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BOLETIM AGROPECURIO UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS

MTODOS PARA OBTENO DE POPULAO MONOSEXO NA PISCICULTURA

Boletim Agropecurio - n. 69 - p.1-27 Lavras/MG GOVERNO DO BRASIL

MINISTRIO DA EDUCAO UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS MINISTRO: Fernando Haddad REITOR: Antonio Nazareno Guimares Mendes VICE-REITOR: Ricardo Pereira Reis Diretoria Executiva: Marco Antnio Rezende Alvarenga (Diretor), Nilton Nagib Jorge Chalfun e Luiz Roberto Guimares Guilherme. Conselho Editorial: Marco Antnio Rezende Alvarenga (Presidente), Luiz Carlos de Oliveira Lima, Luiz Roberto Guimares Guilherme, Renato Paiva, Cludia Maria Ribeiro, Nilton Nagib Jorge Chalfun e Rilke Tadeu Fonseca de Freitas Consultoria Tcnica: Ana Tereza Mendona Viveiros - DZO/UFLA - Lavras/MG e Priscila Vieira Rosa Logato - DZO/UFLA - Lavras/MG. Secretria: Cludia Alves Pereira Estevam Reviso de Bibliografia: Mrcio Barbosa de Assis Reviso de Portugus: Amanda Jackeline Santos Silva Editorao Eletrnica: Luciana Carvalho Costa, Alzia C. Modesto Ribeiro, Christyane A. Caetano Impresso: Grfica/UFLA Marketing e Comercializao: Maria Aparecida Torres Florentino

EDITORA

O BOLETIM AGROPECURIO DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS tem o propsito de publicar informes tcnicos de interesse agropecurio. ENDEREO PARA CORRESPONDNCIA: EDITORA UFLA - Caixa Postal 3037 - 37200-000 - Lavras, MG. Telefax: (35) 3829-1532 Fone: (35) 3829-1115 E-mail: editora@ufla.br

SUMRIO
1 INTRODUO............................................................................................................ 2 MODIFICAO NA EXPRESSO SEXUAL......................................................... 2.1 Quanto ao Sexo...................................................................................................... 2.2 Quanto Determinao Sexual............................................................................ 3 INVERSO SEXUAL................................................................................................. 3.1 Linhagens Invertidas Monosexo pela Tcnica Hormonal.................................. 3.2 Supermachos.......................................................................................................... 3.3 Superfmeas........................................................................................................... 4 PRODUO DE MONOSEXO POR MANIPULAO CROMOSSMICA ... 4.1 Poliploidia............................................................................................................... 4.1.1 Triplides Puros e Hbridos......................................................................... 4.1.2 Tetraplides................................................................................................... 4.2 Haplides................................................................................................................ 4.3 Ginognese.............................................................................................................. 4.3.1 Produo de Ginognicos............................................................................. 4.4 Andrognese .......................................................................................................... 4.4.1 Produo de Linhagens Andrognicas........................................................ 4.4.2 Andrognicos e Supermachos...................................................................... 4.4.3 Andrognese e Conservao Gentica........................................................ 5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................... 5 6 8 8 9 10 13 15 15 17 18 20 21 21 22 24 24 25 25 26

MTODOS PARA OBTENO DE POPULAO MONOSEXO NA PISCICULTURA

Marcos Pinto Cesar1 Lus David Solis Murgas2 Rafael Venncio de Arajo1 Cristina Delarete Drummond2 1. INTRODUO
A obteno de lotes monosexo em peixes tem sido amplamente estudada, porm ainda pouco aplicada em cultivo comercial. Inmeras so as vantagens que se pode obter com a produo de lotes monosexo. Uma das vantagens obtidas no cultivo de peixes monosexo ocorre quando um dos sexos apresenta uma marcada superioridade na taxa de crescimento em relao ao outro. Contudo, dependendo da espcie, as tcnicas de controle dos sexos podem trazer outros benefcios, tais como: supresso da reproduo, conteno de gastos energticos com a atividade reprodutiva, uniformidade de tamanho na colheita, reduo dos efeitos da maturao sexual na aparncia e na qualidade da carne, bem como a diminuio dos riscos de impactos ambientais decorrentes do escape de peixes para os sistemas naturais (BEARDMORE et al., 2001). Para a obteno de um lote de peixes do mesmo sexo, novas tcnicas de controle de sexualidade tm sido estudadas e aprimoradas com objetivo de aumentar o potencial produtivo de determinadas espcies, as quais tambm permitem obter benefcios que viabilizaro caractersticas morfolgicas, fisiolgicas ou comportamentais de interesse econmico. No presente boletim so apresentadas e comentadas as principais biotecnologias genticas, atualmente aplicadas na piscicultura, para obteno de peixes monosexo. Inicialmente so abordadas as tcnicas relacionadas inverso sexual: neofmeas, neomachos, supermachos e superfmeas. Posteriormente, sero discutidas as tcnicas de produo de peixes por manipulao cromossmica: poliploidia, triploidia, haploidia, tetraplidia, ginognese e andrognese.
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Acadmico do curso de Zootecnia da Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx.P.3037 37200-000 Lavras/MG . Professor do Departamento de Medicina Veterinria da Universidade Federal de Lavras/UFLA.

A obteno e realizao dos mtodos de produo de linhagens de peixes estreis, monosexuais e com altos nveis de consanginidade so unicamente mtodos de manipulao cromossmica e hormonal, no tendo nenhuma ao de mutaes.

