UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO BIOMDICO DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA

APOSTILA DE AULAS PRTICAS

- DISCIPLINA BACTERIOLOGIA

ORIENTADOR DIDTICO: PROFESSOR ALOYSIO CERQUEIRA

Roteiros de aulas Prticas:

ASSUNTO 1: Material utilizado nas prticas Tcnicas e Processo de Assepsia Microscopia ASSUNTO 2: Meios de Cultura e Tcnicas de Semeadura ASSUNTO 3: Esterilizao e Desinfeco ASSUNTO 4: Diluio Contagem de UFC viveis Obteno de Cultura pura ASSUNTO 5: Colorao Simples Morfologia 1

4 8 14

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ASSUNTO 6: Colorao de Gram ASSUNTO 7: Identificao de Cocos Gram positivos ASSUNTO 8: Colimetria: Exame microbiolgico da gua ASSUNTO 9: Provas Bioqumicas para Idenitifcao de Bacilos Gram Negativos ASSUNTO 10: Teste de Sensibilidade a Antibiticos ANEXO I Tcnicas de Colorao Colorao de Gram Colorao de Zihel-Neelsen (BAAR) Tcnica Para Evidenciao de Espiroquetas Mtodo de Albert-Laybourn

19 23 30 37

42 45 45 45 48 50 53

APRESENTAO
O aprendizado terico e prtico de microbiologia, incluindo a bacteriologia, muito importante para o profissional farmacutico. As reas de atuao em anlises clnicas, enzimologia, controle microbiolgico de medicamentos e alimentos, entre outras, exigem um profundo conhecimento desta disciplina. Muitas vezes os alunos no percebem a importncia da bacteriologia, pois como o curso ministrado durante o ciclo bsico, h uma grande distncia entre o curso de bacteriologia e as demais disciplinas nela embasadas durante o curso de graduao. Ao chegarem ao ciclo profissional percebem o quo fundamental ela para o entendimento de outras disciplinas, assim como, para seu futuro profissional. A presente apostila resulta do processo de atualizao e aperfeioamento da apostila de aulas prticas de bacteriologia para o curso de Farmcia. A apostila contm explicaes tericas e prticas dos procedimentos a serem realizados em cada aula de forma clara e didtica. No final de cada assunto o aluno poder tirar as suas concluses da prtica executada. Sempre que possvel procurou-se utilizar esquemas, gravuras e ilustraes que facilitassem a compreenso do assunto. Cada assunto apresenta uma introduo contendo a teoria do tema abordado, assim como a sua aplicao e importncia no exerccio da profisso, objetivando o melhor entendimento do tema, dos materiais a serem utilizados, da execuo e dos resultados obtidos. Finalmente procurou-se acentuar a importncia e aplicao de cada prtica no contexto das atividades de um farmacutico de modo a estimular o aprendizado.

ASSUNTO 1: - Material utilizado nas prticas de Bacteriologia. - Tcnica e Processos de Assepsia em Bacteriologia. - Microscopia.
INTRODUO: TCNICA E PROCESSO DE ASSEPSIA importante ter claro os procedimentos que se deve adotar na manipulao segura dos meios, culturas bacterianas, etc, de modo a evitar qualquer tipo de contaminao. Tais procedimentos so denominados genericamente de tcnicas de assepsia e incluem: fazer a desinfeco da rea de trabalho e a antissepsia das mos sempre antes e depois de trabalhar (1); trabalhar sempre na rea de segurana (aproximadamente 10cm) em volta da chama do bico de Bunsen (2); esterilizar adequadamente alas e agulhas de inoculao antes e depois do seu uso, evitando a criao de aerossis, para isso aquecendo sempre da base para a ponta (3); flambar a boca dos frascos e tubos antes e depois das inoculaes (4).

BACTRIAS NO AMBIENTE A presena de bactrias pode ser verificada em quase todos os ambientes, no solo, na gua, no ar e colonizando o nosso corpo (ex: trato gastrointestinal, pele). A manipulao e conservao incorretas de medicamentos so fatores predisponentes sua contaminao por microrganismos. Dentre estes podem estar presentes microrganismos patognicos ou microrganismos deterioradores. Fundamentao Terica A presena de bactrias uma constante nos mais variados ambientes. Freqentemente tais bactrias no esto associadas a nenhum prejuzo. A microbiota intestinal desempenha importante papel na defesa do organismo contra certas infeces; existem

estudos que sugerem que a microbiota normal estimula o desenvolvimento das defesas imunolgicas. Ao mesmo tempo que desenvolve atividades benficas a microbiota pode ser responsvel por uma srie de doenas oportunistas que podem ser relacionadas, por exemplo, ao uso constante de drogas imunossupressoras, antibiticos e internaes em UTI. Muitas infeces causadas por bactrias so adquiridas por contato direto ou veiculadas por alimentos. Ao contrrio do que se pensava antigamente, a disseminao de bactrias patogncias pelo ar e poeira no ocorre com grande freqncia, pois de um modo geral, no sobrevivem por longos perodos no ambiente externo. Entretanto, estas vias de transmisso podem ser de grande importncia em determinadas situaes. No caso de bactrias esporuladas a transmisso area mais importante. No ambiente hospitalar deve ser feito o controle microbiano frequentemente para evitar contaminaes. Os alimentos so uma importante via de transmisso de doenas bacterianas como a shigelose, salmonellose, clera e vrias outras. O farmacutico deve estar atento sempre. OBJETIVOS: 1- Apresentar a vidraria e outros materiais de uso corrente em um laboratrio de Microbiologia. 2- Executar tcnicas de preparo de material e montagem para esterilizao. 3- Treinar tcnicas de distribuio assptica. 4- Evidenciar a existncia de bactrias no ar, roupas, etc. 5- Explanao sobre o microscpio. Aps a realizao da atividade prtica voc dever ser capaz de constatar a presena de bactrias no ambiente; compreender a importncia dos critrios bsicos de higiene no ambiente hospitalar e, na produo e manipulao de medicamentos, visando evitar a contaminao dos mesmos por bactrias ambientais; MATERIAL: Vidrarias. Outros materiais de uso em um laboratrio de Microbiologia. gua peptonada. Placas de Petri com Agar simples. Pipetas e tubos de ensaio estreis. Papel, barbante, algodo cardado, gaze.

PRTICA PARA EXECUTAR: a. Apresentao da vidraria e outros objetos de uso freqente nos laboratrios de Microbiologia. b. Demonstrao, pelo professor, de uma cadeia de assepsia nos trabalhos microbiolgicos. c. Cada grupo de alunos treinar, com gua peptonada, as tcnicas de distribuio assptica, usando pipetas. Deixar os tubos em temperatura ambiente por no mnimo 48 horas.

d. Abrir as placas de Agar simples (1 por grupo), fora da rea de segurana, deixando cada uma por 5, 10, 15 e 20, fechando quando atingido o tempo respectivo. Incubar a 37o C por 48 horas e analisar o crescimento obtido.
5 min 10 min 15 min 20 min

e. Evidenciar bactrias da pele, roupa, bancada em meio Agar simples. Inocular em cada quadrante, respectivamente: - a impresso do dedo polegar - um carimbo do tecido do jaleco - alguns fios de cabelo - um swab previamente passado sobre a bancada de trabalho Incubar a 37o C por 48 horas e analisar o crescimento obtido

1. DEDO

2. JALECO

4. CABELO

3. BANCADA

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ASSUNTO 2: - Meios de Cultura - Tcnicas de Semeadura

INTRODUO: O estudo das bactrias necessita normalmente do seu prvio isolamento e identificao. Para tanto diversos meios de cultura so utilizados. Define-se meio de cultura como uma mistura de nutrientes, incluindo fontes de carbono, nitrognio, sais minerais e gua, que propiciam o crescimento in vitro de bactrias. A maioria das bactrias cresce em meios de cultura. Excees so as riqutsias e clamdias que por serem parasitas intracelulares obrigatrios s se desenvolvem in vitro em meios celulares (cultivo celular, ovos embrionados), Mycobaterium leprae e Treponema pallidum. A inoculao das bactrias em diferentes meios envolve vrias tcnicas de semeadura. Toda a manipulao de culturas bacterianas, meios e instrumental necessrio deve ser feita seguindo-se procedimentos bsicos de assepsia e antissepsia, visando evitar qualquer tipo de contaminao. MEIOS DE CULTURA Para uma melhor compreenso das diversas finalidades e usos dos meios de cultura, apresentamos a seguir uma breve classificao dos mesmos: A) Quanto composio: A.1) Naturais so aqueles de origem vegetal (um pedao de batata, po, frutas) ou animal (gema de ovo). A.2) Artificiais so aqueles constitudos de substncias qumicas podendo ser definidos ou indefinidos (complexos). Definidos: sabido toda a sua composio. Indefinidos ou Complexos: desconhecido por si. Sabe-se apenas aproximadamente. Os meios utilizados na rotina so complexos. B) Quanto ao seu estado fsico: Lquido so os caldos, desprovidos de agar. Semi-slido so aqueles que apresentam em sua composio at 1% de agar. Slido so aqueles que apresentam em sua composio 1,5 a 2,5% de agar. C) Quanto finalidade e caractersticas: Simples contm apenas componentes bsicos para o crescimento de uma bactria. Enriquecido meio que tem aumentada a sua capacidade nutricional para a bactria pela adio de substncias como gema de ovo, sangue, plasma, soro,, leite. De uso freqente para bactrias de difcil crescimento (fastidiosas). De enriquecimento meio seletivo que visa inibir o crescimento de bactrias acompanhantes e permitir o crescimento da bactria alvo que pretende-se posteriormente isolar aumentando assim a proporo desta em relao s demais. Por ser um meio lquido no destina-se ao isolamento da bactria.

