RECOMENDAES TCNICAS PARA A PADRONIZAO DE PROCEDIMENTOS E METODOLOGIAS EM BIOLOGIA FORENSE PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRO N 01: Recebimento de material para

exame: a) Verificar a origem do corpo de delito, preocupando-se especialmente com a cadeia de custdia. Conferir o documento de encaminhamento, checando sua legalidade; b) Ao receber o corpo de delito, verificar se est bem acondicionado e as condies da amostra; c) Conferir se as peas que esto citadas no documento da requisio/solicitao da percia correspondem exatamente quelas que foram recebidas. Caso no correspondam, exigir novo documento de encaminhamento ou registrar na requisio/solicitao de exames as divergncias, com o ciente de quem esta entregando ou encaminhando as peas; d) Verificar em que condies a amostra foi acautelada at o recebimento pelo perito (umidade, temperatura, contaminao, tempo de cautela e qualquer outro que possa influenciar nas concluses); e) Verificar sob quais condies a amostra estava sujeita no campo (local da coleta, caractersticas do local, condies climticas, tipo de coleta, caractersticas da vtima e qualquer outro que possa influenciar nas concluses); f) Registrar o que foi recebido para exames nos controles do setor, com anotao do nmero de protocolo, data de entrada e nmero do documento solicitante visando garantir a cadeia de custdia do corpo de delito; g) Realizar a triagem do material quanto ao tipo de exame e registrar por ordem crescente. Priorizar os casos de urgncia (auto de priso em flagrante, reiteraes, tribunal de jri, inquritos policiais e outros); PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRO N 02: DOS EXAMES: A - EXAMES EM MANCHAS DE SANGUE I1.1) PRINCIPAIS TIPOS DE PERCIAS Anlise macroscpica - coleta As caractersticas do suporte devem ser relatadas atravs da sua descrio, como, por exemplo, o material em que confeccionado, cor e estado de conservao. As manchas devem ser localizadas e descritas quanto ao aspecto e tamanho. Deve ser verificado se apresenta quantidade suficiente ao exame, a possibilidade de ter sido lavada, se est livre de contaminaes, bem como as possveis dificuldades quanto a sua extrao. Quando em local de crime, deve ser coletada e guardada de forma a evitar contaminao e/ou deteriorao. Testes de orientao Esses testes so reaes de oxidao que podem detectar a presena de sangue atravs de cor ou luminescncia. Eles no so especficos para sangue podendo dar falso-positivo com outras substncias (extratos vegetais, pus, saliva e outros fluidos orgnicos nas reaes de cor e compostos de ferro e cobre nas reaes de luminescncia). Porm, a reao negativa excludente. Quanto sensibilidade, depende do tipo de teste e outros fatores. Por exemplo, o tipo

de tecido pode influenciar a sensibilidade, tecidos mais absorventes, devido a sua reteno, apresentam melhores resultados. O uso prvio de testes de luminescncia, por exemplo, o luminol, podem afetar testes de certeza, origem, tipagem e outros marcadores moleculares. 1.2) Testes de certeza So testes que confirmam a presena de sangue atravs da formao de cristais de derivados do heme ou de reaes imunolgicas para hemoglobina. O segundo tipo especfico para hemoglobina humana, podendo ser utilizado tambm para determinao da origem, alm de apresentar sensibilidade maior que o teste de cristais. Pode ocorrer falso-positivo no caso de contaminao por ferrugem ou alta temperatura na reao dos cristais e com uso de certos detergentes e exposio prolongada ao luminol na imunocromatografia. 1.3) Testes especficos A determinao da origem humana baseada em reaes antgeno-anticorpo (reconhecimento imunolgico das protenas do sangue) atravs da precipitao/mtodos eletroforticos ou inibio. As reaes de precipitao dependem do anti-soro, sua especificidade, coeficiente de difuso e a concentrao dos reagentes. Seus resultados sofrem influncia da idade da mancha, putrefao, lavagem e aquecimento, podendo provocar falsonegativo. Testes de identificao individual A determinao dos antgenos do sistema ABH, Rh e MN em manchas de sangue so feitas por mtodos indiretos, visto que os glbulos vermelhos j esto destrudos. As manchas sujeitas umidade e contaminao retm sua atividade por pouco tempo. Bactrias podem provocar tanto resultado falso-positivo quanto falso-negativo. Alguns tecidos (seda e l) no se prestam tcnica, podendo provocar falso-positivo. II 2.1) EXAMES MNIMOS INDISPENSVEIS Coleta dos vestgios - Se o sangue se encontra em estado lquido deve coletado com auxlio de tiras de papel absorvente ou tecido estril. As tiras devem ser completamente secas a temperatura ambiente antes de serem guardadas em envelopes de papel; - Se o sangue estiver seco, pode ser solubilizado em soro fisiolgico, coletado e guardado como a tcnica descrita no item anterior. Outra alternativa realizar a raspagem do suporte removendo a crosta; Anlises macroscpicas - Fazer a triagem das manchas, localizando-as no suporte, utilizando, caso lavadas, de reaes de luminescncia; - Descrever o suporte e a mancha; - Observar se a mancha encontrada em quantidade suficiente para as anlises ou se apresenta contaminao; - Escolher o teste a ser utilizado de acordo com as anlises macroscpicas; - As solues devem ser testadas com controles negativos e positivos; Testes de orientao 2.3.1) Reaes de cor - Nestes testes so empregados perxido de hidrognio e um reagente que funciona como indicador, pois o grupo heme atua sobre o perxido liberando oxignio que oxida o indicador formando um composto corado. 2.3.2) Reaes de luminescncia

2.2)

2.3)

As molculas do sangue podem ser excitadas quimicamente atravs de fluorocromos produzindo luminescncia por reao de oxidao com o grupo heme;

2.4)

Testes de certeza 2.4.1) Cristais de Teichmann - H formao de cristais de hemina de cor marrom escura na reao de sangue com cido actico na presena de um sal e aquecimento; 2.4.2) Cristas de Takayama - H formao de cristais de hemocromognio formando bastes de vrias larguras ou em formato de pena pela reao do sangue com pirimidina em meio alcalino; 2.4.3) Imunocromatografia - um teste que combina e determinao do sangue com a determinao da espcie que apresenta grande sensibilidade. realizado em uma membrana cromatogrfica que contm anticorpos imobilizados e anticorpos mveis, que se movimentam por ao capilar. A hemoglobina reage com o conjugado formando uma linha azul; - CUIDADO COM A CONCENTRAO DE HEMOGLOBINA que em excesso pode dar falso-negativo (efeito hook a hemoglobina livre chega zona de reao antes do conjugado se ligando ao anticorpo imobilizado sem corante); Testes especficos 2.5.1) Reao de precipitao - Anticorpo e antgeno interagem em meio lquido ou gel formando um complexo antgeno/anticorpo insolvel. O uso do gel vantajoso porque no h ocorrncia de turbidez, alm de possibilitar a anlise de mais de um sistema antgeno/anticorpo, porm necessrio um longo tempo para a reao; a) Mtodo do anel (lquido) um mtodo rpido e sensvel que forma uma linha interfacial de precipitina entre o anti-soro e o estrato com o antgeno; b) Difuso dupla em duas dimenses O gel colocado em uma placa onde antgeno e anticorpo so colocados em anis circulares separados, difundindose e formando um precipitado em forma de arco. superior ao mtodo anterior porque permite a identificao de antgenos e anticorpos correspondentes em diferentes misturas; c) Mtodos eletroforticos - A tcnica combina a separao de fraes de protenas por mobilidade eletrofortica com a precipitao das protenas em gel devido especificidade antignica. usado para comparaes qualitativas em amostras diferentes. O nmero de arcos de precipitados formados corresponde ao nmero de protenas presentes (imunoeletroforese em duas dimenses, eletroimunodifuso e eletroforese cruzada); 2.5.2) Teste imunocromatogrfico - Tambm utilizado como teste de certeza onde a hemoglobina reage com o conjugado formando uma linha azul; 2.5.3) Teste da inibio da antiglobulina humana - tambm conhecido como teste de Coombs e demonstra a presena de globulina. Neste mtodo a globulina ir inibir a atividade do soro antiglobulina, o qual perder a capacidade de aglutinar hemcias sensibilizadas por anticorpos incompletos. Se uma mancha de sangue contm

