CAPTULO 2.3.5.

MICOPLASMOSIS AVIAR (Mycoplasma gallisepticum, M. synoviae)

RESUMEN
Definicin de la enfermedad: La micoplasmosis aviar est causada por varios micoplasmas patgenos de los cuales Mycoplasma gallisepticum (MG) y M. synoviae (MS) son los ms importantes; ellos son los nicos que estn en la lista de la OIE. Descripcin de la enfermedad: MG causa una enfermedad respiratoria crnica en las aves domsticas de corra, especialmente cuando concurren un menejo estresante y/o la presencia de otros patgenos respiratorios. La enfermedad se caracteriza por coriza, conjuntivitis, estornudos y sinusitis, particularmente en pavos y aves de caza. Puede originar la prdida de la produccin y su descenso en las aves de abasto y en la prdida de la produccin de huevos. MS causa una enfermedad respiratoria, sinovitis o puede dar lugar a una infeccin latente causadas por MG y MS. Las cepas de MG varan en infectividad y virulencia, y las infecciones pueden a veces no ser evidentes. Identificacin del agente: Se puede identificar MG y MS mediante mtodos inmunolgicos despus de su aislamiento en medios de cultivo para micoplasmas o por la deteccin de su ADN en muestras de campo o en cultivos. Las muestras para su aislamiento pueden ser frotis de rganos o tejidos, exudados, homogeneizados tisulares diluidos, obtenidos a partir de los senos infraorbitales o de las articulares, de la yema de huevo o de embriones. Los signos clnicos y las lesiones influirn en la seleccin de la muestra. Para el aislamiento, se usan medios lquidos y slidos, pero normalmente es necesario obtener colonias de micoplasmas en medios slidos antes de intentar la identificacin. En la clasificacin inicial de los aislamientos son tiles las pruebas bioqumicas, pero la identificacin definitiva se hace mediante r pruebas inmunolgicas, siendo la de los anticuerpos fluorescentes y la de la inmunoperoxidasa las ms satisfactorias. En laboratorios especializados se usan mtodos de deteccin de ADN, basados en la reaccin en cadena de la polimerasa. Una vez validados dichos mtodos, pueden utilizarse con material de frotis o con cultivos. Pruebas serolgicas: Para detectar anticuerpos contra MG y MS, se usan varias pruebas serolgicas, pero debido a las variaciones de la especificidad y la sensibilidad, se recomiendan dichas pruebas para analizar bandadas en vez de individuos. Generalmente, las ms usadas son la prueba rpida de aglutinacin srica (RSA), el enzimoinmunoensayo (ELISA) y la prueba de la inhibicin de la hemaglutinacin (IH). En la prueba RSA, se mezcla el suero con el antgeno marcado producido comercialmente, y los sueros que reaccionan en 2 minutos se calientan a 56C durante 30 minutos y se vuelven a ensayar. Los sueros que an reaccionan, especialmente cuando se los diluye, se consideran positivos y se analizan para confirmacin mediante ELISA o IH. Existen varios preparados comerciales ELISA con anticuerpos frente a MG y MS. Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: Aunque el mtodo de control preferido es el mantenimiento de las bandadas libres de MG y MS, para pollos se usan tanto vacunas vivas como inactivadas. La vacunacin debe considerarse apropiada slo para espacios con aves de muchas edades donde la infeccin es inevitable. Se usa normalmente para evitar prdidas en la produccin de huevos por ponedoras comerciales, aunque las vacunas tambin pueden usarse para reducir la transmisin a travs de los huevos en ncleos de reproduccin o

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para favorecer la erradicacin de MG en espacios con aves de muchas edades. Es importante vacunar antes de que aparezca el agente natural. Se dispone de vacunas vivas para MG producidas a partir de la cepa F. y ms recientemente, de las cepas ts-11 y 6/85, que son cepas no patgenas con sus propiedades de seguridad mejoradas. Es preferible la administracin de la cepa F por va intranasal o mediante una gota en el ojo, aunque tambin puede administrarse por aerosol o en el agua de bebida. Para la ts-11 se recomienda el mtodo de la gota en el ojo, y para 6/85, la pulverizacin fina. Las pollitas se suelen vacunar entre las 12 y 16 semanas de edad. Es suficiente con una dosis y las aves vacunadas se convierten en portadoras permanentes. El uso a largo plazo de la cepa F en espacios con aves de diversas edades ocasiona un desplazamiento de las cepas naturales. La cepa ts-11 se ha utilizado para erradicar con xito la cepa F en las ponedoras comerciales de diversas edades. Se ha producido una vacuna viva para MS elaborada a partir de una cepa de MS-H, y debe administrarse mediante una gota en el ojo. Las bacterinas contienen una suspensin concentrada de microrganismos de MG en una emulsin de aceite. Se administran por va parenteral a las pollitas de 1216 semanas de edad, por lo general, por va subcutnea en el cuello. Se recomiendan dos dosis. Las bacterinas son eficaces para evitar las prdidas en la produccin de huevos y la enfermedad respiratoria, pero no evitan la infeccin con MG natural. En los Estados Unidos se ha aprobado una bacterina similar para MSA, pero no se utiliza mucho.

A. INTRODUCCIN
Mycoplasma gallisepticum (MG) y M. synoviae (MS) pertenecen a la clase Mollicutes, orden Mycoplasmatales, familia Mycoplasmataceae. Sin embargo debe destacarse que M. synoviae (MS), M. meleagridis y M. iowae tambin pueden causar la enfermedad en aves de corral, aunque se considera que MG y MS son los ms importantes de los micoplasmas patgenos y los dos se encuentran en todo el mundo. MG es particularmente importante en pollos y pavos como causa de enfermedad respiratoria y del descenso de la produccin de carne y de huevos (3, 24). Tambin puede originar una enfermedad del tracto respiratorio superior en aves de caza. Ms recientemente, se ha advertido en Amrica del Norte que MG causa conjuntivitis en los pinzones (27). En aves de corral, la infeccin se transmite verticalmente a travs de los huevos infectados y horizontalmente por contacto estrecho; se ha identificado el cido nucleico de MG en muestras ambientales (30). Otros mtodos de contagio estn peor documentados. Los ignos clnicos de MG en aves de corral infectadas pueden variar de subclnicos a sntomas respiratorios obvios como coriza, conjuntivitis, tos y estornudos. Puede aparecer exudacin nasal, estertores traqueales y soplos a travs del pico parcialmente abierto. Tambin puede ser caracterstica una sinusitis unilateral o bilateral, particularmente en pavos y aves de caza, y los senos infraorbitales pueden presentarse tan inflamados que los prpados llegan a cerrarse. La conjuntivitis con exudado ocular espumoso es tambin una caracterstica comn en pavos y aves de caza, y a veces en pollos. Los pavos se manchan las plumas de las alas con frecuencia como resultado de los intentos de eliminar el exudado de los ojos. Los pinzones infectados pueden presentar rinorrea y serosidad ocular y los prpados pueden estar inflamados, y haber adems, conjuntivitis. Mycoplasma gallisepticum se puede asociar con las enfermedades respiratorias agudas en pollos y pavos, especialmente en las aves jvenes, siendo ms susceptibles los pavos. La gravedad de la enfermedad est muy influida por el grado de la infeccin secundaria con virus tales como el de la enfermedad de Newcastle y el de la bronquitis infecciosa, y con bacterias tales como Escherichia coli. En los pavos existe sinergismo con la infeccin debida al neumovirus aviar. Puede ocurrir una forma ms crnica de la enfermedad y originar descensos en la produccin de huevos de las reproductoras y las ponedoras. Las lesiones del tracto respiratorios se manifiestan al principio por un exudado mucoso excesivo y despus por una exudacin catarral caseosa, que puede formar masas amorfas en los sacos areos. En los pavos y aves de caza, los senos infraorbitales se encuentran inflamados y contienen una exudacin mucosa o caseosa. La enfermedad por MG o MS en los pollos puede aparentar padecer una enfermedad respiratoria causada por otros patgenos, como las cepas de baja patogenicidad de la enfermedad de Newcastle (captulo 2.3.14) y la bronquitis infecciosa aviar (captulo 2.3.2). Estas se pueden presentar en infecciones mixtas con MG o MS. Tambin deberan descartarse infecciones con Haemophilus paragallinarum ahora Avibacterium paragallinarum), y Pasteurella multocida. En los pavos, MG se puede confundir con infecciones producidas por el neumovirus aviar y la presencia de sinusitis tambin puede parecerse a una infeccin por Pasteurella multocida, Chlamydia

