EVALUACION DE LA CAPACIDAD FERMENTATIVA DE LAS LEVADURAS I.

OBJETIVOS: Determinar la prdida de peso y la cantidad de glucosa consumida por las soluciones de levaduras. Determinar el rendimiento real de las levadura (gr etanol/gr glucosa) Determinar la eficiencia de las levaduras. II. MARCO TERICO: GLUCOLISIS Es una de las rutas ms importante por su frecuencia en los seres vivos. El metabolismo de la glucosa comienza con la gluclisis, (ciclo de Embden Meyerhof) acoplada a la ruta de las pentosas. Durante la gluclisis una molcula de glucosa rinde dos molculas de cido pirvico, es decir una molcula de seis tomos de carbono se escinde en dos de tres. Se puede estructurar en 2 etapas: 1. Pasar de Glucosa a Fructosa-1,6-difosfato. 2. Pasar de Fructosa-1,6-difosfato a dihidroxiacetona y gliceraldehido. La primera fase es una fase de alteracin qumica para dejar la molcula til para la clula. Primera fase de la gluclisis 1. La glucosa se fosforila en el alcohol por la hexoquinasa. La hexoquinasa une el fosfato del ATP mediante un enlace fosfoster y la transforma en Glucosa-6-fosfato. La Glucosa-6-P est preparada para los procesos que continan en la gluclisis. La fosforilacin transforma 1 molcula neutra en una molcula cargada negativamente. Hace que ahora, la glucosa-6-P no pueda volver a salir por la membrana debido a su carga negativa.

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2. A la clula no le gusta la forma aldosa y hace la forma cetosa (Fructosa-6-P). Es realizado por la fosfoglucosa isomerasa.

3. Implica la adquisicin de un segundo fosfato que va a parar al C1 y forma la fructosa1,6-bisfosfato. Lo relaiza la fosfofructoquinasa-1 (PFK-1). La fructosa-1,6-bisfosfato es completamente simtrica. La PFK-1 es un enzima clave en la gluclisis. 4. La fructosa-1,6-bisfosfato se parte por la mitad y da dos molculas (dihidroxiacetonafosfato (DHAP) y gliceraldehido-3-fosfato (G3P)). La gluclisis se da a partir del gliceraldehido-3-P. El equilibrio est desplazado hacia la dihidroxiacetona-fosfato. Slo un 5% es Gliceraldehido-3-P. La desaparicin continua de G3P transforma la DHAP en G3P. Todo acaba siendo G3P. Segunda fase de la gluclisis A partir del G3P comienzan las transformaciones que dan lugar a Piruvato (Pyr) (reacciones de oxidacin). 1. La primera reaccin es que el enzima Gliceraldehido-3-Fosfatodeshidrogenasa oxida el grupo aldehdo a cido (gasta un NAD, que se reduce a NADH). Produce un enzima que es capaz de incorporar un fosfato al cido carboxlico correspondiente. Se forma un ster. La fosforilacin a nivel de sustrato se consigue porque hay ATP con un fosfato ya activado. 2. El 1,3-Bisfosfoglicerato cede 1 fosfato para sintetizar ATP. La reaccin la cataliza la fosfogliceratoquinasa. El producto de la sntesis de ATP es el 3-fosfoglicerato. Sufre transformaciones que dan lugar a la sntesis de Pyruvato. El P3 debe pasar a la posicin 2. Se consigue mediante el enzima fosfogliceromutasa. La mutasa tiene un fosfato activo, que se lo da a la posicin 2. En un momento hay dos fosfatos, pero luego, se lo quita de la posicin 3. Todas las mutasas funcionan as. Se hace para liberar el OH en la posicin 3. 3. Se produce la deshidratacin del OH. Se transforma el alcohol en enol, por la enolasa. Es parecido a Pyruvato, pero con enol y un fosfato. Se llama fosfoenolpiruvato (PEP). Es una molcula muy inestable que se transforma en Pyruvato por la Pyruvatoquinasa y se acopla la energa que se desprende para sintetizar ATP.
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ANLISIS ESTEQUIOMTRICO DE LA GLUCLISIS Glucosa + 2Pi + 2 ADP + 2 NAD+ 2 Pyr + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O

La gluclisi es una va que transforma la glucosa en Pyruvato y, a su vez, reduce 2 NAD+ del citosol a NADH y usa 2 Adp para formar 2 ATP. La clula en cuanto puede, transforma otros monosacridos a molculas que estn en la va de la gluclisis.

