Metode de analiz a amidonului, enzimelor i hidrolizatelor de amidon

Cercettor post-doctorand Dr. Ing. Monica MIRONESCU Tutore Prof. Dr. Biol. Letiia OPREAN

Obinerea produilor de bioconversie enzimatic a amidonului

Surse de amidon: Cartof, porumb, gru ... Reziduuri alimentare Amidon Gelatinizare Lichefiere
Enzime de lichefiere

Amidon lichefiat / Maltodextrine

Enzime de zaharificare

Bioconversia enzimatic

Zaharificare

Hidrolizate de amidon (siropuri de glucoz, maltoz)

Enzime de inversie

Siropuri de fructoz

Metode de analiz
1. Metode de analiz a amidonul 2. Metode de analiz a enzimelor amilolitice 3. Metode de analiz a hidrolizatelor de amidon

Metode de analiz a amidonului

Determinarea caracteristicilor fizico-chimice; Umiditatea, pH-ul, coninutul amidon, proteine, lipide, cenua, caracterul reductor; Determinarea capacitii de mbibare (de reinere a apei) a amidonului; Determinarea solubilitii amidonului la diverse temperaturi; Comportamentul reologic a amidonului i determinarea capacitii amidonului de formare a gelului; Analiza cromatografic a amidonului; Analiza microscopic a granulei de amidon

Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor

12
porumb
8 7 6 5 4 3 2 porumb cartof

10 8 6 4 2 0 Umiditate, %
%

cartof

1 0 pH la 20C

Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor

91 90,5 90 89,5 89 88,5 88 87,5 87 %

0,4

porumb
cartof

0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 %

porumb
cartof

Amidon, %

Cenu, %

Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor

1,2

porumb
1

cartof
0,8 0,6 0,4

0,2 0

Caracter reductor, %

Capacitatea de mbibare a amidonurilor

Capacitatea de mbibare, % Amidon 50oC 2,2 0,2 60oC 2,9 0,16 80oC 11,9 0,12 90oC 15,3 0,18

Porumb

Cartof

3,0 0,15

18,0 0,15

36,5 0,14

100 -0,08

Comportamentul reologic
Curba de viscozitate
104
100

103

90

102

80

III IV

V
70

101 , Pa. 100 s

60

T, C

II
50

10-1 40 10-2

I
30 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

10-3 0

Time, s

20

Curbe de viscozitate pt. amidon porumb

Cerestar C*Gel
10
3

80 C

Pas

75

10

70

65

Cerestar 25% 75C 30s-1 1 ST 24

10
1

60

Viskositt Temperatur

55

Cerestar 25% 75C 30s-1 2 ST 24

10

50

Viskositt Temperatur

45

Cerestar 25% 75C 30s-1 3 ST 24

10

-1

40

Viskositt Temperatur

35

10

-2

30

25

10

-3

100

200

300

400
Zeit t

500

600

700

800

900

20 1.000

Anton Paar GmbH

Curbe de viscozitate pt. amidon porumb

Cerestar C*Gel

10
Pas

80 C

75
3

Cerestar 25% 75C 30s-1 2 ST 24

10

70

Viskositt Temperatur

10

65

C*Gel 25% 75Cmit Pregelatinisation 30s-1 1 ST 24

60
1

Viskositt Temperatur

10

C*Gel 25% 75Cmit Pregelatinisation 30s-1 2

55
T

ST 24 Viskositt Temperatur

50

10

C*Gel 50% 75Cmit Pregelatinisation 30s-1 1

45

ST 24 Viskositt Temperatur

10

-1

40

C*Gel 50% 75Cmit Pregelatinisation 30s-1 2 ST 24

35

Viskositt Temperatur

10

-2

30

10

-3

25
0
200
400
Zeit t
Anton Paar GmbH

600

800

1.000

Msurtori dinamice de viscozitate

Rheoplus

10

10

Pa

10

Pas

10

10

C*Tex 40% freq sweep winkel 0,5 2

10

-1

CP 50-2 G' G'' Speichermodul Verlustmodul Betrag(Viskositt)

10

-2

10

| *|

Remy B7 40% freq sweep winkel 0,5 1

G'

CP 50-2

10
G''

-3

|*|

G' G'' | *|

Speichermodul Verlustmodul Betrag(Viskositt)

10

-4

C*Gel 50% freq sweep winkel 0,5 7

CP 50-2 G' Speichermodul Verlustmodul Betrag(Viskositt)

10

-5

G'' | *|

10

-6

0,1

10

-7

10

-8

10

-2

10

-1

10
Kreisfrequenz

10

1/s

10

10

-2

Anton Paar GmbH

SEC

Analiza cromatografic a amidonului prin SEC

- Coloana umplut cu un material (faza static) - Eluentul (faza mobil) - Proba (Componente cu M diferite)

Separare dup volumul hidrodinamic

Vh = f( Masa molecular, conformaie) Vh = []*M

Detaliu separare

SEC a amidonului de porumb

100 80

1b

RI output signal (volt)

60 40 20 0 -20

Ib

IIb

IIIb IVb

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Elution time, min.