2 MODIFICAO NA EXPRESSO SEXUAL

As caractersticas sexuais e o sexo gonadal em peixes podem ser modificados pelo tratamento das ps-larvas com hormnio por um perodo varivel, iniciando na fase larval da maioria das espcies, quando as gnadas esto ainda em fase indiferenciada de organizao (Figura 1). A diferenciao sexual foi demonstrada inicialmente por Padao (1937) em truta arco-ris, mas a importncia do controle no processo de determinao de sexo nos peixes foi estabelecida com os estudos de Yamamoto (1953, 1955), investigando os mecanismos da determinao do sexo em peixes. Fatores determinantes da fisiologia e mecanismos envolvidos no processo de determinao do sexo em peixes, bem como o controle e a manipulao desta caracterstica pelo tratamento com hormnios, tem sido intensivamente estudado nas trs ltimas dcadas (DONALDSON & HUNTER, 1983; PANDIAN & SHEELA, 1995; PANDIAN et al., 1999; YAMAZAKI, 1983). As tcnicas de modificao das caractersticas sexuais nas prognies de peixe por tratamento com hormnios, difundidas como inverses de sexo , so atualmente reconhecidas como uma metodologia de grande utilidade para a produo de populaes monosexo, cuja importncia para o desenvolvimento da aqicultura pode ser demonstrada por vrios exemplos. Em algumas espcies, machos e fmeas apresentam diferentes taxas de crescimento que podem ser exploradas no processo de produo, com vistas obteno de maiores ganhos, tendo-se como exemplos: Em tilpias, os machos apresentam um crescimento mais rpido que as fmeas, devido a diferenas fisiolgicas especficas; Nos Bagres do canal, os machos crescem em taxas de 10 a 30% mais rpido que as fmeas da espcie; Em salmondeos, as fmeas se desenvolvem e crescem mais rapidamente do que os machos.

7 FIGURA 1 Processo de formao de gnadas em peixes, ovrios e testculos. Processo artificial de induo de modificaes na estrutura das gnadas por tratamento hormonal. XX-XY, ZW-ZZ mecanismo de determinao de sexo; F somatria dos fatores feminilizantes, M somatria dos fatores masculinizantes.

XX ou ZW ( F > M)

Indutor Feminino

Gnada Indiferenciada |

OVRIO

TESTCULO OVRIO XY OU ZZ ( M > F) Indutor Masculino | Gnada Indiferenciada TESTCULO

Fonte: Foresti & Foresti (2004).

O controle da proporo de sexo entre os peixes tambm pode ter aplicao no manejo do tamanho e do crescimento populacional nos tanques de criao. reconhecido pelos criadores que, as tilpias constituem um grupo extremamente prolfero e que a manuteno de um nmero excessivo de indivduos nos tanques pode tolher o desenvolvimento da populao. Assim, nesta espcie, a criao de linhagens monosexo pode determinar a obteno de boas taxas de crescimento. Durante o perodo da maturidade sexual, alguns salmondeos apresentam caractersticas especficas que determinam a deteriorao da qualidade da carne, reduzindo drasticamente o preo do produto. Neste caso, a produo de populaes monosexo femininas tambm tem se mostrado de grande aplicao, uma vez que estas apresentam maturao tardia, permitindo um melhor manejo do estoque, tornando a produo lucrativa (BYE & LINCOLN, 1986). De modo inverso, na produo dos populares peixes de briga ornamentais (Betta aplendens,Regan 1910), o interesse maior est na produo de linhagens monosexo machos, que so apreciados pela presena de nadadeiras de visual atrativo: ondulantes, bem desenvolvidas e em forma de vu (KAVUMPURATH & PANDIAN, 1992).

2.1 Quanto ao Sexo

Os peixes podem ser classificados como: Gonocricos (quando os sexos ocorrem separadamente nos indivduos); Hermafroditas (ambos os sexos esto presentes no mesmo individuo) e Unissexuados (espcies em que ocorre apenas o sexo feminino ou apenas o masculino). Em razo dessa ampla variao, machos e fmeas poderiam ser melhores definidos, respectivamente, como produtores de smen e de ovos (YAMAMOTO, 1969). Os gonocricos so divididos em indiferenciados e diferenciados. Nos indiferenciados, a gnada primordial inicia o desenvolvimento assemelhando-se a um ovrio, e depois uma parte dos indivduos tornam-se machos e a outra parte torna-se fmea. Nos diferenciados, a gnada diferencia-se em um testculo ou em um ovrio. O hermafroditismo dividido em trs tipos: sincrnico (onde os ovos e espermatozides maturam ao mesmo tempo); protognico (primeiro desenvolvem ovrio e posteriormente revertem para testculo); protandrmico (primeiro desenvolvem testculo e depois ovrio). Nos unissexuais, a reproduo natural por ginognese, onde o espermatozide do macho de uma espcie bissexual contribui apenas para a ativao do desenvolvimento do ovo, sem ocorrncia da singamia (YAMAZAKI, 1983).

