Cultivo de embriones bovinos:

Efecto de los medios de cultivo y

de los requerimientos fisiólogicos
sobre la calidad de los embriones
producidos in vitro. Parte (II)

A.T. Palasz y J. de La Fuente

Dept. de Reproducción Animal y Conservación de Recursos Zoogenéticos. INIA, Madrid
Dr. Palasz Dr. de la Fuente

Introducción fabricados suelen tener un coste superior ya que se requieren

En la producción in vitro de embriones bovinos los
elementos constitutivos son de importancia capital, así el
uso de suero sanguíneo y de células somáticas resultan
ser las principales fuentes de la inconsistencia de los re-
sultados obtenidos (datos científicos no concluyentes) y
aun más relevante, una fuente potencial de contamina-
ción con agentes víricos infecciosos. Por estas razones se
Una rutina han llevado a cabo numerosos intentos para desarrollar
diaria de un sistema de cultivo más definido y eficiente, sin ningún
tipo de producto biológico, para la producción in vitro por
limpieza y FIV de embriones bovinos. De igual manera, los requeri-
control de la mientos fisiológicos para el mantenimiento y desarrollo de
asepsia en las los embriones resultan fundamentales y sus márgenes de
variación reducidos.
superficies en
contacto con En el presente artículo se pretende revisar los princi-
los envases de pios básicos y las medidas de control de calidad para los
sistemas de FIV bovina.
los embriones
prevendrán
una posible Cultivo: Constituyentes del
contaminación Medio y Condiciones de Cultivo
de los cultivos
en el incubador Medio de Cultivo
En numerosos laboratorios los medios de cultivo suelen
ser comprados al fabricante y solo en algunos casos fabri-
cados en el propio laboratorio, dependiendo generalmente
de la complejidad del medio en sí mismo. Los medios auto
medidas de asepsia estrictas y la mejor calidad posible de
agua y de componentes, que a su vez han de haber sido
testados para evitar una posible toxicidad sobre los embrio-
nes. Después de pesar todos los componentes del medio, la
preparación final debe ser realizada bajo una mesa de flujo
laminar y las soluciones finales almacenadas en recipientes
estériles, bien de plástico o de cristal. Normalmente los me-
dios complejos, por ejemplo el Ham´s F-10, deben ser utiliza-
dos antes de las 2 semanas de su preparación y guardados a
4º C antes de su uso. Por el contrario el PBS o las soluciones
salinas pueden ser almacenadas por más de 6 meses a 4ºC.
Los cambios en el pH y la exposición a la luz de los medios
almacenados son los factores responsables del deterioro de
alguno de sus componentes. El piruvato, los antibióticos y
L-glutamina se degradan espontáneamente durante el alma-
cenaje y por lo tanto deben ser adicionados inmediatamente
antes de su utilización. Otros componentes del medio, como
son los factores de crecimiento y el suero deberán haber
sido alicuotados y congelados a –70ºC, ya que esta tem-
peratura previene el deterioro y la desnaturalización de las
proteínas,que producen su indisolubilidad al precipitar los
componentes del medio. Nosotros hemos encontrado que la
repetición de sucesivas congelaciones no afecta a la eficacia
del suero para su utilización normal en los medios de cultivo
ni en las transferencias de los embriones (Palasz et al, 1995).
No se recomienda el almacenar el agua por un prolongado
periodo de tiempo, ya que los metales pesados pueden llegar
a diluirse desde los envases de plástico y de vidrio.
Todas las soluciones deben ser testadas para medir
su pH (la adición de rojo fenol al medio permite la visua-
lización de una posible desviación del pH) y osmolaridad
 Efectos del tipo de conservante añadido Cultivoaldeensilado
embrionesde trigo sobre la producción y composición
bovinos:
Efecto de los medios de cultivo y de los requerimientos
química fisiológicos sobre la calidad de los embriones producidos in vitro
de la leche
nº 9
Nut rición

antes de proceder a su esterilización mediante filtración Embriones PIV de 4-8 células

con un filtro de presión positiva con un tamaño de poro
de 0.22 µm, inmediatamente antes de su uso. Todas las
preparaciones de nuevos medios deben ser testadas por
una posible contaminación y para demostrar su habilidad
a facilitar el desarrollo de embriones en cultivo. Un en-
sayo muy preciso y conveniente es el cultivo de estadíos
tempranos (2 células) de embriones de ratón. A pesar de
que los embriones de ratón son menos sensibles que los
de otras especies, este bio-ensayo da información como
control de calidad y de una posible toxicidad.

