O que o Sistema HLA Os genes do Sistema HLA (Human Leukocyte Antigens) so importantes no desenvolvimento de doenas auto-imunes e responsveis pela

a rejeio de transplantes de rgos e tecidos. A descoberta do Sistema HLA O Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC - Major Histocompatibility Complex), existente em todos os vertebrados, constitudo, entre outros, por genes com importantes funes imunolgicas e foi descoberto em 1937 por Peter Gorer durante o estudo de transplantes em ratos (Gorer, 1937). Mais tarde Jean Dausset (1958) publicou as suas observaes e concluses sobre a capacidade do soro de pessoas submetidas a transfuses sanguneas aglutinar leuccitos de outros indivduos. Dausset descobriu assim o primeiro antignio humano, denominado MAC (agora HLA-A*02), um dos produtos dos genes do Sistema Humano de Antignios Leucocticos (HLA - Human Leukocyte Antigens), o correspondente humano do MHC. Mais tarde, Jon van Rood e van Leeuwen (1963) publicaram a descoberta de outro gene do sistema HLA a que deram o nome de FOUR (agora HLA-B). Com a inveno da tcnica de cultura linfocitria mista em 1964 (Bach e Hirschhorn, 1964; Bain et al. 1964) foram-se acumulando resultados que conduziram descoberta de novos genes, nomeadamente o HLA-DR na dcada de 70 do sculo XX (Yunis e Amos, 1971; Tosi et al. 1978). O envolvimento do Complexo Maior de Histocompatibilidade na resposta imunitria do organismo s foi confirmada no incio da dcada de setenta do sculo XX (Shevach et al., 1972) mas actualmente conhece-se j em detalhe a estrutura e funo dos genes classe I e classe II do sistema HLA (Bjorkman et al., 1987; Brown et al. 1993). Apesar de actualmente desconhecermos ainda o mecanismo exacto que associa determinados alelos e haplotipos (conjunto de alelos de diferentes loci transmitidos em bloco de gerao em gerao) do sistema HLA a um elevado risco de desenvolver determinadas doenas autoimunes, j em 1967 esta associao era conhecida (Amiel, 1967). Devido s suas mltiplas funes, nomeadamente ao nvel da histocompatibilidade e regulao imunitria, a investigao em torno do sistema HLA despertou o interesse de vrias equipas de investigao possibilitando a descoberta de largas centenas de alelos nos diferentes genes. Nomenclatura do sistema HLA A enorme diversidade gentica do Sistema HLA tornou necessrio, desde muito cedo, o estabelecimento de regras claras ao nvel da nomenclatura utilizada, tendo sido organizado em 1968 por Bernard Amos o primeiro encontro do Comit de Nomenclatura da Organizao Mundial de Sade (WHO-Nomenclature-Committee, 1968). Um cdigo de 4 dgitos que distingue os alelos que diferem ao nvel das protenas codificadas foi implementado pela primeira vez no Relatrio de Nomenclatura em 1987 em sequncia do X Workshop de Histocompatibilidade que decorreu em Nova Iorque nesse mesmo ano (Dupont, 1988). Desta forma foi possvel acomodar os diferentes alelos, identificados atravs de mtodos moleculares, que constituem cada grupo serolgico. A utilizao de um asterisco depois da designao do locus permitiu distinguir a caracterizao allica por mtodos moleculares da caracterizao por mtodos serolgicos. Em 1990 foi adicionado um quinto dgito para distinguir as sequncias que diferem apenas por substituies nucleotdicas sinnimas (mutaes silenciosas) (Bodmer et al., 1991). No entanto, este sistema de nomenclatura j est a atingir, para certos grupos de alelos (e.g HLA-A*02 e HLA-B*15), o nvel mximo de alelos que consegue comportar pelo que j esto a ser adoptadas novas convenes. Assim, para acomodar novos alelos nos grupos mais polimrficos, assim que estes atinjam 99 alelos, uma segunda srie ser utilizada para continuao. A srie B*95 est assim reservada para acomodar novos alelos quando o B*1599 for atingido, da mesma forma que a srie A*92 dar continuidade aos alelos do grupo A*02 (Marsh et al., 2002).