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(captulo 2.3.1) o MS. La sinovitis infecciosa causada por MS puede diferenciarse de la infeccin por Staphylococcus aureus y de la tenosinovitis infecciosa causada por reovirus. Los pollos con sinovitis infecciosa pueden presentar las crestas plidas, cojeras y crecimiento retardado. Pueden aparecer inflamaciones alrededor de las articulaciones. Con frecuencia se observan excrementos verdosos con grandes cantidades de uratos. Las articulaciones pueden presentar una exudacin viscosa, de color entre crema y gris tanto en la propia articulacin como a lo largo del recubrimiento de los ligamentos y riones que aparecen moteados, inflamados. Puede presentarse tambin hepatomegalia y esplenomegalia (17). Los signos respiratorios y las lesiones son similares a las provocadas por MG, excepto que, por lo general, son ms leves y, al igual que ocurre con MG, existe sinergismo con otros agentes respiratorios (19). Las cepas de MS presentan una variabilidad muy importante con respecto a su virulencia y al tropismo por los tejidos (18, 22, 26).

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
La presencia de MG o MS se puede confirmar aislando el microorganismo en un medio sin clulas o detectando directamente su ADN en tejidos infectados o muestras de frotis. Tambin se utilizan mucho las pruebas serolgicas para el diagnstico. Cuando los resultados son dudosos, se ha de realizar un nuevo muestreo en las aves, aunque se pueden inocular embriones de pollo o pollos con el material sospechoso.

1.

Identificacin del agente

Cultivo
Se toman muestras de aves vivas, de cadveres recientes o de cadveres de aves que fueron congelados inmediatamente. En aves vivas, se pueden tomar frotis de la hendidura coanal, la orofaringe, el esfago, la trquea, los ojos, la cloaca y el falo. En el caso de las aves muertas, se pueden tomar muestras de las fosas nasales, seno infraorbital, trquea o sacos areos. Los exudados se pueden aspirar de los senos infraorbitales y de las articulaciones. Tambin se pueden recoger muestras de embriones muertos sin eclosionar o de pollos o aves que han roto la cscara pero no lograron eclosionar. Tambin pueden tomarse las muestras de la superficie interna de la membrana vitelina, y de la orofaringe y los sacos areos del embrin. Todas las muestras deben examinarse tan pronto como sea posible. Si es necesario el transporte, se deben poner pequeos trozos de tejido en un medio lquido para micoplasmas, o se deben agitar vigorosamente los bastoncillos de algodn que contienen los frotis en 12 ml de caldo para micoplasmas y despus desecharlos. Alternativamente, los bastoncillos del muestreo se pueden introducir en medio lquido para micoplasmas antes de tomar las muestras (36) y despus se pueden colocar en los recipientes para su transporte. Debera incluirse un paquete con hielo o cualquier otro medio de refrigeracin, dado que MG y MS mueren rpidamente a temperatura ambiente. Pueden ser tiles las diluciones seriadas en un medio lquido para micoplasmas de las muestras porque la presencia de anticuerpos, de antibiticos o de sustancias inhibidoras en los tejidos puede inhibir el crecimiento de los micoplasmas, a menos que estos se diluyan. Se han formulado varios medios de cultivo adecuados (10) y los apropiados para aislar micoplasmas aviares pueden adquirirse en Mycoplasma Experience, Reigate, Surrey, United Kingdom. Los medios para micoplasmas contienen generalmente protenas hidrolizadas y una base de infusin de carne suplementada con un suero o una fraccin srica, factores de extracto de levaduras, glucosa e inhibidores bacterianos. Es importante que cada nuevo lote de medio se ensaye con cultivos de MG de un aislamiento reciente y un bajo nmero de pases in vitro porque algunos componentes, especialmente el extracto de levadura y el suero, pueden variar en cuanto a su capacidad para permitir el crecimiento. En EE.UU. y en otros pases es muy frecuente el uso del medio desarrollado por Frey et al. para el aislamiento de MG y MS (2, 11). La Nicotinamida adenn dinucletido (NAD) es un requisito de crecimiento para el aislamiento primario de MS, pero puede omitirse en el medio para el cultivo de MG. Los siguientes medios lquidos y slidos tambin son satisfactorios para el crecimiento de MG: Parte A: Medio lquido base para microorganismos como los de la pleuroneumona (grupo PPLO) sin cristal violeta (Difco) (14,7 g); agua destilada o desionizada (700 ml).

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Parte B: Suero porcino (calentado a 56C durante 1 hora) (150 ml); 25% (peso/volumen) de extracto de levadura fresco (100 ml); 10% (p/v) de solucin de glucosa (10 ml); 5% (p/v) de acetato de talio (10 ml); 200.000 Unidades Internacionales (UI)/ml de penicilina G (5 ml); y 0,1% (p/v) de solucin de rojo fenol (20 ml). El acetato de talio puede ser txico para el hombre y deben tomarse precauciones para su uso. El pH se ajusta a 7,8. El suero porcino puede sustituirse por suero de caballo, pero es importante comprobar que permite el crecimiento de MG.

La parte A se autoclava a 121C, a 1 atmsfera durante 15 minutos y, despus de enfriar, se aade la parte B, que ha sido esterilizada previamente por filtracin. Para el medio slido correspondiente, se aaden 10 g de agar purificado, que permite el crecimiento de MG, a la parte A antes indicada. La mezcla se autoclava como se ha dicho y se mantiene en un bao de agua a 56C. Los ingredientes de la parte B, omitiendo el rojo fenol, se mezclan separadamente y luego se incuban a 56C. Las partes A y B se mezclan cuidadosamente para evitar la produccin de burbujas y se distribuye el medio en placas de 50 mm usando 79 ml/placa. La excesiva humedad superficial puede evitarse con una incubacin corta a 37C. Las placas pueden almacenarse en un recipiente hermtico a 4C hasta 2 semanas. El extracto de levadura fresco est comercialmente disponible, aunque es preferible prepararlo en el propio laboratorio tomando levadura activa y seca de panadera (250 g) y suspendindola en agua destilada (1 litro).Se calienta hasta ebullicin, se enfra y luego se centrifuga durante 20 minutos a 3.000 g. El lquido sobrenadante se decanta y se ajusta a pH 8,0 con 0,1 M NaOH. Se clarifica mediante filtracin o centrifugacin, y luego se esteriliza por filtracin. El extracto se guarda a 20C. La glucosa de grado reactivo (10 g) se disuelve en agua destilada o desionizada (100 ml) y se ajusta a pH 7,88,0 con 0,1 M NaOH. Se esteriliza por filtracin y se guarda a 4C. El acetato de talio de grado reactivo se disuelve (5 g) en agua destilada o desionizada (100 ml), se esteriliza por filtracin y se guarda a 20C. La solucin de penicilina (106 UI de benzilpenicilina en 5 ml de agua destilada) se mantiene a 4C y se puede almacenar durante 1 semana. En aislamientos realizados a partir de muestras muy contaminadas, se puede aumentar la concentracin de la penicilina hasta 2.000 unidades/ml o se puede utilizar alternativamente la ampicilina 0,51,0 mg/ml. El rojo fenol (0,1 g) se pulveriza en 0,1 M NaOH (2,8 ml) y luego se lleva a 100 ml con agua destilada estril y se autoclava a 115C a 1 atmsfera durante 30 minutos. Se guarda a 4C. (Nota: el acetato de talio es muy txico y se deben tomar precauciones, en especial cuando se prepara la solucin stock). Las muestras se inoculan en medios slidos y lquidos para micoplasmas. El medio slido ayuda a detectar colonias de micoplasmas de crecimiento lento, que pueden pasar desapercibidas en los medios lquidos por saprofitos. Puede ser necesario hacer diluciones de hasta 103 para tener xito en el aislamiento. Las placas inoculadas se incuban a 37C en recipientes sellados. Se ha descrito que aumenta el crecimiento en una atmsfera hmeda y una tensin parcial de CO2 creciente; estas condiciones se pueden establecer incluyendo un papel o lana de algodn hmedo e inyectando en el contenedor 510% de CO2 en nitrgeno, colocando una vela encendida en el contenedor, o usando una incubadora con CO2 o un sistema adecuado de generacin de gas. Las tapas de los recipientes del medio lquido deben estar fuertemente ajustadas antes de la incubacin a 37C para evitar cambios indeseables de pH. Durante los primeros das, las placas se han de examinar a diario para detectar la aparicin de colonias mediante un microscopio estereoscpico; despus se examinan con menor frecuencia. Los cultivos con material de campo no se deben considerar como negativos hasta que no hayan transcurrido al menos 20 das. El medio lquido debe examinarse a diario y su la acidez se detecta por un cambio de coloracin del indicador del rojo a anaranjado o amarillo. Cualquier crecimiento observado debe subcultivarse inmediatamente en un medio slido. Incluso si no existe cambio de color, se debe subcultivar en un medio slido despus de 710 das o antes, ya que la presencia de especies de micoplasmas que hidrolizan la arginina (productoras de lcali) puede enmascarar el cambio de color del cido producido por MG. Por lo general, se pueden reconocer las colonias de micoplasmas en los medios slidos, aunque puede que no presenten la tpica apariencia de huevo frito. Pueden aparecer colonias bacterianas en la siembra primaria, pero a menudo son ms pigmentadas y no deben resembrarse en medios para micoplasmas. Las reacciones bioqumicas (como la fermentacin de la glucosa y la incapacidad de hidrolizar la arginina) pueden ayudar en la identificacin, aunque no sean especficas de MG y de MS y sea necesaria la seleccin del cultivo por clonacin. Para identificar los aislamientos de micoplasmas, se pueden usar mtodos inmunolgicos y de deteccin de ADN. Estos incluyen la prueba de la inmunoflorescencia indirecta con anticuerpos (IFI) y de la

