LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA II PRUEBAS BIOQUIMICAS

2011

Facultad:Ing. Industrial y de Sistemas

Escuela:Ing. de Agroindustrial

Curso:Laboratorio de Microbiologa II

Tema: Pruebas bioqumicas

Alumno:Dextre Tuya Christian Misael

Codigo:2008010751

ING. AGROINDUSTRIAL

ING.FLOR VSQUEZ NAEZ

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Introduccin...3 Objetivos.4 Pruebas bioqumicas....5 Concepto...5 Pruebas.....5 Prueba de oxidasa...6 Prueba de catalasa..6 Prueba de la Coagulasa..7 PruebaMI.....8 Prueba TSI...9 Prueba LIA.10 Agar Citrato ,,,.11 Indol.,,,11 Rojo Metilo. 12 VoguesProskauer.13

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A BA B B L GA A

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INDICE

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Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de multiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. Adems estudiaremos los resultados que estos test arrojan, comparando resultados experimentales entre los distintos grupos de trabajo de nuestro laboratorio.

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Introduccin

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Objetivos
y

Realizar el experimento adecuadamente y poder identificar -aplicando ste mtodo- distintos microorganismos. Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas bioqumcas es o son el (los) adecuado(s) de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar. Entender los principios bioquimicos de las pruebas. Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por laspruebasbioqumias Conocer el uso de las pruebas bioqumicas para la identificacin de microorganismos Identificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder reconocer en que partes del procedimiento se cometi el o los errores, para as, mediante el desarrollo experimental conocer mas profundamente las pruebas bioqumic as.

y y

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I)

Las pruebas bioqumicas observan los niveles de substancias y enzimas especficas que son producidas por reacciones qumicas en el cuerpo. Los desrdenes metablicos con frecuencia son el resultado de una enzima que falta o que no funciona. Cuando falta una enzima, o cuando sta se presenta en cantidad reducida, o no funciona correctamente, el cuerpo no puede desempear sus reacciones qumicas usuales. Como resultado, pueden ocurrir varios cambios dainos en la bioqumica del cuerpo. Estas incluyen la acumulacin de substratos, la acumulacin de precursores, deficiencia de productos, y el redireccionamiento de substratos a vas alternas. Las pruebas bioqumicas observan los niveles de estos desordenes y pueden ser utilizadas para detectar varias condiciones metablicas diferentes.

II) PRUEBAS A) Prueba de la Oxidasa

El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina : el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a prpura.
Procedimiento:

Con un pequeo papel de filtro aadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algn cambio. Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo. Se considera positva esta prueba cuando toma un color prpura la muestra.

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PRUEBAS BIOQUIMICAS

CONCEPTO

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Resul a (+) P ( )E

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B) Prueba e la a alasa (-)E El i i li El i t i t l i t l j ti l l tili i l l t i i l li i t l

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i t l t i l (H2O2 -> H2O + O2).

Prodecimiento: A i l t i i l i i iti i t i i t t t ili t i l. ti l i t l l i i i t i j t lt l l t . i li i i l % t t l ,l

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Resultados: (+) St ( - ) St t l .

C) Prueba de la Coagulasa l j ti t i f l i l i t l l St l ti i . E t l . t li l l i tili i i i if i l l . El

Procedimiento: l , l. (cal cerebro corazon) , l. P e lasma e conejo en n t bo e ensayo reviamente esterilizado. a muestra ya contiene cepas de St. Aureus. apamos el tubo de ensayo con durante una ora, al odn idroflico y lo llevamos a bao ara a observando la muestra cada minutos. Al completa la ora, sacamos las muestras y observamos sus resultados. Resultados: Estratificaremos los resultados en distintos niveles:

: Pequeos cogulos no oganizados 2: Pequeos cogulos oganizados : Gran cogulo organizado : odo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.

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Se consideran positivos los niveles (+) Staphylococcusaureus ( - ) Staphylococcus epidermis.

y .

D) Prueba

IO ( otility-Indole-Ornitine

otilidad-Indol-Ornitina)

Esta prueba bioqumica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reaccin de Indol a la descarboxilacin de la ornitina. Procedimiento: Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a . Interpretacin y esultados: eaccin Enturbiamiento del Hay movilidad Agar. Agar transparente deNo hay movilidad sarrollo solo en picada Azul (alcalino) oloracin Amarilla (cido) ojo (anillos) Amarillo (anillos) escarboxilaornitina No descarboxila Indol (+) Indol ( - ) Interpretacin

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E)

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambien permite la identificacin de la produccin de SH2. Esta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de gnero en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:
y y y y y

Prodedimiento:

Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm.del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.
Resultados:
y

A estos resultados se les agrega el resu ltado de la produccin de gas.