2.2 Quanto Determinao Sexual

O sexo gentico ocorre na fertilizao pela combinao dos cromossomos provenientes do ovo e do espermatozide, sendo a determinao sexual definida como a soma dos genes responsveis pela formao das gnadas e de suas caractersticas. Esses genes podem estar espalhados pelo genoma ou estando a maioria deles concentrados em um par de cromossomos que, neste caso, so chamados de cromossomos sexuais. As determinaes sexuais podem ser do tipo: cromossmico, polignico e interao gentipo-ambiente (PIFERRER, 2001). A determinao cromossmica implica na presena de cromossomos sexuais, em que um par de cromossomos (denominados de heterocromossomos) acumula a maioria dos genes responsveis pelo desenvolvimento sexual e, com base em anlises citogenticas, inverso sexual e cruzamentos controlados, oito sistemas cromossmicos j foram descritos. Estes sistemas variam desde sistemas simples

como XX/XZ ou WZ/ZZ, at os mais complexos, envolvendo mais que um par de cromossomos sexuais ou diferentes nmeros de cromossomos, dependendo do sexo. Os peixes que possuem cromossomos iguais so chamados homogamticos, e heterogamticos quando so diferentes. No sistema polignico de determinao sexual, genes epistticos determinantes do sexo esto presentes tanto nos cromossomos autossmicos como nos heterocromossomos, e o sexo do embrio ser resultante da combinao dos fatores masculinos e femininos presentes no conjunto cromossmico herdado de cada parental (DONALDSON & HUNTER, 1983). Neste sistema, a proporo sexual macho:fmea ser diferente de 1:1. O controle gentico um dos principais determinantes do sexo, mas fatores ambientais, tais como temperatura, fotoperodo, salinidade e alta densidade de estocagem tambm possuem grande influncia no processo.

3 INVERSO SEXUAL
A manipulao de gametas, ovos e embries podem ser realizadas com maior facilidade em peixes do que em outros animais, porque eles geralmente apresentam fecundao e desenvolvimento externos. Valendo-se disso, consegue-se controlar o sexo fisiolgico dos peixes por meio da adio de hormnios esterides anabolizantes na sua dieta ou na gua em que vivem. A razo pela qual possvel controlar o sexo fisiolgico dos peixes que, enquanto o sexo gentico determinado por ocasio da fecundao, a determinao do sexo fisiolgico que acontece pelo desenvolvimento das clulas germinativas primordiais determinantes do sexo, mais tardia. No incio da embriognese, um peixe no nem macho nem fmea porque no possui ovrio, testculos ou outras caractersticas associadas aos sistemas reprodutores. Ao contrrio, um embrio de peixe possui precursores embriolgicos de ovrios e testculos (clulas germinativas primordiais) e, nesse estgio, um embrio totipotente podendo se desenvolver em macho ou fmea. Em determinado momento durante o desenvolvimento embriolgico (momento que especfico de cada espcie), um sinal qumico originado de um gene ou de um conjunto de genes informa ao tecido totipotente em que direo se desenvolver. Uma vez que isso ocorra e o tecido pr-gonadal complete seu desenvolvimento, o peixe se torna fisiologicamente macho ou fmea.

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Aps essa fase no mais possvel alterar o sexo fisiolgico, exceto por tcnicas radicais, tais como a cirurgia gonadal que tem mostrado pouco sucesso. Neste pequeno espao de tempo, que varia de espcie para espcie, durante o qual o sexo fisiolgico pode ser alterado, se um peixe ingerir ou absorver esterides anabolizantes, ele pode interferir diretamente no desenvolvimento das clulas totipotentes. Esta tecnologia tem sido muito pesquisada nas ltimas dcadas e vem sendo rotineiramente aplicada em programas de piscicultura envolvendo tilpias, salmondeos e ciprindeos. O conhecimento dos mecanismos que determinam a expresso do sexo nos peixes um pr-requisito fundamental para o desenvolvimento de estratgias efetivas na induo de alteraes na proporo sexual em uma espcie. Embora o sexo gentipo seja estabelecido no momento da fertilizao do vulo pelo espermatozide, a diferenciao do sexo fenotpico ocorre em etapas mais avanadas do desenvolvimento, sendo aps o perodo final de absoro do saco vitelnico e incio da alimentao (perodo da transio entre a alimentao endgena e exgena). Esse perodo varivel de espcie para espcie, contados em Graus Celsius Dias. Isto explicado devido os peixes serem pecilotrmicos, sendo que seu desenvolvimento est estreitamente relacionado com a temperatura da gua, portanto as medidas so dadas em unidades trmicas acumuladas (UTA). Deve-se lembrar que o tratamento com o hormnio apropriado, administrado em dosagem adequada durante a fase indiferenciada de desenvolvimento da gnada, condio determinante do sucesso da inverso sexual. Atualmente, mais de trinta diferentes hormnios naturais e sintticos tm sido usados por diferentes pesquisadores no estudo da inverso. O mais utilizado entre os andrgenos a 17 -metil-testosterona, e entre os estrgenos o 17 -estradiol. A inverso do sexo nem sempre 100% efetiva, sendo difcil at de ser conseguida em certas espcies. Dessa forma, o desenvolvimento de estoques com a totalidade de indivduos pertencentes a apenas um dos sexos pode ser feito pela combinao destas tcnicas com outras de cruzamento (MAIR et al., 1997).

3.1 Linhagens Invertidas Monosexo pela Tcnica Hormonal

A diferenciao sexual das gnadas bem expressiva no estgio de desenvolvimento e a inverso sexual pode ser facilmente obtida por meio do fornecimento de estrgenos ou andrgenos na alimentao.