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inmunoperoxidasa (IP), que son simples, sensibles, especficas y rpidas de realizar; tambin la inhibicin del crecimiento (IC); y la inhibicin del metabolismo (IM). Para las pruebas IC e IM se necesitan cultivos purificados (clonados), pero no para las pruebas IFI o IP. Estas ltimas pueden detectar la presencia de ms de una especie de micoplasma, ya que las colonias especficas reaccionarn frente al antisuero mientras que las otras no lo harn. No obstante, M. imitans, que es una especie de micoplasma que est relacionada serolgicamente con MG y que presenta propiedades bioqumicas similares, se ha aislado en algunos pases a partir de patos, gansos y a veces de otras especies aviares no domsticas. Se puede diferenciar de MG usando el mtodo PCR-RFLP (reaccin en cadena de la polimerasa/polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin), como describe Kempf (16). Alternativamente, las colonias aisladas se pueden examinar por inmunofluoerescencia usando diluciones seriadas de antisueros para MG y M. imitans en paralelo. El antisuero homlogo debera tener un ttulo considerablemente ms alto. Los mtodos de deteccin de ADN para identificar directamente MG o MS en tejidos o para identificar aislamientos en el laboratorio se presentan ms adelante y normalmente se basan en la tcnica de PCR. Cuando los mtodos anteriores no sean concluyentes, pueden ser apropiados la inoculacin de embriones de pollo o los bioensayos en pollos vivos. Sin embargo, estas tcnicas son costosas y de larga duracin y tienden a ser reemplazadas por la tecnologa de la PCR, aunque an constituyen una herramienta til en la investigacin. Las muestras requeridas para la inoculacin de embriones de pollo son las mismas que las usadas en la inoculacin de medios artificiales. Se preparan en medios lquidos omitiendo el cido de talio, se incuban a 37C durante 3060 minutos, y luego se inoculan alcuotas de 0,050,1 ml en el saco vitelnico de varios embriones de pollo de 68 das de edad de bandadas que estn libres de micoplasma. Los huevos se examinan al trasluz diariamente y se desechan los embriones que mueren a las 24 horas de la inoculacin. Cualquier embrin muerto posteriormente se mantiene refrigerado hasta el cultivo, y los que sobreviven ms de 5 das se colocan a 4C durante 4 horas para matarlos y reducir las hemorragias al abrirlos. La yema se subcultiva en un medio lquido y en otro slido. Los lpidos de la yema tienden a oscurecer las colonias, de modo que resulta esencial sembrar la yema en estra fina o, preferiblemente, diluirla antes en un medio lquido para micoplasmas. Los bioensayos se pueden llevar a cabo mediante la inoculacin de un homogeneizado de material sospechoso en al menos cuatro pollos susceptibles de 810 semanas de edad que estn libres de micoplasmas. El diagnstico se confirma mediante el aislamiento del micoplasma de estas aves, la demostracin de su ADN y/o la demostracin de anticuerpos especficos (28).

Mtodos inmunolgicos
Los procedimientos de inmunofluorescencia y de IP para el diagnstico se aplican generalmente en el laboratorio en los aislamientos sospechosos antes que directamente en los exudados o tejidos infectados. Esto se debe a que los organismos son demasiado pequeos para reconocerlos de modo concluyente por microscopa ptica y a que es improbable que se pueda disponer de los correspondientes controles negativos y positivos a partir de un exudado o un tejido.

a)

Prueba de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos

La tcnica recomendada para la prueba IFI (31) requiere un cultivo del aislamiento desconocido en un medio slido que contenga numerosas colonias pequeas y diferenciadas, un cultivo conocido de MG o de MS como control positivo, y un cultivo de otra especie de micoplasma, como M. gallinaceum o M. gallinarum como control negativo. Tambin se necesita un suero policlonal anti-MG o MS de conejo, un suero normal de conejo y un suero fluorocromo-conjugado con una anti-inmunoglobulina de conejo. Los sueros se pueden preparar en especies que no sean conejos, pero no se deben usar los anticuerpos monoclonales (MAb) porque MG o MS muestran una expresin variable de sus epitopos superficiales y puede que un MAb no reconozca al organismo. Las diluciones de trabajo adecuadas en solucin salina estril tamponada con fosfato (PBS; 0,01 M, pH 7,2) del suero anti-MG o MS, y del conjugado se determinan previamente mediante una titulacin cruzada, y se seleccionan para su uso diluciones de dos a cuatro veces inferiores a los puntos finales reales. Estas se aplican a las colonias de micoplasmas que se van a identificar y que se han crecido previamente en placas con agar como se indica a continuacin. i) ii) Procedimiento de la prueba A partir de placas con medio slido que contengan colonias, se cortan en bloques de aproximadamente 1,0 0,5 cm y se colocan en portas identificados con las colonias hacia arriba. Para permitir despus la orientacin, se corta la esquina inferior derecha del bloque. En cada porta se pone un bloque con el aislamiento desconocido, un bloque con cultivo conocido de MG, un bloque con el cultivo conocido de MS, y un bloque con un micoplasma diferente, pero conocido. En otro porta, se coloca otro bloque del aislamiento desconocido.