2.5)

globulinas humanas e incubada com anti-soro globulina humano, essa globulinas iro neutralizar o anti-soro e nenhuma aglutinao ocorrer, indicando que a mancha de origem humana; 2.6) Testes de identificao individual - Os grupos sangneos so caracterizados pela presena de substncia antignica nas hemcias que aglutina em presena de anticorpo especfico. Em relao ao sistema ABO, pesquisada a presena dos antgenos A e B e anticorpos a e b. Os antgenos so determinados atravs de lminas e tubos pelos soros anti-A e anti-B (humanos/anticorpos naturais, monoclonais e lecitinas), enquanto os anticorpos so identificados atravs de classificao reversa, por suspenso de hemcias (A e B). Em relao ao sistema MN e Rh, so pesquisados os antgenos M, N e o fator D; - So utilizados mtodos indiretos: a) Teste de Lattes O extrato da mancha colocado diretamente com o indicador de clulas, verificando a aglutinao. til apenas nas duas primeiras semanas e no pode ser usado isoladamente devido contaminao; b) Absoro-Eluio O antgeno da mancha colocado com o anticorpo que absorvido, o excesso de anticorpo lavado e os anticorpos absorvidos so eludos e identificados por indicadores. Mtodo mais sensvel que pode utilizar pequenas quantidades de sangue; c) Aglutinao Mista Teste utilizado quando a quantidade de material nfima. O anti-soro adicionado mancha, depois da absoro o excesso lavado, o anticorpo que reagiu permanece, os indicadores so adicionados e se unem a extremidade livre (o anticorpo reage com o antgeno e com o indicador). TCNICAS E MTODOS EMPREGADOS NOS EXAMES Exame macroscpico e coleta de evidncias a) Exame visual do local do exame ou do suporte encaminhado a exame, visando verificar seu estado geral, preservao, alm de identificar e selecionar os vestgios; b) Caracterizao das condies em que os vestgios se encontravam; c) Quanto coleta, necessrio observar a quantidade coletada que deve suficiente aos exames subseqentes, bem como a manuteno de sua integridade; d) Se o suporte que contm a mancha possibilitar o transporte, devemos encaminhlo ao laboratrio, caso contrrio apenas a mancha deve ser coletada; e) Para embalagem e armazenamento devemos utilizar invlucros de papel que evitam a contaminao; f) As amostras devem ser etiquetadas com os dados da ocorrncia; g) Os vestgios devem ser mantidos na geladeira e encaminhados com brevidade ao laboratrio para exames; h) Caso as manchas tenham sido lavadas, se torna necessrio a realizao de testes de orientao para localiz-las como, por exemplo, a lanterna com lmpada UV ou a aplicao de luminol; i) No caso de coleta no local do crime, devem ser anexadas fotografias ilustrativas. Testes de orientao 3.2.1) Reaes de cor a) Reagente de Kastle-Meyer (fenolftalena)

III 3.1)

3.2)

Procedimento: A mancha (tecido) ou crosta deve ser macerada em salina. Adicionar duas gotas do reagente de KIastle-Meyer diludo (1:5 em etanol) a duas gotas do macerado. Esperar por 30 segundos e adicionar uma gota de H2O2 a 3%. Os reagentes devem ser guardados sob refrigerao e em frasco escuro. Resultado: colorao vermelha Obs1: Pode apresentar erro em presena de sais de ferro, cobre, oxidantes em geral, suco gstrico e qualquer substncia capaz de decompor a H2O2. b) Reagente de Adler-Ascarelli Procedimento: A mancha (tecido) ou crosta deve ser macerada em salina. Adicionar duas gotas do reagente a duas gotas do macerado. Esperar por 30 segundos e adicionar uma gota de H2O2 a 3%. Resultado: colorao azul. Obs1: Pode apresentar erro em presena de sais de ferro e oxidase de vegetais; Obs2: Apresenta sensibilidade maior que o primeiro reagente; 3.2.2) Reaes de luminescncia a) Luminol Procedimento: Antes de usar deve ser adicionado 10 mL de H 2O2 a 3% e 90 mL de gua destilada. Para aplicao deve ser utilizado um frasco vaporizador e o resultado deve ser observado em ambiente escuro (sem luz) Resultado: Luminescncia branco-azulada. Obs1: Sua utilizao afeta o exame de identificao individual por tipagem sangnea, porm no afeta o DNA; 3.3) Testes de certeza 3.3.1) Cristais de Teichmann Procedimento: Preparar uma lmina contendo o macerado da mancha, cobrir com lamnula, adicionar o reagente pela borda evitando bolhas de ar, aquecer a lmina at o lquido borbulhar e observar ao microscpico; Resultado: Cristais rmbicos ou prismticos, isolados ou agrupados de cor marrom escura. Obs 1: Recomendado para extratos concentrados da mancha. 3.3.2) Cristais de Takayama Procedimento: Preparar uma lmina contendo o macerado do material suspeito, adicionar uma gota do reagente pela borda evitando bolhas de ar, aquecer a lmina por 30 segundos; Resultado: Bastes em formato de pena de cor rsea avermelhada; Obs 1: Recomendado para fibras de tecido ou raspado de crosta. Obs 2: Aps o procedimento, colocar a lmina na geladeira a fim de acelerar a reao. Obs 3: No sangue decomposto os cristais podem ter forma de agulha. 3.3.3) Imunocromatografia Procedimento: Colocar um segmento pequeno da mancha em um tubo, quebrar a ponta do frasco tampo, gotejar sobre a mancha e fazer um macerado. Diluir o macerado em diluio maior que 1:1000 para evitar o efeito hook. Colocar 100 L do macerado na abertura do dispositivo teste. Ler o resultado em 10 minutos. Resultado: Aparecimento das duas linhas. Obs 1: No resultado negativo s aprece a linha de controle. 3.4) Testes especficos As manchas devem ser extradas com pouca salina. 3.4.1- Testes de precipitina

Obs1: Indicados para materiais degradados, porm o anti-soro no encontrado com facilidade no mercado. a) Mtodo do anel - Diluir o extrato com salina, deixar escorrer pela parede de um tubo de ensaio inclinado 50 l dessa substncia e, em seguida, 100 l do anti-soro. Deixe o tubo em repouso por cerca de 3 minutos na posio vertical; Resultado: Observar com luz oblqua uma linha fina de precipitina na interface das substncias. b) Difuso dupla em duas dimenses Dissolver, em Banho Maria, 1 g de gar em 100 ml de gua destilada. Distribuir 4 ml do gar quente em uma placa de petri. Aps secar, fazer escavaes de cerca de 5 mm de dimetro em torno de um anel central. Colocar 15 l de anti-soro humano no anel central, nos outros anis deve ser colocada a mesma quantidade de extrato de mancha, controle negativo e positivo; Resultado: formao de arcos de precipitina entre o anti-soro e os anis de extrato da mancha. 3.4.2- Teste da antiglobulina humana Obs1: apresenta baixo custo e fcil de executar. a) Titular o soro antiglobulina humano (Coombs) - Identificar 6 tubos de ensaio (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64), colocando em cada tubo uma gota de salina e uma gota de soro humano diludo 1:1000; - Diluir o soro antiglobulina humano nos ttulos indicados, colocando uma gota de cada diluio no seu respectivo tubo e deixando em repouso por 15 minutos; - Adicionar uma gota de hemcia tipo O sensibilizada, homogeneizar e deixar em repouso por 15 minutos; - Centrifugar e observar no microscpio para detectar a primeira diluio onde houver ausncia total de aglutinao. b) Sensibilizao das hemcias - Fazer uma suspenso de hemcias O Rh positivo a 10% em salina, colocando 10 gotas em tubo de ensaio; - Adicionar 10 gotas de soro anti-Rh diludo 1:10, incubar a 37C por trinta minutos; - Lavar quatro vezes com salina, decantar todo o sobrenadante da ltima lavada e acrescentar 1,5 ml de salina; c) Procedimento - Marcar quatro tubos, sendo: n (1) Controle positivo com 1 gota de soro diludo 1:1000; n (2) Controle negativo com 1 gota de salina; n (3) Controle negativo com 1 gota do macerado do suporte ou fragmento do suporte; n (4) Teste com 1 gota do macerado da mancha; - No caso de macerado - Adicionar a cada tubo uma gota de soro antiglobulina humano diludo conforme o ttulo adequado (procedimento a) - Deixar em repouso por 15 minutos no caso de macerado e levar a refrigerao por 24 h no caso de mancha; - Acrescentar uma gota de hemcia sensibilizada a cada tubo (no caso de mancha retirar previamente a mancha e suporte do tubo); - Homogeneizar, deixar em repouso por 15 minutos, centrifugar (1000 rpm/1 minuto) e levar ao microscpio. Resultado: A ausncia de aglutinao indica a presena de protena humana. 3.5) Testes de identificao individual a) Antgenos A e B - Marcar seis tubos, sendo trs com a inscrio A e trs com a inscrio B;