Tcnicas de caracterizao do sistema HLA A evoluo das tcnicas utilizadas na identificao e caracterizao das diferentes formas dos genes que compem o sistema HLA constituiu um dos factores cruciais no desenvolvimento dos conhecimentos nesta rea. Os primeiros passos na descoberta do sistema HLA foram dados com recurso s tcnicas de leuco-aglutinao com as quais foi possvel definir vrios antignios codificados por este conjunto de genes (Berah e Dausset, 1963). At meados dos anos 80 do sculo XX as tcnicas serolgicas constituam a nic a forma de caracterizar a diversidade allica do sistema HLA. O teste linfocitotxico foi amplamente divulgado na abordagem serolgica para identificao dos antignios do sistema HLA, existindo actualmente mltiplas variaes desta tcnica base. Esta tcnica consiste na mistura de linfcitos B com soro contendo anticorpos especficos para determinados antignios do sistema HLA. Os anticorpos, quando na presena de linfcitos B contendo antignios complementares, ligam-se provocando, com a adio de um complementar, a destruio membranar, o que permite a sua identificao por colorao (Kippax et al., 1985; Zachary et al. 1995). Devido a problemas de reaco cruzada e indisponibilidade de certos anticorpos, muitos laboratrios adoptaram tcnicas de gentica molecular para a caracterizao dos Sistema HLA. No entanto, estes mtodos serolgicos continuam a ser amplamente utilizados em testes de crossmatching com o objectivo de validar potenciais dadores seleccionados para transplantes de rgos e tecidos. Este procedimento desenvolvido como salvaguarda ocorrncia de rejeio aguda do transplante pois alguns pacientes podero ter sido previamente sensibilizados contra determinados antignios HLA. Mesmo que os alelos do dador e do receptor sejam compatveis, em sequncia de transfuses de sangue, da realizao de outros transplantes ou de uma gravidez, o paciente poder ter desenvolvido anticorpos contra alguns dos antignios do dador levando a uma reaco violenta logo no incio do transplante, pondo em causa o seu sucesso (Moore et al., 1997). Os mtodos de restrio enzimtica (RFLP- Restriction Fragment Length Polymorphysm) permitiram dar os primeiros passos na identificao gentica destes alelos no incio da dcada de 80 do sculo XX permitindo uma maior preciso comparativamente aos mtodos serolgicos. Com o advento da PCR (Polymerase Chain Reaction) (Saiki et al., 1985, Mullis e Faloona, 1987), particularmente aps a sua automatizao, depressa os mtodos de caracterizao allica do sistema HLA por restrio enzimtica evoluram e mais tarde foram mesmo ultrapassados por outros procedimentos mais modernos (Howell et al., 1989; Ota et al., 1992). A associao entre a PCR e a restrio enzimtica permitiu a adopo de uma tcnica de caracterizao allica do sistema HLA mais eficiente e em alta resoluo. Aps a amplificao dos exons polimrficos do locus HLA em estudo, o DNA obtido por PCR digerido com enzimas de restrio especificas e o perfil dos fragmentos produzidos analisado aps separao por electroforese (Mitsunaga et al., 1998). Vrios mtodos foram desenvolvidos com base na PCR. A caracterizao allica por SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probes) recorre a primers complementares de zonas conservadas para amplificar os exons polimrficos dos loci HLA (exons 2 e 3 nos genes HLA classe I e exon 2 nos genes classe II). O DNA amplificado fixo a uma membrana e hibridado com sondas oligonucleotdicas marcadas com fluorescncia. As sondas complementares s zonas polimrficas do DNA amplificado produzem um padro de hibridao cuja anlise permite identificar os alelos presentes do sistema HLA (Middleton, 2000). Esta tcnica permite a caracterizao do sistema HLA em baixa ou alta resoluo consoante o painel de sondas utilizado e adequada para grandes quantidades de amostras (Middleton e Williams, 1997). O teste SSP (Sequence Specific Priming) utiliza directamente a tcnica de PCR para identificar os alelos do sistema HLA com recurso a oligonucleotidos complementares a sequncias nucleotdicas polimrficas conhecidas (Bunce et al., 1995; Olerup e Zetterquist, 1992; Olerup e Zetterquist, 1993). Esta tcnica baseia-se no facto de um primer complementar cadeia de DNA ser mais eficiente na amplificao por PCR do que os primers com um o mais u nucletidos no coincidentes. Primers especficos para a amplificao de determinados alelos, com separao e visualizao atravs de electroforese em gis de agarose, permitem