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iii) iv) v)

A la superficie de cada bloque del primer porta se aade una gota de antisuero contra MG (o MS) adecuadamente diluido y se aade el suero normal de conejo al bloque aislado del segundo porta. Se incuban todos los bloques 30 minutos a temperatura ambiente en una atmsfera hmeda. Cada bloque se coloca en un tubo marcado que contenga PBS, pH 7,2, y se lava durante 10 minutos en un agitador rotatorio, luego se vuelve a lavar de modo similar, y finalmente se devuelven los bloques a los portas originales para observalos al microscopio. Se absorbe el exceso de humedad de los lados de los bloques. A cada bloque se aade una gota del conjugado diluido, y se incuba y se lava como antes. Se devuelven los bloques a sus portas originales, y se examinan las colonias mediante luz incidente usando un microscopio de fluorescencia.

vi) vii)

La interpretacin de los resultados es subjetiva y requiere alguna experiencia; las comparaciones con los controles son esenciales, y deben presentar las reacciones correctas. Algunos laboratorios usan antisuero conjugado con fluorescena en una prueba de inmunofluorescencia directa (IFD). Una tcnica muy usada para IFD es aquella en la que los reactivos se aplican sucesivamente dentro de cilindros de acero inoxidable que se colocan en las placas originales con el medio slido para los micoplasmas (32). Aunque esto es rpido y fcil de realizar, los resultados obtenidos son menos especficos que mediante el uso del mtodo indirecto, que es, por tanto, el preferido.

b)

Prueba indirecta de la inmunoperoxidasa

Se basa en un principio similar al de la prueba IFI pero la unin de los anticuerpos especficos a las colonias se detecta in situ aadiendo una inmunoglobulina anti-conejo que est conjugada con el enzima peroxidasa. Luego se desarrolla una reaccin positiva aadiendo el substrato apropiado que, por oxidacin, produce colonias coloreadas. Tambin se puede usar un procedimiento de inmunounin en el que las colonias ensayadas se transfieren a nitrocelulosa (21) y despus reaccionan de una manera similar. Para el serotipado de aislamientos por IP, como por IFI, se deben usar anticuerpos policlonales. La ventaja de la prueba IP sobre la de inmunofluorescencia es que para la prueba IP no se necesita el costoso microscopio de fluorescencia.

c)

Prueba de inhibicin del crecimiento

En la prueba IC, se inhibe el crecimiento de los micoplasamas mediante un antisuero especfico, lo que posibilita la identificacin de la especie. Es una prueba relativamente poco sensible y los sueros deben tener ttulos muy altos, ser monoespecficos y proceder de mamferos, ya que los sueros de aves no siempre inhiben el crecimiento de los micoplasmas de un modo eficaz. El microorganismo en cuestin ha de estar en cultivo puro (clonado) y se deben probar varias diluciones; la ptima es una concentracin de 104 unidades formadoras de colonias (UFC/ml). La velocidad de crecimiento del microorganismo puede influir en la inhibicin, y es adecuado retardar al principio el crecimiento mediante incubacin a 27C durante 24 horas, y despus seguir con otra incubacin a 37C. Los detalles sobre esta prueba y su interpretacin se han publicado en otro lugar (6).

Mtodos de deteccin del cido nucleico

El uso de mtodos de deteccin de ADN especfico es una alternativa al cultivo e identificacin convencionales. Se puede detectar MG o MS por hibridacin con sondas de ADN, pero en la actualidad es mucho ms comn usar la PCR para amplificar porciones especficas del ADN en el material analizado. Al menos una prueba comercializada de ADN de MG usa directamente PCR sobre el material extrado de frotis. Un laboratorio privado produce un kit para detectar cepas de campo de MG y otro que identifica la cepa vacunal F. Se han publicado tambin varias pruebas caseras basadas en la PCR incluyendo una PCR mltiple, diseada para detectar los cuatro micoplasmas aviares patgenos (34), pero que no ha sido validada con muestras clnicas. Kempf ha citado varios mtodos (16) y, adems, el manual publicado por Lauerman (23) contiene una prueba de PCR validada para MG, MS y otros micoplasmas aviares basados en las secuencias nicas contenidas en el gen del ARN 16S. Este mtodo para MG se presenta ms adelante. En los Estados Unidos, se est empezando a utilizar ms ampliamente una PCR basada en el gen mgc2 de MG (12) o en el gen de vlhA de MS (14) debido a que la identificacin preliminar de la cepa se puede realizar mediante la secuenciacin del producto de la PCR; debemos recordar que las cepas no relacionadas entre s pueden compartir ocasionalmente la misma secuencia.

a)

Aislamiento de ADN
El ADN se extrae de muestras de un frotis (se pueden juntar de tres a cinco) por suspensin en 1 ml de PBS de grado para la PCR depositado en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con tapn a presin. La suspensin se centrifuga 30 minutos a 14.000 g y 4C. El sobrenadante se recoge cuidadosamente con una pipeta

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Pasteur y el precipitado se suspende en 25 l de agua de grado para la PCR. El tubo con su contenido se hierve durante 10 minutos y luego se coloca en hielo durante 10 minutos antes de centrifugar a 14.000 g durante 5 minutos. El ADN se encuentra en el sobrenadante.

b)

Cebadores
Los cebadores para MG son las siguientes secuencias. MG14F: 5-GAG-CTA-ATC-TGT-AAA-GTT-GGT-C-3 MG13R: 5- GCT-TCC-TTG-CGG-TTA-GCA-AC-3 Para la MS se utilizan los siguientes cebadores: MSF: 5-GAG-AAG-CAA-AAT-AGT-GAT-ATC-A-3 MSR: 5-CAG-TCG-TCT-CCG-AAG-TTA-ACA-A-3

c)

Reaccin en cadena de la polimerasa

Las mezclas de reaccin deben prepararse en un rea limpia separada, usando un juego de pipetas dedicadas a tal fin. Para una reaccin de la PCR de 50 l la mezcla es la siguiente: H2O ultrapura 10 Tampn para PCR dNTP (10 mM) Cebador F (20 pmoles/l) Cebador R (20 pmoles/l) Taq (5 U/l) MgCl2 (50 mM) 35,75 l 5,00 l 1,00 l 0,50 l 0,50 l 0,25 l 2,00 l

En cada tubo de PCR se disponen 45 l de la mezcla de reaccin. Esta mezcla se debe tapar con unas gotas de aceite mineral ligero a menos que el termociclador est equipado con una tapadera caliente. Los tubos se llevan luego a otra rea limpia donde se aade la muestra de ADN apropiada (5 l) a cada tubo. Se deben usar controles negativos y positivos en cada serie. Los tubos se colocan luego en un termociclador para los siguientes ciclos: 40 ciclos: 94C durante 30 segundos, 55C durante 30 segundos, 72C durante 60 segundos; 1 ciclo (extensin final): 72C durante 5 minutos y colocar a 4C.

d)

Electroforesis
Los productos de la PCR se detectan en la electroforesis convencional en gel de agarosa, incorporando marcadores adecuados de tamao, y examinndolos con luz UV. El producto de la PCR para MG tiene 185 pb. La visualizacin de los productos de la PCR debe realizarse en un rea del laboratorio distinta, bien separada de donde se llevan a cabo todos los otros pasos del procedimiento. Las pruebas PCR todava suelen efectuarse en laboratorios especializados y probablemente deban considerarse como auxiliares tiles de los mtodos actuales de diagnstico una vez que se establezca claramente su validacin. Se debe tener mucho cuidado en evitar la contaminacin de las muestras con ADN de MG o de MS de las salas post mrtem cercanas, de laboratorios de cultivo o de amplificaciones positivas de reacciones PCR anteriores (ver captulo 1.1.5 para las precauciones adecuadas). Sin embargo, la preparacin comercial referida anteriormente tiene licencia como mtodo diagnstico por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y su uso est aprobado por el Plan Nacional de Mejora Aviar (NPIP). Debe sealarse que las pruebas de la PCR no estn validadas para una prueba diaria en aves de varios das para detectar la infeccin con precisin.