 Seletivo contm substncias seletivas que inibem o crescimento de certas bactrias e permitem o crescimento de outras. So meios slidos e tm como objetivo isolar culturas puras. Indicadores meios que permitem a diferenciao visual do crescimento bacteriano facilitando a sua identificao. Freqentemente os meios seletivos so tambm indicadorese todos os meios utilizados na confirmao bioqumica dos isolamentos so indicadores. A indicao mais freqente a alterao de cor do meio por mudana no pH do mesmo, podendo ainda ser a produo de gs, precipitao de componentes do meio por atividade proteoltica e lipoltica, etc... Estoque so meios normalmente semi-slidos com a finalidade de preservar uma cultura bacteriana pura para posteriores utilizaes no laboratrio. TCNICAS DE SEMEADURA MAIS EMPREGADAS NA ROTINA I- Semeadura em meios slidos A. Meio Inclinado Em estria sinuosa: semear com ala de platina, em ziguezague, partindo da base para a extremidade da superfcie inclinada do meio Este tipo de semeadura permite a obteno de melhor massa de microorganismos. Em estria reta: semear com agulha de platina, em estria reta, partindo da base para a extremidade da superfcie inclinada do meio, ou em profundidade e superfcie. Este tipo de semeadura utilizada em provas bioqumicas para identificao bacteriana. B. Meios em p (camada alta) Em picada: com agulha de platina fazer o inoculo penetrar de 0,5 a 1,0 cm no centro do meio de cultura. Este tipo de semeadura bastante utilizado para conservao de bactrias no meio de cultura e quando o meio utilizado semi-slido, esta semeadura utilizada para a verificao da motilidade.

C. Em Placa de Petri: C.1. Em superfcie: Estrias mltiplas ou esgotamento: fazer o inoculo em um ponto da superfcie do meio, flambar a ala, deixar esfriar e da semear em ziguezague em toda a superfcie do meio.

Este tipo de semeadura empregado para o isolamento bacteriano, obteno de u.f.c. isoladas. Denomina-se tcnica se esgotamento.

Por distenso: com pipeta, colocar no centro da superfcie do meio 0,1 mL da suspenso e espalhar uniformemente com swab ou ala de Drigalski. Com swab, obteremos crescimento confluente e com ala de Drigalski, utilizamos para contagem. Utiliza-se este tipo de inoculao para realizao de determinados testes, como por exemplo, o antibiograma. C.2. Em profundidade ou disseminao: Pour plate: depositar na placa de Petri 0,1/ 1,0 mL da suspenso bacteriana. Adicionar 10 mL do meio fundido em tubo de ensaio e resfriado a 45-50 C. Homogeneizar com movimentos giratrios da placa sobre uma superfcie plana. Utilizado, para isolamento, contagem e identificao bacteriana, conforme o meio de cultura utilizado. D. Repique por pescaria: colnia em placa de Petri retirada atravs de uma agulha para um meio de cultura lquido ou slido Mtodo empregado para isolamento bacteriano. II. Semeadura em meios lquidos Procedimento para remover microorganismos da cultura em meio lquido2:

Procedimento para inocular em caldo simples:

Difuso: com ala de platina ou pipeta, introduzir o inoculo ( 0,1 mL) na massa do meio. Este tipo de semeadura empregada para obteno do crescimento bacteriano. um repique normal. OBJETIVOS: 1- Explanao sobre os principais meios de cultura empregados em laboratrios de Microbiologia 2- Identificao das tcnicas de semeadura mais empregadas na rotina bacteriolgica 3- Cultivo de bactrias com finalidade de obteno de cultura pura, ou seja, uma populao onde todas as bactrias se originam de uma nica clula bacteriana. MATERIAL: tubos de ensaio com caldo simples, Agar simples e Agar semi-slido. Placas de Petri com Agar simples. Culturas bacterianas em caldo simples, Agar simples (em placa de Petri). Ala e agulha de platina.

PRTICA PARA EXECUTAR: Definir meio de cultura, cultivo e condies necessrias ao crescimento de microorganismos (pH, presso osmtica, temperatura de incubao, etc.). Classificao dos meios de cultura quanto a origem, estado fsico, fora seletiva. Seqncia da preparao dos meios. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

ASSUNTO 3: - Esterilizao e Desinfeco - Ao dos Agentes Fsicos e Qumicos sobre as Bactrias

INTRODUO: As taxas de crescimento e morte microbianas so fortemente influenciadas por vrios fatores ambientais. O controle microbiano compreende uma srie de procedimentos com a finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir ou impedir a multiplicao de microrganismos existentes em um determinado equipamento, ambiente, em alimentos ou em superfcies vivas. de extrema importncia apresentando inmeras aplicaes prticas na rea mdica e de alimentos. A conservao de medicamentos envolve sempre o uso de uma ou mais tcnicas empregadas no controle microbiano. Fundamentao Terica importante inicialmente definir alguns termos utilizados no controle microbiolgico: A) Desinfeco significa reduo do nmero de microrganismos em superfcies inanimadas (ambiente ou materiais) e conseqente eliminao de sua potencialidade infecciosa. B) Sanitizao mesmo significado de desinfeco, porm utilizado rotineiramente em indstria de alimentos. C) Antissepsia significa reduo do nmero de microrganismos em tecidos vivos. D) Esterilizao destruio ou remoo completa dos microrganismos em ambientes ou materiais. E) Assepsia significa ausncia de microrganismos / as tcnicas asspticas representam uma srie de cuidados que previnem a contaminao. O controle de microrganismos pode ser feito por agentes fsicos ou qumicos. 1 Controle Microbiano por Agentes Fsicos Calor o mtodo mais empregado para destruio de microrganismos por ser barato, eficaz e prtico. Quando se tem finalidade esterilizante deve ser calculado para a destruio das formas esporuladas de bactrias, mais resistentes. Pode ser utilizado na forma de calor seco ou calor mido em funo da presena de gua. O primeiro mata as bactrias por oxidao protica, enquanto o segundo por desnaturao protica. Alm disso, o calor mido um mtodo de maior eficincia devido gua ser um melhor condutor de calor do que o ar. Calor seco: na ausncia de gua - Flambagem: contato direto do material a ser tratado com o fogo, um tipo de esterilizao. - Forno ou Estufa: material submetido a uma temperatura de 170 a 180o C por 1 2 horas, um tipo de esterilizao, porm no qualquer material que pode ser submetido a esse tratamento. Utilizado principalmente para vidraria e metais (instrumentos cirrgicos p. ex.) - Incinerao: a queima total de um material, mtodo utilizado com materiais descartveis, principalmente aqueles materiais hospitalares.
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 Calor mido: na presena de gua (ou vapor dgua) - < 100o C: pasteurizao (mtodo desinfetante). Muito utilizado para alimentos e bebidas. A pasteurizao rpida do leite emprega uma temperatura em torno de 72o C por 15 a 20 segundos, seguida de resfriamento rpido. A pasteurizao consegue eliminar cerca de 99,5% de microrganismos, aqueles esporulados so termoresistentes, conseguindo resistir a esse tratamento. Alimentos pasteurizados leite, sucos industriais. - = 100o C: a fervura (mtodo desinfetante). O alimento submetido a uma temperatura igual a 100o C por at 15 minutos. Eficiente contra as formas vegetativas bacterianas mas no destri completamente as formas esporuladas. - > 100o C: a autoclavao (mtodo esterilizante). Os materiais e alimentos so submetidos a uma temperatura em torno de 121o C por 15-30 minutos, um tempo e temperatura bem inferiores queles empregados em calor seco. Isso possvel pelo emprego de alta presso interna (1 ATM) na autoclave. A autoclave similar a uma panela de presso. Ultravioleta (radiao no ionizante) Possui uma atividade mxima num comprimento de onda de 260nm, geralmente so desinfetantes e usados em ambientes. - Limitao: no tem poder de penetrao, tudo que estiver embalado ou protegido por vidro no desinfetado, aps umas 200 horas de uso da lmpada sua eficincia diminuda. - Por que mata? ela penetra nos microrganismos e so captadas pelos seus cromossomos, causando mutao letal por serem absorvidos diretamente. Radiao Gama (radiao ionizante) um mtodo de esterilizao, mais energtico que as radiaes UV com menor comprimento de onda e desequilibra quimicamente as clulas irradiadas, todos os seus componentes qumicos podem ser alterados. Muito utilizado para esterilizao de produtos hospitalares descartveis em uso crescente em indstrias de alimentos (esterilizao superficial). Filtrao Clarificantes: so os filtros domsticos, retm as impurezas grosseiras, so desinfetantes. Esterilizantes: possuem poros iguais ou menores a 1mm podendo reter inclusive alguns vrus. Outros: Presso Osmtica (Salga); Dessecao (prod. Alimentcios em p, liofilizao); uso de baixas temperaturas (refrigerao, congelamento) 2 Controle Microbiano por Agentes Qumicos Fenis e derivados: um desinfetante fraco, porm utilizado como um desinfetante de referncia para ser comparado com outros produtos. Um coeficiente maior que 1 indica que o produto mais ativo que o fenol. Atuao: fenis/cresis desnaturam protenas.