caracterizar em baixa ou alta resoluo os genes HLA (Middleton e Williams, 1997). A caracterizao allica dos genes do sistema HLA atravs da sequenciao nucleotdica (SBT- Sequence Based Typing) o mtodo molecular actualmente mais fivel, o qual permite inclusive a identificao directa de novos alelos (Middleton e Williams, 1997; Kurz et al., 1999; McGinnis et al., 1995). Esta tcnica desenvolve-se com a amplificao, por PCR, dos fragmentos contendo os exons polimrficos a sequenciar. As tcnicas e tecnologias mais recentes permitem a sequenciao directa do fragmento sendo que a sua natureza heterozigtica implica a utilizao de um programa informtico prprio para a descriminao dos alelos presentes em cada amostra. A escolha do mtodo a utilizar na caracterizao allica do sistema HLA depende das especificidades de cada laboratrio e dos objectivos do trabalho. Desde a rapidez necessria at ao nmero de amostras, passando pelo equipamento existente, oramento disponvel e experincia dos recursos humanos, inmeras so as variveis que influenciam a escolha do mtodo. Consoante as necessidades e os objectivos dos laboratrios, nomeadamente se pretendem baixa ou alta resoluo, podero optar por utilizar mais de um mtodo. No entanto, em qualquer dos casos, qualquer um dos mtodos disponveis necessita de ser continuamente actualizado por forma a integrar as alteraes que permitem a evoluo das tcnicas e considerar os novos alelos que continuamente so descobertos (Middleton e Williams, 1997). Estrutura e funo do Sistema HLA Os loci HLA esto localizados no brao mais pequeno do cromossoma 6 na banda 6p21.3 formando um complexo sistema de genes funcionalmente relacionados entre si (Figura 1) (Bender et al. 1983). O sistema HLA constitudo por 224 genes, dos quais 128 so genes funcionais e 96 so pseudogenes.

- Mapa da regio HLA (banda 6p21.3 do cromossoma 6). Os genes e pseudogenes no clssicos classe I esto representados por rectngulos no preenchidos. Os genes funcionais do sistema HLA so os mais variveis do genoma humano com capacidade de expresso, 40% dos quais desempenham um importante papel em funes imunolgicas. Para alm destes genes existem ainda no sistema HLA elementos repetitivos que compreendem quase 50% da sequncia do sistema HLA (MHC sequencing consortium, 1999; Garrigan & Hedrick, 2003). O sistema HLA, com cerca de 4 Mb (megabases) de extenso, est subdividido em trs regies: classe I, classe II e classe III, de acordo com a estrutura e funo dos seus genes. Os genes classe I, localizados na poro mais telomrica do sistema HLA, so constitudos por vrios exons, intercalados por introns, que codificam para a formao da cadeia polipeptdica alfa de receptores glicoproteicos da membrana das clulas nucleadas, constitudos por uma regio extracelular de ligao a antignios, uma regio transmembranar e um segmento citoplasmtico. Os polimorfismos nos genes classe I localizam-se essencialmente nos exons

