1 Einleitung - Nukleinsäuren

Nukleinsäuren I
Nukleinsäuren sind als
Bausteine der DNA
(DeoxyriboNucleic Acid),
Bestandteil unseres
genetischen Materials. Die
erstmalige Entdeckung,
die dem Makromolekül
DNA eine genetische
Bedeutung zukommen
ließ, erfolgte 1928 von
dem Medizinalbeamten
Frederick Griffith. Bis in
die 1940er jedoch wurden
auch Proteine als
potentielles Erbmaterial in
Betracht gezogen. Weitere Versuche waren nötig (z.B. 1944 Avery, McCarty und MacLeod,
1947 Chargaff, 1952 Hershey und Chase) bis schliesslich alle Zweifel aus dem Weg
geräumt waren.

Heutzutage findet man dank immer weiterentwickelter Methoden zur Aufschlüsselung der
DNA (das sog. Next Generation Sequencing, NGS) riesige Web-Datenbanken, in denen
ganze Genome (d.h. das gesamte aufgeschlüsselte Erbmaterial) verschiedenster
Organismen aus den Reichen der Bakterien, Pilze, Pflanzen und Tiere zu finden sind.

Die drei größten Datenbanken sich zu umfangreichen Plattformen für biologische

Resourcen aller Art entwickelt. Dies sind: DDBJ DNA Data Bank Japan, in Japan), EMBL-
EBI (European Bioinformatics Institute, in UK), NCBI (National Center for Biotechnology
Information, in US). Die drei Datenbanken sind verbunden über die International
Nucleotide Sequence Database Collaboration (http://www.insdc.org/).

1953 wurde die Doppelhelix-Struktur der DNA von den Forschern Watson und Crick
veröffentlicht. Die Vorarbeiten von Franklin und Wilkins machten dies möglich.

Nukleinsäuren II
Die DNA besteht aus:

vier Basen Cytosin (C), Guanin (G), Adenin (A), Thymin (T) (in der RNA, Uracil (U)
anstelle von Thymin):
Die Basen sind mit Zuckern (DNA=Deoxyribose, RNA=Ribose) und Phosphat zu
Nukleotiden verknüpft.

Nukleinsäuren III
Einzelne Nukleotide (Nukleosidmonophosphate) sind linear verknüpft und bilden in Ketten
die DNA. Die Phosphatgruppe eines Nukleotids ist mit der Zuckergruppe des nächsten
Nukleotids verbunden, so bilden sie das sogenannte Rückgrat der DNA.

DNA liegt in einem Doppelstrang vor. Die Basen zweier Ketten sind gegenläufig über
Wasserstoffbrückenbindungen miteinander verbunden. Dabei sind es zwei
Wasserstoffbrücken zwischen A und T und drei zwischen den Basen C und G.
3D Struktur der DNA: https://www.rcsb.org/3d-view/1BNA/1
Die Gesamtlänge der DNA in einer Zelle eines Menschen (verteilt auf 2x23 Chromosomen)
entspricht etwa 2m!

2 PCR

PCR - Einführung
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, Polymerase Chain
Reaction) ist eine diagnostische Routinemethode, mit der
sich kleinste Mengen DNA in kurzer Zeit vervielfältigen
(amplifizieren) lassen, so dass man sie im Labor
untersuchen kann.
So können z.B. Mutationen im Erbgut bestimmt werden,
Vaterschaftstest durchgeführt werden oder in der
Gerichtsmedizin ein genetischer Fingerabdruck ermittelt
werden.

Theoretisch genügt dafür ein einziges DNA-Molekül. Die

PCR ist damit eine der empfindlichsten
molekularbiologischen Methoden.
Damit spezifische Bereiche amplifiziert werden, die für
die entsprechende Fragestellung aussagekräftig sind,
werden kurze Oligonukleotide mit einer definierten
Sequenz benötigt. Diese sogenannten Primer dienen
auch als Anknüpfungspunkt für die Polymerase.

Die eigentliche Vervielfältigung wird durch die Polymerase katalysiert. Die Polymerase ist
ein Enzym, welches einen komplementären Strang zu einem einzelnen DNA Strang
aufbaut. Dieser Strang dient damit als Matrize.
PCR - Schritte
Der PCR Prozess besteht aus einer Serie von meist 20 bis 30 Zyklen. Jeder Zyklus besteht
aus drei Schritten:

1. Denaturierung: Der Versuchsansatz wird auf 96°C erhitzt, damit sich die beiden
DNA Stränge voneinander trennen. Dies geschieht durch das Lösen der
Wasserstoffbrücken zwischen den Basen.
2. Hybridisierung: (auch Annealing): Die Senkung der Temperatur erlaubt das
Anlagern der Primer an den komplementären Bereichen der DNA. Die optimale
Temperatur zum korrekten Annealing hängt von den Primern ab und kann für jeden
Primer berechnet werden. Ist die Temperatur falsch gewählt, können hier Fehler
auftreten, d.h. die Primer hybridisieren dann auch an Bereichen die nicht
komplementär passen.
3. Polymerisation: Beginnend am angelagerten Primer synthetisiert die hitzestabile
DNA-Polymerase den komplementären Strang. Dieser Schritt wird auch Elongation
(Verlängerung) genannt. Hier hängt die optimale Temperatur von der Polymerase ab
(etwa zwischen 68°C und 72°C).