OBS: Dos cresis o mais importante a creolina, utilizada para pisos e sanitrios. O hexaclorofeno muito usado na antissepsia cirrgica. lcool Etlico: possui vrios mecanismos de ao, sendo relativamente eficiente, so solventes de lipdios (ao detergente), so desidratantes (retiram a gua das clulas) e desnaturam protenas. O lcool etlico pode ser usado como desinfetante ou anti-sptico. O lcool absoluto (no hidratado) fraco germicida. Um lcool parcialmente hidratado (60- 70%) mais ativo que o absoluto, pelo maior poder de penetrao e conseqente desnaturao protica mais rpida. Cloro / Iodo (Halognios) - O Cloro desinfetante de guas, alimentos e pisos. Mecanismo de ao oxidante. Cl2 + H2O HCl + HClO cido hipocloroso instvel, espontaneamente forma mais HCl e oxignio nascente, isso que matar os microorganismos. - O mecanismo de ao do Iodo a sua combinao irreversvel com protenas atravs da interao com aminocidos aromticos, fenilalanina e tirosina, levando desnaturao das mesmas. um dos anti-spticos mais utilizados na prtica cirrgica. Detergentes catinicos (agentes de superfcie): alteram a permeabilidade de membrana ( ex: compostos quaternrios de amnio cloreto de benzalcnio). Mais ativo contra Gram negativos Sais de Metais Pesados: - Mercrio (Hg): anti-sptico . Em desuso pelo risco de intoxicao por absoro. - Sulfato de Cobre (CuSO4): desinfetante para guas de recreao. - Nitrato de Prata (AgNO3): anti-sptico, altamente eficiente contra gonococos, que causam oftalmia em recm-nascidos e gonorria em adultos com vida sexual ativa. Atuao: afinidade por protenas, inativando enzimas, por isso importante no ingeri-los. Uso tpico apenas. cidos orgnicos e inorgnicos: Freqentemente usados na conservao de alimentos. Exs.: cidos actico, ltico, benzico. lcalis: Hidrxido de Sdio (NaOH)= presente nos sabes conferindo a estes a sua relativa ao anti-sptica. Outros: KOH, Ca(OH)2 Corantes Bsicos: mais eficientes contra Gram positivos. Ex.: Cristal Violeta, Azul de Metileno.

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 Oxidantes e Redutores - Oxidantes: oxidam componentes celulares levando morte das clulas. Ex.: Oznio (O3), gua oxigenada (H2O2), permanganato de potssio, perxido de zinco. Usados como anti-spticos. - Redutores: reduzem compostos celulares levando morte das clulas. Aldedos e derivados: Formaldedo/ formalina: muito irritante / So usados para desinfectar paredes e pisos. Glutaraldedo: mais ativo e menos txico que o formaldedo; esporocida aps 6 horas de contato) xido de Etileno (gs): um agente alquilante inativando protenas e cido nuclico. Usado em um recipiente fechado que recebe todo material a ser utilizado (contm algumas ampolas de xido de etileno lquido), temperatura de 52o C, este lquido torna-se gasoso, assim, seus vapores so esterilizantes. Usado para esterilizao de materiais de borracha ou plstico. A clula microbiana est em equilbrio, oxidantes e redutores rompem esse equilbrio, matando a clula. Antimicrobianos: ao contrrio dos anteriores possuem ao seletiva contra microrganismos por isso no sero discutidos neste assunto. OBJETIVOS: - Verificar a eficincia de agentes qumicos e fsicos sobre as bactrias. Aps a realizao da atividade prtica voc dever ser capaz de conceituar e diferenciar os termos utilizados no controle microbiolgico; descrever os agentes fsicos e qumicos utilizados no controle microbiano; entender o funcionamento de autoclaves e fornos de esterilizao, diferenciando calor mido de calor seco; compreender as diferenas encontradas na destruio de microrganismos esporulados e no esporulados frente ao do calor; compreender as diferenas encontradas na ao dos diferentes mtodos de antissepsia utilizados. MATERIAL: - Placas de Petri com agar simples ou caldo simples - Culturas de E. coli e Bacillus sp - Solues antisspticas - Gaze - Trip, tela de amianto e panela EXECUO: A Agentes Qumicos: observao da ao de antisspticos sobre bactrias a microbiota da pele. a) Numa placa de agar simples dividida em 4 quadrantes fazer a semeadura do 1 quadrante utilizando a ponta do polegar (fazer a impresso digital suavemente para no ferir a camada do meio de cultura); b) Um segundo aluno lava seu polegar com sabo e gua por 1 minuto, seca com gaze estril e inocula o segundo quadrante fazendo a impresso do dedo;

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c) Um terceiro aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 1 antissptico por 1 minuto, seca o dedo com gaze estril e faz depois a impresso no terceiro quadrante; d) Um quarto aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 2 antissptico por 1 minuto, seca o dedo com gaze estril e faz depois a impresso no quarto quadrante. - Incubar a placa a 37 C por 24 horas e analisar o crescimento.
1. DEDO 2. DEDO + SABO

3. DEDO + 4. DEDO + ANTIS. 1 ANTIS. 2

B Agentes Fsicos: calor a) Numa placa de agar simples dividida e marcada em 8 partes semear as culturas bacterianas de E. coli e Bacillus sp. no espao respectivo ao tempo T0 ; b) Colocar as culturas em banho-maria fervente e reinocular os quadrantes T5, T10, T20 aps 5, 10 e 20 minutos de tratamento trmico, respectivamente. - Incubar a placa a 37o C por 24 horas e analisar o crescimento.
t0 t5 t10 t20 E B

C Atividade de Diferentes Agentes Qumicos sobre bactrias in vitro (opcional, pois a metodologia idntica ao teste de sensibilidade a antimicrobianos) a) Semear uma cultura bacteriana com swab (para crescimento confluente) em uma placa de Petri com agar simples; b) Assepticamente, com pina, embeber discos de papel de filtro com diferentes agentes qumicos; c) Colocar os discos eqidistantes na placa semeada; - Incubar a 37 C por 24 horas e analisar os dados obtidos.