2 e 3, os quais codificam para as estruturas moleculares alfa 1 e alfa 2 do receptor membranar onde se localiza o stio de ligao aos antignios (Malissen et al., 1982). Estes receptores membranares interagem com linfcitos T CD8 positivos que detectam alteraes de expresso nas clulas, alteraes estas que podem ocorrer devido a infeces ou ao desenvolvimento de clulas tumorais. Desta forma os linfcitos T (CD8+) reconhecem as clulas que devero atacar para combater o avano de uma determinada infeco ou de um tumor (Doherty & Zinkernagel, 1975). Os genes classe II localizam-se na regio mais centromrica do sistema HLA e codificam para as estruturas alfa e beta de receptores membranares que se expressam nas clulas que apresentam antignios, nomeadamente linfcitos B e clulas dendrticas. O exon 2, que codifica para a estrutura extracelular do receptor membranar, responsvel pela ligao aos antignios, concentra a maior parte dos polimorfismos nestes genes. Estes receptores membranares, constitudos por uma poro extracelular, uma regio transmembranar e um segmento citoplsmtico, reconhecem a presena de elementos estranhos e estimulam os linfcitos T CD4 positivos, reforando a resposta imunitria contra agentes infecciosos (Das et al., 1983; Doherty & Zinkernagel, 1975; Gatti & Pierre, 2003). A regio classe III do sistema HLA localiza-se entre os genes classe I e classe II e, apesar de no ser to polimrfico como estes ltimos, constitui o segmento do genoma humano com maior densidade de genes (Xie et al., 2003). Ao contrrio da regio classe I e classe II onde existem dezenas de pseudogenes, a regio classe III possui apenas dois (MHC sequencing consortium, 1999). Os genes presentes nesta regio no so, na sua maioria, relacionados entre sim nem com os genes da classe I e II e no possuem um padro comum de expresso. Os genes classes III do sistema HLA possuem funes vrias, destacando-se o seu papel na codificao de protenas solveis importantes na modelao e regulao da resposta imunitria (Xie et al., 2003). Os genes clssicos HLA-A, HLA-B, HLA-Cw (classe I), HLA-DRB1, HLA-DPB1 e HLA-DQB1 (classe II), co-dominantes, so os mais polimrficos e mais estudados do sistema HLA (Mizuki et al., 1996). Por ouro lado, os genes no clssicos, nomeadamente HLA-E, HLA-F e HLA-G (classe I), com funes ainda mal conhecidas, possuem uma distribuio muito restrita, baixos nveis de expresso e so pouco polimorfismos comparativamente aos genes clssicos, com os quais partilham uma estrutura similar (Le Bouteiller, 1997). Os genes classe I e II constituem no seu conjunto 1998 alelos diferentes, sendo o mais polimrfico o locus HLA-B com 627 alelos, seguindo-se o HLA-DRB1 com 394, o HLA-A com 349, o HLA-Cw com 182 e o HLA-DPB1 com 116 (Marsh et al., 2005). O nmero de alelos em cada gene est constantemente a aumentar medida que novas populaes mundiais so tipadas ao nvel do Sistema HLA. Evoluo e diversificao do sistema HLA O Sistema Maior de Histocompatibilidade (MHC), cujo correspondente humano o sistema HLA, surgiu atravs de repetidas duplicaes e converses de genes ao longo de milhes de ano no decorrer da evoluo dos vertebrados desde a divergncia dos ciclstomos (Kasahara et al., 1996; Kasahara et al., 1997). A anlise do MHC de alguns vertebrados mostra diferenas notrias, nomeadamente ao nvel da incluso, ordem e sequncias nucleotdicas dos genes mas, por outro lado, revela a existncia de uma estrutura comum principalmente entre os mamferos (Yuhki et al. 2003). Ao contrrio do que sucede nos mamferos, noutros vertebrados, como aves e peixes, os loci MHC nem sempre esto reunidos num nico conjunto, dispersando-se no mesmo ou em cromossomas diferentes (Miller et al., 1994; Bingulac-Popovic et al., 1997). A grande quantidade e diversidade de informao disponvel relativamente diversidade, estrutura e funo dos genes do sistema HLA apresentam padres de variao que mostram sinais evidentes de seleco. A frequncia de homozigticos em vrios loci HLA significativamente inferior ao esperado em condies neutrais em inmeras populaes humanas. Vrios loci do sistema HLA submetidos ao teste de neutralidade Ewens-Watterson tm rejeitado a neutralidade em inmeras populaes (Piancatelli et al., 2004; Cao et al., 2004;

