfilas, el manitol es desdoblado por especies patgenas lo cual no es absoluto con presencia de cido y sirve como indicador de la presencia de Staphylococccus aureus, debe sembrarse con un buen inoculo a partir de muestras donde se sospecha la presencia de Staphylococccus

Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa. En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol es el indicador de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color .Los estafilococos que no fermentan el manitol , se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o prpura.

Composicin de Medio Agar Manitol Salado

Frmula (en gramos por litro) Extracto de carne 1.0gr Peptona de casena 5.0 Peptona de carne 5.0 NaCl 75.0 Manitol 10.0 Rojo de fenol 0.025 Agar 15.0 pH final: 7.4

Siembra

Sembrar en superficie un inculo en nuestro laboratorio fue 0,1ml de la dilucin de la muestra de queso artesanal y hisopado nasofarngeo. El mtodo de sembrado fue el estriado.

Incubacin
24-48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo

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UNMSM COAGULASA Fundamento

Permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de especies de Staphylococcus (coagulasas negativos). Casi todas las cepas de Staphylococcus aureus posee esta enzima .La tcnica en tubo detecta coagulasa libre y ligada. Mecanismo de accin de la coagulasa libre: procoagulasa (enzima extracelular bacteriana) reacciona con un factor activador presente en el plasma sanguneo similar a la protrombina, dando lugar a un complejo anlogo a la trombina (coagulasa propiamente dicha) que reacciona con fibringeno formando un cogulo de fibrina en ausencia de Ca2+. La coagulasa ligada o factor de agregacin acta directamente sobre el fibringeno y lo convierte en fibrina. No requiere la presencia de activadores plasmticos.

DNAsa Fundamento:
Estaphylococcus aureus extracelulares. puede expresar desoxiribonucleasas (DNasa) estas son enzimas

El agar DNA permite diferenciar a las bacterias que poseen la enzima desoxirribonucleica de aquellas que no las poseen, el procedimiento consiste en sembrar, a partir de in cultivo puro, un inoculo denso por puntura o por estra e incubar en anaerobiosis durante 1824 horas en 37oC.La presencia de la enzima, se puede detectar mediante el agregado de cido clorhdrico 1N, se observa en los 5 minutos. El cido desoxirribonucleico hidrolizado presenta transparencia, mientras que el acido desoxirribonucleico polimerizado, precipita y torna opacidad al medio de cultivo

COLORACIN GRAM
La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante empleado en esa tincin. La propiedad de teirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o Gram negativas), es un criterio de clasificacin importante correlacionable con otras propiedades bacterianas, ya que unos pocos organismos son Gram-variables. Tanto las Gram positivas como las Gram negativas captan la misma cantidad de yodo y cristal violeta formando un complejo. Este sin embargo, es atrapado dentro de la clula Gram positiva por la deshidratacin y la reduccin del tamao de los poros de la pared, resultado del proceso de lavado con el solvente (alcohol-acetona). En las Gram negativas en cambio, la fina capa de peptidoglicano no impide la extraccin del complejo por el solvente.

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UNMSM PROCEDIMIENTO 1
Aislamiento de bacterias del genero Micrococcus y Estaphylococcus .

Aislamiento en una muestra de queso :

se tomo de una muestra representativo 1g de queso y se mesclo con solucin salina de esa mescla se cogi 0.1ml y se sembr por diseminacin en placas con agar: ABP (Agar Baird - Parker),AS (Agar Sangre)Y AMS (Agar Manitol Salado).Despus del sembrado se dejo reposar de 15 20 min para que la muestra se absorba se invirtieron las placas y se incubaron a 37oC por 24 48 hrs .

Aislamiento farngeo :

mediante

un

hisopado

se realiz un hisopado nasofaringeo mediante un hisopo ,este de coloco en solucin salina y se agito ligeramente ,con el mismo hisopo se procedi a sembrar mediante estriado en agares diferentes como :ABP (Agar Baird - Parker),AS (Agar Sangre)Y AMS (Agar Manitol Salado).Despus de la siembra se invirtieron las placas y se incubaron a 37oC por 24 48 hrs .

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UNMSM PROCEDIMIENTO 2

Prueba de catalasa
Esta prueba nos va a permitir evidenciar la presencia de microorganismos de la familia Staphylococcaceae. La enzima catalasa descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y oxgeno bajo la frmula

2 H 2O2 2 H 2O + O2
De esta manera las bacterias se protegen del efecto txico del H2O2, que es un producto final del metabolismo aerobio de los azcares. Colocar una gota de perxido de hidrgeno sobre una lmina portaobjeto.

Sobre una gota colocar una muestra de la colonia con el asa de siembre y mezclar.

Un resultado positivo se visualiza con la aparicin de burbujas.

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UNMSM Prueba de la coloracin Gram

Extender la muestra bacteriana sobre un portaobjeto y fijar el frotis al calor.

Colorear por 1 minuto con cristal violeta, verificando que el colorante cubra toda la preparacin.

Eliminar el exceso de colorante y lavar rpidamente con agua de cao, manteniendo el portaobjeto en posicin inclinada. Cubrir el frotis con lugol durante 1 minuto.

Lavar nuevamente con agua de cao.

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UNMSM
Decolorar por algunos segundos con una solucin de alcohol acetona.

Lavar con agua de cao. Cubrir el frotis con safranina (colorante de contraste) por 30 segundos aproximadamente.

Lavar con agua, secar y observar al microscopio con aceite de inmersin (objetivo de 100x).

Siembra en Medio Hugh-Leifson

1. Despus de la seleccin de 2 colonias las cuales haban cresido en diferente medio se procedi a la siembra de estas en medio Hugh-Leifson . 2. En una batera de 4 tubos con medio Hugh-Leifson en los que ,2 tenian glucosa y los otros 2 manitol . los 2 tubos primeros (con glucosa)se sembro una de las colonias elegidas y a uno de ellos se le agrego parafina liquida . 3. En los otros 2 tubos (con manitol) se sembr la otra colonia y a uno de ellos se le agrego parafina liquida. 4. Posteriormente incubar todos los tubos a 37C durante 24 horas.

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UNMSM Prueba de la DNAsa:

Para esta prueba se debe tener 2 placas con agar DNAsa, para cada cultivo bacteriano. Prueba de DNAsa a partir de cultivo de BPA (Agar Baird Parker) Al obtener las colonias del microorganismo, se va a proceder a realizar esta prueba de la siguiente manera: Esterilizar el asa de siembra en punta.

Tomar la muestra con el asa de siembra, teniendo cuidado de que el alambre de nicrom no est muy caliente.

Con mucho cuidado, se va a proceder al estriado sobre la placa que contiene el agar DNAsa.

Esterilizar el asa de siembra.

Incubar la placa a 35 por 24 48 horas.

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UNMSM Prueba de DNAsa a partir de cultivo de Agar Sangre:

Al obtener las colonias en el agar sangre, se realizo en un primer momento la disolucin en el caldo BHI (Infusin Cerebro-Corazn) y desde ah se procedi al sembrado. Esterilizar el asa de siembra en aro.

Tomar la muestra con el asa de siembra a partir del caldo BHI, asegurndose de haber tomado la muestra en el aro.

Realizar el estriado sobre la placa petri con agar DNAsa.

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UNMSM
Esterilizar el asa de siembra.

Incubar la placa a 35 por 24 48 horas.

Prueba de la coagulasa:
Se agrego en un tubo 0.5 ml de plasma sanguneo Y 0.1ml del caldo BHI (caldo el cual contiene la cepa asilada) y se incuba a 37 oC. por 4 - 24 h en la estufa.

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