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Importncia da Aula de Controle Microbiano Esta aula de extrema importncia para a rea farmacutica, pois a contaminao microbiana de medicamentos e cosmticos podem causar alteraes das suas caractersticas sensoriais, tornando-os imprprios para o uso; e promover a degradao de componentes da formulao, podendo comprometer a sua eficcia e segurana ou causar danos sade, dependendo do tipo do microrganismo presente, da via de administrao utilizada e do estado de sade do usurio do produto. Os microrganismos, de maneira geral, exigem condies favorveis para seu crescimento, o que torna algumas matrias-primas livres de contaminao ou, pelo contrrio, muito susceptveis. Estas ltimas podem tornar-se substrato para o crescimento microbiano, uma vez que podem ser utilizadas como fonte de carboidratos, protenas, aminocidos, vitaminas, sais orgnicos, gua, entre outros. Alm disso, muitos microrganismos requerem ons metlicos como coenzimas, os quais podem estar presentes nos insumos como impurezas2. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________

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ASSUNTO 4: - Diluio - Contagem de u.f.c.viveis - Obteno de Cultura Pura

OBJETIVOS: 1. Metodologia de Diluies 2. Plaqueamento para contagem de u.f.c. viveis 3. Contagem de u.f.c. viveis 4. Obteno de cultura pura MATERIAL: - Tubos com 9mL de salina - Placas de Petri com Agar simples - Alas de Drigalski - Cubas com lcool 70 - Agar inclinado - Caldo simples - Cultura bacteriana em caldo - Pipetas de 1mL PRTICA PARA EXECUTAR: a. Diluio A partir da cultura bacteriana, inocular 1mL em 9mL de salina, homogeneizar, retirar 1mL e transferir para outro tubo com 9mL de salina... Obtendo assim, as diluies 1/10, 1/100, 1/1000... b. De cada diluio inocular 0,1mL, em duplicata, na superfcie do meio de Agar simples. Semear por distenso com ala de Drigalski. Incubar a 37C por 24 horas. c. Contagem da u.f.c. com diluio n placa 1 + n placa 2 aplicar na frmula: 2 u.f.c. = n encontrado x diluio x inoculo d. Repicar u.f.c. para Agar inclinado e caldo simples. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

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ASSUNTO 5: - Colorao Simples - Morfologia

INTRODUO: Torna-se necessrio fixar e corar as bactrias para o estudo exato da sua morfologia e citologia. Com efeito, a pequenez dos detalhes estruturais, a falta de contraste natural destes detalhes e o movimento das bactrias aliado sua grande refringncia, tornam impossvel o estudo morfolgico exato destes organismos nos simples exames a fresco. A fixao a coagulao do protoplasma bacteriano e a sua colagem s lminas, com o mnimo de deformao, quer dizer, imobilizao dos microrganismos e das estruturas celulares. So agentes fixadores o calor, atuando em escala moderada, os vapores de cido smico, o formol, o ter, os sais de mercrio, etc. Os corantes so substncias dotadas de cor prpria e que uma vez dissolvidas comunicam essa cor s estruturas com as quais so postas em contacto. Os corantes usados em Bacteriologia so produtos artificiais ou sintticos. Os corantes sintticos, so compostos orgnicos de estrutura complexa em que um ou mais anis benznicos se encontram ligados a um grupo auxcromo e outro cromforo. a. A funo do grupo cromforo conferir ao composto a cor. b. A funo do grupo auxcromo permitir a dissociao inica do corante, tornando-o apto a formar sais e a reagir quimicamente com os tecidos, clulas e estruturas celulares. Os corantes da Bacteriologia so sais e podem ser classificados em corantes cidos e bsicos. Os corantes bsicos so corantes de eleio da Bacteriologia uma vez que as bactrias, possuem carga eltrica negativa. Deste modo, a afinidade eletroqumica torna possvel a fixao do radical corado sobre as estruturas celulares das bactrias, o que no sucede com os corantes cidos cujo radical corado eletronegativo. Os mordentes so substncias que reforam a ao dos corantes, so principalmente usados como mordentes em Bacteriologia, o cido tnico, o cido crmico, o cido fnico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor, os alcalis; estas substncias aumentam a energia de fixao das cores sobre as estruturas celulares. Classificao esquemtica das tcnicas de colorao 1. Coloraes simples ou monocromticas - em que actua apenas um soluto corante. 2. Coloraes duplas ou policromticas - em que actuam sucessivamente dois solutos corantes. Destas duplas coloraes h duas que so de interesse fundamental em Bacteriologia Mdica, a colorao de Gram e a colorao de Ziehl-Neelsen3. OBJETIVOS: 1. Identificao dos vrios tipos de corantes de acordo com os diversos mtodos de colorao empregados em Bacteriologia. 2. Preparao de esfregaos partindo de meio lquido e de meio slido. 3. Fixao de esfregao por meios fsicos e qumicos.

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4.Colorao simples - a colorao de microrganismo com uma nica soluo de corante3. Ex: azul de metileno ou fucsina. 5. Observar formas e arranjos bacterianos atravs de preparaes fixadas e coradas. MATERIAL: - Azul de metileno ou fucsina - Soluo salina - Lminas - Culturas em meios lquido e slido - Ala e agulha de platina PRTICA PARA EXECUTAR: 1. Introduo da tcnica sobre corantes, sua classificao (naturais, artificiais, bsicos e neutros) e quanto ao veculo. Tcnicas de colorao simples, duplas e mistas. 2. Preparo de esfregaos e fixao por meios fsicos e qumicos. a) Preparo das lminas As lminas novas oferecem maior garantia para a confeco de boas preparaes coradas, no obstante as mesmas possam ser recuperadas depois de usadas. O processo de limpeza e esterilizao dessas lminas implica numa srie de medidas que passaremos a enumerar: lavar com gua e sabo, mergulhar em soluo detergente e deixar em ebulio por cerca de 1 a 2 horas, lavar novamente em gua corrente, escorrer e rinsar com gua destilada, escorrer e secar. As lminas devem ser colocadas em frascos fechados contendo lcool. As preparaes coradas so feitas em 3 tempos: 1 esfregao 2 fixao 3 colorao b) Esfregao - Tirar do frasco uma lmina esterilizada e enxugar bem - Flambar, rapidamente, nos dois lados da lmina - Flambar a ala de platina ao rubro e deix-la esfriar prximo chama - Tomar o tubo de cultura (em caldo) com a mo esquerda e com os dedos mdio e anular da mo direita remover o tampo de algodo da boca do tubo -Flambar a boca do tubo de cultura - A ala de platina, segura entre o polegar e o indicador da mo direita, ser introduzida no interior do tubo at tocar no meio de cultura - Flambar novamente a boca do tubo - Fechar o tubo com o tampo de algodo e coloc-lo na estante - Tomar a lmina com a mo esquerda e depositar no centro da mesma uma gotcula (uma alada``) da suspenso bacteriana - Com movimentos de rotao da ala de platina, o material deve ser bem espalhado a fim de se obter um esfregao de forma oval, bem fino e uniforme - Deixar secar ao ar e marcar com lpis dermatogrfico do lado oposto onde se situa a preparao

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Em se tratando de material de cultura em meio slido, deve ser observado o seguinte: - Depositar uma pequena gota de gua destilada ou soluo fisiolgica estril no centro da lmina - Tocar a colnia com uma agulha de platina esterilizada e suspender a mesma na gotcula d`gua, de forma a obter um esfregao fino e uniforme c) Fixao do material A fixao evita que o material se desprenda no decurso das manipulaes posteriores. Pode ser feita por: # Agentes Fsicos (calor) consiste em passar a lmina, com a face onde se acha o esfregao para cima, na chama do bico de Bunsen 2 a 3 vezes rapidamente # Agentes Qumicos utiliza-se uma substncia qumica como lcool metlico, lcool etlico, lcool-acetona, ter-acetona, formol etc., deixando-se em contato com os esfregaos dessecados durante alguns minutos (2 a 10 minutos). O fixador pode ser posto sobre o esfregao convenientemente protegido contra a evaporao rpida, ou ento o preparado ser mergulhado no fixador contido em recipientes apropriados. Procedimento para preparao do esfregao e fixao.2

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3. Colorao Simples , Mtodo fixado e corado a. Preparo do esfregao b. Fixao c. Colorao Cobrir o esfregao com a soluo de azul de metileno ou fucsina diluda durante 5 minutos . Lavar, secar com papel de filtro e observar com objetiva de imerso.

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ASSUNTO 6: - Colorao de Gram