Nun kann der Zyklus erneut starten. Die beiden neu entstandenen DNA-Stränge bilden
nun auch eine Vorlage (Matrize) für die nächsten Durchläufe, die Menge an DNA wächst
also mit jedem neuen Zyklus exponentiell. (1+2+4+8+16+...)

PCR - Animation
In der Animation ist der Ablauf einer PCR schematisch dargestellt. Im folgenden Kapitel
werden Sie sehen und anwenden, wie man Ergebnisse aus einer PCR-Analyse auswertet.

Animation - PCR

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Reverse Transkriptase
Die Reverse Transkriptase ist ein Enzym, welches RNA in DNA umschreibt. Sie benutzt
einen vorhandenen RNA-Strang als Matrize, um Nukleotid für Nukleotid einen
komplementären DNA-Abschnitt (cDNA) aufzubauen. Im Labor wird die Reverse
Transkriptase verwendet, um beispielsweise von einer mRNA die cDNA-Sequenz zu
erhalten. Diese besitzt im Gegensatz zum ursprünglichen Gen keine Introns mehr.

Retroviren (z.B.HIV), deren Erbanlagen als RNA vorliegen, bringen ihre eigene Reverse
Transkriptase mit, wenn sie in menschliche Zellen eindringen. In der Zelle schreibt das
Enzym dann die virale Erbinformation in cDNA um, sodass diese in das Genom der Zelle
eingebaut wird und sich das Virus in der Zelle vermehren kann.
Da sich RNA nicht so einfach vervielfältigen und im Gel auftragen lässt, kann man dies
durch die Reverse Transkription in DNA ermöglichen.
-> RNA bildet komplexe Sekundärstrukturen, daher ist die Laufweite in einem Gel nicht
proportional zu der Größe der Sequenz.

3 Agarose Gelelektrophorese

Einleitung
Die vervielfältigten DNA-Abschnitte die bei der PCR entstehen, können dann durch eine
Agarose-Gelelektrophorese anhand der größenabhängigen Banden identifiziert werden. Die
DNA wird in ein Agarose Gel aufgetragen, auf das eine elektrische Spannung angelegt
wird. Die DNA ist durch die Phosphatreste negativ geladen und bewegt sich daher in
Richtung Pluspol. Die kürzeren DNA-Abschnitte wandern schneller durch die Poren der
Gelmatrix als die längeren DNA-Abschnitte, wodurch sich die unterschiedlichen Größen
voneinander trennen. Trägt man noch einen sogenannten Größenstandard auf (also DNA
mit bekannten Fragmentgrößen) kann man die Größe der zu analysierenden DNA-
Abschnitte bestimmen. Dies sehen Sie in der Abbildung, die ein Agarose-Gel zeigt. An den
Seiten ist jeweils (der gleiche) Größenmarker aufgetragen. Für Proben 1 und 2 sind die
entsprechenden Größen (in Anzahl an Basenpaaren, bp) abgeschätzt: in weisser Schrift,
Probe1 ca. 350bp, Probe2 ca. 510bp.
Methode I
Das Gel wird in eine, mit Pufferlösung gefüllten Gelkammer gelegt. Alle Proben, sowie der
Größenmarker werden mit einem Farbmarker vermischt. Dazu eignet sich z.B.
Bromphenolblau, ein niedermolekularer Farbstoff, der den Verlauf der Proben nicht
beeinflusst sondern hilft, den Fortschritt der Elektrophorese sichtbar zu machen.
Ansonsten kann es leicht passieren, dass die Proben aus der Gelmatrix auslaufen. Der
Farbstoff färbt nicht die DNA-Fragmente!

Nachdem die Proben aufgetragen wurden, wird die elektrische Spannung an der
Gelkammer angelegt.

Methode II
DNA-Fragmente sind normalerweise nicht sichtbar. Sie können jedoch mittels bestimmter
Farbstoffe markiert werden (z.B. UV-Fluoreszenzfarbstoff GelRed). GelRed lagert sich in
die DNA ein und fluoresziert im ultravioletten Licht. Eine DNA-Bande kann dann aus dem
Gel ausgeschnitten werden und z.B. sequenziert werden.

Ablauf einer Elektrophorese in der Animation:

Gelelektrophorese - Animation

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4 PCR Anwendungsgebiete

Genetischer Fingerabdruck
Der genetische Fingerabdruck wird in der Gerichtsmedizin zur Identifikation einer Person
eingesetzt, wobei ihre DNA mit einer vorhandenen Probe verglichen wird. Auf diese Weise
kann eine DNA-Probe von einem Verbrechensschauplatz mit der DNA eines Verdächtigen
verglichen werden. Die Probe (Blut, Speichel, Sperma, Haare, etc.) braucht nur geringe
Mengen an DNA zu enthalten, theoretisch genügt sogar ein DNA-Molekül. Von der
isolierten DNA werden mit Hilfe von Primern bestimmte Bereiche via PCR amplifiziert. Man
benutzt dazu Regionen der DNA, die nicht für Proteine codieren und aus sich
wiederholenden (repetitiven) Sequenzen bestehen. Wichtig ist, dass Regionen benutzt
werden, in denen die Anzahl der Wiederholungen bei jedem Menschen unterschiedlich
ist (Polymorphismus). Die vervielfältigten DNA-Fragmente werden anschließend mit Hilfe
von Restriktionsenzymen geschnitten und die erhaltenen Bruchstücke mittels
Gelelektrophorese aufgetrennt. Auf diese Weise entsteht ein für jeden Menschen
spezifisches Bandenmuster, der "genetische Fingerabdruck".