Cortar seis pequenos segmentos de suporte, sendo dois do suporte contendo a mancha, dois do suporte sem mancha e o dois de um controle conhecido; - Com cada um dos trs tipos de segmentos, colocar um corte no tubo A e outro no tubo B, adicionando trs gotas no diludas de anti-A e anti-B monoclonais respectivamente; - Aps incubar a 4C por 20 horas, eliminar o anti-soro no absorvido lavando seis vezes com salina gelada, agitando os tubos por 2 minutos; - Aps a ltima lavada, retirar a salina gelada e colocar duas gotas de salina temperatura ambiente; - Aps incubar a 56C por 15 minutos, retirar as amostras dos tubos e colocar uma gota de suspenso de clulas a 3% em salina, sendo hemcias A no tubo que foi colocado anti-A e hemcias B no outro tubo; - Agitar por 10 minutos e deixar em repouso por 30 minutos Resultado: Se for tipo A aglutina no tubo A, se for tipo B no tubo B, se AB aglutina nos dois e, quando no houver aglutinao tipo O. b) Antgenos H - Cortar um pequeno segmento do suporte contendo a mancha, suporte sem a mancha e controle conhecido, colocar em tubos identificados e adicionar trs gotas de soro anti-H lecitina no diludo; - Seguir os passos da tcnica anterior substituindo a temperatura de incubao de 56C para 60C, colocar uma gota de suspenso de clulas O a 3%; - Agitar por 10 minutos e deixar em repouso por 30 minutos IV 4.1) EQUIPAMENTOS E RECURSOS INDISPENSVEIS Exames de coleta de evidncias/macroscpicos a) Invlucros de papel; b) Luminol 0,1 g Luminol 5 g de Carbonato de Sdio 100 ml gua Destilada c) Swab; d) Soro fisiolgico; e) Tiras de tecido ou papel estril; f) Esptula; g) Conta-gotas; h) Mquina fotogrfica digital com zoom mnimo de 10 x; i) Etiquetas; j) Tesoura; k) Duas bancadas, sendo uma de 5m de comprimento/0,70m de largura/0,70 de altura e outra de 8m de comprimento/0,70m de largura/0,70 de altura, com iluminao fria para exame visual do corpo de delito, placas de Petri, vidros de relgios, tubos de ensaio, etc Exames de orientao a) Reagente de Kastle-Meyer - Pode ser adquirido comercialmente com objetivo de detectar sangue oculto nas fezes. 2 g de Fenolftalena 20 g de NaOH 20 g de Zinco (p) 100 ml gua destilada

4.2)

b) Perxido de Hidrognio a 3% (uso de gua destilada para o seu preparo) c) Reagente de Adler-Asacarelli (Benzidina-actica) Deve ser preparada no momento do uso devido decomposio rpida, filtrada e colocada em frasco escuro. Pode ser adquirida comercialmente como tiras para urinlise; 0,16 g Benzidina 4 ml de cido Actico Glacial 4 ml H2O2 a 3% d) Cadinho; e) Luminol; f) Swab; 4.4) Exames de certeza a) Cristais de Teichmann 0,1 g Cloreto de Potssio 0,1 g Brometo de Potssio 0,1 g Iodeto de Potssio 100 ml cido Actico Glacial b) Cristais de Takayama 3 ml soluo de NaOH a 10% 3 ml soluo de glicose a 10% 3 ml piridina 7 ml gua destilada c) Lmina; d) Lamnula; e) Bico de Bunsen; f) Microscpio esteroscpico; g) Geladeira; h) KIT - Tampo Tris pH 7,5 como diluente. Membrana cromatogrfica (conjugado de partculas azuis cobertas por anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e anticorpos anti-IgG) 4.5) Exames especficos a) Tubos de ensaio; b) Salina; c) Anti-soro; d) gar; e) Becker; f) Fogareiro; g) Esptula; h) Bico de Bunsen; i) Placa de Petri; j) Soro antiglobulina humano; k) Hemcias O sensibilizadas; l) Centrfuga; m) Microscpio estereoscpio; n) Decantador; Exames de identificao individual a) Soro anti-A, anti-B e anti-H; b) Salina; c) Tubos de ensaio; d) Estufa;

4.6)

e) Hemcias A, B e O; B-EXAMES EM MANCHAS DE SECREES ORGNICAS I - PRINCIPAIS TIPOS DE PERCIAS 1.1) Anlise macroscpica - coleta As caractersticas do suporte devem ser relatadas atravs da sua descrio, como, por exemplo, o material em que confeccionado, cor e estado de conservao. As manchas devem ser localizadas com auxlio de luz ultravioleta, pois alguns fluidos corporais como, por exemplo, saliva, urina e esperma se tornam luminescentes quando expostos a ela. Devem ser descritas quanto ao aspecto e tamanho. Deve ser verificado se apresenta quantidade suficiente ao exame, se est livre de contaminaes, bem como as possveis dificuldades quanto a sua extrao. Quando em local de crime, deve ser coletada e guardada de forma sa evitar contaminao e/ou deteriorao, sem dobrar o tecido. Testes de identificao para esperma 1.2.1) Microscpico Indubitavelmente, prova definitiva da presena de esperma a localizao de espermatozides, porm sua identificao microscpica em manchas nem sempre possvel, pois inmeros fatores podem levar a sua destruio. Para o preparo de lminas coradas deve ser usada a colorao de Christmas Tree e nos exames a fresco o corante Eosina B. 1.2.2) Testes qumicos Baseados na deteco de componentes especficos do esperma ou que sejam encontrados em nveis elevados nessa secreo. a) Colina (Cristais de Florence) uma substncia formada depois da ejaculao pela ao da fosfatase cida prosttica na fosforilcolina secretada pelas vesculas seminais. Um teste clssico a reao de Florence, porm existem mtodos mais seguros baseados na reao da colina oxidase. No um teste especfico, pois resulta em falso-positivo em extrato de vrios rgos corporais e esperma de outras espcies, alm da possibilidade de falso-negativo, possivelmente, devida a sua distribuio irregular no smen e a contaminao por microorganismos. Junta-se o reagente de Florence (lugol) ao extrato da mancha formando cristais de iodeto de colina de formato rombodrico e cor marrom-amarelado. b) Cristais de Barberio Tambm um teste apenas de probabilidade. Nesse teste cristais com aspecto de agulhas grossas de cor amarelada resultam de uma reao aquecida do extrato da mancha com o cido pcrico. c) Fosfatase cida So enzimas, presentes em grande quantidade no esperma, capazes de hidrolizar fosfatos orgnicos em meio cido. A deteco de sua atividade pode ser feita a partir de vrios substratos (fenilfosfato de sdio, p-nitrofenil-fosfato, L(+)-tartarato como inibidor, -naftil-fosfato, timolftalena monofosfato de sdio). O ltimo substrato mais especfico e elimina a necessidade de utilizar outras substncias para diferenciar a fosfatase prosttica de outras fosfatases, sendo o mais aconselhado. As fosfatases seminal e vaginal no podem ser discriminadas, pois vrios fatores podem elevar o nvel de fosfatase endgena nas mulheres, desta forma, a presena de grande quantidade de fosfatase apenas indicativa da presena de esperma e no conclusivo. d) Teste imunolgico O plasma seminal contm uma glicoprotena de origem prosttica denominada PSA. Tambm pode estar presente, em baixas concentraes, no soro humano, podendo aumentar em indivduos com patologias prostticas. Os mtodos para sua determinao so baseados em

