IDENTIFIZIERUNG VON

MIKROORGANISMEN

n Identifizierung von Bakterien heißt, so

wenige Eigenschaften wie möglich und so
viele wie notwendig zu bestimmen, um
einer unbekannten Kultur ihren Platz im
Nomenklatur zuzuordnen und sie damit
auch benennen zu können.

1
n Grundsätzlich können 3 Gruppen von Eigenschaften für die
Identifizierung herangezogen werden:

• Morphologische Merkmale: Gram-Verhalten, Form, Größe,

Kapsel

• Physiologische Merkmale: Nachweis verschiedener Enzyme

wie Katalase, Koagulase

• Chemische Merkmale: DNA-Struktur, Zellwand-Aufbau

n Unter Taxonomie (Systematik) versteht man

das Beschreiben und Ordnen der Lebewesen
in einem hierarchischen System.

n Dieses beginnt mit der umfassendsten

Einheit und endet mit der kleinsten Einheit.

2
 Die Reihenfolge der einzelnen Kategorien
(Taxa, Singular = Taxon) lautet:

n Reich (Procaryotae), Division, Klasse, Ordnung,

n Familie,

n Gattung (Genus)

n Art (Spezies, sp.)

n Unterarten (Subspezies, spp.)

n Bakterienstämme

n Jedes Taxon umfasst alle ihr nachgeordneten Taxa, d.h. z.B.

in eine Gattung werden alle diejenigen Arten, die
miteinander ähnliche Merkmale haben, eingeordnet.

n Einer Familie werden ähnliche Gattungen zugeordnet usw.

n Die Art als kleinste Einheit umfasst diejenigen

Bakterienstämme die in ihren Eigenschaften
übereinstimmen.

3
Biochemische Tests

Plasmakoagulase

n Dieses von S. aureus gebildete Exo-Enzym führt zur Verklumpung von

Plasma. Die Mechanismen sind denen der physiologischen
Blutgerinnung ähnlich, aber nicht ident.

n Die pathogenetische Bedeutung der Koagulase liegt in der Bildung

eines Fibrinschutzwalles um die in das Gewebe eingedrungenen
Staphylokokken.

n Dieser Fibrinschutzwall kann später, nach entsprechender

Vermehrung, durch das von Staphylokokkenzellen gebildete
Fibrinolysin wieder aufgelöst werden.

4
 Plasmakoagulase

n Die durch ungestörte Vermehrung ihrer Zellzahl und damit

auch ihrer pathogenen Potenz verstärkten Staphylokokken
können sich dann in die Umgebung ausbreiten.

n Anwendung: Differenzierung von S. aureus und Koagulase-

negativen Staphylokokken

n S. aureus: Verklumpung, S. epidermidis: keine

Verklumpung

Katalase

n Die Eigenschaft eines Keimes, eine 3%ige

Wasserstoffperoxidlösung mittels Katalase in Wasser und
Sauerstoff (Gasbläschen) abzubauen, ist ein wichtiges
Differenzierungsmerkmal in der Bakteriendiagnostik.

n Die Katalaseaktivität einer Kultur läßt sich einfach prüfen,

indem man sie direkt oder nach Übertragung einer kleinen
Menge Koloniemasse auf einen Objektträger mit 3%iger
H2O2-Lösung übergießt.

5
 Katalase

n Aufsteigende Gasblasen (02) zeigen die Anwesenheit

des Enzyms an. Die Katalase ist ein
Atmungskettenenzym und wird in der
Routinediagnostik vorwiegend zur Differenzierung von
Staphylokokken und Streptokokken verwendet.

n Staphylokokken: Katalase-positiv (Schaumbildung)

n Streptokokken: Katalase-negativ

Hämolyse

n Man erhält eine relativ scharf begrenzte Hämolysezone

um die Kolonien, die Erythrozyten sind aufgelöst, und
der Blutfarbstoff ist abgebaut, sodaß eine klare Zone im
sonst undurchsichtigen Blutagar entsteht (ß-Hämolyse).