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A produo de lotes de monosexo pela tcnica hormonal pode ser obtida de 2 modos: o DIRETO em uma etapa, ou INDIRETO em duas etapas. 1) Linhagens produzidas em uma etapa Altera-se o sexo fisiolgico dos peixes. As larvas e alevinos devem ser alimentados com rao contendo andrgenos (hormnios masculinos) ou estrgeno (hormnios femininos), ou mantidos por certo tempo em gua contendo concentraes diludas desses mesmos hormnios. O processo em uma nica etapa mais usado na produo de tilpias (Figura 2). Essa monosexagem de machos tem como finalidade impedir a reproduo precoce e descartar as fmeas que crescem mais devagar que os machos. Com essa finalidade, larvas de Tilpia do Nilo so alimentadas com rao contendo 40 mg de 17 metiltestoterona / Kg de dieta durante um perodo de 40 dias. Essa dosagem usualmente reverte de 90 a 99% das larvas em machos, dependendo do manejo e das condies ambientais. Na piscicultura de truta arco-ris, em que uma das finalidades a monosexagem para fmeas, as larvas indiferenciadas so alimentadas com rao contendo 20 mg de 17 -estradiol / Kg de dieta durante um perodo de 40 dias. Se acompanhado o manejo e a tcnica corretamente obtm-se normalmente 100% de fmeas revertidas.
FIGURA 2 Esquema geral do protocolo para a produo direta de linhagens invertidas de machos ou fmeas, em peixes com determinao do sexo tipo XX/XY.
ETAPA NICA: Produo direta de linhagens revertidas

FASE DE VIDA

Larvas Indiferenciadas

TIPO DE ESTERIDE SEXO FISIOLGICO SEXO GENTICO

ANDRGENOS MACHOS

ESTRGENOS FMEAS

Machos Revertidos Fmeas Revertidas ou Neomachos (XX) ou Neofmeas (XY) Machos Normais (XY) Fmeas Normais (XX)

Fonte: Almeida-Toledo et al. (1996).

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2) Linhagens produzidas em duas etapas para fmeas - Utilizada na obteno de matrizes capazes de produzir linhagens constitudas somente de fmeas, possuindo sistemas de determinao do sexo do tipo XX/XY. Neste caso, so utilizados hormnios andrgenos para produzir neomachos XX, que so obtidos em duas etapas, assim como mostrado na Figura 3. No possvel separar os neomachos ou machos invertidos XX dos machos normais XY pelas suas caractersticas sexuais externas. Assim, uma 2 etapa fazse necessria para realizar um teste de prognie, identificando os machos revertidos dos normais para separ-los. Com esta finalidade, so feitos cruzamentos entre casais de fmeas normais e machos tratados hormonalmente, em que cada famlia criada separadamente at que a descendncia possa ser sexada. Caso a descendncia se mostre constituda por 50% de fmeas e 50% de machos, o macho parental do tipo XY e deve ser descartado. Se, por outro lado, a descendncia for 100% fmeas, ento o macho parental testado um neomacho tipo XX e deve ser mantido porque estes tipos de matrizes serviro para a produo de linhagens monosexo de fmeas.
FIGURA 3 Esquema geral do protocolo para a produo de linhagens monosexuais de fmeas em espcies de peixes com sistema de determinao do sexo tipo XX/XY.
1. Etapa: Produo de linhagens de machos invertidos (XX) - Linhagens indiferenciadas Andrgenos Machos revertidos (XX) e Machos normais (XY)

2. Etapa de Prognie para identificao dos machos revertidos (XX) - Fmeas normais (XX) x Machos revertidos (XX) - Fmeas normais (XX) x Machos normais (XY) 100% de fmeas normais (XX) 50% de machos normais (XY) + 50% de fmeas normais (XX) Guardar Linhagens de Machos Revertidos (XX)

Fonte: Almeida-Toledo et al. (1996).

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3) Linhagens produzidas em duas etapas para machos - Utilizada para se obter matrizes que sejam capazes de produzir linhagens monosexo de machos em espcies com sistema de determinao do sexo tipo ZW/ZZ. As larvas devem ser revertidas sexualmente com estrgeno. Assim, so produzidas linhagens de neofmeas ZZ. O nico modo de diferenciar as neofmeas ZZ de fmeas normais ZW por meio do teste de prognie das fmeas, em que as neofmeas ZZ que produzem 100% de descendentes machos sero as matrizes que iro ser guardadas, pois so fmeas capazes de produzir linhagens monosexo de machos.

3.2 Supermachos
a reproduo realizada em peixes que apresentam sistemas de determinao do sexo tipo XX/XY. A obteno de linhagens monosexo de machos feita por meio da produo de matrizes de supermachos (machos que so YY em vez de XY). Observando a Figura 4 nota-se que a obteno de supermachos um dos mais eficientes mtodos de produo de machos. Em contrapartida, um mtodo demorado at a obteno do reprodutor desejado.
FIGURA 4 Esquema geral do protocolo para a produo de supermachos em espcies de peixes com sistema de determinao do sexo tipo XX/XY.
1. Etapa: Produo de linhagens de fmeas revertidas Larvas indiferenciadas Estrgeno Fmeas normais XX + Fmeas revertidas XY

2. Etapa: Teste de prognie para identificar fmeas revertidas Fmeas normais XX x Machos normais XY 50% Fmeas normais XX + 50% Machos normais XY 25% Fmeas normais XX + 50% Machos normais XY + 25% Supermachos YY

Fmeas revertidas XY x Machos normais XY

3. Etapa: Teste de Prognie para identificar os Supermachos Fmeas normais XX x Supermachos YY 100% Machos Fmeas normais XX x Machos Normais XY 50% Machos normais XY + 50% Fmeas normais XX Guardar as Linhagens de Supermachos YY

Fonte: Almeida-Toledo et al. (1996).