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Prueba TSI Triple Su arIron Triple Azcar Hierro)

bacterias fermentadoras de la glucosa bacterias fermentadoras de la lactosa bacterias fermentadoras de sacarosa bacterias aerognicas bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgnicas que contengan azufre.

Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentacin de azucares. Caracterstica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonassp. Pico alcalino/fondo cido : fermentadas. Shigellaspp. lucosa fermentada,lactosa ni sacarosa

Pico alcalino/fondo negro : lucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de cido sulfhdrico. Salmonelaspp. Pico cido/fondo cido: lucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichiacoli.

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F)

Prueba LI (LysineIron gar gar Lisina ierro)

Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilacin o desaminacin de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es ms sensible que el SI para la deteccin de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros. Procedimiento: Inocular en forma de estra las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a . Interpretacin y Resultados: eaccin Azul (alcalino) ojo Engrecimiento uptura del Agar Fondo Amarillo y escarboxilacin de lisina endido prpura Interpretacin Hay movilidad No hay movilidad escarboxilaornitina No descarboxila

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G) Pruebas Bioqumicas IMViC: A ar Citrato

La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias . La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
Procedimiento:

Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4 das. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al azul.
Resultados:

(+)Klebsiellaspp. ( - ) EscherichiaColi

H) Indol

El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
Procedimiento:

Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este per odo, aadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.

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Resultados: (+) Escherichiacoli ( - ) Klebsiellapneumoniae

I) Rojo

etilo

na de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: a fermentacin cido -mixta y la fermentacin del 2, butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y O2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los O2. principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre , (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta. Procedimiento: Inocular el caldo ojo etilo con un cultivo puro de no ms de 24 horas del durante 48 horas. uego de microorganismo en estudio. Incubar a finalizado el tiempo de incubacin agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. a prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo ferment la glucosa por la va de cido mixta. n color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. Resultados: (+) Escherichiacoli ( - ) Enterobacteraerogenes

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J)

En la prueba de Voges -Proskauer se determina la va de fermentacin del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil -metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa -naftol dando un color rojo -fucsia.
Procedimiento:

Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa -naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxge no atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojo -fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona y por lo tanto una prueba VP positiva.
Resultados:

(+) Enterobacteraerogenes
Microor anismos utilizados en las Pruebas Bioqumicas MICROORGANISM O FAMI IA TINCIO N FORMA MOVI IDAD

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PSEUDOMO A SPP.

E TEROBACTE R E TEROBACTE R E TEROBACTE R E TEROBACTE R

BACILOS CORTOS, RAM CURVADOS O RECTOS RAM RAM BACILOS CORTOS BASTO CILLO S

POSEE LA ELOS POLARES LA ELOS PERTRICO S O TIE E

SALMO ELLA SHI UELLA SPP. ESCHERICHIA COLI

BACILOS LA ELOS CORTOS O RAM PERTRICO ESPORULADO S S RAM + COCACEA O TIE E

STAPHYLOCOCCU MICROCACEAE S AUREUS

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Grupo 2: Yuri

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Resultados Experimentales

Grupo 1: Sebastin Leyton - Carlos Vera

lvez - David uica

Grupo 3:

raciela Quintero - Carolina

Grupo 4: Carolina Iribarra - Jessica Pizarro

Oxidasa MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

PSEUDOMO A SPP. SALMO ELLA SHI UELLA SPP. ESCHERICHIA COLI STAPHYLOCOCCUS AUREUS

+ + + -

+ + + -

+ + + -

+ + + -

Catalasa MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

PSEUDOMO A SPP. SALMO ELLA SHI UELLA SPP. ESCHERICHIA COLI STAPHYLOCOCCUS AUREUS

+ + + +

+ + + + +

+ + + +

+ + + + +

Coagulasa MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

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Indol

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

ESCHERICHIA COLI

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Agar Citrato

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

ESCHERICHIA COLI

Vogues-Proskauer MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

ESCHERICHIA COLI

Rojo Metilo

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

ESCHERICHIA COLI

IA MICROORGAN ISMO(S) GRUPO 1 DETECTADO( S) GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

SALMO ELLA SHI UELLA SPP.

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MICROORGAN ISMO(S) GRUPO 1 DETECTADO( S) GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

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SUL HIDRIC SUL HIDRIC SUL HIDRIC SUL HIDRIC O O O O LUCOSA LUCOSA LUCOSA LUCOSA ERME TAD A I

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