Figura 1. Diagrama de la glucolisis

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Limitaciones del Proceso La determinacin de los factores que limitan la gliclisis fermentativa del etanol son complejos debido a la interrelacin existente y a la naturaleza de los parmetros intervinientes durante el proceso de fermentacin. Algunos de ellos se deben tener en cuenta en la fermentacin alcohlica industrial. En las limitaciones que surgen durante el proceso se pueden enumerar algunos de los ms importantes como son:

Concentracin de etanol resultante - Una de las principales limitaciones del proceso, es la resistencia de las levaduras a las concentraciones de etanol (alcohol) que se llegan a producir durante la fermentacin, algunos microorganismos como el saccharomyces cerevisiae pueden llegar a soportar hasta el 20% de concentracin en volumen. En ingeniera bioqumica estos crecimientos se definen y se modelizan con las ecuaciones de crecimiento celular dadas por las ecuaciones de Tessier, Moser y de la ecuacin de Monod.

Acidez del substrato - El pH es un factor limitante en el proceso de la fermentacin ya que las levaduras se encuentran afectadas claramente por el ambiente, bien sea alcalino o cido. Por regla general el funcionamiento de las levaduras est en un rango que va aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH. Los procesos industriales procuran mantener los niveles ptimos de acidez durante la fermentacin usualmente mediante el empleo de disoluciones tampn. Los cidos de algunas frutas (cido tartrico, mlico) limitan a veces este proceso.

Concentracin de azcares - La concentracin excesiva de hidratos de carbono en forma de monosacridos y disacridos puede frenar la actividad bacteriana. De la misma forma la baja concentracin puede frenar el proceso. Las concentraciones lmite dependen del tipo de azcar as como de la levadura responsable de la fermentacin. Las concentraciones de azcares afectan a los procesos de osmosis dentro de la membrana celular.

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Contacto con el aire - Una intervencin de oxgeno (por mnima que sea) en el proceso lo detiene por completo (es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razn por la que los recipientes fermentadores se cierren hermticamente.

La temperatura - El proceso de fermentacin es exotrmico, y las levaduras tienen un rgimen de funcionamiento en unos rangos de temperatura ptimos, se debe entender adems que las levaduras son seres mesfilos. Si se expone cualquier levadura a una temperatura cercana o superior a 55 C por un tiempo de 5 minutos se produce su muerte. La mayora cumple su misin a temperaturas de 30 C.

Ritmo de crecimiento de las cepas - Durante la fermentacin las cepas crecen en nmero debido a las condiciones favorables que se presentan en el medio, esto hace que se incremente la concentracin de levaduras.

CICLO DE KREBS. El ciclo de Krebs se desarrolla en las mitocondrias. El cido pirvico formado durante la gluclisis se convierte en acetil CoA, el cual a travs del ciclo de krebs se transforma en anhidrido carbnico. El paso de cido pirvico a acetil CoA tiene lugar en la matriz mitocondrial y es catalizado por la piruvato deshidrogenasa. El acetil CoA ahora entra en el ciclo de krebs uniendose al cido oxalactico para formar el cido ctrico, por medio de una isomerasa se transforma en isoctrico, el cual por medio de una descarboxilasa da lugar al alfa-cetoglutrico, este paso supone la liberacin de anhdrido carbnico y NADH.

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Figura 2. Diagrama del ciclo de krebs El proceso comienza con la oxidacin del piruvato, produciendo un acetil-CoA y un CO2. El acetil-CoA reacciona con una molcula de oxalacetato (4 carbonos) para formar citrato (6 carbonos), mediante una reaccin de condensacin. A travs de una serie de reacciones el citrato se convierte de nuevo en oxalacetato. El ciclo consume netamente 1 acetil-CoA y produce 2 CO2. Tambin consume 2 NAD+ y 1 FAD, produciendo 3 NADH y 3 H+ y 1 FADH+.