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A obteno de supermachos ocorre em 3 etapas: A primeira etapa deste programa consta da alimentao das larvas sexualmente indiferenciadas com rao contendo estrgeno, com a finalidade de produzir neofmeas ou fmeas invertidas. Ao fazer a sexagem, verifica-se que os peixes tratados com hormnio se enquadram em trs categorias: machos normais XY, fmeas invertidas XY e fmeas normais XX. Os machos e fmeas normais devem ser descartados, mas difcil separar as fmeas normais XX das fmeas invertidas XY examinando-se apenas as caractersticas sexuais externas. Ento se faz a segunda etapa, em que consta da realizao do teste de prognie, para identificao das fmeas revertidas XY e descarte das fmeas normais XX. Isto feito pelo cruzamento de cada fmea com um macho normal com cultivo de cada famlia em tanques individuais, at que a descendncia possa ser sexada. As fmeas que produzirem descendncia constituda por 50% de fmeas e 50% de machos, sero descartadas. As fmeas que produzirem 75% de machos e 25% de fmeas so neofmeas XY. E dos 75% dos machos, 50% so machos XY e 25% so os machos de interesse YY. Nesse ponto, os 25% de fmeas so descartadas e os 75% de machos (XY e YY) passaro por uma terceira etapa, como mostra o Figura 5.
FIGURA 5 Processo da formao de indivduos Supermachos (YY), por meio de tratamento hormonal em uma primeira fase e cruzamentos dirigidos, na segunda.
XY XX

XY

XX

XY

XY

XX XY 50% 50%

XX

YY 25%

XX 25%

XY 50%

XX

XY 100%

XX XY 50% 50%

Fonte: Foresti & Foresti (2004).

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No sendo possvel separar machos normais XY e supermachos YY pelo exame das caractersticas sexuais externas, faz-se uma terceira etapa em que realizado o teste de prognie para identificar os supermachos. Descartam-se as linhagens que produziram 50% machos e 50% fmeas, mantendo as que produziram 100% de machos, em que se sabe que so supermachos. Este mtodo de produo de supermachos utilizado em tilpias do Nilo, em que as matrizes de supermachos podem ser produzidas pela combinao das biotecnologias de inverso sexual e ginognese, j que so espcies com sistema de determinao do sexo tipo XX/XY.

3.3 Superfmeas
As matrizes de superfmeas (WW) possibilitam a produo de linhagens monosexo de fmeas em espcies em que o sistema de determinao do sexo do tipo ZW/ZZ. Para sua obteno, realizam-se trs etapas, sendo as mesmas para obteno dos supermachos, seguindo os mesmos procedimentos. Elas diferenciam-se apenas nos hormnios, pois onde eram feminilizantes agora so masculinizantes (andrgenos para inverso), e nas tipagens eram espcies do tipo XX/XY e agora so para espcies ZW/ZZ. Os testes de prognie tambm so os mesmos, que agora so feitos para separao das superfmeas que so machos invertidos ZW.

4 PRODUO DE MONOSEXO POR MANIPULAO CROMOSSMICA

Vrias tcnicas so descritas na literatura para produo de peixes haplides, triplides, tetraplides ou mesmo os que possuem apenas cromossomos maternos (ginognicos) ou paternos (andrognicos), como exemplificadas na Figura 6, em que esto acompanhadas de seus produtos e respectivas aplicaes de cada tcnica. H duas divises categricas nas tecnologias de alterao no nmero de cromossomos: Choques de Temperatura (ou trmicos) e Choques de Presso (ou hiperbricos).

16 FIGURA 6 Tipos de biotecnologias genticas aplicadas piscicultura.

Tipo de Biotecnologia TRIPLOIDIA PURA Produtos Obtidos Linhagens estreis Aplicaes em Piscicultura Controle da reproduo, Linhagens com maior sobrevivncia e crescimento Controle da reproduo, Linhagens com maior sobrevivncia e crescimento e resistncia a doenas Produo de ginogenticos e/ou Androgenticos haplides Produo de Linhagens monosexo de fmeas para casos de determinao do sexo tipo XX/XY; Produo de linhagens altamente endocruzadas; Identificao de sistema de determinao do sexo Produo de supermachos; Produo de linhagens altamente endocruzadas; Criopresevao do germoplasma Produo de linhagens invertidas; Produo de supermachos e superfmeas; Identificao do sistema de determinao do sexo Linhagens com caractersticas vantajosas codificadas pelo DNA transplantado

TRIPLOIDIA HBRIDA

Linhagens hbridas estreis

HAPLOIDIA GINOGNESE

Linhagens haplides Linhagens ginogenticas

ANDROGNESE

Linhagens androgenticas

INVERSO

Linhagens de neomachos e neofmeas

DNA RECOMBINANTE

Linhagens transgnicas

Fonte: Almeida-Toledo et al. (1996).