INTRODUO: O mtodo de colorao de Gram o mais utilizado em Bacteriologia e permite a diferenciao da maioria das bactrias em 2 grupos pelas diferenas marcantes na parede celular que apresentam. Baseado nessas diferenas de parede celular os corantes utilizados coram as bactrias Gram-positivas em roxo e as Gram-negativas em vermelho. O mtodo de Gram utilizado na maioria das infeces bacterianas, permitindo o diagnstico de algumas delas com bastante segurana. Porm no se aplica para micoplasmas, bactrias desprovidas de parede, micobactrias pela presena de muitos lipdios insolveis na parede e espiroquetas pela estrutura muito delgada e pouco permevel aos corantes. Fundamentao Terica A colorao pelo mtodo de Gram chamada de colorao diferencial porque so utilizados dois corantes e as bactrias ficam coradas em tonalidades diferentes. Isso possvel devido composio da parede celular das mesmas. Essas bactrias podem ser aerbias, anaerbias facultativas e anaerbias. Possuem a forma de cocos, bacilos ou vbrios (bacilos encurvados). Muitas so patognicas e outras, membros da microbiota normal do corpo humano. A maioria dos cocos Gram-positiva com exceo dos gneros Neisseria e Veillonella que so os nicos Gram-negativos; entre os bacilos Gram-positivos incluemse aqueles pertencentes aos gneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium; os demais bacilos so Gram-negativos (a maioria); os vbrios so Gramnegativos. A investigao das caractersticas morfolgicas e de colorao (morfo-tintoriais) das bactrias etapa inicial de grande importncia no isolamento e identificao de bactrias de material clnico bem como de alimentos. No entanto, a identificao completa de uma bactria sempre necessitar de dados fisiolgicos ou genticos da mesma. O mecanismo da colorao de Gram se refere composio da parede celular, sendo que as G+ possuem uma espessa camada de peptideoglicano e cido teicico, e as G-, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas e lipopolissacardeos. Durante o processo de colorao, o tratamento com lcool (ou cool-acetona) extrai os lipdeos, da resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das G-. Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as G- so descoradas. A parede celular das bactrias G+, em virtude de sua composio diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com lcool, a porosidade diminui, a permeabilidade reduzida e o complexo CV-I no pode ser extrado. Outra explicao baseia-se tambm em diferenas de permeabilidade entre os dois grupos de bactrias. Nas bactrias G+, o complexo CV-I retido na parede aps o tratamento pelo lcool, o que causa, provavelmente, uma diminuio do dimetro dos poros da camada de glicopeptdeo ou peptideoglicano da parede celular. Os poros da parede das bactrias G- permanecem suficientemente grandes, mesmo depois do tratamento pelo lcool, possibilitando a extrao do complexo CV-I.

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Segundo Trabulsi, na etapa diferencial com lcool, as bactrias G- devido pequena espessura da camada basal e s descontinuidades existentes nesta camada, em pontos de aderncia entre a membrana externa e a membrana celular, tm o complexo corado extrado pelo lcool que deixa as clulas descoradas. OBJETIVOS: 1. Observar e interpretar o mecanismo de reao de Gram como um mtodo de colorao diferencial. 2. Discutir as vrias etapas da metodologia e a importncia taxonmica do mtodo na Bacteriologia. MATERIAL: - Lminas. - Culturas em meios lquido e slido. - Ala e agulha de platina. - Cristal violeta. - Lugol. - lcool etlico. - Fucsina de Ziehl. PRTICA PARA EXECUTAR COLORAO DE GRAM (MTODO CLSSICO) a. Preparar um esfregao fino, secar a temperatura ambiente e fixar pelo calor. b. Cobrir o esfregao seco e fixado com a soluo de cristal violeta (corante) durante 1 minuto. c. Esgotar a lmina e cobrir com lugol (mordente) durante 1 minuto. d. Inclinar a lmina 45 e lavar em gua corrente. e. Mantendo-a inclinada, diferenciar (lavar) com lcool 95 GL (diferenciador). f. Lavar e depois cobrir a preparao com soluo diluda de fucsina de Ziehl (contracorante) (15 a 30 segundos). g. Lavar e secar entre duas fitas de papel de filtro, delicadamente. h. Colocar uma gota de leo de cedro no centro do esfregao. i. Observar com a objetiva de imerso. Vi Lulu Ali A Fumar Fucsina Algo gua

Cristal Lugol Violeta

lcool gua

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Procedimento para colorao de Gram5.

Notas: 1. O etanol poder ser usado como agente descorante fraco. 2. O material dos corantes empregados na tcnica, principalmente sedimento do cristal violeta poder aparecer como artefato. 3. O descoramento para mais ou para menos resultante de incorreta diferenciao pelo lcool. 4. A idade da cultura bacteriana tem importncia fundamental na colorao de Gram. Em culturas envelhecidas, clulas Gram-positivas freqentemente se tornam Gramnegativas. Enzimas lticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos membrana da clula, como por exemplo, alterando a permeabilidade dos solventes. Conseqentemente, o complexo iodo-cristal violeta poder ser retirado da clula.

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5. Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou Gram-negatividade da cultura, uma colorao de Gram paralela aconselhvel. Para isto, deve-se usar culturas bacterianas conhecidas como G+ (Staphylococcus aureus) e G- (Escherichia coli) como controle. Interpretao: Bactrias G+ coradas em roxo. Bactrias G- coradas em vermelho Fotomicrografia representativa da colorao de Gram2.

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ASSUNTO 7: - Cocos Gram-positivos

INTRODUO: Identificao das bactrias de importncia mdica material de colheita: secrees, lquidos biolgicos e outros Cocos Gram positivos: Dentre as duas famlias conhecidas (Microcacceae e Streptococcaceae), trataremos dos gneros e das espcies de interesse patognese das infeces. I. Staphylococcus

Os estafilococos so cocos Gram-positivos, catalase positiva, que tendem a formar agrupamentos semelhantes a cachos de uva, devido aos seus arranjos irregulares. So bactrias anaerbias facultativas de fcil crescimento. So amplamente distribudos na natureza e fazem parte da microbiota normal da pele e mucosas de mamferos e aves (encontrados principalmente na mucosa da nasofaringe). De todas as espcies existentes, se destacam em patologias humanas o Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus e Staphylococcus haemolyticus. Staphylococcus aureus representa a espcie que est geralmente envolvida em infeces humanas (de origem comunitria e hospitalar) e apresenta uma freqncia de 30 a 40% de portadores na populao. Causam diferentes doenas supurativas tais como: furnculo, impetigo, osteomielite, abcessos de tecidos, pneumonia, meningite, artrite purulenta, etc. Algumas amostras (S. aureus) produzem uma enterotoxina que provoca um quadro agudo de intoxicao alimentar, enquanto outros (S. aureus e S. saprophyticcus) causam infeces do trato urinrio. So membros normais da microbiota anfibintica da pele e membranas mucosas. A colheita do material deve ser realizada com o mximo de assepsia: swab de nasofaringe, fezes, urina. Em se tratando de sangue, este dever ser colhido com heparina, ou ser desfibrinado, nunca utilizar citrato de sdio, pois o sdio inibe G+, principalmente em pH prximo a 6. So inibidos pela presena de corantes do tipo Azul de Metileno e Violeta de Genciana. Crescem em meio de Agar Simples, Agar Sangue e Chapman. Suas colnias so redondas, elevadas, opacas e de colorao amarelo-dourado a branco. Cresce em presena de altas concentraes de NaCl, sendo este um fator de estimulao da produo da enzima coagulase. O meio Chapman seletivo, porque contm 7,5% de NaCl; indicador porque possui manitol e o indicador Vermelho de Fenol, as UFCs fermentadoras do manitol apresentam-se com colorao amarelas aps 24 48 horas de incubao a 37C. Aps o crescimento de colnias tpicas fazemos a colorao de Gram para observarmos a presena de cocos Gram + dispostos em grupos (cachos) ou isolados. Diferenciamos o gnero Staphylococcus do gnero Streptococcus atravs da prova da catalase. A diferenciao das espcies do gnero se d atravs das provas de fermentao do manitol, da coagulase, da DNAse, da sensibilidade a novobiocina e da reduo de nitratos.

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Provas bioqumicas - Prova da Catalase: A prova da catalase se destina a verificao da presena da enzima catalase. A prova pode ser efetuada com o crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de cultura, exceto meios com sangue pois este possui catalase, levando a resultados falsopositivos. A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio com formao de gua e oxignio molecular. A verificao da produo dessa enzima por determinada bactria pode ser feita adicionando-se perxido de hidrognio (H2O2 a 30%) a cultura em meio slido ou lquido, e verificando-se desprendimento de bolhas gasosas (O2). Na ausncia de catalase, no h decomposio do perxido. Uma leitura da prova de catalase pode ser feita de maneira cuidadosa a partir de um crescimento em agar-sangue da seguinte maneira: adiciona-se primeiramente uma gota de perxido em uma rea do meio desprovida de crescimento e em seguida sobre uma colnia a ser testada. Considera-se positivo apenas se o borbulhamento foi mais rpido e intenso sobre a colnia. - Fermentao do Manitol: O manitol um acar que alguns microorganismos so capazes de utilizar como fonte de energia atravs da fermentao. A prova se baseia na alterao do pH do meio, graas a produo de cidos durante o processo de fermentao. Essa mudana de pH pode ser observada pela viragem de cor do meio devido a presena do indicador de pH Vermelho de Fenol. A prova pode ser realizada em meios de cultura lquidos ou slidos. Aps a semeadura, o meio deve ser incubado a 37C por 18 24 horas. Interpretao: positivo: amarelo negativo: no h alterao da cor - Prova da coagulase: A coagulase estafiloccica se apresenta em duas formas: coagulase ligada e coagulase livre. A coagulase ligada, presente na parede da clula bacteriana, converte o fibrinognio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulao, e pode ser detectado em teste direto em lmina, utilizando-se da suspenso de Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos circulares e observando-se a formao de cogulo no tempo de 1-2 minutos. Pode-se tornar mais sensvel o teste em tubo, por este detectar tanto a coagulase livre quanto a ligada, sendo a prova de escolha. A coagulase livre produzida e liberada pelo microorganismo, reagindo com o fator de coagulao do plasma, CRF, formando uma substncia semelhante, mas no idntica, trombina, que converte fibrinognio em fibrina. Para o teste, utiliza-se plasma citratado humano ou de coelho, estril, diludo em soluo salina na proporo de 1:5. a reao ocorre volume a volume a 37C. Estudos recentes demonstraram que a produo da enzima coagulase se intensifica quando o microorganismo crescido e meio contendo alta concentrao de NaCl. Desta forma, aconselha-se a utilizao de colnias para a prova, crescidas em Agar Manita (Agar Manitol Salgado) contendo NaCl e Vermelho de Fenol. Este procedimento aumentaria a sensibilidade do teste.