Ellis et al., 2000; Tiercy et al., 1992; Mack et al., 2000; Renquin et al., 2001). A vari ao nos loci HLA est essencialmente concentrada nas regies envolvidas na codificao dos stios de ligao aos antignios dos receptores membranares, situao que no susceptvel de ter sido originada a partir de uma evoluo neutral (Parham et al., 1988; Hedrick et al., 1991; Valdes et al., 1999). A maior acumulao de substituies no sinnimas nas regies que codificam para os stios de ligao aos antignios revela tambm a actuao da seleco natural, privilegiando o aumento da variao que neste caso funcionalmente relevante (Nei & Gojobori, 1986; Hughes & Nei, 1988). O mecanismo que parece ter maiores responsabilidades na manuteno dos elevados nveis de polimorfismo encontrados nos genes do sistema HLA, e que fazem deles os mais variveis do genoma humano, a seleco oscilante, decorrente da aco de diferentes parasitas (Hedrick & Thomson, 1983; Hedrick, 1999). A seleco oscilante refere-se a mecanismos de seleco natural que conduzem manuteno de polimorfismos genticos numa populao, em oposio seleco direccional que favorece um nico alelo. Entre os diferentes mecanismos inerentes seleco oscilante destacam-se como os mais estudados a vantagem dos heterozigticos e a seleco dependente da frequncia. A vantagem dos heterozigticos baseada na ideia de que os heterozigticos so capazes de reconhecer o dobro dos parasitas, um por cada alelo, apresentando uma vantagem adaptativa em relao aos homozigticos (Spencer & Marks, 1988). A seleco dependente da frequncia baseia-se no pressuposto de que os alelos mais raros possuem uma forte vantagem selectiva relativamente aos mais comuns para os quais os parasitas podem ter j desenvolvido resistncia (Bodmer, 1972).

O COMPLEXO GNICO DO MHC

O complexo MHC contm vrios genes que controlam vrios antgenos, a maioria dos quais influenciando a rejeio alogrfica. Esses antgenos (e seus genes) podem ser divididos em trs classes principais: classe I, classe II e classe III. Os antgenos de classe I e classe II so expressos em clulas e tecidos enquanto que antgenos de classe III so representados em protenas no soro e outros fluidos corporais (ex.C4, C2, fator B, TNF). Antgenos de produtos de genes de classe III no tm papel na rejeio de enxrtos.

MHC humano
O MHC humano est localizado no cromossomo 6. MHC classe I O complexo de genes de classe I contm trs loci principais, B, C e A e outros loci indefinidos secundrios (figura 5). Cada locus principal codifica para um polipeptdio; a cadeia alfa que contm determinantes antignicos, polimrfico (tem muitos alelos). Ele se associa com a beta-2 microglobulina (cadeia beta), codificada por um gene fora do complexo MHC, e expresso na superfcie da clula. Sem a beta-2 microglobulina, o antgeno de classe I no ser expresso na superfcie da clula. Indivduos com gene da beta-2 microglobulina defeituoso no expressam nenhum antgeno de classe I e portanto tem uma deficincia de clulas T citotxicas. MHC classe II O complexo de genes de classe II tambm contm pelo menos trs loci: DP, DQ e DR; cada um desses loci codificam para uma cadeia polipeptdica alfa ou beta que se associam para formar antgenos de classe II. Assim como antgenos de classe I, os antgenos de classe II so tambm polimrficos. O locus DR contm mais de um, possivelmente quatro genes funcionais de cadeia beta.