Choques de temperatura so aplicados aos ovos logo aps a fertilizao (cerca de 5 10 minutos), sendo chamados choques precoces. J os choques de presso so aplicados aos ovos decorridos tempos maiores aps a fertilizao (cerca de 60 90 minutos), sendo chamados choques tardios. A finalidade do choque precoce atuar na meiose, bloqueando a eliminao do segundo corpsculo polar do ovcito. J o choque tardio, interferir no incio da mitose, impedindo a primeira clivagem do zigoto que se tornaria um embrio com duas clulas. Em algumas estaes de piscicultura, utiliza-se o choque trmico e no o hiperbrico, pois a aparelhagem para manuteno de temperaturas constantes oferece maior segurana para os operadores, alm de possibilitar o trabalho com volumes

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maiores de ovos. Nos choques de presso so usados cilindros hidrulicos de ao inoxidvel, sendo bastante caros, comportando volumes reduzidos e operando por vrios minutos em altas presses que oscilam por volta de mil psi (psi = libra por polegada quadrada), ocorrendo muitas vezes riscos de rompimento. Embora possam se utilizar tanto os choques trmicos quentes quanto os frios, os quentes produzem melhores resultados em espcies de guas frias e os frios em espcies de guas quentes. Deve-se lembrar que o tipo, a intensidade e a durao do tratamento trmico so peculiares para cada espcie. Na verificao do sucesso da manipulao cromossmica, vrias tcnicas podem ser usadas: Em primeiro lugar, sendo o mais laborioso, contar o nmero de cromossomos; Um segundo mtodo medir o tamanho dos ncleos dos eritrcitos, isto , coram-se esfregaos de sangue com Giemsa e mede-se ao microscpio ptico o eixo maior do ncleo dos eritrcitos; Um terceiro mtodo a medio do volume nuclear do eritrcito, rotineiramente realizado nas pisciculturas norte-americanas produtoras de carpas capim triplides com o auxlio do aparelho Coulter Counter Channelyzer, sendo caro porm bastante eficiente e rpido; Um quarto mtodo consiste na determinao do contedo de DNA do ncleo dos eritrcitos por citofotometria de fluxo; Um quinto mtodo pela colorao de um esfregao de sangue por nitrato de prata, em que contado o nmero mximo de nuclolos existentes nos ncleos dos eritrcitos; Uma sexta tcnica pode ser pela realizao da eletroforese.

4.1 Poliploidia
Com a manipulao do nmero de cromossomas do genoma consegue-se obter peixes poliplides. Fazendo-se a fertilizao normal seguida da reteno do segundo corpsculo polar nos ovcitos, obtm-se vulos triplides (Figura 7) que apresentam trs conjuntos cromossmicos, dois de origem materna e um de origem paterna. Os ovcitos triplides so freqentemente viveis e de aparncia normal.

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Se for impedida a realizao da primeira diviso de clivagem do embrio, tendo acmulo dos conjuntos de cromossomos duplicados, sero originados indivduos tetraplides (Figura 7) com quatro conjuntos cromossmicos.
FIGURA 7 Processo de desenvolvimento e obteno de peixes triplides e tetraplides, utilizando choques de temperatura ou presso, para reteno do segundo corpsculo polar, no caso da triploidia, ou no impedimento da realizao da primeira diviso de clivagem do embrio, no caso da tetraploidia.

Fonte: Tabata et al. (2000).

4.1.1 Triplides Puros e Hbridos As vantagens da produo dos triplides so possurem maior crescimento que os diplides e serem estreis (no se reproduzem, auxiliando no manejo). Ocorrem dois tipos de triploidia: - Os Triplides Puros, tambm chamados de autotriplides e triplides intraespecficos, no qual so formados por trs conjuntos haplides de cromossomos provenientes de uma mesma espcie. - Os Triplides Hbridos, tambm designados como autotriplides ou triplides interespecficos, no qual so formados por dois lotes haplides de cromossomos de uma mesma espcie e por um outro lote de outra espcie.

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Produo Os triplides so obtidos logo aps a fertilizao comum, quando os ovos so submetidos a choques trmicos (Tabela 1) (sabendo-se que por ocasio da desova, as fmeas eliminam o que comumente se costuma chamar de ovas ou vulos , mas na realidade so ovcitos secundrios). Estes vulos eliminam o segundo corpsculo polar somente aps terem sido fertilizados. Porm, se um vulo recm-fertilizado for submetido a um choque trmico, o segundo corpsculo polar no ser eliminado. Em conseqncia, o ovo resultante ir conter trs ncleos haplides: um que o pr-ncleo do vulo , outro o pr-ncleo proveniente do espermatozide, e o outro o ncleo do segundo corpsculo polar. Os trs haplides se fundem para formar um zigoto triplide que, por sua vez, produzir um peixe triplide.
TABELA 1 Valores otimizados para induo de triploidia por choques trmicos em algumas espcies usadas na piscicultura brasileira.
Espcie Bagre africano Bagre do canal Carpa capim Carpa comum Tambaqui Tilpia do Nilo Truta arco-ris Incio do choque (minutos) 4 5 4 10 2 7 25 Temperatura do choque (C) 5 5 42 0 0,2 39 9 26 Durao do choque (minutos) 40 60 1 30 3 30 20 Frequncia de triplde (%) 8 100 100 67 95 12 100 100 Taxa de ecloso (%) 9 40 79 72 52 82 86 87

Fonte: Cyrino et al. (2004).

Otimizao A temperatura exata e a durao do choque trmico, que so necessrias para a produo de triplides, devem ser estabelecidas inicialmente por tentativa de erro, que alguns graus mais frios ou mais quentes que a temperatura normal de cada espcie. O tempo exato em que o choque deve comear e terminar depende do tempo aps a fertilizao, no decorrer do qual o segundo corpsculo polar eliminado, devendo comear antes do evento da eliminao e continuar por tempo suficiente at que seja improvvel a extruso do segundo corpsculo polar.