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A prova consiste da semeadura de uma alada do microorganismo em estudo em tubo contendo o plasma diludo e incubao a 37C. A menor coagulao considerada positiva. Devem ser feitas leituras peridicas a cada 1-2 horas, por at 24 horas, pois algumas espcies produzem fibrinognio, que dissolve o cogulo formado. Aconselha-se tambm utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. aureus. - Prova da DNAse: Alguns microorganismos so capazes de utilizar o DNA presente no meio como fonte de energia, atravs da produo da enzima DNAse. No meio com DNA deve ser feita uma estria simples (reta) ou um spot (ponto de semadura) central com o microorganismo em estudo. Incubar a 37C por 24 horas e adicionar ao meio HCl 1N e aguardar a turvao do meio. Lembrando que o DNA material protico e que o HCl, como cido, tem poder desnaturante sobre as protenas, a turvao do meio apenas a precipitao do DNA desnaturado. Se a bactria produzir DNAse, todo o DNA ao seu redor ter sido degradado, ento ao adicionar o HCL no haver turvao nesta rea. Portanto, se houver um halo claro ao redor do crescimento bacteriano, o resultado positivo. - Sensibilidade a Novobiocina: Semear o microorganismo suspeito em placa de Agar simples ou Mueller Hinton com swab, para obteno de crescimento confluente, e adicionar o disco de novobiocina (5mg/ml). Incubar a 37C por 24 horas. As bactrias resistentes no apresentaro halo de inibio, enquanto as sensveis sim. Interpretao das provas bioqumicas Provas bioqumicas Catalase Fermentao do manitol Coagulase DNAse Sensibilidade a novobicina Reduo de nitratos II. Streptococcus S. aureus + + +/+ R S. epidermidis + S + S. sapophyticus + R -

Os estreptococos so cocos Gram-positivos, catalase negativo, que tendem a formar agrupamentos em cadeia. Fazem parte da microbiota normal (sendo encontrados principalmente na orofaringe), apesar disso, muitos deles so responsveis por uma variedade de manifestaes clnicas, sendo considerados importantes agentes infecciosos tanto para o homem quanto para os animais. A maioria necessita de meios enriquecidos, geralmente pela adio de sangue para o crescimento. O sistema de nomenclatura baseado principalmente em caractersticas hemolticas, de acordo com o tipo de hemlise observada em meios contendo sangue (existindo tambm outros testes para a classificao). Nesse sentido verificam-se trs tipos de hemlise: alfa, beta e gama. O gnero apresenta espcies de interesse mdico como: Streptococcus viridans, Streptococcus beta hemolticos do Grupo A (S. pyogenes) e do grupo B (S. agalactiae) e Streptococcus pneumoniae. Os enterococos pertencem atualmente a um

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gnero separado e possuem caractersticas peculiares. Apresentam-se em forma de cadeia ou em pares, e so Gram positivos. Para o isolamento pode-se recorrer previamente ao uso de meios seletivos ou de enriquecimento. O meio de seletivo especfico para estreptococos mais usado o caldo Hitchens-Pike, seletivo por apresentar azida sdica e cristal violeta. Um meio alternativo para enriquecimento o caldo tioglicolato de sdio, adequado para o crescimento de bactrias, inclusive aquelas microaerfilas e anaerbias. O meio clssico de isolamento de estreptococos o agar sangue aonde pode-se observar o perfil hemoltico dos mesmos. Os Streptococcus foram descritos em 1874 por Billroth, causando exsudato purulento em leses de erisiplela e em feridas infectadas. Em seguida, foram isolados do sangue de pacientes em estado febril, e da garganta de crianas com escarlatina. Em 1903, Schottmuller props que os estreptococos fossem classificados conforme a capacidade de lisar hemcias in vitro. Em 1919, Brown chamou de a, b e g as lises observadas nas hemcias em placas de Agar sangue. Os estreptococos a hemolticos apresentam zonas de hemlise parciais, com hemcias integras na parte mais interna (junto colnia) e hemlise maior na parte mais externa. Frequentemente aparece uma colorao esverdeada na rea de hemlise (devido a alterao da hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da clula bacteriana), que originou a qualificao estreptococos do grupo esverdecente ou Streptococcus viridans. O Streptococcus pneumoniae apresentam hemlise a e colnia puntiforme com aprofundamento no pice da colnia (parecendo um pequeno vulco) Os estreptococos b hemolticos produzem uma zona de hemlise total,, no se observando hemcias ntegras (microscpio ptico com objetiva de 10x). O Streptococcus pyogenes apresenta dois tipos de hemolisinas: O e S a hemolisina O destruda pela ao do oxignio atmosfrico, e, portanto, s demonstrada em colnias crescidas em profundidade no Agar Sangue. A hemolisina S estvel ao oxignio do ar e produz hemlise mesmo nas colnias crescidas na superfcie do meio de cultura. Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam hemolisina O, se torna necessria a semeadura do microorganismo pela tcnica do pour-plate. Os estreptococos g so anemolticos, ou seja, no produzem hemlise nomeio. Muitas das espcies saprfitas so deste grupo. As colnias de estreptococos isoladas em agar sangue so puntiformes (< 1mm de dimetro), transparentes luz transmitida e peroladas luz refletida. Os estreptococos so negativos na prova de catalase o que os diferencia dos estafilococos.

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Na identificao de estreptococos alm do perfil hemoltico, a determinao do Grupo Lancefield (carboidrato antignico de parede) importante. No entanto, em funo do custo desta investigao outras provas auxiliares so realizadas para a identificao das principais espcies. O esquema abaixo apresenta estas provas:

Cultura (pour plate) Fazer uma suspenso do material colhido em um tubo contendo 1 ml de soluo fisiolgica estril e adicionar a uma placa de Petri estril. Juntar o Agar Sangue fundido e resfriado e promover a difuso do inculo no meio atravs de movimentos circulares. Incubar a 37C por 18 horas em atmosfera de microaerofilia ara melhor rendimento, ou jarra com vela. Leitura: Observao do tipo de hemlise em Agar Sangue. Beta hemlise produzida por Streptococcus viridans em Agar Sangue4.

Provas bioqumicas - Prova da optoquina: Colocar um disco de optoquina na superfcie do Agar Sangue (pode-se incluir no antibiograma). Havendo impedimento do crescimento das colnias ao redor do disco de optoquina (2 cm de dimetro), trata-se de teste positivo.
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- Bile solubilidade: A prova realizada conforme esquema que se segue: a 1,0 ml de cultura em calo, adicionar uma gota de vermelho de fenol; acertar o pH em aproximadamente 7,5 com NaOH 0,1N (cor rsea); adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sdio ou blis; incubar juntamente com o tubo sem blis a 37C por 3 horas. * clareamento: positivo * inalterado: negativo - Bacitracina: Utilizar discos impregnados com bacitracina (0,04 U) colocados na superfcie do meio de cultura semeado com o microorganismo em estudo (pode-se incluir no antibiograma) e incubar a 37C por 24 horas em microaerofilia. * Grupo A: sensvel a bacitracina * demais grupos: resistentes - Crescimento a 56C: Para evitar dvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus faecalis), submeter a cultura a um aquecimento a 56C por 30 minutos. Somente os enterococos resistem a este tratamento. - Crescimento em Agar Chapman: Os enterococos toleram altas concentraes de NaCl, como acontecem com Staphylococcus. - Crescimento em Agar EMB: Os enterococos suportam a presena de corantes, como o azul de metileno OBJETIVOS: 1. Isolamento de bactrias das vias areas superiores. 2. Identificao bioqumica atravs da interpretao do metabolismo microbiano. MATERIAL: - cultura de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis 1a aula: swabs estreis, tubo com soluo salina, Agar Chapman, Meio de Tioglicolato (ou de Hitchens-Pike). 2a aula: Agar sangue, Caldo simples ou BHI, Agar inclinado, Agar DNAse, dessecador com vela. 3a aula: reativo para catalase (H2O2), reativo para DNAse (HCl 1N), reativo para coagulase (plasma sangneo), tubo controle positivo, lminas e conjunto de colorao de Gram. PRTICA PARA EXECUTAR 1 DIA: a. inocular swab de orofaringe em Caldo Hitchens-Pike ou Tioglicolato.