Agua
Ovarios de matadero
Es conveniente recordar que el mayor componen-
te de los medios de cultivo es el agua (>98%) y que su
calidad tiene un profundo efecto sobre el desarrollo de
los embriones en cultivo (Whittingham, 1971). El restante
1-2% son iones inorgánicos, amino ácidos, carbohidratos,
vitaminas, antioxidantes, hormonas y factores de creci-
miento, cuya pureza química tampoco debe ser ignorada.

En la actualidad se han desarrollado sistemas muy

sofisticados de purificación del agua, Agua de Grado y
Tipo I, la cual puede ser suministrada de forma comercial
(Millipore Ltd; Barnstead/Thermolyne Corporation). Aun-
que una gran cantidad de contaminantes encontrados en Aspiración de ovocitos
el agua hacen necesario la realización de múltiples test, el para FIV
indicador de pureza mas común es la resistividad (resisten-
cia ofrecida por el agua al paso de una corriente eléctrica).
Así, a mayor resistividad mayor el grado de pureza del
agua. La mayor resistividad es de 18.3 megaohms (Tipo
I-RGW) a 25ºC. Solo este tipo de agua debe ser usada en
los medios de cultivo de embriones. No está recomendado
el almacenamiento del agua pura, ya que con el paso del
tiempo puede llegar a deteriorarse, mayormente debido a
la disolución de metales pesados procedentes de los reci-
pientes, bien sean de cristal como de plástico. Ha quedado
demostrado que el desarrollo de los embriones hasta el
estadío de blastocisto es mayor en los medios preparados
Grupo de ovarios para PIV
con agua fresca Milli-Q que en aquellos preparados con del medio de cultivo, y
agua guardada durante 1 ó 2 semanas (35%, 18% y 18%, que el calcio y el pota-
respectivamente; Nagao et al., 1995). sio son esenciales para
el desarrollo embriona-
No obstante, y a pesar de contar con una composición rio, son muy efectivos
óptima del agua, el medio de cultivo es muy dependiente y se en un rango muy am-
puede ver muy afectado por parámetros físicos como son la plio que va desde 0.4 a
temperatura, pH, osmolaridad, composición del gas utilizado 10 mM. La ausencia de
durante el periodo de cultivo in vitro, luz y la cantidad de em- calcio en el medio de
briones en un determinado volumen de medio de cultivo. cultivo resulta en una
reducción de las di-
Iones inorgánicos visiones embrionarias
y en una incapacidad
Las funciones de los iones inorgánicos son catalíti- para la compactación
cas y fisiológicas. La composición iónica de la mayoría de de las mórulas. Catio-
los medios de cultivo se basa en el análisis bioquímico de nes como el Ca++ y Mg++, así como las glicoproteinas,
la sangre o del liquido oviductal, así es como ejemplo el juegan un papel importante en el proceso de adhesión
medio de Fluido Oviductal Sintético (SOF; Tervit, 1972). celular. El fosfato parece ser efectivo solo a una muy de-
Sin embargo, no hay que olvidar que el fluido oviductal terminada concentración de 0.35 mM en los medios de
no resulta ser un simple filtrado de plasma (Leese, 1988). cultivo para embriones bovinos (Kim et al., 1993).
La composición iónica, el pH, la osmolaridad y el con-
tenido de macromoléculas contenidas en el líquido ovi- Substratos energéticos
ductal difieren enormemente de los del plasma sanguíneo
(Gandolfi et al, 1989). Está generalmente aceptado que Las fuentes de energía más comunes en el medio de
el cloruro sódico es necesario para regular la osmolaridad cultivo son el lactato, el piruvato y la glucosa. Todos es-
 Palasz A. T. y de La Fuente J.
Placas de cultivo
Mesa de flujo laminar y
estereo-microscopios tos substratos se han encontrado en el líquido oviductal, sus
funciones difieren en los medios de cultivo de las diferentes
especies animales y en los diferentes estadíos de desarrollo.
En los estadios mas tempranos (embriones de 1-2 células) se
utiliza el piruvato y/o el lactato pero no la glucosa. De hecho,
la adición de glucosa a los embriones bovinos fertilizados
de una célula cultivados en SOF resulta en un descenso del
desarrollo embrionario posterior (Takahashi y First, 1992),
así como en una desviación en la proporción de sexos de
los embriones bovinos producidos in vitro (Gutiérrez Adán et