ANTGENOS MHC Nomenclatura

Especificidades de HLA so identificadas por uma letra por locus e um nmero (A1, B5, etc.) e os hapltipos so identificados por especificidades individuais (ex., A1, B7, Cw4, DP5, DQ10, DR8). Especificidades que so definidas por anlise genmica (PCR), so nomes com uma letra para o locus e um nmero de quatro dgitos (ex. A0101, B0701, C0401 etc). Especificidades do MHC (H-2) do rato so identificadas por um nmero. Uma vez que ratos de laboratrio so endocruzados, cada linhagem homozigota e tem um mesmo hapltipo. O hapltipo nessas linhagens designado por d uma letra pequena(a, b, d, k, q, s, etc.); por exemplo, o hapltipo de MHC de rato Balb/c mice H2 .

Herana
Genes de MHC so herdados como um grupo (hapltipo), um para cada progenitor. Assim, um humano heterozigoto herda um hapltipo paterno e um materno, cada um contendo trs loci de classe I ( C e A) e trs loci de classe II (DP, B, DQ e DR). Um indivduo heterozigoto ir herdar um mximo de 6 especificidades de classe I (Figura 6: em cima). Similarmente, o indivduo ir tambm herdar genes DP e DQ e expressar ambos os antgenos parentais. Uma vez que a molcula de MHC de classe II consiste de duas cadeias (alfa e beta), com alguns determinantes antignicos (especificidades) em cada cadeia, e cadeias DR alfa e beta podem se associar em combinaes tanto (ambas do cis mesmo progenitor) como trans (um de cada progenitor), um indivduo pode ter especificidades DR adicionais (Figura 6B). Tambm, h mais de um gene funcional de cadeia beta DR (no mostrado na figura). Portanto, muitas especificidades DR podem ser encontradas em qualquer um indivduo.

Crossover
Hapltipos, normalmente, so herdados intactos e portanto antgenos codificados por loci diferentes so herdados juntos (ex. A2; B27; Cw2; DPw6; DQw9; DRw2). Entretanto, ocasionalmente h crossing over entre dois cromossomos parentais, resultando assim em novos hapltipos recombinantes. Assim, qualquer especificidade codificada por um locus pode se combinar com especificidades de outros loci. Isso leva a uma vasta heterogeneidade na combinao de MHC em uma dada populao.

Expresso de antgeno s de MHC nas clulas

Antgenos de MHC so expressos na superfcie da clula de maneira codominante: produtos de ambos os genes parentais so encontrados nas mesmas clulas. Entretanto, nem todas as clulas expressam ambos os antgenos de classe I e classe II. Enquanto antgenos de classe I so expressos em todas as clulas nucleadas e plaquetas (e eritrcitos no rato), a expresso de antgenos de classe II mais seletiva. Eles so expressos em linfcitos B, em uma proporo de macrfagos e moncitos, clulas associadas da pele (Langerhans), clulas dendrticas e ocasionalmente em outras clulas.

Deteco do MHC por testes sorolgicos

Os antgenos de MHC classe I so detectados por ensaios sorolgicos (Ab e C). Tipagem sorolgica de tecido para o HLA era obtida, no passado, a partr de mulheres multparas que foram expostas a antgenos paternos das crianas durante o parto e subsequentemente desenvolveram anticorpos para esses antgenos. Mas recentemente, eles so produzidos por tecnologia de anticorpo monoclonal. Com a mudana em muitos laboratrios para a tipagem de tecido por PCR, o uso da sorologia est rapidamente diminuindo.