Caracteristicile metodei: eluent DMSO; vol. injecie 50 l; temperatura 60oC; rata de curgere eluent 0,4 ml/min (Mironescu, 2007)

Analiza

microscopic

amidonului

Granule de amidon de cartofi

Granule de amidon de porumb

Analiza microscopic a amidonului

30oC 60oC 70oC

90oC

Metode de analiz
1. Metode de analiz a amidonul 2. Metode de analiz a enzimelor amilolitice 3. Metode de analiz a hidrolizatelor de amidon

Metode de amilolitice

analiz

enzimelor

Metode de det. a activitii enzimatice Principiul general de determinare: dozarea substratului rmas sau a produilor formai

Activitatea enzimatic
UI =numrul de micromoli de substrat transformat sau de produs rezultat pe minut n condiii bine definite. cnd substratul este amidon (cu MM nedefinit), se produce un amestec de oligozaharide UI : numrul de micromoli de legturi

hidrolizate pe minut.

Det. numrului gruprilor reductoare

A- metode colorimetrice; B- metode cromatografice; C- metode enzimatice; D- metode fizice; E- metode de dozare volumetric.

Det. numrului gruprilor reductoare prin metode colorimetrice

Metode ce folosesc 3 reactivi:
cupru alcalin fericianur alcalin 3,5 dinitrosalicilat alcalin (Metoda Miller)

Tb. specificat sustratul folisit pt. det. activitii enzimei:

amidon nativ, amidon solubil, amiloz, dextrine limit compui speciali: pentazaharidul substituit la ambele capete cu indol i naftalen (INdp5)

Det. numrului gruprilor reductoare prin metode colorimetrice

Determinarea activitii enzimatice la -amilaze cu micrometoda cu cupru 2,2 bicinchoninate
(Yook and Robyt, 2002)

Substrat: amidon Citirea absorbiei la 570 nm Etalon: maltoza UI: l de legturi glucozidice rupte pe minut

Det. numrului gruprilor reductoare prin metode colorimetrice

Determinarea activitii -amilazei exprimat n Kilo Novo unit (KNU) (Legin,1998)
Substrat: p-nitrofenil -Dglucopiranozid (pNPG) msurarea la 405 nm a p-nitrofenolului (pNP) eliberat de ctre enzim. O unitate de activitate -glucozidazic = cantitatea de enzim care elibereaz un mol de pNP pe minut.

Det. numrului gruprilor reductoare prin metode fizice

Determinarea numrului de legturi hidrolizate prin msurri de osmolaritate (Marchal,1999)
Echivalentul de Dextroz (DE) : DE= MMglucoz x 100 / MMmedie_ hidrolizat
de amidon

DE teoretic: DE= 0,18 x100/(dwkgap / osm) Msurarea osmometric:

18(osmm osmo )(1 dw0 ) DE = dw0 + 18 10 3 (osmm osm0 (1 dw0 ))

Metode de analiz
1. Metode de analiz a amidonul 2. Metode de analiz a enzimelor amilolitice 3. Metode de analiz a hidrolizatelor de amidon

Metode fizice de analiz a amidonurilor

Siropuri de hidrolizate de amidon Unghiul de cu valori DE diferite specific 15,1 18,8 25,2 32,8 36,7 41,8 48,8 55,2 67,2 162,8 168,3 159,8 152,6 146,8 139,9 130,0 105,8 97,0 rotaie

Met. chimice de analiz a amidonurilor

Determinarea echivalentului dextroz DE folosind metoda Luff -Schoorl
2Cu2+O + R CHO 2Cu2+SO4 + 4KICu+2O + R - COOH 2 Cu+I + I02 + 2K2SO4 l02 + 2 Na2S-42O3 2 Na2S-64O6 + 2 NaI-

Metode cromatografice amidonurilor: SEC 1,0

Condiiile de lucru:
eluent apa+tampon fosfat; rata curgere 0,1 ml/min; coloan TSK 50S Vol. injecie 100 l
Intensitatea semnalului DOC-Detektorsignale DOC
0,8 0,6

de

analiz

D-Glucoza D-Maltoza Saccharose Zaharoza D-Glucose Dextran 5x103 Da D-Maltose Dextran 5x104 Da Dextran 5000 Dextran 1,5x105 Da Dextran 50.000 Dextran 106 Da Dextran 150.000 Pullulan 106 Da Dextran Blau Xanthan 1,2x106 Da Pullulan

0,4 0,2

Pullulan Xanthan

0,0

10

15

20

25

30

35

Elutionsvolumen in mL

Timpul de eluie, min.

Cromatograma obinut la SEC a unei probe standard coninnd poli-, oligo- i monozaharide cu mase moleculare diferite. (Mironescu i colab., 2004)

SEC
1,1E+06

5,0E+03

4,0E+03

Masa molecular. Da

8,5E+05

Masa molecular, Da

3,0E+03

6,5E+05

4,5E+05

2,0E+03

y = -575376x + 8E+06
2,5E+05

R = 0,8684

1,0E+03

y = -1430,7x + 29132 R = 0,9899

2

5,0E+04
11 11,5 12 12,5 13 13,5 14

0,0E+00
16,5 17 17,5 18 18,5 19 19,5 20 20,5 21

Timpul de retenie, min.

Timpul de retenie, min.

Curbele etalon obinute la SEC a unei probe standard coninnd poli-, oligo- i monozaharide cu mase moleculare diferite. A) Compui cu mas molecular mare. B) Compui cu mas molecular mic (Mironescu i colab., 2004)

Det. DE i DP prin HPLC

DE = DP1 + 0,63.DP2 + 0,4.DP3 + 0,18.DP4+
DP4+

DP2

DP3

DP1

Caracteristicile metodei: eluent ap; vol. injecie 100 l; temperatura 96oC; rata de curgere eluent 0,5 ml/min (Mironescu et al., 2007)