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reaes antgeno/anticorpo que se estendem desde reaes de precipitina at mtodos mais sensveis como, por exemplo, ELISA e imunocromatografia. O ELISA emprega um anticorpo conjugado com uma enzima para deteco do antgeno. Os testes imunocromatogrficos utilizam uma membrana cromatogrfica onde os anticorpos e as amostras se movem por capilaridade. O excesso de PSA em relao ao conjugado pode dar falso-negativo (efeito hook - o PSA livre chega zona de reao antes do conjugado se ligando ao anticorpo imobilizado sem corante). De acordo com pesquisas realizadas, o PSA especfico no sendo encontrado em nenhum outro fluido corporal alm do esperma, exceto na urina ps-ejaculado. 1.2) Testes especficos A determinao da origem humana baseada em reaes antgeno-anticorpo (reconhecimento imunolgico das protenas humanas) atravs da precipitao. 1.3) Testes de identificao de secrees Esses testes dependem da secreo considerada e so baseados nas substncias que as compem. 1.4) Testes de identificao individual em secrees So testes baseados na presena das substncias grupo-especficas ABH nas secrees sob a forma de antgenos hidrossolveis e em concentraes maiores que no sangue. Desta forma, possvel fazer tipagem em esperma, saliva, secreo vaginal, suco gstrico e lquido amnitico considerando o carter secretor do examinado, ou seja, aquelas pessoas cujas secrees contm esses antgenos (cerca de 80% da populao). Esses antgenos tambm podem ser encontrados, em pequena concentrao, no suor, lgrima, bile e leite. A contaminao por microorganismos inviabiliza o exame. Os microorganismos presentes na secreo vaginal e saliva podem se multiplicar se a mancha no seca imediatamente. II - EXAMES MNIMOS INDISPENSVEIS 2.1) Coleta dos vestgios Se o esperma se encontra em estado lquido deve coletado com swabs, acondicionados em frascos limpos ou preservados em cartes especiais; O esperma deve ser conservado na geladeira e enviado ao laboratrio rapidamente; Se o esperma estiver seco, deve ser coletado, recortando o suporte e guardado sem que seja dobrado; As manchas devem secar antes de serem acondicionadas em invlucros de papel; Para saliva, aconselhvel embeb-la em papel filtro, circular com um lpis a regio, deixar secar e acondicionar invlucros de papel; O material deve ser etiquetado; 2.2) Anlises macroscpicas Fazer a triagem das manchas, localizando-as no suporte, utilizando, se for o caso, luz ultravioleta; Descrever o suporte e a mancha; O esperma tem forma geralmente irregular, de colorao branca ao amarelo citrino, odor caracterstico devido aos derivados fosfatados e em suporte tem aspecto de goma; A saliva tem forma irregular e cor amarelada ou esbranquiada; A mancha de leite bem definida e amarelada; A mancha de colostro tem cor amarela acinzentada sendo ntida nos bordos;

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2.3)

A mancha de urina tem odor caracterstico e cor amarela esverdeada; Observar se a mancha encontrada em quantidade suficiente para as anlises ou se apresenta contaminao. Extrao do material As tcnicas de identificao e tipagem necessitam de um macerado que deve ser feito com pouca salina. Testes de identificao de esperma a) Microscopia - Eosina B; - Christmas Tree; b) Teste Qumico - Fosfatase cida c) Teste imunolgico - PSA Testes de identificao de outras secrees a) Saliva A saliva pode ser identificada atravs do exame microscpio pela presena de clulas bucais ou atravs de exame qumico na pesquisa de sulfocianeto de potssio (outros lquidos orgnicos tambm contm a substncia) e de ptialina. b) Leite e Colostro A Mancha pode ser identificada atravs do exame microscpio pela presena de clulas ricas em glbulos de gordura e granulaes proticas ou atravs do exame qumico com guaiacol, hidroquinona, pirocatequina e iodo que d cor escura. c) Urina A mancha pode ser identificada atravs do exame qumico baseado na presena de seus componentes normais, sendo a pesquisa de creatinina a mais especfica. Teste de identificao individual em secrees O mtodo mais indicado o de absoro-inibio que baseado na capacidade que as substncias grupo-especficas tm de neutralizar os anticorpos correspondentes que, conseqentemente, perdem a capacidade de reagir com antgenos correspondentes nas hemcias.

2.4)

2.5)

2.6)

III - TCNICAS E MTODOS EMPREGADOS NOS EXAMES 3.1) Exame macroscpico e coleta de evidncias a) Caracterizao das condies em que os vestgios se encontravam; b) Exame visual do local do exame ou do suporte encaminhado a exame, visando verificar seu estado geral, preservao, alm de identificar e selecionar os vestgios; c) Quanto coleta, necessrio observar a quantidade coletada que deve suficiente aos exames subseqentes, bem como a manuteno de sua integridade; d) Para embalagem e armazenamento devemos utilizar invlucros de papel que evitam a contaminao; e) As amostras devem ser etiquetadas com os dados da ocorrncia; f) Os vestgios devem ser mantidos na geladeira e encaminhados com brevidade ao laboratrio para exames; g) No caso de coleta no local do crime, devem ser anexadas fotografias ilustrativas. 3.2) Extrao do material

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a) Swab Procedimento: Cobrir o swab com 1ml de salina em um tubo de ensaio. Extrair por 20 minutos, pressionar o swab contra a parede do tubo para eliminar a salina absorvida e retir-lo. Centrifugar o extrato. b) Manchas Procedimento: A mancha (tecido) deve ser cortada em segmentos, colocada em tubo de ensaio e coberta por salina. Aps 3 horas, retirar o extrato e centrifug-lo. Obs. 1: O sedimento usado para microscopia e DNA; Obs. 2: O sobrenadante usado para fosfatase cida, PSA e tipagem; Obs. 3: Para PSA e fosfatase cida, macerar imediatamente antes de usar ou congelar o sobrenadante. 3.3) Identificao do esperma 3.3.1) Microscopia a) Eosina B Procedimento: Colocar 10l do sedimento em uma lmina, adicionar a mesma quantidade de Eosina B a 0,1% e cobrir com lamnula. Observar ao microscpio com aumento de 400X; Resultado: Citoplasma cora em rosa claro e o ncleo em rosa escuro. Fazer a contagem: - muito reduzido: at 2 sptz/lmina - reduzido: 2-5 sptz/lmina - moderado 5-10 sptz/lmina - acentuado: > 10 sptz/lmina b) Christmas Tree Procedimento: Colocar o sedimento em uma lmina, fixando pelo calor, cobrir com o corante nuclear fast red por 15 minutos, lavar com gua destilada at ficar incolor, adicionar gotas do corante picro-ndigocarmim. Aps 30 segundos, lavar com lcool etlico absoluto P.A. e secar. Observar ao microscpio com aumento de 400X. Resultado: Espermatozide com citoplasma corado em verde e ncleo (cabea) de vermelho a rosa. 3.3.2) Teste qumico - Fosfatase cida Procedimento: Numerar trs tubos de ensaio: tubo 1 : colocar 50l do extrato da mancha; tubo 2 : 50l de amostra conhecida de esperma; tubo 3 : 50l de salina. Adicionar a cada tubo, 20 l do substrato timolftalena. Aguardar 30 minutos e adicionar 100l de reagente de cor. Resultado: cor azul ou azul esverdeada indica teste positivo. Obs. 1: Esse teste apenas indicativo da presena de esperma. Obs. 2: Reagentes podem ser adquiridos comercialmente em kit do mtodo colorimtrico para fosfatase cida prosttica. 3.3.3) Teste imunolgico - PSA Procedimento: Colocar 100l do macerado na abertura do dispositivo do teste (kits comerciais). Esperar 5 minutos para ler o resultado, confirmar negativo aps 10 minutos. Caso d negativo, o macerado deve ser diludo 1:100 e o exame repetido, pois pode estar ocorrendo o efeito hook. Resultado: aparecimento de duas linhas na zona de teste e de controle. Obs. 1: Os testes so realizados em equipamentos computadorizados. 3.4) Teste de identificao de secrees a) Saliva