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b. c.

inocular swab de nasofaringe em Agar Chapman pela tcnica de esgotamento. Incubar a 37C por 24 horas.

2 DIA: a. semear material do crescimento em Tioglicolato em placa de Agar Sangue, pela tcnica de esgotamento e incubar em microaerofilia pela tcnica da vela. b. inocular a UFC tpica de Staphylococcus nas provas bioqumicas (catalase, coagulase e DNAse) c. realizar a colorao de Gram 3 DIA: a. leitura e interpretao da placa de Agar Sangue, caracterizar a presena de colnias tpicas de Streptococcus e seu eventual padro hemoltico no meio de Agar Sangue. leitura e interpretao das provas bioqumicas, usando os reativos prprios.

d.

Importncia da Aula: de suma importncia para o profissional farmacutico o conhecimento dos cocos Gram positivos, pois eles so responsveis por diversas infeces humanas. Staphylococcus aureus (o + importante representante) causa abcessos, endocardites e osteomielites, intoxicao alimentar e sndrome do choque txico. S. epidermidis pode causar endocardites e S. saprophyticus causa infeces do trato urinrio. Os estreptococos produzem uma grande variedade de infeces como faringite e infeces celulares septicemia (Streptococcus agalactiae causa infeco urinria em gestantes). Tb podem causar desordens imunolgicas como febre reumtica e glomerulonefrite aguda (causada por Streptococcus pyogenes). ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

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ASSUNTO 8: - Colimetria.
INTRODUO A gua elemento fundamental para a sobrevivncia humana. Sua grande utilizao no abastecimento pblico, na recreao, na industria, no uso domestico atesta essa importncia vital. As guas para abastecimento podem ser poludas por servir de reservatrio para espcies microbianas patognicas e permitir a sobrevivncia das mesmas, e reconhecida desde os primrdios da civilizao. Vrias doenas podem ser veiculadas pela gua, tais como clera, febre tifide, disenterias, leptospirose, tuberculose, hepatite, poliomielite, doenas parasitrias e fngicas. Essas doenas so resultantes da ingesto de gua e alimentos contaminados ou do emprego de gua poluda pela irrigao, pesca, lazer, piscicultura, cultura de marisco. Em cidades onde existe um sistema eficiente de esgotamento sanitrio, o esgoto domstico um dos principais responsveis pela poluio das guas, estimulando o crescimento de microrganismo. A assimilao destes contaminantes orgnicos biodegradveis realizada com o concurso de bactrias presentes, por meio de um processo, que consome o oxignio dissolvido na gua dos rios ou reservatrios. Quando a carga de matria orgnica biodegradvel presente na gua, e o OD (Oxignio Dissolvido), que mede a concentrao de oxignio disperso na gua (Soares, 1999). Alm dos esgotos domsticos, os efluentes industriais e o escoamento superficial urbano contribuem grandemente na poluio dos corpos dgua. Os efluentes industriais contem grandes nmeros ou metais pesados. O escoamento superficial urbano contm todos os poluentes que se depositam na superfcie do solo na ausncia de chuvas, como lixo e matria orgnica. Estes acumulados no solo, valas e bueiros so arrastos quando da estao chuvosa para os cursos dgua superficiais, constituindo-se numa outra fonte de poluio (Soares, 1999). Os microrganismos dotados de potencial patognico chegam s extenses hdricas procedentes das excrees intestinais do homem e de outros animais. Embora j existam mtodos desenvolvidos para a deteco de vrios organismos patognicos de veiculao hdrica, os mesmos no so aplicveis na rotina devido ao alto custo e necessidade de pessoal especializado (CETESB, 1993). Uma alternativa para a avaliao da qualidade sanitria da gua a pesquisa de organismo no patognicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de sangue quente, que quando encontrados indicam a ocorrncia de contaminao fecal, evidenciando o risco da presena de patgenos. Fezes humanas contm de 20-30 % de resduos alimentares no digeridos, sendo o restante constitudo de gua e bactrias. NO indivduo saudvel essas bactrias constituem os habitantes normais do intestinos onde a Escherichia coli a representante caracterstica. O nmero desses microrganismos pode atingir XXXXclulas/g de fezes. Assim a presena da Escherichia coli em alimentos e gua indicativo de contaminao fecal e possibilidade de presena de patgenos entricos. Microrganismos indicadores de poluio de gua so utilizados para monitorar, classificar e restringir o uso das guas. Um indicador ideal deveria preencher os seguintes critrios: 1. Ser aplicvel a todo tipo de gua; 2. Estar presente simultaneamente com os microrganismos patognicos, com um tempo de sobrevivncia igual quele patgeno entrico mais resistente; 3. No se reproduzir em guas contaminadas, para no resultar em valores aumentados ( HAGLER E MENDONAHAGLER, 1998 ).

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No se conhece nenhum microrganismo ou grupo de microrganismo que atenda a todos esses requisitos, mas h vrios que se aproximam das exigncias referidas e que so muito teis. As bactrias empregadas como indicadores de poluio fecal em guas so: os coliformes totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfringens. Contagens de Salmonella e de bactrias do gnero Bifidobactrias tm sido propostas. O Indicador microbiolgico mais empregado o grupo dos coliformes. Este e outros indicadores de poluio orientam a margem de segurana sanitria de gua potvel, da gua utilizada para fins recreativos e dos cultivos de organismos marinhos comestveis. A Organizao Mundial de Sade (OMS) recomenda para guas recreacionais um mximo de 100 coliformes fecais por 100ml de gua. COLETA DE AMOSTRAS A coleta de amostras para exame microbilgico deve ser feita em garrafas esterilizada que tenham sofrido tratamento prvio de limpeza e rinsagem com gua destilada. gua clorada: adiciona-se 0,1 ml de tiossulfato de sdio 10% para cada 250ml de gua para neutralizar-se o cloro livre presente, impedindo que continue com propriedades desinfetantes entre o perodo da coleta e o momento da inoculao, impedindo que continue com propriedades desinfectantes entre o perodo da coleta e o momento da inoculao. gua com alto teor de cobre e zinco: coleta na presena de um agente quelante, de forma a reduzir a toxicidade provocada pelos metais ( 0,3 ml de EDTA a 15%, ph = 6,5para cada 120mL de gua ). Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espao livre na garrafa (cerca de 2,5 cm) para facilitar a homogeneizao antes da inoculao. As garrafas devem ser mantidas vedadas at o momento da coleta da amostra e devem ser tomados todos os cuidados de assepsia no momento da coleta, de forma a evitar contaminaes secundrias. *PONTO DE COLETA 1. gua da torneira a. Abrir a torneira e deixar correr por 5 minutos, para eliminar as impurezas e a gua na acumulada nas tubulaes. b. Com algodo embebido em lcool, passar na abertura e internamente e em seguida flambar. c. Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos. d. Abrir o frasco esterilizado e coletar a gua. Introduzir gua no frasco at cerca de trs quartos do seu volume. e. Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratrio. 2. Poos e Cisternas a. Preparao do frasco amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com um barbante para facilitar a descida no poo. b. Descer o frasco dentro do poo sem permitir que o mesmo toque nos lados. c. Submergir o frasco completamente na gua.