6
 Hämolyse

n Um die Kolonien findet man grüne Höfe von

unterschiedlicher Farbintensität, in deren Bereich der
Blutfarbstoff aufgelöst ist, während die
Erythrozytenmembran weitgehend erhalten bleibt (a-
Hämolyse).

n g-Hämolyse: Fehlende Veränderungen des Blutagars,

keine Hämolyse!

Cytochromoxidase-Test

n Oxidase test dient zur Abgrenzung der

Enterobakterien von anderen Gram-negativen Keimen
wie z.B. Pseudomonaden oder Aeromonaden.
n Der Nachweis von Cytochromoxidase erfolgt durch Auftropfen von
Oxidasereagenz (1%iges a-Naphthol und N,N,Dimethyl-p-
phenylendiammoniumdichlorid) auf die verdächtigen Kolonien.

n Oxidase-positive Kolonien färben sich etwa nach 30 Sekunden

dunkelblau (Indophenol-Blau), Oxidase-negative Kolonien bleiben
unverändert.

7
 Cytochromoxidase-Test

n Mit dem Cytochrom-Oxidase-Test werden Bakterien erfaßt,

die Cytochrom c als Respirationsenzym enthalten.

n Der Farbstoff N, N-Dimethyl-p-phenylen-

diammoniumchlorid fungiert dabei als künstlicher
Elektronenakzeptor.

n In der reduzierten Form ist er farblos, bei Vorhandensein

von Cytochromoxidase und Luftsauerstoff, wird er oxidiert,
wobei sich ein blauer Indophenolkomplex bildet.

Cytochromoxidase-Test

n Bei Zusatz einer wäßrigen Lösung von oben genannten

Farbstoff und einer 1 %-igen alkoholischen Lösung von
a- -Naphtol zum Zellmaterial spielt sich folgende
Reaktion ab: H3 C

N
CH3

H3 C CH 3

N N

+ ------------- + 4H + 4e
>

N H2
OH O

Dim ethyl- a lpha- Indophenol

p-ne dia m in
phe ny le N aphtol blue
e

8
 Cytochromoxidase-Test

positive Reaktion

negative Reaktion

Oxidations/Fermentations-Test

n O/F-Test wird z.B. zur Differenzierung von Mikrokokken

(Oxidation) und Staphylokokken (Fermentation)
verwendet.

n Für den Fermentationstest wird das beimpfte

Agarröhrchen mit sterilem Paraffinöl überschichtet.

n Eine positive Reaktion manifestiert sich im Umschlag des

Indikators im Zuckernährboden.

9
 MUG TEST

n Das fluorogene Substrat MUG wird durch das Enzym

ß-D-Glucuronidase gespalten. Methylumbelliferon
ist als Spaltprodukt fluoreszenzoptisch nachweisbar.

n Eine blaue Fluoreszenz des Nährbodens weist auf die

Anwesenheit von Methylumbelliferon hin.

n Der E. coli-Nachweis ist erbracht, wenn Fluoreszenz

nachweisbar ist und der Indoltest positiv ausfällt.

ONPG

n ß-Galactosidase (Lactase) ist ein intrazelluläres Enzym, das

Lactose zu Galactose und Glucose abspaltet.

n Lactose wird durch Lactose-Permease in die Zelle transportiert

und durch ß-Galactosidase gespalten.

n o-Nitrophenyl-ß-D-Galactosid (ONPG)

n ß-Galactosidase setzt Nitrophenol aus ONPG frei

n Innerhalb der Enterobakterien ist diese Reaktion das wichtigste

Unterscheidungsmerkmal von coliformen Bakterien.

10
 Äsculinhydrolyse

n Enterokokken (D-Streptokokken) hydrolysieren das

Glucosid Äsculin (ß-Glucose-6,7-dihydroxycumarin) zu
Glucose und Äsculetin (6,7-dihydroxycumarin), welches mit
Eisen(III)-Ionen einen olivgrünen bis schwarzen Komplex
bildet.

n ß-D-GLUCOSIDASE

n Äsculin ist unter UV-Bestrahlung bei 365 nm fluoreszierend,

das Endprodukt Äsculetin aber nicht.