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Pesquisa de KCNS (sulfocianato de potssio) Procedimento: O macerado da mancha tratado com HC diludo a 50% e soluo de FeC3 a 10%. Resultado: A cor vermelha indica a probabilidade de seu saliva devido formao de Fe(CNS)3. Pesquisa de Ptialina Procedimento: Juntando o extrato da mancha com amido cozido e uma gota de lugol a 30%. Resultado: O no aparecimento da cor azul indica a presena de saliva, pois a ptialina hidrolisou o amido. b) Leite Guaiacol Procedimento: Colocar o extrato da mancha com gotas de soluo alcolica de guaiacol a 10%. Resultado: A colorao amarelo-alaranjada indica leite ou colostro. Hidroquinona Procedimento: Colocar o extrato da mancha com gotas de soluo de hidroquinona a 10%. Resultado: A colorao rsea indica leite ou colostro. Pirocatequina Procedimento: Colocar o extrato da mancha com gotas de soluo de pirocatequina a 10%. Resultado: A colorao amarelo-escura indica leite ou colostro. c) Urina Procedimento: Cortamos 1cm2 do suporte com a mancha e adicionamos 1 gota do reagente de Jaffe-Dominguez-Martinez recentemente preparado. Resultado: A colorao vermelho-alaranjada indica urina. 3.5) Teste de identificao individual em secrees Procedimento: Para preparar o material, em caso de esperma em estado lquido deve ser diludo 1:20, enquanto manchas (tecido ou papel filtro) ou swab devem ser maceradas com salina e centrifugadas. Adicionar 50l dos soros anti-A e anti-B, diludos em prvia titulao, aos respectivos tubos e 100l do soro anti-H lecitina sem diluir. Deixar os tubos 4C de 1 at 18 horas. Levar a banho-maria 25C por 10 minutos. Adicionar 1 gota de suspenso de hemcias A a 3% onde foi colocado o soro anti-A, hemcia B no tubo com soro anti-B e hemcia O no tubo com anti-H. Agitar por 3 minutos. Centrifugar por 1 minuto os tubos identificados como A e B, desprezar o sobrenadante e adicionar 100l de salina a cada tubo. O tubos H devem ficar em repouso por 15 minutos antes da centrifugao, centrifugar por 1 minuto, desprezar o sobrenadante e adicionar 100l de salina. Soltar o boto de hemcias e ler macroscopicamente. Resultado: a ausncia de aglutinao nos tubos A indica a presena de antgenos A, a ausncia de aglutinao nos tubos B indica presena de antgenos B e ausncia de aglutinao nos tubos H indica presena de antgenos H. Titular os anti-soros A, B, e H: Identificar 3 sries de tubos de ensaio com A., B e H para as diluies: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 e 1:256. Coloque nos tubos das sries 1:2, 50l de salina e a mesma quantidade de soro anti-A, anti-B e anti-H, respectivamente em cada srie; Homogeneizar, retirar 50l das misturas em passar para os tubos das sries 1:4 e assim sucessivamente at sua diluio 1:256, desprezando os ltimos 50l; Adicionar 50l de suspenso de hemcias A, B ou O a 3% em salina nos tubos marcados A, B ou H, respectivamente;

14 -

Agitar por 3 minutos, centrifugar por 1 minuto e ressuspender os botes de hemcia e observar macroscopicamente para detectar o ltimo tubo onde h aglutinao (mesmo fraca) e baixar dois ttulos.

4.3)

Teste de identificao individual em secrees o) Soro anti-A, anti-B e anti-H; p) Tubos de ensaio; q) Soro fisiolgico (salina); r) Becker; s) Fogareiro; t) Bico de Bunsen; u) Centrfuga; v) Hemcias A, B e O; w) Agitador.

IV 4.1)

EQUIPAMENTOS E RECURSOS INDISPENSVEIS Exames de coleta de evidncias macroscpicas a) Invlucros de papel; b) Luz ultravioleta; c) Swab; d) Tiras de tecido ou papel-filtro estril; e) Conta-gotas; f) Mquina fotogrfica digital com zoom mnimo de 10X; g) Etiquetas; h) Tesoura; i) Recipiente de isopor; j) Lpis; k) Duas bancadas, sendo uma de 5m de comprimento/0,70m de largura/0,70m de altura e outra de 8m de comprimento/0,70m de largura/0,70m de altura, com iluminao fria para exame visual do corpo de delito, placas de Petri, vidros de relgios, tubos de ensaio, etc; l) Geladeira. Extrao do material - Swab; - Salina; - Tubo de ensaio; - Centrfuga; - Tesoura; - Cadinho. Exame de identificao para esperma a) Microscpico - Microscpio estereoscpio; - Lmina e lamnula; - Eosina B a 0,1% 0,1g de Eosina 100ml de gua destilada - Christmas Tree

4.2)

4.3)

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nuclear Fast red Dissolver 5g de sulfato de alumnio em 100mL de gua deionizada quente. Adicionar 0,1g de nuclear fast red, esfriar e filtrar e conservar a 4C. ii. Corante Picro-ndigocarmim Dissolver 1,3g de cido pcrico em 100ml de gua deionizada. Adicionar 0,33g de ndigocarmin agitando at a dissoluo completa. Filtrar e conservar a 4C. b) Teste qumico - Fosfatase cida - Kit comercial do mtodo colorimtrico; - Salina; - Timolftalena. c) Teste imunolgico - PSA - Kit comercial 4.4) -

i. Corante

Teste de identificao de secrees a) Saliva Tubo de ensaio HC diludo a 50% soluo de FeC3 a 10% Amido Lugol a 30% b)Leite Tubo de ensaio Guaiacol a 10% Papel-filtro Hidroquinona a 10% Pirocatequina a 10% c)Urina Tubo de ensaio Tesoura Reagente Jaffe-Dominguez-Martinez NaOH a 10% cido pcrico saturado Teste de identificao individual em secrees a) Soro anti-A, anti-B e anti-H; b) Tubos de ensaio; c) Soro fisiolgico (salina); d) Becker; e) Fogareiro; f) Bico de Bunsen; g) Centrfuga; h) Hemcias A, B e O; i) Agitador. C -EXAMES EM PLOS / FIBRAS

4.5)

I - PRINCIPAIS TIPOS DE PERCIAS

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1.1)

Identificao e comparao de plos e/ou fibras - coleta O exame de identificao de plos visa caracterizar a origem, humana ou animal, e no caso de fibras se vegetal ou sinttica, bem como fazer a comparao, caso necessrio. A coleta do fio deve ser realizada observando-se o tipo de suporte em que est aderido a fim de preservlos intactos. Exames para identificao do plo/fibra 1.2.1) Macroscpicos - Comprimento - Tipo - Cor - Impregnaes 1.2.2) Microscpicos - Extremidade - Bulbo - Medula - Crtex - Cutcula - Dimetro - Impregnaes II - EXAMES MNIMOS INDISPENSVEIS 2.2) Exames de coleta dos fios 2.2.1) Coleta de fios in vivo e post-mortem - Deve ser realizada cuidadosamente visando-se extrair o fio ntegro, utilizando material/equipamento adequado ao suporte (cabea e/ou demais regies do corpo); - As amostras devem ser individualizadas e acondicionadas em envelope de papel lacrado; - As amostras embebidas ou impregnadas com substncias orgnicas (sangue, urina, esperma, saliva e/ou outras), devem secar a temperatura ambiente antes de serem acondicionadas; - O material deve ser devidamente etiquetado e encaminhado com brevidade para o laboratrio. 2.2.2) Coleta de fios em suporte removvel - Encaminhar os fios juntamente com o suporte; Para os plos aderidos a um suporte contendo substncias orgnicas e/ou outras, deve-se secar os mesmos a temperatura ambiente, antes de serem acondicionados; - O material deve ser acondicionado em embalagem de papel e em seguida se necessrio em saco plstico, devidamente etiquetado e encaminhado com brevidade ao laboratrio. 2.2.3) Coleta de fios em suporte no removvel - Deve ser realizada cuidadosamente, utilizando material/equipamento adequado ao suporte, visando-se manter o fio ntegro; - As amostras devem ser individualizadas e acondicionadas em envelope de papel;

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As amostras embebidas ou impregnadas com substncias orgnicas (sangue, urina, esperma, saliva e/ou outras), devem secar a temperatura ambiente antes de serem acondicionadas; O material deve ser devidamente etiquetado e encaminhado imediatamente ao laboratrio. 2.3) Exames para comparao Comparar as caractersticas macroscpicas e microscpicas de cada uma das amostras estudadas (vide item 1.2). - Animal - Humano - Fibra - Natural (vegetal) - Sinttica - Semelhantes ou Dessemelhantes. III - TCNICAS E MTODOS EMPREGADOS NOS EXAMES 3.1) Exame macroscpico e coleta de evidncias a) Exame visual do local do exame ou do suporte, visando verificar seu estado geral, preservao, alm de identificar e selecionar os vestgios; Caracterizao das condies em que os vestgios foram recebidos; b) necessrio observar a quantidade de fios que deve ser suficiente aos exames subseqentes, bem como a manuteno de sua integridade; (para comparao o ideal no mnimo 10 unidades) c) Se o suporte pode ser removido, o mesmo deve ser encaminhado juntamente com o material a ser examinado; d) Para embalagem armazenamento devemos utilizar invlucros de papel que evitam a contaminao; e) As amostras devem ser etiquetadas com todos os dados da ocorrncia (histrico); f) Anlise do material atravs da lupa microestereoscopica. 3.2) Preparao para exame microscpico (dependente do fio a ser examinado) a) Limpeza b) Desidratao c) Descolorao d) Montagem lmina-lamnula, com uso de blsamo do Canad ou Entellan. Exame microscpico da evidncia a) Observao atravs de microscpico binocular; b) Uso de escala micromtrica.