Tambin hay mtodos moleculares disponibles para diferenciar las cepas de MG y MS (16), pero en la actualidad su uso est restringido a laboratorios especializados. Un mtodo rpido y preciso para el anlisis del ADN consiste en la utilizacin de la PCR con cebadores aleatorios o del ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD). En esta tcnica se utilizan cebadores de PCR cortos y arbitrarios, que generan patrones reproducibles en gel de agarosa (8). Este mtodo es rpido y simple y se ha demostrado que es muy til para la identificacin rpida de las cepas de MG en estudios epidemiolgicos. Sin embargo, puede haber problemas con la reproducibilidad, de modo que las cepas a comparar deben activarse en el mismo gel. Adems resulta difcil la interpretacin de los patrones de bandas que parecen semejantes. La secuenciacin del gen diana (GTS) utilizando cebadores de PCR para los genes mgc2, gapA, pvpA y MGA_0309 de MG pueden utilizarse para proporcionar un mtodo reproducible y preciso de tipificacin de cepas,

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que permitir comparaciones globales rpidas entre los laboratorios (9). La identificacin preliminar de la cepa con cebadores para la PCR de diagnstico para el gen mgc2 de MG o el gen vlhA de MS mediante secuenciacin del producto de la PCR, permite la identificacin preliminar de la cepa sin necesidad del aislamiento previo del microorganismo (14, 15). Sin embargo, algunas veces las cepas no relacionadas tienen idnticas secuencias utilizando estos cebadores, y puede ser necesaria una caracterizacin adicional.

2.

Pruebas serolgicas

Las pruebas serolgicas de uso corriente pueden carecer de especificidad o de sensibilidad; es muy aconsejable su uso para controlar bandadas ms que para individuos. Quienes deseen usar dichas pruebas para el diagnstico deben tener en cuenta que ha de establecer un ensayo de sensibilidad y especificidad (captulo 1.1.4) bajo las condiciones propias de su laboratorio. Debera tambin resaltarse que estas pruebas no han sido validadas para ser usadas con sueros de aves de varios das o de aves de caza (4). Las pruebas ms usadas normalmente son la RSA, el ELISA y la IH, aunque se han descrito otras como el radioinmunoensayo, la microinmunofluorescencia y la prueba de la IP. El nmero de sueros que se han de probar dentro de una bandada depende del nivel de deteccin y de los lmites de confianza que se requieran. Los requisitos mnimos pueden pasarse por alto en el comercio internacional y tambin puede estipularse la frecuencia de los ensayos como, por ejemplo, en la Directiva 90/539/EEC del Consejo de la Comunidad Europea. Los requisitos mnimos y las pruebas aprobadas tambin han sido expuestas por miembros del NPIP de los EE. UU. Las compaas propietarias de las granjas que usan las tcnicas ELISA para detectar los anticuerpos contra virus en un gran nmero de sueros pueden encontrar adecuado este tipo de ensayo para los micoplasmas. Las tcnicas de ELISA no se describen aqu con detalle porque estn disponibles comercialmente varios sistemas para la deteccin de MG. En su lugar, se aportan detalles de la prueba IH ya que los reactivos necesarios para esta prueba no tienen una comercializacin amplia.

a)

Prueba rpida de aglutinacin srica

Se recogen sueros de una muestra de la bandada y, si no se ensayan inmediatamente, se mantienen sin congelar a 4C. La prueba debe realizarse a temperatura ambiente (2025C) dentro de las 72 horas posteriores a la recogida del suero y los reactivos tambin deben estar a temperatura ambiente. Una centrifugacin previa reducir las reacciones inespecficas. Los antgenos para RSA se comercializan, pero pueden variar en especificidad y sensibilidad entre los diferentes fabricantes y de un lote a otro. Pueden almacenarse siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Tambin se pueden preparar los antgenos adecuados coloreados para RSA de modo "casero" siguiendo los mtodos de cultivo descritos en la seccin B.1.; estos se tien luego con el colorante cristal violeta. A continuacin se describen los estndares del control de calidad para antgenos de micoplasma en pruebas serolgicas. i) Procedimiento de la prueba (1) Se pone un volumen de suero (aproximadamente 0,02 ml) encima de una baldosa limpia blanca o en una placa de cristal, y a continuacin se pone un volumen de antgeno MG o MS coloreado. No se ha de permitir que el suero se seque antes de la adicin del antgeno. Es importante agitar el recipiente del antgeno vigorosamente y con frecuencia durante su uso para mantener en suspensin la cantidad correcta de antgeno. Se extiende la mezcla sobre un rea circular de aproximadamente 1,5 cm de dimetro mediante una varilla de vidrio. Se balancea la baldosa o el cristal durante 2 minutos. La aglutinacin se advierte por la floculacin del antgeno en 2 minutos. Se incluyen en la prueba los controles positivos y los negativos conocidos. Se vuelven a probar las diluciones seriadas de cualquier suero aglutinante despus de calentarlas a 56C durante 30 minutos. Si todava reaccionan fuertemente, se consideran positivos si lo hacen diluidos (a 1/4 o ms).

ii)

iii) iv)

En EE.UU. se pueden obtener antisueros positivos de referencia de MG y de MS del USDA National Veterinary Services Laboratories (NVSL), y en Europa de la AFFSA en Ploufragan1, Francia. Los sueros control de MG y MS producidos en pollos o en pavos se pueden comprar con varios rangos de titulacin. Tambin se pueden comprar preparaciones de antisueros en el Departamento de Medicina Aviar de la Universidad de Georgia, dependiendo de sus disponibilidades.

Agence nationale charge de la scurit sanitaire de lalimentation, de lenvironnement et du travail (Anses), Laboratoire de Ploufragan, Mycoplasmology Bacteriology Unit, 22440 Ploufragan, France.

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No hay estndares internacionales para interpretar estas pruebas, pero una proporcin alta de sueros positivos en una bandada (10% o ms) indica una infeccin por MG, en especial si se confirma por la prueba IH o por ELISA. Para su confirmacin, la misma poblacin debera ser analizada de nuevo al cabo de un mes. Cuando los resultados son poco concluyentes se hace necesario el aislamiento del microorganismo y la demostracin de la presencia de su ADN. Los resultados dudosos deben investigarse mediante pruebas con antgeno de MS (y viceversa) ya que la infeccin con estos organismos causa a veces, reacciones cruzadas. Las pruebas se pueden realizar en la yema o vitelo de los huevos as como en los sueros, aunque la yema debe ser primero diluida o extrada.

b)

Prueba de la inhibicin de la hemoaglutinacin

MG y MS son capaces de hemoaglutinar los hemates aviares (RBC), y la presencia de anticuerpos especficos en los sueros causa inhibicin. Se debe seleccionar una cepa que crezca bien y que hemoaglutine con seguridad. La prueba IH requiere un antgeno de MG y de MS que aglutine de forma satisfactoria, unos hemates frescos lavados de pollo o pavo, segn proceda, y el suero problema. El antgeno puede ser un cultivo fresco en un medio lquido o una suspensin lavada y concentrada de clulas de micoplasma en PBS. El suministro de altos ttulos de antgeno por cultivo en medio lquido puede resultar difcil mantener; sin embargo, el uso de antgeno concentrado (que normalmente contiene 2550% de glicerol y se guarda a 70C) incrementa la probabilidad de las reacciones inespecficas. En EE.UU, se puede comprar antgeno para hemaglutinacin (HA) de MG y MS en los NVSL. La prueba IH sigue procedimientos bien conocidos (1). Se determina primero el ttulo HA del antgeno en diluciones duplicadas sucesivas, definindose la unidad HA como la menor cantidad de antgeno que produce una completa HA en el sistema de prueba ensayado. La prueba IH debera realizarse usando 4 unidades de HA por el mtodo siguiente o por un mtodo que tenga una sensibilidad equivalente determinada por pruebas con sueros positivos conocidos. Todas las titulaciones HA y las pruebas IH se realizan mejor en placas de plstico con multipocillos de fondo en forma de V y usando volmenes constantes de 50 l. En cada prueba se incluye un suero control positivo y otro negativo. Se necesita una fila de ocho pocillos para cada suero analizado. i) ii) iii) Procedimiento de la prueba Se aaden 50 l de PBS al primer pocillo de cada fila Se aaden 8 unidades de HA de antgeno en volmenes de 50 l al segundo pocillo de cada fila y se aaden 50 l de 4 unidades HA de antgeno a cada uno de los pocillos del 3 al 8. Se aaden 50 l de una dilucin 1/5 preparada previamente del suero ensayado al primer pocillo, se mezclan y se transfieren 50 l al segundo pocillo, y as sucesivamente. Se desechan 50 l del ltimo pocillo. El primer pocillo es el control del suero. Se necesitan seis pocillos para el control de antgeno. Se aaden 50 l de PBS a los pocillos 2 a 6, inclusive, y se aaden 8 unidades HA de antgeno a los pocillos 1 y 2. Se mezcla el contenido del pocillo 2 y se transfiere 50 l al pocillo 3, se mezcla y se repite hasta el pocillo 6, y se eliminan 50 l. Se requieren dos pocillos para el control de hemates. Se aaden 50 l de PBS a cada uno de estos. Se aaden 50 l de una suspensin al 0,5% de hemates (clulas de pollo para suero de pollo, y de pavo para suero de pavo) a todos los pocillos. Se agita suavemente la placa para asegurar que se mezcla bien el contenido de los pocillos, y se evala despus de dejar que repose aproximadamente 50 minutos a temperatura ambiente o cuando la titulacin del antgeno seale 4 unidades HA. Para la lectura de los resultados, la placa debera inclinarse y se considera que presentan inhibicin slo aquellos pocillos en los que los hemates "se deslicen" al mismo tiempo que en los pocillos del control de hemates. El control de suero debera mostrar un claro botn de hemates y los controles positivos y negativos deberan reaccionar segn lo esperado. El ttulo de la IH es la dilucin ms alta del suero que manifiesta una inhibicin completa de la HA.