Do

Ü6
IDENTIFIZIERUNG VON MIKROORGANISMEN

API 10 ist ein miniaturisiertes System zur

Identifizierung von Enterobakterien und
anderen Gram-negativen Stäbchen mit Hilfe
von standardisierten biochemischen
Reaktionen.

11
BUNTE REIHE
§ Der API 10 Streifen besteht aus 10 Mikroröhrchen, in denen sich
verschiedene Substrate in dehydratisierter Form befinden.
§ Die Röhrchen werden mit der zu untersuchenden Bakteriensuspension
beimpft, welche die Substrate löst.
§ Die biochemischen Reaktionen können anhand von Farbumschlägen
abgelesen werden, die entweder spontan während der Inkubation oder
nach Zugabe von Reagenzien entstehen.

Vorbereitung des Streifens:

n Eine Inkubationswanne mit Deckel bereitstellen

und zur Herstellung einer feuchten Kammer 3 ml
Wasser in die Wanne geben.

12
Vorbereitung des Streifens:

n Die Nummer der Untersuchungsprobe auf dem

dafür vorgesehenen Teil der Inkubationswanne
notieren.
n Den Streifen aus der Verpackung nehmen und in
die Inkubationswanne legen.

Keimsuspension
Die Bakterien im Suspensionsmedium
sorgfältig homogenisieren.

Ein Röhrchen mit 3 ml sterilem Aqua dest.

Trübung: milchig

13
 Beimpfung des Streifens:

n Diese Suspension mit der Pasteur Pipette in die

Mikroröhrchen pipettieren.
Becherchen und Röhrchen füllen

Becherchen

Röhrchen füllen
Röhrchen

Beimpfen des API-Streifens

Paraffin

14
 Beimpfung des Streifens:

n Bei CIT Becherchen und Röhrchen füllen.

n Für die anderen Reaktionen nur Röhrchen füllen.

n Die unterstrichenen Reaktionen LDC, ODC, H2S

und URE hoch mit Paraffinöl überschichten.

n Die Inkubationswanne schließen und bei 37°C/ 24

Stunden inkubieren.

Die Oxidasereaktion nach folgender

Methode prüfen:

a) 1 Tropfen Oxidasereagenz auf die Bakterienkolonie geben.

b) Bei positiver Reaktion tritt innerhalb von 1-2 Minuten eine dunkle blau-
violette Färbung auf.
C) Die Oxidasereaktion auf dem Ergebnisblatt als 11. Test notieren.

positive Reaktion
•negative Reaktion

15
Auswertung

Reagenzien eintropfen

16
API 10 S

Auswertung der Übungsstämme

Aeromonas hydrophila

17
Citrobacter freundii

Escherichia coli

18
Klebsiella pneumoniae

Proteus mirabilis

19
n ONPG: ß-Galactosidase spaltet o-Nitrophenyl-ß-D-Galactosid (ONPG)
und weist daher auf die Lactoseverwertungsfähigkeit hin. Es wird
gelbes o-Nitrophenol aus farblosem ONPG freigesetzt. Die
Gelbverfärbung weist auf die positive Reaktion hin.

n GLUCOSE und ARABINOSE: Der Verbrauch von Kohlenhydrat führt zur

Säurebildung und einem anschließenden pH-Rückgang. Der Indikator
Bromthymolblau schlägt von blau nach gelb um. Die Fermentation der
Kohlenhydrate setzt in dem am stärksten anaeroben Teil (Boden) des
Röhrchens ein. Diese Reaktionen werden deshalb im Röhrchen von
unten nach oben abgelesen.

n LDC: Lysindecarboxylase baut Lysin zu Cadaverin ab. Dieses Amin

bewirkt einen pH-Anstieg in dem säuregepufferten System und ein
Umschlagen des Indikators Phenolrot von gelb nach orange.

n ODC: Ornithindecarboxylase wandelt Ornithin in Putrescin (ein

basisches Amin) um. Dies bewirkt einen pH-Anstieg und ein
Umschlagen des Indikators Phenolrot von gelb nach rot.

n CIT: Der Citratverbrauch bewirkt einen pH-Anstieg und ein

Umschlagen des Indikators Bromthymolblau von grün nach blau. Die
Citratverwertung weist auf einen positiven Ablauf der Reaktion hin.