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Reconhecimento Em relao morfologia externa, os triplides puros e os diplides geralmente no possuem diferenas significativas. A nvel celular que se encontram as diferenas mais marcantes, pois o tamanho dos ncleos e das clulas dos triplides cerca de um tero maior que dos diplides. A maneira mais fcil para identificar triplides de peixes atravs da medida dos eixos maiores dos eritrcitos em esfregaos de sangue corados por Giemsa. Outros procedimentos para o reconhecimento so as seis tcnicas j citadas, que verificam o sucesso da manipulao cromossmica. Interesse Os triplides tm despertado interesse na piscicultura por dois motivos: o de apresentar maior crescimento em peso e comprimento, e por serem estreis. Sob aspecto terico, espera-se que os triplides sejam maiores que os diplides, pois suas clulas contm 33% a mais de informao gentica. 4.1.2 Tetraplides Tetraplides apresentam quatro conjuntos haplides de cromossomos no lugar de dois lotes normais. Eles podem ser produzidos por choque hiperbrico tardio, que bloqueia a primeira diviso mittica de um zigoto diplide (Figura 8). Desse modo, foram produzidos em 1984 salmondeos tetraplides de primeira gerao, em que mostraram taxas de ecloso variando de 5% a 80% e taxas de sobrevivncia e crescimento bastante baixas (CHOURROUT, 1987; THORGAARD, 1992). O interesse potencial dos tetraplides em projetos de piscicultura, no qual usado para a produo de triplides interplides estreis, faz com que a tcnica de produo elimine a necessidade de se produzir triplides pelos mtodos convencionais de choques trmicos precoces. Entretanto, os cruzamentos tanto de machos como fmeas de linhagens tetraplides com diplides produzindo descendncia chamada de triplide interplide, possuem taxas de fertilizao reduzidas, pois os espermatozides possuem dificuldade de penetrao nas micrpilas dos vulos que apresentam dimetros no suficientes para a realizao da fecundao. Atualmente, a tecnologia de tetraplodia se encontra restrita apenas ao nvel experimental, no tendo sido ainda includa na rotina de projetos de piscicultura. Somente trabalhos futuros diro sobre as reais possibilidades dos peixes tetraplides na rea aplicada.

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4.2 Haplides
So organismos que apresentam somente um lote de cromossomos. Como possui um nico conjunto cromossmico, qualquer gene com efeito detrimental (deletrio) ir se manifestar e, como tal, pouco provvel que a maioria dos haplides sobreviva durante muito tempo. De fato, prticas laboratoriais comprovam a baixa sobrevivncia destes peixes (CHOURROUT, 1987). Uma das tcnicas de produo dos haplides consiste na fertilizao dos vulos com espermatozides que tiveram seu material gentico destrudo (por raios X, raios gama, produtos qumicos ou radiao UV). Esses espermatozides permanecem mveis e aptos para fertilizarem e ativarem os vulos que, uma vez ativados, iniciam o desenvolvimento embrionrio (mesmo que o espermatozide fecundante no mais transporte genes funcionais). O espermatozide inativado, no contribui com seu material gentico. Portanto, os alelos contidos no ncleo haplide do vulo so os nicos a fazerem parte do ncleo do zigoto . Os embries assim produzidos so ginogenticos haplides, pois todo seu material gentico de provenincia materna. Outro modo de produzir haplide destruindo o material gentico dos vulos com raios X ou raios Gama e fertiliz-los com espermatozides normais. Como o gene haplide do espermatozide o nico que contribui para o genoma do zigoto, o embrio ser haplide. Neste caso, o embrio ser androgentico haplide, pois seu material gentico proveniente exclusivamente do parental paterno. Portanto, sob o ponto de vista prtico, importante conhecer como produzir os haplides, pois constituem o primeiro passo para a produo de peixes ginogenticos e androgenticos diplides.

4.3 Ginognese
Ginognese ou herana materna completa, termo identificado pela prpria raiz etimolgica, o processo de trazer existncia um ser somente a partir da fmea . Na prtica, em peixes e outros organismos possvel produzir uma descendncia a partir de uma fmea madura, sem que haja contribuio gentica paterna (PURDON, 1993). A tcnica para produzir vulos ginogenticos (Figura 8) requer a inativao do genoma paterno e a diploidizao do material gentico da fmea no zigoto, por

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um processo induzido por agentes fsicos ou qumicos, no qual a determinao do sexo do tipo XX/XY, em que fmeas so homogamticas (XX) e todos os ginogenticos sero fmeas. Esse processo tem duas grandes aplicaes potenciais em piscicultura: a primeira no controle da proporo sexual pela produo de linhagens monosexo fmeas, e a segunda a rpida produo de linhagens altamente consangneas.
FIGURA 8 Processo natural de desenvolvimento em peixes e processos de obteno de indivduos ginognicos, utilizando irradiao de espermatozides e choques de temperatura ou presso, para reteno do segundo corpsculo polar.

Representao Esquemtica da Ginognese

Fonte: Tabata et al. (2000).

4.3.1 Produo de Ginognicos H trs tcnicas de produzir linhagens ginogenticas: 1 Ginognicos meiticos Essa primeira maneira ativando os vulos com espermatozides que tiveram seu material gentico destrudo por raios X, raios Gama (em geral usando fonte de CO) ou radiao UV. A radiao gama preferencial por obter maior poder de penetrao, mas deixa fragmentos cromossmico na descendncia. No entanto, utiliza-se mais a inativao dos espermatozides por UV.