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El resultado de un ciclo es (por cada molcula de piruvato): 1 GTP, 3 NADH, 1 FADH2, 2CO2 Cada molcula de glucosa produce (va gluclisis) dos molculas de piruvato, que a su vez producen dos acetil-CoA, por lo que por cada molcula de glucosa en el ciclo de Krebs se produce: 2 GTP, 6 NADH, 2 FADH2, 4CO2. Por cada molcula de acetil CoA se forman dos molculas de anhdrido carbnico, una GTP, tres NADH y un FADH2, el ciclo necesita la incorporacin de dos molculas de agua. En el ciclo de krebs se encuentran acopladas las lanzaderas, las cuales intervienen en diferentes procesos anablicos. De esta forma a partir del ciclo de krebs pueden formarse aminocidos, cidos grasos incluso glucosa (gluconeognesis). FERMENTACIN Todas las clulas estn capacitadas para sintetizar ATP por el proceso de la gliclisis. En muchas clulas, si el oxgeno no est presente, el piruvato es metabolizado en un proceso llamado fermentacin. La fermentacin complementa a la gliclisis y hace posible producir ATP continuamente en la ausencia del oxgeno. Por la oxidacin del NADH producido en la gliclisis, la fermentacin regenera el NAD+, el cual interviene otra vez en para producir ms ATP. C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP 2 CH3-CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + 25.5 kcal

Se puede ver que la fermentacin alcohlica es desde el punto de vista energtico una reaccin exotrmica, se libera una cierta cantidad de energa. Un clculo realizado sobre la reaccin qumica muestra que el etanol resultante es casi un 51% del peso, los rendimientos obtenidos en la industria alcanzan el 7%.

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Figura 3. Proceso de fermentacin

En la fermentacin alcohlica, el cido pirvico de la giclisis pierde un carbono en la forma de bixido de carbono para formas acetaldehido, el cual es reducido a alcohol etlico, el NADH se convierte en NAD+ (es oxididado). Esta es la fermentacin que ocurre normalmente en las levaduras. Como en la fermentacin del cido lctico, la fermentacin alcohlica permite a la gliclis continuar y asegurar que el NADH regresa a su estado oxidado (NAD+). La energa neta ganada en la fermentacin es de 2 molculas/glucosa de ATP. En ambas fermentaciones (lctica y alcohlica), todo el NADH producido en la gliclisis es consumido en la fermentacin, por lo tanto no hay produccin neta de NADH, y ningn NADH entra a la CTE y forma ATP.
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RESPIRACION: La reaccin qumica global de la respiracin es la siguiente: C6 H12 O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + energa (ATP)

En este punto la clula ha ganado solo 4 ATP, 2 en la gluclisis y dos en el ciclo de Krebs, sin embargo ha capturado electrones energticos en 10 NADH2 y 2 FADH2. Estos transportadores depositan sus electrones en el sistema de transporte de electrones localizado en la membrana interna de la mitocondria. La cadena respiratoria est formada por una serie de transportadores de electrones situados en la cara interna de las crestas mitocondriales y que son capaces de transferir los electrones procedentes de la oxidacin del sustrato hasta el oxgeno molecular, que se reducir formndose agua. Como resultado de esta transferencia de electrones, los transportadores se oxidan y se reducen alternativamente, liberndose una energa que en algunos casos es suficiente para fosforilar el ADP y formar una molcula de ATP. Se trata de la fosforilacin oxidativa que permite ir almacenando en enlaces ricos en energa la energa contenida en las molculas NADH2, FADH2, NADPH2, que se liberan en la gluclisis y en el ciclo de Krebs y que ser ms tarde fcilmente utilizada. Toda cadena respiratoria que comience por el NAD conduce a la formacin de 3 ATP mientras que si comienza por el FAD produce slo 2 ATP. El rendimiento energtico del NADP es similar al del NAD, as como el del GTP lo es al del ATP.