20
n H2S: Hier werden Bakterien nachgewiesen, die Schwefelwasserstoff aus
Thiosulfat bilden können. Schwefelwasserstoff reagiert mit Eisensalzen unter
Bildung eines schwarzen Präzipitates, die Lösung im Mikroröhrchen wird
schwarz.

n URE: Nachweis von Bakterien, die mit Hilfe der Urease Harnstoff in Kohlendioxid
und Ammoniak spalten können. Ammoniak bewirkt einen pH-Anstieg und ein
Umschlagen des Indikators Phenolrot von gelb nach rot. Jegliche Orange- oder
Rotfärbung weist auf den positiven Verlauf der Reaktion hin.

n TDA (Tryptophandesaminase) bildet aus Tryptophan Indolbrenztraubensäure, die

in Anwesenheit von Eisen-III-Chlorid einen bräunlich-roten Farbkomplex bildet.
Dies weist auf den positiven Reaktionsverlauf hin.

n IND: Der Abbau von Tryptophan führt zur Bildung von Indol. Indol und
Kovacs-Reagenz bilden einen gefärbten Komplex. Eine Rot- oder
Rosafärbung weist auf den positiven Verlauf der Reaktion hin. Die
Reaktion sollte innerhalb von 2 Minuten nach Zugabe des Reagenzes
abgelesen werden.

n NIT: Nitrite bilden mit Sulfanilsäure und N,N-Dimethyl-1-Naphthylamin

einen roten Komplex. Nach dem Ablesen der Glucose-Reaktion und
Kontrolle der Blasenbildung infolge der Nitratreduktion werden die
oben genannten Reagenzien zugesetzt. Bei positiver Reaktion tritt
Rotfärbung ein.

21
BETRIEBS- UND PERSONALHYGIENE

Abklatschverfahren

n Eine mikrobiologische Kontrolle aller Oberflächen, mit denen

Lebensmittel bei der Ver- und Bearbeitung, Verpackung und dem
Transport in Berührung kommen, ist unbedingt notwendig.
Maschinen, Geräte, Finger, Hände, Türklinken usw. sollen einer
Stufenkontrolle unterzogen werden.

n Die auf sämtlichen Oberflächen befindlichen Keime können durch

Abklatsch-, Abstrich- oder Abschwemmverfahren erfasst werden.

22
 Abklatschverfahren

n Beim Abklatschverfahren (Rodac-Platten, Replicate Organism Detection

and Counting oder Folien) wird eine Agarnährbodenfläche auf die zu
untersuchende Oberfläche gedrückt.

n Zu starkes Andrücken muß wegen möglicher Rißbildung im Agar

vermieden werden.

n Die Keime der Untersuchungsfläche bleiben weitgehend auf dem

Nährboden haften.

n Der Nährboden wird dann bebrütet. Die abgeklatschten

Mikroorganismen entwickeln sich zu Kolonien, die gezählt und
ausgewertet werden.

Abklatschverfahren

n Die Rodacplatte ist so konstruiert, daß eine überstehende, konvexe

Nährbodenfläche zur Verfügung steht, die mit der zu untersuchenden
Fläche in Berührung gebracht wird.

n Der Deckel der Schale drückt nicht auf die Agarschicht und läßt einen
genügenden Luftraum über.

