CINVESTAV Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados Unidad Irapuato

EquipoKZ

Kontrol Zellen
Reporte de avances Modelo RFP
15 de Julio 2011

Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Instituto Politcnico Nacional

Universidad Autnoma Universidad Autnoma de Aguascalientes de Baja California

Universidad Autnoma de Sinaloa

2do. Taller de Biologa Sinttica

II Taller de Biologa Sinttica - Proyecto KONTROL ZELLEN

Resultados Preliminares

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Resultados Preliminares
Recuperar Biopartes Purificacin de los fragmentos a ligar Ligacin de los fragmentos T-RD Desarrollo del perfil de temperatura-nivel de fluorescencia Pruebas de crecimiento a diferentes temperaturas

Ruta crtica del proyecto

Transformar clulas competentes

Digestin del ligado RD

Transformacin con el ligado TRD

Extraccin de plsmidos

Extraccin del plsmido ligado RD

Extraccin del plsmido ligado TRD

Crecimiento de las clulas transformadas

Digestin

Transformacin con el ligado RD

Digestin del ligado TRD

Transformacin de clulas con el dispositivo PTRD

Purificacin de banda

Ligacin de fragmentos R-D

Purificacin del fragmento TRD

Ligacin del dispositivo P-TRD

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Resultados Preliminares Diseo de las digestiones Primera Etapa Segunda Etapa

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Resultados Preliminares

Tercera Etapa

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II Taller de Biologa Sinttica - Proyecto KONTROL ZELLEN II Taller de Biologa Sinttica - Proyecto KONTROL ZELLEN

Resultados Preliminares Resultados Preliminares

Desarrollo del perfil de temperatura-nivel de fluorescencia Pruebas de crecimiento a diferentes temperaturas

Recuperar Biopartes

Purificacin de los fragmentos a ligar

Ligacin de los fragmentos T-RD

Ruta crtica del proyecto

Transformar clulas competentes

Digestin del ligado RD

Transformacin con el ligado TRD

Extraccin de plsmidos

Extraccin del plsmido ligado RD

Extraccin del plsmido ligado TRD

Crecimiento de las clulas transformadas

Digestin

Transformacin con el ligado RD

Digestin del ligado TRD

Transformacin de clulas con el dispositivo PTRD

Purificacin de banda

Ligacin de fragmentos R-D

Purificacin del fragmento TRD

Ligacin del dispositivo P-TRD

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Resultados Preliminares Recuperacin de Biobricks

BBa_K115017 Promotor Termmetro BBa_E1010 RFP Terminador

El primer paso fue recuperar los biobricks de los platos, resuspendiendo el DNA en Agua desionizada teida con un colorante rojo
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Resultados Preliminares Transformacin de clulas competentes con los biobricks

Posteriormente el DNA recuperado se utiliz inmediatamente para transformar clulas quimiocompetentes de E. coli TOP10

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Resultados Preliminares
Recuperar Biopartes
Purificacin de los fragmentos a ligar Ligacin de los fragmentos T-RD Desarrollo del perfil de temperatura-nivel de fluorescencia Pruebas de crecimiento a diferentes temperaturas

Ruta crtica del proyecto

Transformar clulas competentes

Digestin del ligado RD

Transformacin con el ligado TRD

Extraccin de plsmidos

Extraccin del plsmido ligado RD

Extraccin del plsmido ligado TRD

Crecimiento de las clulas transformadas

Digestin

Transformacin con el ligado RD

Digestin del ligado TRD

Transformacin de clulas con el dispositivo PTRD

Purificacin de banda

Ligacin de fragmentos R-D

Purificacin del fragmento TRD

Ligacin del dispositivo P-TRD

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Resultados Preliminares Extraccin de plsmidos con miniprep

4000

1500

La extraccin del plsmido de las clulas se realiz usando un miniprep, y se corri una electroforesis en gel de agarosa al 1% durante una hora

500

Fig. 1 Extraccin de plsmidos (Miniprep)

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Resultados Preliminares
Recuperar Biopartes
Purificacin de los fragmentos a ligar Ligacin de los fragmentos T-RD Desarrollo del perfil de temperatura-nivel de fluorescencia Pruebas de crecimiento a diferentes temperaturas

Ruta crtica del proyecto

Transformar clulas competentes

Digestin del ligado RD

Transformacin con el ligado TRD

Extraccin de plsmidos

Extraccin del plsmido ligado RD

Extraccin del plsmido ligado TRD

Crecimiento de las clulas transformadas

Digestin

Transformacin con el ligado RD

Digestin del ligado TRD

Transformacin de clulas con el dispositivo PTRD

Purificacin de banda

Ligacin de fragmentos R-D

Purificacin del fragmento TRD

Ligacin del dispositivo P-TRD

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Resultados Preliminares
Esquema de la primera etapa de digestiones

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Resultados Preliminares
La primera etapa de digestiones se realiz utilizando una combinacin de buffer-enzimas para cada muestra Promotor C S P S +P RNA termmetro C X X P P 3529 bp 68 bpbp 75
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5000 3000 bp 1500

Fig. 2a Digestiones de plsmido C plsmido sin digerir S - SpeI P PstI X - XbaI

2170 bp

500

X+P

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Resultados Preliminares

X X E E E+X

E+X
Fig. 2b Digestiones de plsmido
C plsmido sin digerir E EcoRI S - SpeI P PstI X - XbaI

Terminador C E X C

RFP

3000 bp

5000

1500 3189 bp 500 681 bp

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Resultados Preliminares
Recuperar Biopartes
Purificacin de los fragmentos a ligar Ligacin de los fragmentos T-RD Desarrollo del perfil de temperatura-nivel de fluorescencia Pruebas de crecimiento a diferentes temperaturas