Deteco do MHC pela reao leucocitria mista (MLR)

Tem sido observado que linfcitos de um doador, quando cultivado com linfcitos de um doador no relacionado, so estimulados a proliferarem. Foi estabelecido que esta proliferao primariamente devida disparidade nos antgenos de MHC de classe II (DR) e clulas T de um indivduo interage com clulas portadoras de antgeno alogeneico de MHC classe II (clulas B, clulas dendrticas, clulas de langerhans, etc.). Esta reatividade foi chamada de reao leucocitria mista (MLR) e tem sido usada para estudar o grau de histocompatibilidade. Neste teste, os linfcitos testados (clulas respondedoras) so misturadas com leuccitos irradiados ou tratados com mitomicina C do recipiente, contendo linfcitos B e moncitos (clulas estimuladoras). As clulas so cultivadas por 4 6 dias. ays. As clulas T respondedoras iro reconhecer os antgenos estranhos de classe II encontrados no doador e realizar a transformao (sntese de DNA e crescimento: blastognese) e proliferao (mitognese). As clulas T que respondem a antgenos estranhos de classe II so tipicamente clulas CD4+ TH-1. Essas mudanas so registradas pela adio de timidina (tritiada, 3H) na cultura e monitorando sua incorporao no DNA.

Gerao de linfcitos T citotxicos

Uma outra consequncia da interao entre o antgeno em MHC e clula T a induo de linfcitos Tcitotxicos. Quando linfcitos T so cultivados na presena de linfcitos alogeneicos, alm de realizar mitose (MLR), eles tambm se tornam clulas citotxicas do mesmo tipo que estimulou MLR (figura 7). Assim, linfcitos T de hapltipo 'x' cultivados por 5 - 7 dias com linfcitos B de hapltipo 'y' iro realizar mitose e os linfcitos T sobreviventes se tornam citotxicos para clulas do hapltipo 'y'. A induo de mitose em MLR requer disparidade de apenas antgenos de classe II, enquanto que a indu de o linfcitos T citotxicos (CTL) requerem disparidade de ambos os antgenos de classe I e II. Entretanto, uma vez induzidas as clulas citotxicas, as clulas efetoras citotxicas reconhecem somente antgenos de classe I para causar citotoxicidade.

Fundamentos da Tcnica de PCR

Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao servio da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califrnia, recebeu o prmio Nobel da Qumica pelo desenvolvimento de um mtodo que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta tcnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a reas como o diagnstico de doenas, medicina forense entre muitas outras para alm da Investigao em Biologia. A tcnica de PCR (polymerase chain reaction - reaco em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicao de DNA que ocorre in vivo . Durante o PCR so usadas elevadas temperaturas de forma a separar as molculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo ento a ligao de oligonucletidos iniciadores (primers), tambm em cadeia simples e geralmente constitudos por 15 a 30 nucletidos, obtidos por sntese qumica. Para amplificar uma determinada regio so necessrios dois iniciadores complementares das sequncias que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3', de modo a permitir a actuao da DNA polimerase durante a sntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar (figura 1).

Para realizar PCR so necessrias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampo salino contendo a polimerase, oligonucletidos iniciadores, os quatro desoxinucletidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura submetida a vrios ciclos de amplificao que consistem em:


Desnaturao do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96C), de modo a separar as duas cadeias Associao dos iniciadores por ligaes de hidrognio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associao, a mistura de reaco arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65C, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequncia a amplificar) Extenso dos iniciadores atravs da sntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72C)

O processo envolvendo estes trs passos, pode ser repetido vrias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possvel aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentrao de DNA

pr-existente (figura 2). Em teoria, se for possvel levar a cabo 25 ciclos de amplificao seguidos, a concentrao de DNA aumentaria 225 vezes embora, na prtica, devido a alguma ineficincia no processo de amplificao, esse aumento fique por um milho de vezes.

Como na tcnica de PCR se encontram envolvidos vrios ciclos de amplificao, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contnua e automatizada, os vrios ciclos de aquecimento e arrefecimento. Para tal ser concretizvel, as DNA polimerases utilizadas devero ser termoestveis, tendo tal sido conseguido com o isolamento da DNA polimerase da estirpe termoflicaThermus aquaticus (Taq DNA polimerase) que actua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da especificidade da reaco. De referir ainda que o produto de PCR pode ser visualizado aps electroforese em gel de agarose e o seu tamanho ser estimado por comparao com padres lineares de DNA.