iv)

v) vi) vii)

Los sueros que dan una HA inespecfica deben adsorberse para extraer todas las hemaglutininas inespecficas de modo que se obtenga un claro botn en el pocillo control sin antgeno HA. La adsorcin se realiza incubando 1 ml de dilucin srica con 68 gotas de de hemates de pollo o pavo lavados y compactados. Las clulas se eliminan despus de incubar a 37C durante 10 minutos, y el sobrenedante se ensaya para actividad hemaglutinante.

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No hay definicin oficial de resultados negativos o positivos para el comercio internacional pero el NPIP establece que los ttulos de 1/80 o superiores se consideran positivos y ttulos de 1/40 son altamente sospechosos.

c)

Enzimoinmunoensayo
Algunas preparaciones comercializadas de ELISA para anticuerpos frente a MG y MS se pueden encontrar en el mercado. La sensibilidad viene determinada en cierto modo por las recomendaciones de los fabricantes en cuanto a los niveles de corte para considerar las reacciones positivas y sospechosas. A veces la sensibilidad puede estar "amortiguada", para evitar las bien conocidas reacciones cruzadas entre MG y MS. En una tcnica ELISA se usa un anticuerpo monoclonal (MAb) que reconoce un eptopo de un polipptido de 56 kDa de MG (7). En este sistema, las placas de ELISA estn recubiertas con un antgeno de clulas enteras de MG y los sueros ensayados se aaden como en el mtodo convencional indirecto de ELISA, pero la reaccin se valora en funcin de la magnitud bloqueo que ocurre cuando se aade el MAb conjugado. Se ha comercializado un ELISA similar para MS. Una ventaja de este sistema es que puede usarse para sueros de cualquier especie aviar sin necesidad de adaptacin. i) Control de calidad de antgenos de Mycoplasma gallisepticum y M. synoviae Antgenos de Mycoplasma gallisepticum Los antgenos se suelen preparar de la cepa S6 o de la cepa A5969 de MG. Tambin se pueden usar los antgenos de otras cepas cuando sea necesario. Antgeno MG para la prueba RSA: Los mtodos de control de calidad que se describen ms abajo slo se aplican a suspensiones de MG teidas con un colorante apropiado, que contienen un conservante y que estn dirigidas a ser usadas con suero en la prueba de aglutinacin rpida en placa. Tales antgenos estn comercialmente disponibles. El antgeno debe aparecer como una suspensin homognea sin flculos o precipitados cuando se examina al microscopio y el medio lquido de suspensin debe estar libre de colorante residual. Debe estar exento de contaminacin por bacterias y hongos. El pH debe estar entre 6,5 y 7. Debe mantenerse a 53C y calentarse a temperatura ambiente antes de usarse. La sensibilidad y especificidad del antgeno se determina mediante sueros positivos conocidos de ttulos alto y bajo, y con sueros negativos conocidos. Una reaccin positiva se reconoce por la formacin de flculos coloreados y el aclaramiento del medio de suspensin. Los criterios antes descritos son vlidos hasta la fecha de expiracin declarada por el fabricante. Antgeno MG para la prueba IH: La prueba se realiza con preferencia con cultivos vivos en crecimiento activo: El antgeno debe estar libre de contaminacin por bacterias y hongos. Antgeno MG para ELISA: Puede ser difcil preparar un antgeno satisfactorio para uso en la tcnica indirecta de ELISA sin una considerable experimentacin previa y la confirmacin de la sensibilidad y la especificidad. El uso de una preparacin comercial fiable es probablemente el mejor mtodo en la mayor parte de los laboratorios de diagnstico. Algunas preparaciones tienen ahora licencia del USDA y su uso est aprobado por el NPIP en USA. ii) Antgenos de Mycoplasma synoviae Los antgenos se preparan de la cepa WVU 1853 o de otras cepas adecuadas. Antgeno de Mycoplasma synoviae para la prueba RSA: Las especificaciones son las mismas que para el antgeno MG en la prueba RSA. Antgeno de Mycoplasma synoviae para la prueba IH: Las especificaciones son las mismas que para el antgeno MG en la prueba IH. iii) Comentarios adicionales Los sueros que dan reacciones inespecficas en la prueba RSA no suelen dar una reaccin positiva en la prueba IH usando antgeno HA vivo. Las reacciones RSA positivas se pueden confirmar por la prueba de la IH con sueros tomados en las 23 primeras semanas despus de la infeccin (el tiempo que tardan en aparecer los anticuerpos IH). Sin embargo, la prueba de la IH suele ser especfica de cepa (20) y, por tanto, puede carecer de sensibilidad. La tcnica ELISA puede ser una alternativa til. En las pruebas RSA no se deben congelar las muestras de suero antes de usarlas. Deben carecer de hemlisis y de contaminacin para evitar reacciones inespecficas. El empleo de vacunas inactivadas para otras enfermedades puede originar reacciones inespecficas. Las muestras deben ser ensayadas tan pronto como sea posible (dentro de las 72 horas) debido a que los anticuerpos frente a micoplasmas se pueden deteriorar con el tiempo de almacenamiento. Los sueros se pueden inactivar en un bao con agua a 56C durante 30 minutos.

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C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

El mejor mtodo de control es mantener las poblaciones libres de MG y MS. La vacunacin se debe contemplar slo en situaciones donde la exposicin resulte inevitable, como en granjas con aves de distintas edades. Tambin hay que considerar la posible exposicin de bandadas de aves de corral vecinas. Para el control de MG, existen dos tipos de vacunas. Estas son cepas atenuadas suaves o avirulentas de MG que se usan como vacunas vivas o bacterinas inactivadas en emulsiones de aceite. El tema de la vacunacin ha sido revisado por Whithear (35). Aunque entre las cepas de MG existe variacin antignica, se piensa que la vacunacin con una sola cepa resulta suficiente. En el captulo 1.1.8 se recogen algunas directrices para la produccin de vacunas veterinarias. Las indicadas aqu y en el captulo 1.1.8 son de carcter general y pueden ser suplementadas con requisitos nacionales y regionales.