al., 2001). Otras fuentes de energía, incluyendo la glucosa,
son utilizadas a partir del estadio de 8 células. Ha quedado
claramente demostrado (Rieger et al, 1992) que los embrio-
nes bovinos utilizan la glucosa como principal fuente de
energía desde las 8 células hasta el estadío de blastocisto.
Kobayashi et al, (1994) han reportado que se incrementan
los blastocistos bovinos producidos in vitro utilizando ba-
jas concentraciones de glucosa en el medio (0.4 mg/ml) en
combinación con una baja (5%) tensión de oxígeno. El piru-
vato-glucosa puede llegar a ser sustituido por una mezcla de
piruvato-ribosa e incluso en algunos medios determinados
por galactosa.
Aminoácidos y vitaminas
Los medios de cultivo más frecuentemente utilizados,
como son el Ham´s F-10 o el TCM-199, contienen del orden
de 20 aminoácidos, sin embargo, aún están poco definidas
sus funciones en los medios de cultivo. Normalmente los
20 aminoácidos están implicados en la síntesis proteica. Si
a los medios de cultivo solamente se les enriquece con una
gran cantidad de aminoácidos esenciales, una porción de
ellos se degradarán para proveer de una fuente de nitróge-
no que sirva para la síntesis de aminoácidos no esenciales.
Se acepta de forma general que los aminoácidos sir-
ven como fuente de energía, tampones intracelulares del
pH, y como “pool” para la síntesis proteica. Se ha demos-
trado que la retirada de ciertos aminoácidos, así como la
inclusión de otros puede llegar a mejorar las condiciones de
cultivo (Keskintepe et al., 1995; Steeves y Gardner 1999).
Muchos de los aminoácidos nutricionales, como la fenila-
lanina, tirosina, lisina, valina y treonina son apenas utili-
zados por las células embrionarias (Eagle, 1959), mientras
que otros, como la glutamina, son activamente metaboli-
zados y muy utilizados como fuente de energía durante el
desarrollo embrionario (Rieger et al., 1992). Sin embargo,
en otros estudios, al suplementar con los 20 aminoácidos
esenciales y con aminoácidos no esenciales, el resultado fue
que se incrementó el desarrollo embrionario (Takahashi y
First, 1992) y se vio que la acción de los aminoácidos sobre
el desarrollo embrionario era dependiente del estadío de
desarrollo (Kim et al., 1993; Lane y Gardner, 1997).
Las vitaminas juegan un importante papel como
coenzimas en el metabolismo de los carbohidratos y de los
aminoácidos (Lehninger, 1975), igualmente está demostra-
do que las vitaminas hidrosolubles son necesarias para la
expansión del blastocisto y la salida de la zona pelucida en
los embriones de hámster y de conejo (Kane et al., 1988).
Pero, por encima de todo, los efectos de las vitaminas so-
bre el crecimiento de los embriones bovinos han resultado
generalmente no concluyentes (Takahashi y First, 1992).
Colina e Inositol, generalmente incluidas como vitaminas,
juegan un papel de substratos mas que de catalizadores. La
colina es un precursor de la fosfatidilcolina y de la esfingo-
mielina, dos de los mayores fosfolípidos estructurales de la
capa exterior de las membranas embrionarias.
Hormonas
Existe una clara evidencia de que algunas hormonas,
como es la insulina, tienen un gran efecto sobre el desa-
rrollo de los embriones. Así, la adición de insulina a los
medios de cultivo resulta en un incremento de las tasas
de desarrollo morfológico y del transporte de glucosa al
blastocisto (Gardner y Kaye, 1991). A la vista de la micros-
copía electrónica, la supervivencia post descongelación y
los porcentajes de gestación, la adición de insulina y sele-
nio a los medios de cultivo de embriones bovinos, resultan
en una mayor calidad de los blastocistos (Shamsuddin et
al., 1993). La suplementación con hormonas, tales como
LH, FSH y estradiol 17β, de los medios de maduración
de los ovocitos bovinos, se ha demostrado que ofrecen
efectos beneficiosos sobre el porcentaje de complejos cú-
mulo-ovocito (COC) que son capaces de completar la ma-
duración meiótica con el consecuente desarrollo in vitro
(Sirard, 1988; Saeki et al., 1991).
 Cultivo de embriones bovinos:
Efecto de los medios de cultivo y de los requerimientos fisiológicos sobre la calidad de los embriones producidos in vitro
nº 9
Nut rición