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III. MATERIALES Y METODOLOGA A. MATERIALES Levadura instantnea (Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae) Agua destilada Matraces 250 ml. Algodn Azcar B. EQUIPOS Brixometro Balanza analtica Sartorius CPA224S, Max 220g, d=0.1mg. C. METODOLOGIA Pesar los matraces, para poder sacar clculos posteriores, Preparar dos soluciones de sacarosa al 10% y 20 %, Luego de esto verter en las soluciones 1% de levadura, diluirla en la solucin y tapar con algodn la boca de los matraces, Tomar peso y Brix en el tiempo 0, luego tomar peso cada doce horas, luego de cuatro pesadas tomar peso y Brix para los clculos, Encontrar la prdida de peso y cantidad de glucosa consumida(Brix), Determinar el rendimiento real (gr etanol/gr glucosa) Calcular finalmente la eficiencia de las levaduras.
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IV. RESULTADOS Tabla 1. Pesos inciales

PESO DE LEVADURA PESO DE MATRAS 1 PESO DE MATRAS 2 1,5 130,8 151,2

Tabla 2. Pesos y Brix: muestra 10 %

t 0 12 PESO 282 280,6 274,5 274,1 BRIX 10,6 2,9

Tabla 3. Pesos y Brix: muestra 20 %

t 0 12 PESO 302,4 300,9 291,7 290,2 BRIX 20,5 9,2

Tabla 4. Prdida de peso y sacarosa consumida: muestra 20 %

PERDIDA DE PESO SACAROSA CONSUMIDA 7,9 11,8715

Tabla 5. Prdida de peso y sacarosa consumida: muestra 10 %

PERDIDA DE PESO SACAROSA CONSUMIDA 12,2 18,208

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factores X/A Y/B

1,66 0,515

Tabla 6. Variables: muestra 10 %

X+Y A+B 7,9 11,8715

Tabla 7. Variables: muestra 20 %

X+Y A+B 12,2 18,208

Tabla 8. Encontrando valores de las variables: muestra 10 %

1.66A + 0.515B = 1.66(11.8715-B) + 0.515B = (0.515B - 1.66B) + 1.66*11.8715 = B= A= X= Y= 7,9 7,9 7,9 10,312 1,560 2,590 5,310

Tabla 9. Encontrando valores de las variables: muestra 20 %

1.66A + 0.515B = 1.66(18.208 -B) + 0.515B = (0.515B - 1.66B) + 1.66*18.208 = B= A= X= Biotecnologa de los PAI Pgina 12 12,2 12,2 12,2 15,743 2,465 4,093

Y=

8,107

Tabla 10. Valores encontrados: muestra 10 %

CANTIDAD DE ETANOL CANTIDAD DE SACAROSA RENDIMIENTO REAL RENDIMIENTO TEORICO EFICIENCIA 5.310*92/8 8= 5,552 11,872 184/342 = 46,766 53,801 86,924

Tabla 11. Valores encontrados: muestra 20 %

CANTIDAD DE ETANOL CANTIDAD DE SACAROSA RENDIMIENTO REAL RENDIMIENTO TEORICO EFICIENCIA 8.107*92/8 8= 8,476 18,208 184/342 = 46,551 53,801 86,524

V. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES Para la produccin de etanol se utiliza con mayor frecuencia a Saccharomyces cerevisiae, pero este hongo levaduriforme es incapaz de utilizar directamente el almidn porque no produce enzimas amilolticas (Gonzlez et al., 2007); se requiere que el sustrato polimrico sea pretratado para que bajo condiciones anaerbicas utilice la glucosa por la va de EmbdenMereyhofParnas y produzca etanol y dixido de carbono (Gunasekaran et al., 1999). Existen levaduras que prefieren un metabolismo fermentativo incluso en aerobiosis, en las cuales como mximo un 10% de glucosa se consume por va oxidativa. (Leveux,
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2000).En nuestra prctica, las levaduras, utilizaron el 46.8 % de la glucosa para la fermentacin en el caso de la muestra a 10 Bx. y del 46.7 % de glucosa en la muestra a 20Bx, esto nos indica que utilizaron un promedio del 46.7 % del total del sustrato consumido, en la fermentacin y el resto fue destinado a la respiracin, esto es adecuado tomando en consideracin que se trat de mantener las condiciones anaerobias en todo momento para facilitar la fermentacin con respecto a la respiracin.