3.3)

3.4)

Identificao do Fio a) Plo Humano x Plo Animal Cabelos - so fios mais longos e mais finos que nascem na cabea dos seres humanos. Plos - so sempre mais curtos, mais grossos e com caractersticas outras, se espalham pelo corpo humano e cobrem os seres das outras espcies (animais). A identificao do fio (plo) dada por um conjunto de caracteres da medula, do crtex e da cutcula.

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Macroscopicamente, os plos animais so, em geral, curtos e fusiformes, de colorido uniforme ou variado e de diversas espessuras. Os plos humanos so flexveis e de colorido homogneo. Caracterstica dos plos humanos: Medula Ausente ou presente. Quando presente, mostra um desenvolvimento rudimentar; clulas invisveis ou quase; o dimetro muito reduzido; cheias de bolhas de ar; clulas interrompidas. Crtex Clulas cornificadas e espessas; pigmento em forma de gro finssimo e homogneo; mais larga que no animal. Cutcula - Formada por escamas delgadas e transparentes sem salincias; forte imbricamento; clulas dispostas na superfcie como telhas de um telhado. Caracterstica dos plos animais: Medula - Geralmente presente; clulas visveis e aparentes; dimetro bastante amplo; cheia de bolhas de ar como sacos grandes e pequenos; clulas contnuas. Crtex - Forma de cilindro oco e delgado; pigmentos em forma de gros irregulares maiores que nos plos humanos; muito reduzida. Cutcula - Escamas grossas e salientes; imbricamento com serrilhado bem visvel; aspecto de um conjunto de espinhos. b) Fibra Natural (vegetal) x Fibra Sinttica Fibra natural (vegetal) - Estrutura com clulas bem caractersticas ao exame microscpico. Fibra sinttica - Estrutura geralmente tubular e oca ao exame microscpico. A identificao de uma fibra dada pelo diagnstico diferencial com as caractersticas dos plos, associado a testes fsico-qumicos. Caracterstica de fibra vegetal: Clulas vegetais bem caracterizadas microscopia; queima-se rapidamente com odor caracterstico, sendo que a ponta queimada fica afilada. (plo humano: a queima mais demorada, odor desagradvel e caracterstico, ponta queimada arredondada em forma de baqueta de tambor) Teste Qumico Procedimento: Em tubo de ensaio colocar o fio, adicionar 1,0mL de gua destilada, 2 gotas de -naftol (soluo 10% em lcool 95%v/v) e 1mL de cido sulfrico). Resultado: Se a fibra for vegetal ela se dissociar e o lquido apresentar cor violetaescura. Se for animal (plo) aparecer cor marrom-avermelhada. Caracterstica de fibra sinttica: Identificada microscopicamente pela ausncia de clulas. IV 4.2) EQUIPAMENTOS E RECURSOS INDISPENSVEIS Exames de coleta de evidncias macroscpicas - Luvas descartveis; - Pina estril; - Lupa; - Invlucros de papel; - Tesoura; - Etiquetas; - Lpis. Exame microscpico e fsico-qumico da evidncia - Lupa estereoscopica;

4.3)

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- Microscpio binocular; - Escala micromtrica; - Rgua milimtrica transparente; - Beckers; - Basto de vidro; - Lmina e lamnula; - Tubos de ensaio; - Placa de Petri; - gua destilada; - ter sulfrico P.A.; - cido ntrico P.A.; - lcool etlico P.A.; - Xilol comercial; - -naftol; - cido sulfrico P.A.; - Blsamo do Canad ou Entellan. D - EXAMES EM ENTOMOLOGIA FORENSE I1.1) PRINCIPAIS TIPOS DE PERCIAS DE ENTOMOLOGIA FORENSE Exame de estimativa de Intervalo Ps-Morte (IPM) O exame de estimativa de intervalo ps-morte visa estabelecer o tempo decorrido desde a morte, ou pelo menos, o tempo decorrido desde que o corpo foi colocado exposto aos insetos necrfagos, visto que esses insetos no fazem postura em pessoas vivas. A medicina legal dispe de alguns parmetros de estimativa de IPM, mas essas tcnicas podem no ser eficientes, especialmente, para corpos em adiantado estado de decomposio. Ateno especial deve ser dada coleta dos espcimes e das condies climticas as quais os insetos estavam sujeitos no local em que o corpo ficou exposto. A identificao taxonmica base para qualquer procedimento de entomologia forense, portanto tambm deve ser minuciosa. Exames para verificar o lugar em que a morte ocorreu Baseado na distribuio geogrfica, habitat natural e biologia das espcies coletadas no local onde o cadver foi encontrado, possvel confirmar ou excluir a possibilidade de ser esse o local onde a morte ocorreu. Por exemplo, certas espcies de dpteros da famlia Calliphoridae so tpicas de centros urbanos, assim, a associao dessas espcies a corpos encontrados em meio rural sugere que a vtima tenha sido morta no centro e levada para o ponto onde foi encontrada. 1.2) Exames para identificar as causas da morte Pela voracidade das larvas dos insetos necrfagos, os fluidos do corpo e partes macias necessrias para as anlises toxicolgicas desaparecem, sendo ento, necessrio identificar medicamentos e substncias txicas (cocana, herona, anfetamina, pio e outros metablitos) no corpo de larvas de insetos que se alimentaram desses cadveres contaminados, podendo indicar um caso de morte por ingesto de dose letal dessas substncias (over dose). 1.3) Exames para identificar a vtima possvel obter sangue e outros tecidos do cadver no interior do trato digestivo de insetos necrfagos, possibilitando exames de DNA para identificar a vtima, quando seus tecidos, devido ao estado de decomposio, j no permitem tal exame.

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Exames de verificao da rota do trfico Podemos determinar a origem da Cannabis sativa - maconha, com base na identificao de insetos acompanhantes da droga que, no momento da prensagem do vegetal, ficaram ali retidos, e, atravs da distribuio geogrfica das espcies encontradas, traar a rota do trfico. II 2.1) EXAMES MNIMOS INDISPENSVEIS Exames de coleta de evidncias 2.1.1- Coleta de fatores abiticos - Verificar sistematicamente as condies de temperatura e umidade nas quais os espcimes estavam expostos no dia da coleta e nos dias anteriores descoberta do corpo; - Deve ser medida a temperatura ambiente, da massa de larvas, do solo e, se possvel, do cadver; - Devem ser anotadas as demais condies climticas (vento, chuva, incidncia de sol, sombra, etc); - Devem ser anotadas as condies do local (saneamento bsico, acesso aos insetos, tipo de solo, etc); - Verificar e anotar as condies fsico-qumicas do cadver, tentando correlacionar os parmetros usuais de estimativa de intervalo ps-morte (rigidez, lividez, queda da temperatura, fases do processo de decomposio cadavrica, ltima vez que foi visto com vida, etc); 2.1.2- Coleta de fatores biticos (espcimes entomolgicos) - Procura de imaturos (ovos e larvas); - Escolha dos espcimes a serem coletados; - Coleta de imaturos e adultos; - Preservar alguns imaturos em lquido preservativo, desde que colocados previamente em gua quente; - Transporte dos espcimes; - Pesquisa no solo (coleta de amostras); - Anotar a colorao do puprio; 2.2) Exames de triagem e identificao dos espcimes e instares - Verificar o nstar larval; - Separar por morftipos de imaturos para criao; - Guardar alguns exemplares de cada morftipo de imaturo em lquido preservativo para formar banco de dados e para enviar ao entomlogo (quando for o caso); - Tentar realizar a identificao das larvas, quando existirem chaves disponveis na literatura; - Identificar os espcimes adultos atravs de chaves dicotmicas; - Enviar as amostras a um especialista entomlogo; Exames para criao dos espcimes - Transferir as neolarvas do papel filtro umedecido para a carne ou dieta artificial; - Evitar a competio; - Evitar o ataque de predadores criao; - Evitar a desidratao; - Separar os puprios; - Utilizar gaiolas com manga para manusear os espcimes recm-emergidos;

2.3)

21

Utilizar cmaras climatizadas para assegurar o sucesso da criao;