23
 Methoden zur Resistenzbestimmung

n Bestimmung des Hemmhofdurchmessers

– Agardiffusionstest
n Bestimmung der minimalen
Hemmkonzentration (MHK, MIC)
– Dilutionstest
– E-Test

ANTIBIOGRAMM

n Die Resistenzprüfung von Erregern in vitro, auch

Empfindlichkeitsbestimmung genannt, ist deshalb
notwendig, weil die Empfindlichkeit vieler Bakterienarten
von Stamm zu Stamm wechselt und das Resistenzverhalten
nicht im voraus zu erkennen ist.

n Daraus ergibt sich die zwingende Notwendigkeit der

Resistenztestung zur vollständigen Befunderstellung.

24
 ANTIBIOGRAMM

n Durch die Testung erfolgt der Ausschluss jener Substanzen,

die schon in vitro nicht wirksam sind und damit für die
klinische Anwendung nicht in Frage kommen.

n Bezüglich der wirksamen Substanzen entscheiden dann

andere Parameter (Bioverfügbarkeit, Applikation, klin.
Aspekte, etc.) über deren Einsatz beim Patienten.

ANTIBIOGRAMM

n Eine Keimsuspension wird mittels eines Glasspatels

flächendeckend auf einem Nährboden aufgetragen.

n Mit einem Dispenser, der die Antibiotika-Testblättchen

enthält, werden diese Testblättchen auf den Agar
gedrückt.

n Die Probe wird nun 24 Stunden bei 37°C bebrütet und

dann ausgewertet.

25
 Agardiffusionstest

n Die Antibiotika diffundieren von dem aufgelegten imprägnierten

Filterpapierplättchen in das Agar und bewirken je nach Wirksamkeit
eine Hemmung des Bakterienwachstums um das Testplättchen
(Hemmhof).

n Bei Unwirksamkeit der Testsubstanz kommt es zu einem ungehinderten

Bakterienwachstum.

n Abhängig von der Größe des Hemmhofes und der

Wirkstoffkonzentration werden die Ergebnisse in "sensibel" (oder
empfindlich), "mäßig sensibel" und "resistent" (oder unempfindlich)
unterteilt.

Antibiotikaplättchen

n OXACILLIN OX

n CEFAZOLIN CZ

n TEICOPLAMIN TEC

n NORFLOXAIN NOR

n AMPICILLIN AM

n CEFLAZIDIM CAZ

26
E. coli

27
 Kl. pneumoniae

Dilutionstest
Beim Reihenverdünnungstest wird eine geometrische Verdünnungsreihe des
Antibiotikums hergestellt.
In die einzelnen Röhrchen der Verdünnungsreihe werden gleiche Mengen der
zu prüfenden Bakteriensuspension gegeben. Nach der Bebrütung wird
festgestellt, bei welcher minimalen Antibiotikum-Konzentration kein
makroskopisch sichtbares Bakterienwachstum mehr stattgefunden hat (MHK).

28
 Epsilometer-Test

DO
BESTIMMUNG DER KEIMZAHL VON
OBERFLÄCHEN UND LUFT

n Ü7: BESTIMMUNG DER KEIMZAHL VON OBERFLÄCHEN

(GRUPPENBEISPIEL)

n Ü8: BESTIMMUNG DER LUFTKEIMZAHL

(GRUPPENBEISPIEL)

n Ü 9: ANLEGEN EINES ANTIBIOGRAMMS

(GRUPPENBEISPIEL)

29
DO

Ü7: OBERFLÄCHE

n Verschiedene Oberflächen (Arbeitsplatz,

Sterilbank, etc.) werden mittels Rodac
Platten abgeklatscht.

n Inkubation: 37°C, 1d; Auszählen der KBE

n Ergebnis:.................................

DO

Ü8: LUFT

n Impaktion-Verfahren
n Die zu untersuchende Luft wird mittels eines Zentrifugalsammlers angesaugt
und durch einen Spalt auf einen im Inneren des Gerätes befindlichen
Nährbodenstreifen aufgeschleudert.
n Verwendetes Gerät: Biotest-Luftkeimsammler (Abscheidevolumen 40 l/min)
n Nährbodenstreifen in den Zentrifugalsammler einlegen
n ¯
n Zentrifugalsammler 1 min betreiben
n ¯
n Nährbodenstreifen entnehmen und inkubieren: 37°C, 1d
n ¯
n Auszählen der KBE
n Ergebnis: KBE/m3 = KBE x 1000:40 =...........................