Factores de crecimiento

Entre un gran número de factores de crecimiento que tienen un papel importante en la proliferación celular del embrión,
los más importantes parecen ser los relacionados con la insulina (insulin-like growth factors; IGF), los de transformación (trans-
forming growth factors; TGF) y los epidérmicos (epidermal growth factors; EGF). Los péptidos de IGF afectan al transporte de
membrana y a las actividades enzimáticas en las células embrionarias. La IGF-I y la insulina se ha demostrado que incrementan
la producción estrogénica en los embriones de cerdo en cultivo, lo cual es necesario para la transición del estadio de mórula
al de blastocisto (Hofig et al., 1990). La adición de TGF-B al medio de cultivo también estimula las actividades mitóticas en
la masa interna celular del blastocisto (ICM), sobre todo cuando el embrión se encuentra en un estadío inicial de blastocisto
(Marguant-LeGuaienne et al., 1989). La familia de los EGF de los factores de crecimiento se ha visto que causan un incremento
significativo en el desarrollo en los embriones bovinos de 2 a 8 células, así como en el paso de mórula a blastocisto (Yang et al.,
1993). Por otra parte, un estudio realizado por Shamsuddin. et al., (1993) demostró que los EGF no estimularon el desarrollo
embrionario hasta el blastocisto pero que si incrementaron la ruptura zonal de los blastocistos.

Proteínas de origen biológico

Una forma de suplementar proteínas a los embriones in vitro es mediante la adición al medio de suero fetal (FCS) o
de albúmina del suero bovino (BSA), los cuales son usualmente añadidos a la mayoría de los medios de cultivo embrionario.
Estos dos compuestos realizan un papel similar, aunque no del todo conocido y ambos están compuestos de una forma muy
variable, debido a la escasa definición de sus componentes (Barnes y Sato, 1980; Bavister, 1992). El suero fetal y la BSA afectan
al pH del medio y actúan como quelantes de iones metálicos, contienen factores de crecimiento y ciertas cantidades variables
de hormonas que inciden en la proliferación y diferenciación celular (Ball et al., 1985), además sirven como agentes activos
de superficie (Palasz et al., 1995). Las proteínas biológicas que contienen acarrean un peligro potencial de contaminaciones
cruzadas y de esta manera los embriones pueden aparecer infectados con virus y otros patógenos provenientes de las donantes
de las proteínas (Rossi et al., 1980). Debido fundamentalmente a este hecho, la posible contaminación, además de su variable
aportación en cuanto a constituyentes y funciones, los medios con productos biológicos deberían ser sustituidos por medios
definidos que permitieran similares tasas de crecimiento embrionario in vitro.