2.4) Exames de formao de um banco de dados 2.4.1- Coleo de referncia - Separar uma amostragem dos imaturos coletados em lquido preservativo; - Separar alguns exemplares de adultos montando caixas entomolgicas; 2.4.2- Registro de dados - Lanar na memria do computador dados de condies climticas (estao meteorolgica e Tiny tag); - Lanar dados do desenvolvimento das espcies; - Lanar observaes sobre a biologia dos espcimes de interesse forense; - Lanar o padro de sucesso observado em cada rea de estudo; 2.5) Exames de entomotoxicologia - Exames devem ser realizados de acordo com os protocolos de deteco das substncias conforme o Kit de anlise; Exames de clculos de estimativa de intervalo ps-morte - Anlise do padro de sucesso em intervalos adiantados; - Pesquisar dados de biologia; - Jogar os dados obtidos na estao meteorolgica no programa Tiny tag para estimar a temperatura prvia a data em que o cadver foi encontrado; - Realizar os clculos de grau-dia acumulado e grau-hora acumulado em intervalos iniciais (antes da primeira emergncia da espcie); TCNICAS E MTODOS EMPREGADOS NOS EXAMES Exames de coleta de evidncias a) Exame visual do local do exame, visando verificar seu estado geral; b) Caracterizao das condies em que o cadver se encontra: fase de decomposio, fenmenos tanatolgicos observados, ferimentos e tipo de morte; c) Montagem do aparelho Tiny tag data logger com programao para coleta de dados de temperatura do dia do exame e do perodo anterior (calcular o intervalo de acordo com as condies do cadver); d) Coleta de dados de temperatura da massa de larvas colocando o bulbo do termmetro no centro da agregao; e) Coleta de dados de temperatura do solo utilizando um termmetro sonda entre 10 a 20 cm de profundidade; f) Procura e coleta de imaturos. Os espcimes devem ser procurados em orifcios naturais (boca, narinas, ouvidos, orifcios genitais e nus), lugares abrigados (atrs da orelha, cabelos, dobras da roupa e das articulaes), borda de ferimentos e solo. Os imaturos devem ser coletados com auxlio de pincis e pinas. Deve ser coletada uma amostra de cada tipo de larva encontrada em diferentes partes do corpo. Para as anlises de IPM deve ser considerado o espcime imaturo mais velho, pois este corresponder s primeiras posturas; g) Amostras do solo devem ser coletadas, tanto sob o corpo, quanto no raio a seu redor (3,0 a 10,0 m em torno do cadver); h) A escolha do material de auxlio para a coleta de adultos deve ser feita de acordo com a ordem considerada. Para os colepteros e insetos menos geis podemos usar pinas ou tubos invertidos. Para os mais geis como, por exemplo, dpteros e lepidpteros, podemos usar redes entomolgicas comuns ou a rede entomolgica de Khouri. Como auxlio para coleta de todas as ordens podemos utilizar papel adesivo organizado em

2.6)

III 3.1)

22

i)

j)

k) l) m) 3.2)

forma de tenda, montada em ngulo de 60 a cerca de 1,0 m do corpo, e deixado durante todo o exame; A rede entomolgica comum deve ser usada dando golpes no ar seguido de virada da boca para impedir a sada dos espcimes. A rede de Khouri tem duas aberturas, a abertura menor deve ser acoplada a um saco plstico por meio de um pregador de roupa. A rede deve ser colocada sobre o corpo e, aps os espcimes entrarem no seu interior, a boca deve ser virada para impedir a sada e pregador retirado possibilitando a passagem para o saco plstico; Para transporte dos espcimes devemos utilizar potes plsticos que contenham tampa vazada coberta por tecido em malha fina para possibilitar a entrada de ar e impedir a entrada de outros animais. No lugar da tampa pode ser utilizado um segmento de tecido adaptado com um elstico. Os espcimes devem ser agrupados por semelhana e tamanho. Os ovos devem ser conduzidos sobre papel filtro umedecido para evitar a desidratao. As larvas de dpteros devem ser conduzidas em potes contendo carne em decomposio ou dieta artificial. As larvas de colepteros devem ser conduzidas em potes contendo larvas de dpteros e carne em decomposio. Deve ser verificada a colorao da pupa. As pupas ou larvas maduras devem ser conduzidas em potes que contenham serragem, vermiculita ou um pouco do solo do local. Os adultos devem ser conduzidos nos sacos plsticos e as amostras de solo em sacos plsticos tipo ziploc; Os recipientes devem ser etiquetados com dados gerais; Acompanhar os procedimentos de necropsia para coletar espcimes porventura camuflados no interior do corpo, tendo o cuidado de anotar o perodo o qual o corpo ficou guardado e em que condies de temperatura; Para perpetuar o comportamento dos espcimes no cadver devem ser tiradas fotografias ilustrativas.

Exames de triagem e identificao dos espcimes e instares a) Exame visual dos imaturos, macroscpica e microscopicamente, para separar por morftipos (por semelhana); b) Os ovos devem ser deixados no papel umedecido at a ecloso, quando as neolarvas devem ser colocadas no alimento; c) Deve ser determinado o nstar dos espcimes: pelo nmero de fendas existentes nos espirculos para muscides e por tamanho nos demais grupos; d) Uma pequena amostra de imaturos deve ser fixada em lquido preservativo (lcool a 70%), sendo as larvas previamente mortas em gua quente e preparadas levando ao fogo (em banho Maria) em soluo aquosa a 10% de KOH; e) As larvas devem ser colocadas em potes com alimentos de forma que no tenha competio. Esses potes devem ser colocados no interior de recipientes contendo serragem no fundo e cobertos por tampa vazada; f) Os recipientes devem ser etiquetados; g) Aps as larvas serem separadas por morftipos, alguns exemplares de cada morftipo devem ser preparados para anlise de acordo com chaves dicotmicas; h) As amostras do solo devem ser colocadas em uma bandeja, de forma a separar os espcimes maiores, e depois processadas em um funil de Berlese.
a)

3.3)

Exames para criao dos espcimes Os recipientes de criao devem ser colocados no interior das cmaras climatizadas reguladas em 27C 1C, 70-80% U.R. (umidade relativa do ar) e fotoperodo de 12 horas;

23

b) Na falta de cmaras climatizadas, os recipientes devem ser colocados dentro de bandejas contendo gua e sabo, arrumadas sobre bancadas cujos ps sejam lambuzados de graxa, leo ou similar; c) No caso de criao em ambiente aberto, deve ser utilizado algodo umedecido ou pingar gua limpa com auxlio de uma pipeta na fonte de alimento; d) Para evitar a competio deve ser calculado 1 ou 2 gramas de alimento por larva; e) Os recipientes devem ser pesquisados a cada dia para acompanhar o desenvolvimento; f) Os puprios devem ser separados e colocados em recipientes contendo substrato de pupao no interior de gaiolas teladas; g) Os recipientes devem ser mantidos midos por meio de algodo umedecido; h) Aps as emergncias, os adultos devem ser deixados por um perodo de 24 horas nas gaiolas, depois do que so capturados em tubos de ensaio, anestesiados ou mortos por congelamento; i) Os espcimes devem ser montados com alfinetes entomolgicos de acordo com as regras entomolgicas; j) Os exemplares de Sarcophagidae devem ter a genitlia exposta. 3.4) Exames de formao de um banco de dados 3.4.1- Coleo de referncia Amostras das diferentes espcies de adultos coletados devem ser montadas em alfinetes entomolgicos formando caixas de referncia que devem ser utilizadas para identificao dos espcimes coletados por comparao. Tambm deve ser guardada amostra de imaturos para anlise por comparao; 3.4.2- Registro de dados Os dados devem ser armazenados em arquivo prprio em um computador, correlacionando a espcie ao intervalo ps-morte, contendo, preferencialmente, o tempo de chegada ao corpo e tempo do final de sua freqncia. Exames de entomotoxicologia Os protocolos de entomotoxicologia devem seguir as propostas dos kits para deteco das diferentes substncias. Exames de clculos de estimativa de intervalo ps-morte - Comparar os dados entomolgicos com o padro de sucesso para mesma rea e condies climticas; - Preparar tabelas que contenham o tempo requerido para todas as fases de desenvolvimento de acordo com dados publicados na literatura (ovo at adulto) que tenha utilizado temperatura de criao semelhante encontrada no campo; - Preparar tabelas com dados de temperatura obtidos pelo programa Tiny tag data logger, massa de larvas e solo; - Realizar os clculos matemticos para clculo de grau-dia ou grau-hora acumulado, utilizando os limiares de temperatura e realizando os clculos da data de coleta para trs (retrospectiva);

3.5)

3.6)

IV - EQUIPAMENTOS E RECURSOS INDISPENSVEIS 4.1) Exames de coleta de evidncias a) Redes entomolgicas, colher de jardineiro, pinas e pincis para manuseio dos espcimes.