30
DO

Ü9: ANLEGEN EINES ANTIBIOGRAMMS

0,1 ml einer Keimsuspension auf einer Agarplatte gleichmäßig mit einem Glasspatel verteilen und trocknen lassen.
¯
Mittels eines Dispensers werden die Antibiotikablättchen auf die Agaroberfläche aufgebracht.
¯
Inkubation: 37°C, 1 d
¯
Auswertung:

Antibiotikaresistenz ®ungehindertes Bakterienwachstum

Hemmung des Bakterienwachstums ®Hemmhofbildung
Ergebnis: Hofbildung
Antibiotikum: +/-
1...................................... ....................
2...................................... ....................
3...................................... ....................
4...................................... ....................
5...................................... ....................
6...................................... ....................

NICHT-KULTURELLE UND INDIREKTE

KULTURELLE METHODEN

31
 Gaschromatographie (GC) Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC)

n Die Erstellung chemotaxonomischer Profile (Aminosäuren,

Fettsäuren, Kohlenhydrate) bietet neue, genaue und schnelle
Identifizierungsmöglichkeiten von Mikroorganismen.

n Fermentierende Bakterien, insbesondere Anaerobier, bilden

als Endprodukte ihres Kohlenstoff- und Energiestoffwechsels
verschiedene organische Verbindungen, die sich in
Nährmedien wie aber auch in Eiter und Exsudaten anreichern
und mittels HPLC oder GC nachweisen lassen.

n Die Art und Menge dieser Endprodukte sind gruppen- und

speziesspezifisch und somit von großer diagnostischer
Bedeutung.

Gaschromatographie (GC) Hochdruckflüssigkeitschromatographie

(HPLC)

n Die Identifizierung von Bakterien mittels GC wird schon seit

langem zu diagnostischen und taxonomischen Studien
verwendet.

n Es handelt sich hierbei um den Nachweis eines

bakterienspezifischen Fettsäuremusters.

n Verschiedene Gattungen weisen unter standardisierten

Bedingungen ein gleichbleibendes, typisches Fettsäureprofil
auf.

n Die Art und Verteilung sowie die quantitativen Abweichungen

der vorliegenden Fettsäuren erlauben eine genaue
Charakterisierung der zu untersuchenden Mikroorganismen.

32
 Elektrophorese in der Diagnostik

Die elektrophoretische Differenzierung - in allen ihren

Variationen - und vor allem die Verwendung
elektrophoretischer Muster intrazellulärer löslicher Proteine,
deren Gehalt genetisch determiniert ist, führte in der
bakteriologischen Diagnostik zu einem zusätzlichen
Hilfsmittel in der Taxonomie der Mikroorganismen.

Elektrophorese in der Diagnostik

n Die gelelektrophoretische Auftrennung basiert auf der Abspaltung

eines Proteingemisches in seine Komponenten im elektrischen Feld
durch die unterschiedlichen Eigenladungen und Molekulargewichte
der einzelnen Fraktionen.

n Die Elektrophorese wird in verschiedenen Bereichen wie in der

medizinischen Diagnostik, der Lebensmittelanalyse, der Genetik
und der Mikrobiologie eingesetzt.

33
PCR

n Bei dieser 1985 zum ersten Mal publizierten Methode ist es

möglich, Nukleinsäuremoleküle millionenfach identisch zu
vervielfachen, dadurch können kleine Mengen von
Nukleinsäuren und sogar einzelne Moleküle spezifisch
nachgewiesen werden.

n Diese Technik basiert auf einem 3-Schritt-Zyklus, gestartet

durch eine Hitzedenaturierung der zu untersuchenden DNS
und deren Umwandlung von einem Doppelstrang in einen
Einzelstrang.