Aunque se han encontrado muchos gneros de levaduras en fermentaciones, la especie Saccharomyces cerevisiae es la principal responsable de la fermentacin alcohlica, as como de la produccin de la mayora de los compuestos aromticos. La levadura Saccharomyces cerevisiae permite una conversin aproximada del 85% al cabo de 32 horas y del 90% al cabo de 75 horas en la produccin de etanol. En nuestra prctica las levaduras, utilizaron el 46.8 % de la glucosa para la fermentacin en el caso de la muestra a 10 Bx. y del 46.7 % de glucosa en la muestra a 20Bx y el resto fue destinado a la respiracin (Ramrez et al. 1997). Es sabido que a elevadas concentraciones de soluto, algunas levaduras experimentan una plasmlisis celular, reduccin del poro y otras alteraciones que disminuyen el crecimiento microbiano lo cual sugerira la baja o nula produccin de etanol, sin embargo segn estipula que se deben aadir soluciones estriles de los azcares a ensayar. La concentracin final del azcar debe ser del 2% para todos los azcares. Solo se obtuvo una concentracin final de azucares de 2,9 en la muestra de sacarosa al 10% (Leveux, 2000). La temperatura ptima para la formacin de alcohol se estima en el rango de 32 C a 35 C (Navarro et al, 1986). Souza Oliveira et al. publicaron en 2004 un estudio de criterios de seleccin de

levaduras para la obtencin de cachaza en la revista World Journal of Microbiology & Biotechnology, donde probaron 24 cepas de Saccharomyces cerevisiae en comparacin con otras especies diferentes (Candida apicola, C. famata, C. guilliermondii, Hanseniospora occidentalis, Pichia subpelicullosa y Schizosaccharomyces pombe). La produccin de etanol por parte de las levaduras era uno de los criterios importantes de seleccin tenidos en cuenta. La gran mayora de levaduras pertenecientes a S. cerevisiae
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mostraron los mismos rendimientos en alcohol (prximos a un rendimiento alto de 91,7%), mientras que los gneros Candida, Hanseniospora y Schizosaccharomyces mostraron capacidad mucho ms baja en el rendimiento de etanol, produciendo contenidos ms altos de glicerol y cidos orgnicos.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Gonzlez, R. Barcenilla, J Y Tabera, L. (2007). Cepas vnicas de Saccharomyces cerevisiae con bajo rendimiento en etanol. Revista de Enologa, 86, Gunasekaran, P. and Chandra, k. (1999). Ethanol fermentation technology Zymomonas mobilis. Current Science, 77, 56-68. Leveux, j. Bouix, M. (2000). Microbiologa Industrial. Los Microorganismos de inters industrial. Editorial Acribia. Zaragoza-Espaa. Navarro, A. et al; 1986. Produccin de etanol por fermentacin con alta concentracin levaduras. Revista Argentina de Microbiologa 18 (1): 7-11. Oviedo, L. et al; 2009. Levaduras autctonas con capacidad fermentativa en la

produccin de etanol a partir de pulpa de excedentes de pltano Musa (AAB Simmonds) en el departamento de Crdoba, Colombia. Revista Colombiana de Biotecnologa. Universidad Nacional de Colombia. Vol. XI, Nm. 1. Colombia. pp. 40-47. Ramrez M., De Miguel C., Valds M. E., Prez F., Regodon, J. A. (1997). A simple and effective procedure for selection of wine yeast strain. Food Microbiol. Vol. 14: 247-254.

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Souza Oliveira, E.; Rosa, C.A.; Morgano, M.A. y Serra, E.; (2004). Fermentation characteristics as criteria for selection of cachaa yeast. World Journal of Microbiology & Biotechnoly, N 20, 19-24 http://www.slideshare.net/.../glucolisis-2872239 - Estados Unidos http://www.biologia.edu.ar/.../met3glicolisis.htm http://www.biologiamyblog.files.wordpress.com/2010/03/glucolisis.pdf http://www.ciclodekrebs.com/etapas_del_ciclo_de_krebs

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