24 b) c)

d) e)
f) g)

Aparelho para coleta de dados de condies meteorolgicas como Tiny tag data logger; Termmetros variados (Termmetro sonda, mxima e mnima, termohigrmetro digital); Recipientes em polietileno para transporte dos espcimes contendo vermiculita e tampa vazada coberta por tecido em malha fina; Recipientes contendo alimento (carne em decomposio ou dieta artificial); Sacos plsticos tipo ziploc; Mquina fotogrfica digital com zoom mnimo de 10 x;

4.2)

Exames de triagem e identificao dos espcimes e nstares Duas bancadas, sendo uma de 5m de comprimento/0,70m de largura/0,70 de altura e outra de 8m de comprimento/0,70m de largura/0,70 de altura, com iluminao fria para exame visual do corpo de delito, placas de Petri, vidros de relgios, alfinetes entomolgicos n 0, 1 e 2, jogo completo de pinas e estiletes entomolgicos para manuseio dos espcimes. b) Banco de altura regulvel para adaptao a Lupa; c) Microscpico estereoscpico com lupa simples; d) Microscpico estereoscpico com cmara clara; e) Microscpico binocular ptico; f) Bandejas plsticas 300 x 450 mm; g) Microvial para genitlia (microtubo);
a)

4.3)

Exames para criao dos espcimes Cmara climatizada (estufa) B.O.D.(Demanda Biolgica de Oxignio) b) Geladeira duplex; c) Freezer; d) Gaiolas de madeira com tela e manga; e) Exaustor; f) Recipientes plsticos para criao; g) Vermiculita (suporte para pupao); h) Dieta artificial.
a)

4.4) Exames de formao de um banco de dados a) Caixas entomolgicas; b) Alfinetes entomolgicos n 0, 1 e 2; c) Naftalina; d) Exaustor; e) Armrios com prateleiras; 4.5) Exames de entomotoxicologia a) Bomba vcuo Speedvacuum; b) Rotaevaporador; c) Homogenizador de tecidos; d) Cromatgrafo gs; e) Espectrmetro de massa; f) Centrfuga; g) Balana de preciso; h) Bico de Bunsen; i) Compressor com banho de gua para refrigerar o rotaevaporador; Exames de clculos de estimativa de intervalo ps-morte

4.6)

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Computador; Dados de uma estao meteorolgica; Programas de anlise de Tiny tag; d) Banco de dados; e) Programas de comparao e anlise do banco de dados; f) Instrumento para medida de comprimento das larvas.
a) b) c)

PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRO N 03: DOS REQUISITOS: I) QUALIFICAO DOS PERITOS PARA REALIZAREM PERCIAS DE BIOLOGIA/ENTOMOLOGIA a) Formao acadmica (bacharelado), com preferncia para a formao nas reas cientficas (Biologia, Bioqumica, Farmcia Veterinria ou Agronomia). b) Especializao em biologia forense, compreendendo: b.1) Curso de formao, quando do ingresso na carreira de perito criminal, com um mnimo de 40 h/a para a disciplina de biologia/entomologia; b.2) Curso de qualificao e aperfeioamento em biologia/entomologia forense, com um mnimo de 40 h/a tericas e 40 h/a prticas. II) ESTRUTURA MNIMA DO LAUDO PERICIAL DE EXAME DE SANGUE 2.1) Ementa Discriminar a data e o local em que for elaborado o laudo pericial, o nome do Instituto e rgos superiores aos quais est subordinado, tipo de laudo, a data da requisio e/ou solicitao, nome do diretor e dos peritos signatrios do laudo, bem como o objetivo dos exames periciais. Histrico Fazer neste tpico um pequeno relato da requisio, bem como uma sntese do fato que originou a requisio da percia. Objetivo Pericial Descrever, conforme consta na requisio, qual(is) o(s) objetivo(s) a ser(em) buscado(s) na percia, os quais devero estar contidos na requisio da percia ou nos quesitos formulados. No sendo especificado, na requisio, o(s) objetivo(s) da percia, de bom alvitre que os peritos descrevam com certa preciso quais so os objetivos periciais daqueles exames. No caso de entomologia, iniciar com uma breve introduo terica a fim de esclarecer o leitor de suas finalidades e aplicaes como auxlio justia. Discriminar todas as tcnicas e mtodos empregados naquela percia, bem como o embasamento bibliogrfico. No necessrio, na maioria dos casos, descrever as tcnicas. Seja claro e conciso. Dos Exames Periciais Quando os vestgios forem colhidos por terceiros, a forma de sua colheita ou obteno, deve sempre ser referida, bem como o nome do coletor. Estes vestgios devem preencher, no mnimo, os requisitos de autenticidade, adequabilidade e quantidade. Descrever o material do exame com mincias, especialmente quando as variveis verificadas so capazes de influenciar nas concluses. Deve ser especificados a forma de acondicionamento, cor, estado de conservao, localizao, tamanho e qualquer outro detalhe de importncia. Toda a descrio deve ser minuciosa. No caso de Entomologia, deve ser especificado o tipo de ambiente (rural/urbano), seu solo, fauna, flora, presena ou vestgios de animais de grande porte que se alimentem de 2.4) 2.3) 2.2)

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carnia, se rea aberta ou construda, pontos de acesso, etc. O cadver dever ser descrito com todas as caractersticas necessrias a sua identificao, descrio de ferimentos, acesso a insetos, bem como aspectos fsicos utilizados na cronotanatognose. Os vestgios entomolgicos devem ser descritos com todos os detalhes, comeando pelo ponto de coleta, tipo, fase de desenvolvimento, abundncia, comportamento e todos os demais dados. Deve ser informado se coletados vivos ou preservados. Registrar todos os dados de temperatura no qual os espcimes coletados estavam sujeitos dependendo do nstar coletado (ambiente instantnea, ambiente mxima e mnima, estao meteorolgica, massa de larvas, cadver, solo, geladeira do necrotrio, etc). Deve ser registrada a distncia da estao meteorolgica, tempo de exposio na geladeira, condies de chuva e sol, etc. Relatar as condies de temperatura de criao dos espcimes (ambientes ou cmaras climatizadas) relacionando os valores. Informar data e hora do pico de pupao e emergncia. Relacionar as espcies coletadas e identificadas, bem como os dados de sua biologia j publicados na literatura. Discriminar todas as tcnicas e mtodos empregados no exame, no sendo necessrio, na maioria dos casos, descrever as tcnicas. E finalmente, relatar os resultados apresentados. Consideraes Tcnicas Fazer as anlises e interpretaes das evidncias constatadas, de forma a facilitar a compreenso por parte do leitor. Outros Elementos Captulo onde so relacionadas todas as observaes as quais no possuem um campo prprio para tal finalidade como, por exemplo, as referncias bibliogrficas. Informar sobre os exames auxiliares (toxicolgicos, biogeografia dos espcimes coletados, presena de substncias orgnicas, contaminao, tamanho da massa de larvas, etc). Discusso Discorrer sobre as inferncias que os resultados encontrados podem apresentar. Por exemplo, no caso de entomologia, informar sobre qual a onda de sucesso pertencem os insetos encontrados, relatar dados de biologia das espcies que possam inferir nos clculos, alm de informar o IPM de acordo com comprimento, peso e clculo do grau-dia acumulado. Concluso e/ou Resposta aos Quesitos A concluso dos exames deve apontar para o fato ora questionado e deve estar baseada nas constataes discutidas nos tpicos anteriores do respectivo laudo. Se na solicitao da autoridade policial constar quesitos, o perito deve transcrev-los textualmente, respondendoos na seqncia. Caso exista mais alguma informao e/ou concluso importante a acrescentar, dever ser colocada em pargrafo independente, neste mesmo tpico. Mesmo que no seja possvel uma concluso sobre aquela percia, o perito dever informar a impossibilidade de concluso relacionando os fatores que conduziram a essa dificuldade. O perito dever argumentar sobre as possibilidades, hipteses e caminhos, explicando os possveis diagnsticos. Em casos de exigidade de vestgios, o perito dever, se possvel, explanar sobre os fatores que determinaram essa escassez. 2.9) Anexos Incluir ao final todos os anexos que foram produzidos e que sejam necessrios acompanhar o laudo para fins de melhor compreenso do mesmo, tais como, resultado de exames complementares, fotografias, grficos, relatrios de outros peritos/profissionais, etc. 2.8) 2.7) 2.6) 2.5)

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