PCR

n Im zweiten Schritt der Reaktion werden spezifische kurze

Oligonukleotide (primer) in einer bestimmten Region an
beide Stränge der Startnukleinsäure hybridisiert.
n Die hybridisierten Oligonukleotide werden nun von einer
DNS-Polymerase durch Aneinanderfügen von Nukleotiden
zu einem neuen DNS-Strang verlängert, der komplementär
zur Ausgangssequenz ist.
n Durch Wiederholung dieser Vorgangsweise kann eine
millionenfache Kopie eines DNS-Moleküls erreicht werden.

34
 Impedanzmessung

n Bei der Impedanzmessung, ein indirekt kulturelles Verfahren, werden

mikrobiell bedingte Widerstands- oder Leitfähigkeitsänderungen gemessen,
die bei der Vermehrung von Mikroorganismen durch entstehende
Stoffwechselprodukte in einem Wachstumsmedium auftritt.

n Wachsende Mikroorganismen produzieren Stoffwechselprodukte, welche bei

einer Anreicherung in einem flüssigen Medium zur Änderung des elektrischen
Widerstandes führen.
n Die Leitfähigkeit nimmt zu bzw. der Widerstand ab.

n Diese Änderungen werden allerdings erst registriert, wenn sich vermehrende

Mikroorganismen eine Zellzahl von etwa 106- 107/ml erreicht haben.

Direkte Epifluoreszent-Filter-Technik (DEFT)

n Die DEFT stellt eine verbesserte mikroskopische Gesamtkeim- bzw.

Gesamtzellzahlbestimmung dar, wobei allerdings keine
Unterscheidungen zwischen toten und vermehrungsfähigen bzw.
stoffwechselaktiven Zellen möglich ist.
n Mikroskopische Zählung der in einem Nahrungsmittel vorhandenen
Mikroorganismen nach Filtration durch Vorbehandlung filtrierbar
gemachter Lebensmittelhomogenisate.
n Anschließend werden die auf dem Filter abgeschiedenen
Mikroorganismen mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt und im
Fluoreszenzmikroskop ausgezählt. Die Methode wird zur raschen
Keimzahlbestimmung innerhalb 30-45 min, insbesondere zur
mikroskopischen Rohstoff- und Verarbeitungskontrolle, eingesetzt.

35
 Limulus polyphemus

Das Aktives Zentrum des Hämocyanins von

Limulus polyphemus, dem Pfeilschwanzkrebs.

Limulus-Test (LAL)

n Der Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test (LAL) ist eine sehr rasche,

hochempfindliche Methode zum quantitativen und qualitativen
Nachweis von Lipopolysacchariden gramnegativer Bakterien
(Endotoxinen) in flüssigen und festen Lebensmitteln.

n Das Blut des Pfeilschwanzkrebses (Limulus polyphemus) gerinnt bei

einer Infektion mit gramnegativen Bakterien.

n Dabei kommt es zu einer Gelbildung zwischen Zellwandbestandteilen

(Lipopolysacchariden) dieser Bakterien und den Amöbozyten, den
einzigen Blutkörperchen des Limulus-Blutes.

36
 Limulus-Test (LAL)

n Die Amöbozyten enthalten Proenzyme und Agglutinationsenzyme.

n Bei Anwesenheit von Lipopolysacchariden werden die Proenzyme

aktiviert. Diese reagieren weiter mit den Agglutinationsenzymen unter
Gelbildung.

n Der Nachweis von Endotoxinen erfolgt aufgrund dieser Gelbildung.

n Der Nachweis von Endotoxinen erfolgt aufgrund dieser Gelbildung.

n Da zwischen der Endotoxinkonzentration und dem Keimgehalt eine

lineare Korrelation besteht, kann aufgrund des ermittelten
Endotoxingehaltes der Grad der Verunreinigung mit gramnegativen
Bakterien bestimmt werden

37