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Inicialmente o esperma diludo de modo que possa ser espalhado numa camada bem fina em uma placa de vidro e exposto a uma fonte de UV de uma lmpada germicida. Grande nmero de vulos podem ser fertilizados quando colocados diretamente na placa de vidro na qual feita a inativao dos espermatozides. Normalmente, com exposies apropriadas radiao UV, nenhum fragmento cromossmico paterno permanece nos espermatozides. importante lembrar que h a possibilidade de alguns dos peixes produzidos pelo mtodo acima descrito ser diplide normal, visto que espermatozides no-inativados tambm podem fertilizar os vulos . Para evitar esse tipo de ocorrncia, alguns pesquisadores usam espermatozides de outras espcies, por saberem que produziro embries hbridos no-viveis. Aps a ativao dos vulos , estes so submetidos a choques precoces para impedir a eliminao do segundo corpsculo polar (Figura 8 e 9), em que os ovos assim produzidos contero dois ncleos haplides: o ncleo do vulo e o ncleo do segundo corpsculo polar. Estes dois ncleos iro se fundir formando um ncleo diplide que contm os dois conjuntos de cromossomos originados do parental materno.
FIGURA 9 Esquemas gerais dos protocolos para produo de linhagens de peixes poliplides, ginognicos e andrognicos.
1. Produo de Linhagens Poliplides
CTP TRIPLIDE | ESPERMATOZIDES + VULOS OVOS | CHT TETRAPLIDES

2. Produo de Linhagens Ginognicas e Andrognicas

CTP GINOGNTICOS MEITICOS | Espermatozides + vulos OVOS inativados por UV | CHT GINOGNICOS MITTICOS ESPERMATOZIDES + VULOS OVOS inativados por Co | CHT ANDROGNICOS

CTP = choque trmico precoce; CHT = choque hiperbrico tardio; UV = fonte de ultravioleta; Co = fonte de cobalto Fonte: Almeida-Toledo et al. (1996).

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2 Ginognicos mitticos Essa segunda tcnica para produzir peixes ginognicos, se inicia do mesmo modo que os meiticos: Numa primeira etapa, os vulos so ativados por espermatozides que tiveram seu material gentico destrudo por radiao, produzindo assim ginogenticos haplides. Quando o zigoto haplide inicia a primeira clivagem dado um choque tardio que bloqueia a metfase da primeira diviso mittica. Desse modo, os dois ncleos haplides fundem-se e formam um zigoto diplide com dois lotes cromossmicos provenientes do parental materno. Estes ginognicos mitticos produzidos pela supresso da primeira clivagem so homozigotos para todos os seus locos e apresentam 100% de consanginidade, mas deve-se lembrar que apresentam baixas taxas de sobrevivncia (em torno de 1,5%) devido expresso dos genes detrimentais recessivos, que podero se apresentar em maior ou menor quantidade nessas linhagens. 3 Consiste na fertilizao do vulo de fmeas tetraplides com espermatozides, cujo DNA tenha sido inativado por radiao. Como as fmeas tetraplides produzem vulos diplides, no h necessidade dos vulos serem submetidos a choques precoces para a produo do complemento cromossmico diplide. Embora esses tipos de ginognicos sejam consangneos por definio, apresentam nveis consideravelmente maiores de heterose do que os ginogenticos produzidos a partir de parentais maternos diplides, pois conhecido que esse tipo de ginogentico apresenta pouca reduo nos nveis de heterozigose.

4.4 Andrognese
A andrognese consiste na produo de linhagens que apresentam somente o genoma paterno, contrrio a ginognese que possuem somente o genoma materno. 4.4.1 Produo de Linhagens Andrognicas Linhagens andrognicas podem ser obtidas de duas tcnicas, sendo que a mais aceita e usada pela fecundao do vulo , cujo material gentico tenha sido destrudo por raios X ou raios Gama com um espermatozide normal; obtendo-se desse processo um androgentico haplide.

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Quando o zigoto androgentico haplide sofre a primeira clivagem mittica, dado um choque hiperbrico tardio para impedir a diviso celular, em que os dois ncleos haplides se fundiro para formar um ncleo diplide. Todos os cromossomos do peixe androgentico provm do parental paterno, e os peixes produzidos so altamente consangneos. Como o complemento cromossmico diplide provm de um nico lote que se autoduplicou, os nveis de homozigose e de consanginidade so da ordem de 100%, tendo essas linhagens taxas de sobrevivncia ao redor de 5%, devido expresso dos alelos serem recessivos detrimentais. Outra tcnica consta na fertilizao do vulo que teve seu material gentico destrudo por radiao com espermatozide de machos tetrapides, pois os tetraplides produzem espermatozides diplides, fazendo com que os zigotos resultantes sejam diplides. Essa tcnica teve sucesso em 1990 nos EUA em truta arco-ris androgenticas (TABATA et al., 2000). 4.4.2 Andrognicos e Supermachos Quando ocorre a sobrevivncia dos androgenticos at o perodo da primeira maturao sexual, eles so utilizados para a produo de supermachos (YY) nas espcies cujos sistemas de determinao do sexo sejam do tipo XX/XY. Neste caso, os machos so heterogamticos fazendo com que metade dos androgenticos produzidos seja supermachos. 4.4.3 Andrognese e Conservao Gentica Tratando-se da manuteno do germoplasma e conservao da espcie, os androgenticos possuem um considervel potencial de interesse no qual, pela andrognese, consegue-se recuperar o material gentico de espcies, cujas amostras de esperma tenham sido criopreservadas em bancos de germoplasma. Portanto, como a preservao de vulos de peixes ainda no satisfatria, a nica via prtica para a estocagem e recuperao gentica na rea ictiolgica fertilizar vulos recm-obtidos com esperma criopreservado, usando-se a andrognese.

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5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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