Vacunas vivas: mtodos de uso

El uso de vacunas vivas equivale a una "exposicin controlada". La finalidad es infectar la bandada con una cepa inmunognica de MG suave a una edad en la que ocurra poco o ningn dao. Dicha exposicin origina resistencia frente a una infeccin posterior en la vida, como en granjas comerciales con aves de distinta edad. Las aves vacunadas con xito son resistentes a la enfermedad respiratoria, la saculitis, y a los descensos en la produccin de huevos causados por MG. La vacunacin tambin proporciona una disminucin del nivel de transmisin por huevos en las reproductoras. La cepa ms usada en las vacunas es la cepa F de MG (5). Se trata de una cepa natural con virulencia moderada o dbil en los pollos, pero virulenta en los pavos. De ordinario se contagia lentamente de ave a ave. Cuando se administra a pollos sanos a travs del tracto respiratorio, no se observa reaccin respiratoria o esta es escasa. Sin embargo, cuando se administra mediante aerosol o en presencia de otros agentes de enfermedades respiratorias, como el virus de la enfermedad de Newcastle o el de la bronquitis infecciosa, se pueden presentar sntomas respiratorios y saculitis. Los pollos vacunados son portadores permanentes, de modo que es suficiente una dosis nica. El uso de la vacuna con la cepa F en cada reposicin de bandadas en una granja desemboca a largo plazo en el desplazamiento de la cepa natural por la cepa vacunal. Las cepas ts-11 y 6/85 son avirulentas y no se produce su extensin a aves no vacunadas o lo hace muy escasamente cuando las aves estn en contacto muy estrecho (25). Los pollos destinados al comercio se vacunan normalmente entre las 12 y 16 semanas de edad, pero se permite la vacunacin de aves ms jvenes o ms viejas. Es esencial realizar la vacunacin antes de que la bandada se infecte de forma natural. En casos de probable infeccin natural inicial se pueden vacunar aves de 24 semanas de edad. Para la cepa F, es preferible la administracin nasal o mediante una gota en el ojo. A menos que se realice adecuadamente, la administracin mediante el agua de bebida puede dar lugar a que algunas aves no resulten vacunadas. La administracin por aerosol tambin debe realizarse de forma cuidadosa, de modo que todas las aves resulten expuestas. A los 57 das de la vacunacin es de esperar una reaccin respiratoria si la misma se administr por aerosol. Las poblaciones vacunadas deben ensayarse con la prueba de la aglutinacin unas 34 semanas despus de la vacunacin para asegurarse de que todas las aves fueron expuestas de modo adecuado. Es deseable vacunar las aves a una edad en la que no reaccionen frente a otras vacunas respiratorias. La cepa ts-11 debe administrarse por gota en el ojo, y la 6/85, mediante un pulverizador fino. La vacuna con ts-11 produce una respuesta serolgica baja pero reconocible por aglutinacin srica en placa, la IH y ELISA, pero la vacuna con 6/85 no origina de ordinario respuesta serolgica. Tanto con 6/85 como con ts-11 no se deben observar reacciones post-vacunales. Las poblaciones vacunadas con las cepas F o ts-11 son positivas para los cultivos durante la vida de la bandada, pero en cambio la cepa 6/85 puede ser difcil de recuperar despus de las 46 semanas de la vacunacin. Las vacunas vivas comercializadas deben usarse 12 horas despus de su reconstitucin. Las vacunas liofilizadas deben guardarse a 4C. Algunos fabricantes suministran la vacuna congelada. Tales vacunas deben mantenerse en nitrgeno lquido, en hielo seco, o a 70C o ms fro. La vacuna viva para MG no es estable durante largos perodos a las temperaturas de los congeladores ordinarios. Debe evitarse el almacenamiento a 20C ms all de unos pocos das. Las cepas ts-11 y 6/85 son ms seguras que la cepa F, aunque su nivel de proteccin puede ser algo menor, y pueden resultar tiles como vacunas primarias en una granja o como una vacuna de segunda generacin en sitios en los que previamente se ha usado la vacuna con la cepa F. Tambin pueden preferirse en situaciones en las que puede resultar preocupante la exposicin inadvertida de poblaciones de aves cercanas. La cepa F desplaza a la cepa natural de MG con ms eficacia que la ts-11 o la 6/85, pero la ts-11 se ha usado para erradicar la cepa F de MG en una granja de produccin comercial de huevos (33). Los lugares en los que se usa repetidamente la cepa 6/85 a menudo dan pruebas negativas para MG, lo que sugiere que aquella desplaza a la cepa natural.

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Las vacunas vivas tambin se han usado en algunos pases en el caso de productoras de pollos. En Australia, se est extendiendo el uso de la vacuna viva ts-11 en reproductoras y en ponedoras comerciales. Durante varios aos, en algunos pases de Amrica Latina la vacuna con cepa F se ha usado en reproductoras bajo condiciones de granja; ms recientemente ha habido un uso limitado de las cepas ts-11 y 6/85. En EE.UU. ha habido un uso restringido de la cepa 6/85 como vacuna para los pavos comerciales, pero no existen datos aceptables sobre su eficacia. Generalmente, no se recomienda la vacunacin de los pavos con vacunas vivas, y la vacunacin de los pollos con vacunas vivas o inactivadas no ha tenido xito. Ninguna de las vacunas ha sido validada para su uso con aves de caza. En muchos pases est disponible una vacuna viva contra MS para utilizarla en criadores de pollos para asar y en ponedoras. Se produce a partir de una mutante, el MS-H, que es sensible a la temperatura (29) Sus caractersticas y modo de uso son semejantes a los de la vacuna ts-11 contra MG.

Vacunas inactivadas: mtodo de uso

Las bacterinas de MG se preparan a partir de una suspensin concentrada de clulas enteras que se emulsiona en un adyuvante lipdico. Es esencial que haya un elevado contenido antignico. Las bacterinas se usan normalmente en pollas comerciales para conseguir una proteccin adecuada frente al descenso de la produccin de huevos que ocurre en las granjas despus de la exposicin a MG (13). Tambin se pueden usar en ponedoras para reducir el nivel de transmisin a travs de los huevos. El uso de bacterinas en pollos se reduce por el hecho de que los vacunados antes de 12 semanas de edad no quedan protegidos. Aunque las bacterinas pueden conferir proteccin contra los sntomas respiratorios, la saculitis y la prdida de produccin de huevos, las bandadas vacunadas se infectan. No se conoce la duracin de la inmunidad, pero la mayor parte de las poblaciones estn expuestas entre 12 meses despus de la vacunacin. La administracin puede ser por las vas intramuscular o subcutnea, con una dosis normal de 0,5 ml por ave. Existe el riesgo de que una reaccin persistente en el lugar de la aplicacin de la vacuna haga necesario el retoque de las carcasas de las aves vacunadas por va intramuscular, de modo que la vas subcutnea de administracin en la parte dorsal del cuello es la ms utilizada. Son preferibles dos dosis, pero el coste y el trabajo pueden aconsejar una dosis simple, normalmente entre las 16 y 18 semanas de edad en los pollos comerciales. Se puede usar una jeringa multidosis. Todo el equipo debe limpiarse y esterilizarse entre los tratamientos de las bandadas, y los vacunadores deben seguir procedimientos de seguridad cuando se desplazan de una bandada a otra. Las vacunas deben guardarse a 28C hasta su uso. No deben congelarse ni exponerse a la luz fuerte. Est autorizada una bacterina similar contra MS en Estados Unidos, pero ha tenido un uso limitado.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Vacunas vivas La cepa vacunal debe ser inmunognica, debe colonizar el tracto respiratorio superior y causar el mnimo dao al sistema respiratorio. Una fuerte respuesta de los anticuerpos no se correlaciona necesariamente con la inmunidad. Los inculos de cultivo deben estar libres de agentes extraos. El cultivo debe ser clonado para asegurar su pureza. Si se desea, se pueden desarrollar los perfiles de ADN del micoplasma con endonucleasas de restriccin en geles de agarosa para confirmar la identidad y pureza de la cepa. Los inculos de siembra deben ser estables y sin tendencia a la reversin de la virulencia. Esto se puede confirmar mediante diez pases en pollos susceptibles. Se pueden introducir pollos testigo a intervalos semanales. Si es necesario, se pueden tomar frotis traqueales de pollos infectados e introducirlos luego en la trquea de los pollos testigo. Debe demostrarse la transmisin del organismo. El aislamiento resultante se puede usar a continuacin para infectar pollos susceptibles. Vacunas muertas

Las caractersticas ms importantes de las vacunas muertas son un alto rendimiento y una buena antigenicidad. Se supone, aunque no est probado, que son mejores las cepas virulentas. Los inculos de cultivo deben estar libres de organismos contaminantes.