Ruta crtica del proyecto

Transformar clulas competentes

Digestin del ligado RD

Transformacin con el ligado TRD

Extraccin de plsmidos

Extraccin del plsmido ligado RD

Extraccin del plsmido ligado TRD

Crecimiento de las clulas transformadas

Digestin

Transformacin con el ligado RD

Digestin del ligado TRD

Transformacin de clulas con el dispositivo PTRD

Purificacin de banda

Ligacin de fragmentos R-D

Purificacin del fragmento TRD

Ligacin del dispositivo P-TRD

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Resultados Preliminares
3189 bp D X+E 681 bp R 3529 bp T X+P 2170 bp P S+P

3000 bp

5000 1500

500

Fig 3. Digestiones para obtener biopartes (para purificacin de banda)

Las bandas obtenidas en la electroforesis fueron cortadas y purificadas con un kit zymo para recuperacin de DNA

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S+E

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Resultados Preliminares
Recuperar Biopartes
Purificacin de los fragmentos a ligar Ligacin de los fragmentos T-RD Desarrollo del perfil de temperatura-nivel de fluorescencia Pruebas de crecimiento a diferentes temperaturas

Ruta crtica del proyecto

Transformar clulas competentes

Digestin del ligado RD

Transformacin con el ligado TRD

Extraccin de plsmidos

Extraccin del plsmido ligado RD

Extraccin del plsmido ligado TRD

Crecimiento de las clulas transformadas

Digestin

Transformacin con el ligado RD

Digestin del ligado TRD

Transformacin de clulas con el dispositivo PTRD

Purificacin de banda

Ligacin de fragmentos R-D

Purificacin del fragmento TRD

Ligacin del dispositivo P-TRD

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Resultados Preliminares

Las bacterias transformadas no crecieron en el medio con kanamicina, en el gel de la electroforesis de las ligaciones mostr 5 bandas en el mismo canal. Se repiti la reaccin de ligacin a partir de la digestin, esta vez se us un control de ligacin, uno de los plsmidos (termmetro) fue cortado con EcoRI y tratado de la misma manera que las muestras.

La imagen del gel no esta disponible

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Resultados Preliminares
Recuperar Biopartes
Purificacin de los fragmentos a ligar Ligacin de los fragmentos T-RD Desarrollo del perfil de temperatura-nivel de fluorescencia Pruebas de crecimiento a diferentes temperaturas

Ruta crtica del proyecto

Transformar clulas competentes

Digestin del ligado RD

Transformacin con el ligado TRD

Extraccin de plsmidos

Extraccin del plsmido ligado RD

Extraccin del plsmido ligado TRD

Crecimiento de las clulas transformadas

Digestin

Transformacin con el ligado RD

Digestin del ligado TRD

Transformacin de clulas con el dispositivo PTRD

Purificacin de banda

Ligacin de fragmentos R-D

Purificacin del fragmento TRD

Ligacin del dispositivo P-TRD

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Resultados Preliminares

T
5000

1500

500

Fig. 4 Extraccin de plsmidos (Miniprep)

Se realiz una segunda etapa de miniprep pues las cantidades de termmetro y promotor no fueron ptimas
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Resultados Preliminares
3529 bp T S+P 681 bp R S+E 3189 bp D

Control X

3000 bp

5000

1500

500
Fig 5. Digestiones para obtener biopartes (para purificacin de banda) Control Digestin simple de RNA termmetro con XbaI

En la segunda etapa de purificacin fue posible recuperar las bandas y purificarlas de la misma manera que en la anterior etapa.
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X+E

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Resultados Preliminares
3529 bp
T 3000 bp 5000

681 bp
R D

3189 bp
C

1500
500

Fig 6. Purificaciones para iniciar las construcciones Control Digestin simple de RNA termmetro con XbaI

El gel representa la confirmacin de la recuperacin de los fragmentos

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Resultados Preliminares
R
Kit

P 5000

1500

500

Fig. 7 Extraccin de plsmidos (Miniprep)

Fue necesaria una tercera etapa de miniprep para garantizar una reserva de los plsmidos en caso de fallar en la ligacin nuevamente
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Resultados Preliminares
Recuperar Biopartes
Purificacin de los fragmentos a ligar Ligacin de los fragmentos T-RD Desarrollo del perfil de temperatura-nivel de fluorescencia Pruebas de crecimiento a diferentes temperaturas

Transformar clulas competentes

Digestin del ligado RD

Transformacin con el ligado TRD

Extraccin de plsmidos

Extraccin del plsmido ligado RD

Extraccin del plsmido ligado TRD

Crecimiento de las clulas transformadas

Digestin

Transformacin con el ligado RD

Digestin del ligado TRD

Transformacin de clulas con el dispositivo PTRD

Purificacin de banda

Ligacin de fragmentos R-D

Purificacin del fragmento TRD

Ligacin del dispositivo P-TRD

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Resultados Preliminares

Para la segunda etapa de ligacin, se realizaron modificaciones a las proporciones plsmido/inserto, esta vez con 1:1, 1:3 y 1:5 y no 1:2 como se haba planteado inicialmente. Posterior a la ligacin, este fragmento fue utilizado para transformar clulas competentes de E. coli Top10 una vez mas.

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Resultados Preliminares

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Resultados Preliminares

Modelo de piocianina de Pseudomonas aeruginosa

5000

1500

500

Fig.1 Extraccin de DNA cromosomal