Sustitutivos del suero y de la tensión superficial

La tensión superficial de los medios de cultivo ha resultado ser un factor importante en el cultivo in vitro de los
embriones de mamíferos (Palasz et al., 2000). Esto ha sido resuelto tradicionalmente por la adición de BSA, pero en la
 Palasz A. T. y de La Fuente J.
Estufa de cultivo para PIV
Equipo de purificación de
agua
actualidad algunos polímeros sintéticos pueden reemplazar
las propiedades de actividad de las membranas, aunque de
ninguna manera puedan reemplazar las propiedades em-
brio-tróficas de la BSA o del suero en los medios de cultivo.
Estas últimas han de ser sustituidas por factores de creci-
miento en los medios químicamente definidos. La actividad
superficial de los fosfolípidos y de los surfactantes quími-
camente definidos se expresa por la formación de micelas
en soluciones acuosas. Los micelas forman una agrupación
de micelas que atrapa las moléculas en solución (a los nu-
trientes en los medios de cultivo) y su disponibilidad para
las células ha desarrollar (de los embriones) está en relación
con los cambios en la tensión superficial de las soluciones.
La efectividad del suero y de la BSA en la colecta de
los embriones, en el corto o largo periodo de cultivo y en
los medios de congelación o descongelación (los cuales
son procesos biológicos y físico-químicos muy diferen-
tes) sugiere que ambos (suero y BSA) poseen propieda-
des comunes o al menos muy parecidas, más allá de sus
componentes nutricionales. Al mismo tiempo, la polivinil-
pirrolidona (PVP; Saeki et a1, 199l; Leibo y Oda 1993),
el alcohol de polivinilo (PVA; Keskintepe et al., 1995), el
hialuronato de sodio (SH; Joly et al., 1992; Palasz et al.,
1993) y el ET surfactante (Palasz et al., 1995), han sido
utilizados de forma exitosa como reemplazantes del suero
y la BSA en los medios de colecta, cultivo y congelación
de las células germinales de mamíferos. Aunque algunas
de las moléculas citadas pueden recordar o tener similitu-
des con la albúmina, de ninguna manera pueden provocar
las posibles reacciones que realizaría el suero y además
son inertes desde el punto de vista fisiológico (Catálogo
de Merck, 1989).
En los sistemas biológicos, la actividad superficial
es evidente para los compuestos de bajo peso molecu-
lar como son el glicerol y los aminoácidos, así como los
polímeros macromoleculares como los fosfolípidos y las
proteínas (Encyclopedia of Chemical Technology, 1970).
Todos ellos realizan importantes funciones in vivo en
cuanto al ensamblamiento y funcionamiento de muchas
estructuras biológicas como son las membranas celulares
y los revestimientos surfactantes de los alvéolos pulmo-
nares (Possmayer et al., 1984), así como en los fluidos
uterinos y oviductales (Nichol et al., 1992). Una sustancia
activa a nivel superficial tiene la tendencia de absorber
dentro de la superficie de las membranas celulares y a ser
incorporada dentro de esas membranas. Las mediciones
de la tensión superficial proveen de una indicación muy
efectiva de las propiedades absorbentes y de la capacidad
de interacción de moléculas en una determinada superfi-
cie estática en gas-liquido de los medios de cultivo. Las
concentraciones momentáneas de los agentes activos de
superficie (proteínas) pueden resultar en una significati-
va reducción de la tensión superficial de los medios de
cultivo. La absorción de proteínas al citoplasma celular a
través de la membrana bi-capa permite el mantenimiento
de la integridad y de la forma de la membrana, y por
tanto puede controlar la circulación de metabolitos (hacia
dentro y hacia fuera) en el embrión. Ya que estos agentes
actúan como “intercambiadores”, pueden potencialmente
afectar al trasporte de oxígeno a través de los componen-
tes gas-líquido de el medio de cultivo, lo cual puede tener
un efecto muy profundo sobre el desarrollo embrionario
(Tervit et al., 1972; Berthelot y Terqui, 1996).
Keskintepe et al., (1995) han reportado la posibili-
dad de producir un medio de cultivo sintético para los
embriones bovinos constituido por medio SOF al que se le
añadió PVA, agentes quelantes, citrato y aminoácidos no
esenciales, pero sin ser añadida la BSA. El alcohol de poli-
vinilo es un polímero coloidal con poca actividad química
y su eficacia en los medios de cultivo ha de ser debida
a sus propiedades como activador de superficie más que
a las coloidales. En otro estudio reciente (Palasz et al.,
2000), la tensión superficial del PVA fue más aparente que
la del PVP, cuando ambos fueron utilizados a los niveles
habituales en los medios de cultivo. Esto puede explicar
el porqué el PVA es más frecuentemente utilizado en los
medios de cultivo in vitro de los embriones de mamíferos
(Kane, 1987; Eckert y Niemann, 1995) de lo que es el PVP
(Berthelot y Terqui, 1996; Kim et al., 1996).
 Cultivo de embriones bovinos:
Efecto de los medios de cultivo y de los requerimientos fisiológicos sobre la calidad de los embriones producidos in vitro
nº 9
Nut rición

Antibióticos

Los medios de cultivo suelen ser complementados de

forma estandarizada por 0.1% de antibióticos para supri-
mir el crecimiento de microorganismos contaminantes y
para prevenir la expansión de patógenos. Aunque no son
necesarias altas concentraciones de antibióticos, 10 veces la
concentración normal de Penicilina G y de Estreptomicina
durante 72 horas se ha visto que no resulta toxica para los
embriones a 37º C (Riddel et al, 1985). De cualquier manera
no está recomendado que se incluyan en los medios antibió-
ticos almacenados durante largos periodos de tiempo, ya que
la vida media de la mayoría de los antibióticos se encuentra
entre los dos días a las dos semanas, dependiendo del tipo de
antibiótico y de la temperatura de almacenamiento.