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b)

Mtodo de cultivo
El inculo de cultivo se puede propagar en un medio similar al descrito anteriormente (seccin B.1.). Para las vacunas vivas el cultivo lquido se liofiliza o se congela a 70C o a ms fro. Para las bacterinas, el cultivo se debe concentrar y resuspender en un pequeo volumen de solucin salina o PBS antes de preparar la emulsin.

c)

Validacin como vacuna

Antes de la produccin masiva de la vacuna se deben obtener datos sobre su eficacia. Los pollos se deben vacunar por la misma va que la usada en condiciones de campo. Las aves vacunadas deben ser expuestas y su proteccin determinada teniendo en cuenta los sntomas respiratorios, la rinorrea, y/o la saculitis. Idealmente, se debe de evaluar la proteccin respecto a la prdida de produccin de huevos, pero tales intentos son caros e incmodos de realizar. Eficacia de la prueba: Se vacunan grupos de 20 pollos libres de patgenos especficos (SPF) o al menos libres de micoplasmas, de 2 semanas de edad o mayores mediante una gota en el ojo u otra va de administracin con una dosis de campo de la vacuna viva, o subcutnea o intramuscularmente con una dosis de bacterina (normalmente 0,5 ml). Se mantiene aislado un grupo similar de pollos no vacunados como control. Todos los pollos se exponen a un cultivo lquido de 24 horas de una cepa virulenta de MG, a las 23 semanas despus de la vacunacin. Un mtodo simple de exposicin es la inoculacin de 0,1 ml de un cultivo de descarga en el saco areo torcico posterior. Despus de 710 das del desafo, se realiza la necropsia a todos las aves y se anotan las lesiones en los sacos areos. Otros mtodos alternativos son la prueba por inoculacin de 0,1 ml en el seno infraorbital y el examen de la rinorrea en las aves despus de un perodo de entre 7 y 14 das o aplicarla mediante un aerosol y medir el grosor de la mucosa traqueal en secciones microscpicas de cuatro o seis puntos equidistantes predeterminados (35).

2.

Mtodo de produccin

La vacuna debe producirse en ambientes limpios y seguros, bien separados de los servicios de diagnstico o de la produccin comercial. Debe tenerse especial cuidado en evitar la contaminacin por MG de otros productos producidos en los mismos servicios. La produccin de la vacuna debe realizarse mediante un sistema de siembra por lotes, con una cepa adecuada de MG de origen e historia del cultivo y pureza conocidos. El medio de cultivo es similar al indicado anteriormente. El suero empleado en el medio de crecimiento debe inactivarse a 56C durante 1 hora para evitar la contaminacin con algn micoplasma presente, y esterilizarse por filtracin. Es aconsejable proveerse de suero SPF. Se inocula el medio lquido con un inculo de crecimiento rpido en una proporcin aproximada del 5% (v/v). Se incuba a 37C. La produccin puede ser discontinua, usando grandes contenedores o en un fermentador. Si se trata de cultivos discontinuos, estos se recogen despus de aproximadamente 24 horas de incubacin. Las vacunas vivas se conservan mediante liofilizacin o por congelacin a 70C en nitrgeno lquido o en hielo seco. Para la produccin de bacterinas, se debe concentrar el antgeno, normalmente mediante centrifugacin, ultrafiltracin u otro mtodo adecuado. Las bacterinas se presentan como emulsiones de agua en aceite, por lo general con 80 de aceite mineral, 20% de fase acuosa, y con un agente emulsionante apropiado.

3.

Control interno

Contenido antignico: El ttulo debera ser de 108 a 109 ufc /ml cuando se recoge. La concentracin antignica de las bacterinas es difcil de estandarizar pero se puede basar en el volumen celular comprimido, que normalmente es de un 1% (v/v) de clulas comprimidas en el producto final. Inactivacin de vacunas muertas: con frecuencia la inactivacin se hace con beta-propiolactona o formaldehdo. El agente inactivador y el proceso de inactivacin bajo las condiciones de produccin de vacunas debe lograr la inactivacin del microorganismo vacunal y de los contaminantes potenciales. Antes de la inactivacin, se debe procurar una suspensin homognea exenta de partculas que resulten impenetrables al agente inactivador. Debe realizarse una prueba de inactivacin por cultivo en medio lquido para micoplasmas de cada lote, tanto del producto recogido en masa como del producto final. No debera observarse ningn crecimiento de micoplasmas.

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Esterilidad de las vacunas muertas: El aceite usado en las vacunas debe esterilizarse calentando 1 hora a 160C o por filtracin, y el proceso debe ser eficaz. Las pruebas adecuadas para las vacunas en emulsin de aceite se realizan en cada lote de las vacunas finales como se indica, por ejemplo, en la British Pharmacopoeia (Veterinary) 1985.

4.
a)

Control de lotes
Esterilidad
Las pruebas de esterilidad y ausencia de contaminantes de materiales biolgicos se encuentran en el captulo 1.1.9.

b)

Inocuidad
Prueba de seguridad para vacunas vivas Las aves vacunadas en la prueba de eficacia expuesta anteriormente se pueden usar para evaluar la seguridad de la vacuna. Prueba de seguridad para vacunas muertas

Las aves vacunadas en la prueba de eficacia anteriormente expuesta se pueden observar para efectos locales adversos o efectos sistmicos.

c)

Potencia
Las pruebas de potencia para vacunas vivas e inactivadas se pueden hacer por los procedimientos considerados anteriormente para la prueba de eficacia. El ttulo de las vacunas vivas debe ser suficiente para inducir una infeccin por la va recomendada; en la administracin ocular de la vacuna viva con la cepa F son suficientes 105 CFU/dosis. La dosis recomendada de ts-11 es 107 unidades de cambio de color (CCU)/dosis, y para 6/85, una dosis de 107108 ufc result eficaz en ensayos de infeccin por descarga. Se demostr que para MS-H, eran efectivas dosis de 4.8 105.

d)

Duracin de la inmunidad (vacuna muerta)

Como las poblaciones se exponen generalmente a los 12 meses despus de la vacunacin, la duracin de la inmunidad no es una consideracin importante. Despus de la estimulacin en condiciones naturales, se considera que la resistencia es permanente.

e)

Estabilidad
Se debe comprobar en tres lotes de vacunas que la vacuna supera la prueba de estabilidad 3 meses despus de la duracin requerida.

f)

Conservantes
Normalmente se requieren conservantes para la conservacin de la vacuna en recipientes multidosis. Debe controlarse la concentracin del conservante en la vacuna final y su persistencia durante el tiempo de validez de la vacuna. Se debera utilizar un conservante adecuado que haya sido utilizado para tales fines. Los micoplasmas son sensibles a muchos antimicrobianos excepto a las penicilinas; tales antibiticos no deberan incluirse como conservantes.

e)

Precauciones (riesgos)
Las vacunas con emulsiones de aceite causan grave dao al vacunador si se inyectan accidentalmente en la mano u otros tejidos. En caso de accidente, la persona debe ir de inmediato a un hospital, tomando consigo una muestra de la vacuna. Cada frasco y embalaje de vacuna debe estar marcado con una advertencia sobre las serias consecuencias de la auto-inyeccin accidental. Tales heridas deben ser tratadas por el doctor como una lesin por inoculacin de grasa. El personal implicado en la vacunacin de aves con vacunas vivas por aerosol debe llevar ropa de proteccin y mascarillas.

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Chapter 2.3.5. Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum, M. synoviae)

5.
a)

Pruebas del producto final

Seguridad
Vase la seccin C.4.b.

b)

Potencia
Vase la seccin C.4.b.

REFERENCIAS
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* * *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum y M. synoviae) (vase el cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consltese la lista ms actualizada en la pgina web de la OIE: www.oie.int).

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