Vaterschaftstest
Da genetische Fingerabdrücke einzigartig sind (außer bei eineiigen Zwillingen), aber auch
prinzipiell aus dem Erbgut der Eltern stammen, können damit genetische Beziehungen
(z.B. zwischen Eltern und Kindern oder zwischen Geschwistern) bestimmt werden. Dies
kommt beim Vaterschaftstest zum Einsatz. Eine Abwandlung dieser Technik wird auch zur
Bestimmung evolutionärer Beziehungen zwischen Organismen benutzt.

Diagnose von Erbkrankheiten oder Infektionen

Zur Diagnose von Erbkrankheiten kann jedes Gen, das in Frage kommt, mittels PCR mit
den entsprechenden Primern amplifiziert und anschließend sequenziert werden, um
Mutationen aufzuspüren.
Virale Erkrankungen können ebenfalls mittels PCR diagnostiziert werden, indem man aus
Patienten isolierte Virus-DNA vervielfältigt. Diese Analyse kann relativ schnell nach der
Infektion erfolgen, oft Tage oder Wochen vor dem Auftreten von Virus-spezifischen
Antikörpern oder von ersten Symptomen. Dies ist von großem Vorteil für eine Behandlung
bzw. zur Verhinderung der Ansteckung anderer Menschen.

Analyse alter (fossiler) DNA

In manchen Fossilien ist DNA noch in Bruchstücken vorhanden (allerdings ist es extrem
unwahrscheinlich, dass daraus wie in Jurassic Park wieder Dinosaurier hergestellt werden
können). Mittels Klonierung der isolierten DNA-Fragmente und anschließender
Amplifizierung via PCR ist es möglich, DNA zu analysieren, die tausende von Jahren alt ist.
PCR-Techniken wurden erfolgreich z.B. bei einem 40.000 Jahre alten Mammut eingesetzt,
aber auch an menschlicher DNA, wobei die Anwendungen von der Untersuchung
ägyptischer Mumien bis zur Identifizierung von Verwandten des letzten russischen Zaren
reichen. Dazu wird die durch PCR vervielfältigte DNA sequenziert. Aus der Abfolge der
Basenpaare im Vergleich zu anderen Sequenzen können dann Rückschlüsse auf die
Verwandtschaft gezogen werden. Durch diese Methode wurden beispielsweise gezeigt,
dass die heutige Menschenart Homo sapiens nicht vom Neandertaler abstammt, obwohl
beide zeitgleich in Europa existierten.
Vervielfältigung (Klonierung) von Genen
Mit Hilfe der bakteriellen DNA-Replikationsmaschinerie können DNA-Fragmente im Labor in
Bakterien vervielfältigt werden. Hierzu bedarf es eines Vektors, also eines Träger-DNA-
Moleküls, das die zu amplifizierende DNA dem DNA-Syntheseapparat des Bakteriums
unterschiebt. Als Vektoren dienen ringförmige extrachromosomale DNA-Moleküle
(Plasmide), die mit dem zu vervielfältigenden DNA-Fragment bestückt werden. Um
ausreichend DNA zu bekommen, mit denen die Plasmide beladen werden sollen, bedient
man sich der PCR. Die bestückten Plasmide werden in Bakterien transferiert, die selektiv
herangezüchtet (kloniert) werden. Als DNA, mit der der Vektor beladen wird, kann auch
ein Gen dienen, das für ein therapeutisch relevantes Protein kodiert. Nach Heranzüchten
der Bakterien und damit auch der Plasmide mitsamt der eingebauten Gene kann die
Bakterienkultur zur massenhaften Herstellung "künstlicher" (rekombinanter) Proteine
benutzt werden. Beispiele für derartige Proteine, die zur Therapie eingesetzt werden, sind
therapeutische Antikörper, Gerinnungsfaktoren, Wachstumsfaktoren und Zytokine.

Ende - Übungen
Nun können Sie die Übungen starten!
Diese finden Sie in der Übersicht dieses Lernpfades 03 - E-Learning
Nukleinsäuren/PCR:

1. Übungen PCR - Unterschiedliche Aufgaben z.B. Primerdesign, klinische Fälle -

Diagnosen
2. Multiple Choice Fragen

Weitere Erklärungen finden Sie in den entsprechenden Aufgaben.

Viel Erfolg :)

Sollten Sie Fragen haben, können Sie diese im Forum stellen 03 - E-Learning
Nukleinsäuren/PCR -> Frageforum - E-Learning PCR 2021