Requerimientos fisiológicos

Temperatura, pH, dióxido de carbono y tensión de oxí-

geno, osmolaridad y humedad relativa de los incubadores.
Osmómetro

Osmolaridad y pH

La osmolaridad normal del suero sanguíneo y de la

mayoría de los medios de cultivo es de alrededor de los
308 mOsm. Sin embargo, osmolaridades más bajas (del
orden de 246 mOsm) se han encontrado óptimas para los
medios de cultivo de embriones de rata y medios dentro
del rango de los 275 a 285 mOsm se han usado para
el cultivo de embriones bovinos en muchos laboratorios
(Gordon, 1994). Generalmente se acepta que los embrio-
nes pueden tolerar un amplio rango de osmolaridad si la
relación potasio:calcio se mantiene constante. No obstan-
te, se recomienda la medición de la osmolaridad antes y
después del cultivo in vitro de los embriones.

El pH del medio de cultivo debe estar entre el 7.2 al

7.4, mientras que en los medios de fecundación se reco-
mienda ligeramente superior (7.6-7.8). Debe ser recordado
que la adición de un 10% de suero o un 0.3% de BSA pro-
duce una tendencia a bajar el pH en un 0.1. Como muchos
medios para cultivos durante largos periodos de tiempo son
fosfatados (usado mayormente como sustancia tampón) el
nivel de este bicarbonato controla el pH. Estos medios son
normalmente equilibrados con el gas en el que se va a rea-
lizar el cultivo, generalmente 5% de CO2 en aire, lo cual
mantiene el pH alrededor del 7.4. Sin embargo, sin CO2
y HCO3+, los embriones de ratón no se dividen por enci-
ma de las 2 a 4 células, lo cual sugiere que ambos tienen
funciones adicionales (Whittingham, 1971). El dióxido de
carbono resulta necesario para la regulación del pH intra-
celular (Carney y Bavister, 1986), y la presencia de bicarbo-
nato se ha visto que incrementa el pH intracelular de los
espermatozoides bovinos (Vijayaraghavan et al., 1985).
Gas atmosférico y temperatura
Las condiciones más habituales de cultivo de los em-
briones de 5% CO2 y 95% de aire, proveen de niveles de
oxígeno en la fase gaseosa del 20%, lo cual es mucho mayor
que los niveles de oxígeno medidos en el oviducto y el útero
del conejo (Bavister y Fisher, 1991). La presión parcial de oxí-
pHmetro
geno en los fluidos corporales es significativamente menor
que en el aire. Así, la existencia de altos niveles de oxígeno
han sido asociados al bloqueo del desarrollo embrionario, lo
cual generalmente es contrarrestado con un co-cultivo en
BOEC (Ellington, et al., 1990) o con células bovinas del cu-
mulus o de la granulosa. Sin embargo, cuando los embriones
crecen en medios definidos sin la presencia de suero o de
BSA, se aprecian tasas superiores de desarrollo cuando el ni-
vel de O2 ha sido reducido por debajo del 10% (Tervit et al.,
1972; Thompson et al., 1990).
La mayoría de los laboratorios de producción de em-
briones bovinos in vitro utilizan temperaturas de cultivo
de 39ºC, lo cual representa un incremento de 2ºC sobre
las temperaturas que se utilizaban hace una década. La
razón principal para este cambio es que la penetración
espermática y la subsiguiente fecundación fueron supe-
riores al realizarse a 39ºC (Watson et al., 1991). Hay, no
obstante, algún otro trabajo que reporta mayores tasas
de división de los embriones bovinos cultivados in vitro
a 37ºC (Alfonso y Hunter, 1992). Es de gran importancia
recordar que la temperatura corporal de la vaca es cercana
a los 39ºC, mientras que los 37ºC son mas cercanos a la
temperatura corporal humana.
 Palasz A. T. y de La Fuente J.
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