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d. Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da gua para criar um espao de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente. 3. Rios, Lagoas e Mares a. Coleta da amostra de gua de rios e lagoas nestes casos deve-se mergulhar o frasco at uma profundidade de 20cm, com abertura voltada em direo contrria a corrente, a fim de evitar a contaminao da gua com as mos. b. Coleta da gua do mar a coleta deve ser feita na regio onde as pessoas costumam banhar-se, que corresponde profundidade aproximadamente de 1,0 m, que a regio das praias mais utilizada para a recreao de contato primrio, na mar baixa e 24 horas sem chuvas. ACONDICIONAMENTO E TRANSPORTE DA AMOSTRA PARA O LABORATORIO O ideal a anlise iniciar-se at 1 hora aps a coleta. Caso isto seja impossvel, a amostra deve ser transportada sob refrigerao. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10 graus Celsius no prazo mximo de at 30 horas aps a coleta. Amostras presumivelmente poludas tm de ser inoculadas no mximo aps 6 horas da coleta. Entre o recebimento da amostra e o inicio da inoculao, a mesma deve ser mantida em geladeira (cerca de 5 graus Celsius). EXAMES BACTERIOLGICOS DA GUA O exame bacteriolgico da gua feito atravs de dois processos: Contagem de bactrias heterotrficas viveis na gua e determinao ou estimativa do nmero de bactrias coliformes. A metodologia padro empregada no exame bacteriolgico da gua, para medida do grupo coliforme, inclui dois procedimentos: a tcnica dos tubos mltiplos e a tcnica da membrana filtrante (Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater -APHA, 1980). A. Determinao de coliformes pela tcnica dos tubos mltiplos NMERO MAIS PROVVEL (NMP) A tcnica do nmero mais provvel consiste no exame de uma srie de tubos onde foram inoculados volumes diferentes de amostra. O valor obtido resulta da consulta da tabela que foram estimuladas com base em frmulas de probabilidade. Consideraes tericas e determinaes repetidas em grande escala indicam que este tipo de tcnica tende a fornecer valores mais elevados do que o nmero real. As disparidades tendem a diminuir quando se adota sries com maior nmero de tubos em cada diluio. Portanto, a sensibilidade do teste depende do nmero de tubos adotados. Existem vrias tabelas de NMP e a escolha da srie a ser adotada funo das caractersticas microbiolgicas da amostra.

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Tabelas de NMP/100 ml de amostra: a. b. 5 X 10 ml ----- 2,2 > NMP 16 5 X 10 ml ----- 2,2 > NMP > ou = 240 1 X 1 ml 1 X 0,1 ml 3) 3 X 10 ml ----- 3 3 X 1 ml 3 X 0,1 ml > NMP > ou = 2400

4) 1 X 50 ml ------ 1 > NMP > ou = 240 5 X 10 ml 5 X 1 ml 5) 5 X 10 ml ----- 2 > NMP > ou = 2400 5X 1 5 X 0,1 ml 6) 5 X 50ml ----- 1 > NMP > ou = 240 OBS: nos tubos onde o inoculo de 10 ou 50 ml, usar concentrao dupla do meio e volume igual ao inoculo. TABELA DOS PADRES MICROBIOLGICOS DE PROBABILIDADE VIGENTES TUBOS POSITIVOS POR: 10 ml 1 ml 0,1 ml 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 2 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 2 0 2 0 0 2 0 1 2 1 0 2 1 1 2 2 0 2 2 1 2 3 0 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 1 0 Nmp PARA 100 ml 3 tubos <3 3 3 6 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 30 23 39 64 43

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3 3 3 3 3 3 3 3 3

1 1 2 2 2 3 3 3 3

1 2 0 1 2 0 1 2 3

75 120 93 150 210 240 460 1100 2400

gua potvel: Ausncia de coliformes totais Ausncia de coliformes fecais Teste Presuntivo Inocular, aps a escolha da tabela, dem tubos contendo caldo lauril sulfato triptose ou caldo de lacose em concentraes dupla ou simples. Os tubos devem conter tubinhos de Durham. Ocriscimento com formao de gs significa teste presuntivo positivo para coliformes totais. Os tubos que no apresentarem formao de gs com 24 horas de incubao devem ser incubados at 48 horas. Os tubos positivos com 24 horas devem ser imdiatamente inoculados nos meios de confirmao para se evitar que um crescimento muito abundante provoque o abaixamento do pH, o que pode provocar resultados falsamente negativos. Teste de Confirmao Coliformes Totais A partir dos tubos dom formao de gs, semear por alada (dimetro=3 mm) em tubos contendo caldo de blis para igual nmero de tubos contendo caldo EC. Incubar os tubos a 35 0,5 por 48 3 horas. A formao de qualquer quantidade de gs constitui teste positivo para coliformes totais. Coliforems Fecais Dos tubos positivos do teste presuntivo, transferir com uma ala de platina uma pequena poro do meio para igual nmero de tubos contendo caldo EC. Incubar os tubos a 44,5 0,2 C por 24 horas. A presena de gs no interior dos tubinhos de Durhan considerada reao positiva, indicando contaminao de origem fecal. A ausncia de gs mesmo com evidncia de crescimento indica a presena de coliformes de outra fonte que no seja de intestinos de animais de sangue quente.

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Teste complemento A partir dos tubos positivos de caldo blis verde brilhante, semear por estrias em placa contendo endo agar ou azul de metileno agar (agar EMB). Incubar a 35 0,5C por 24 2 horas. Colnias tpicas: Meio endo agar - colnias vermelhas Meio agar EMB - colnias verdes com centro escuro. De cada placa, escolher uma ou mais colnias tpicas e bem isoladas; transferir cada colnia para tubos contendo caldo de lactose ou caldo lauril triptose e para um tubo inclinado de agar nutriente. Incubar a 35 0,5C por 24 horas, prosseguindo a incubao at 48 3 horas caso no tenha ocorrido formao de gs aps a primeira incubao.

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B. TCNICA DE FILTRAO EM MEMBRANA A tcnica de filtrao na membrana para anlise da gua passou a ser recomendada pelo "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater", ao lado da tnica de NMP, aps a 13 edio . A recomendao afirma que a tcnica popde ser adotada para determinar a potabilidade de qualquer gua, desde que, aps uma srie de exames paralelos, obtenha-se com as duas tcnicas, resultados compatveis. Entretanto, deve ser observado, quanto a tcnica de filtrao em membrana: Vantagens: - Os resultados so obtidos aps 22-24 horas. - Podem ser analizados volumes maiores e mais representativos das amostras. - Os resultados em membrana tm maior grau de preciso, em relao tcnica dos tubos mtiplos, proporcionado tambm maior reprodutibilidade. - Um maior nmero de amostras pode ser processado com um mnimo de espao e equipamentos. Limitaes: - As amostras com alta densidade de bactrias no coliformes, porm capazes de se desenvolverer sobre o meio de cultura, pois os coliformes podero ser impedidos de se desenvolverem ou seno a densidade de coliformes podero ser impedidos de se desenvolverem ou seno a densidade de coliformes pode ser menor do que a obtida pela tcnica do NMP. - guas com alta turbidez devido as alfgas ou substncias em suspenso, pois estas podem formar uma pelcula na superfcie da membrana e interferir no desenvolvimento de colnias caracterstica de coliformes. Tcnica Um volume de 100 ml de amostra filtrada a vcuo atravs de uma membrana de 0,45 de dimetro de poro. As bactrias ficam retidas na membrana e esta transferida para placas apropriadas contendo almofadas de papel absorventes embebidas nos meios adequados. Meio para coliformes totais: Endo (caldo ou agar) Incubao 35 0,5 C por 22-24 horas. Colnisa Tpicas: cor rosa ou vermelha escura com brilho metlico caracterstico. Meio para coliformes fecais: M-FC-Broth Incubao: 44,5 0,2 por 24 horas. Colnias Tpicas: or azul. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

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ASSUNTO 9: - Provas Bioqumicas para a Identificao de Bacilos Gram-negativos

OBJETIVO Identificar enterobactria em gneros ou espcies, utilizando-se para isso vrios meios de cultura especiais, de acordo co o esquema a seguir: 1. Plaqueamento Seletivo Etapa de isolamento bacteriano a partir de espcies clnico, utilizando meios seletivo-indicadores como o Agar EMB. Neste meio as bactrias Gram positivas so inibidas pela presena de eosina e azul de metileno. As bactrias Gram negativas fermentadoras de lactose ( LAC + ) apresentam-se como colnias rosa-avermelhadas com ou sem centro negro, enquanto as no-fermentadoras ( LAC - ) formam colnias transparentes. Plaqueamento Seletivo - Agar EMB6.

2. Triagem Conjunto de provas bioqumicas realizadas simultaneamente em 1 ou 2 meios, permitindo uma diferenciao inicial dos isolamentos e direcionamento da contaminao bioqumica. Quando realizada em meio TSI, podemos observar: - Fermentao de glicose e produo de gs - Fermentao de lactose e/ou sacarose - Produo de H2S Bactrias que utilizam apenas glicose provocam acidificao (de colorao amarela) apenas na base, permanecendo o pice alcalino (de cor avermelhada). Bactrias fermentadoras de lactose e/ou sacarose acidificam todo o meio. A formao de gs evidenciada pelo rompimento ou descolamento do meio. A produo de H2S se manifesta pelo escurecimento do meio.

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Triagem Meio TSI7

3. Confirmao Bioqumica Conjunto de provas necessrias para a identificao bioqumica das colnias suspeitas. Algumas dessas provas esto descritas abaixo: a. Fermentao de Carboidratos: glicose, lactose, manitol, sacarose. A utilizao dos carboidratos leva formao de cidos, com viragem do indicador (vermelho de fenol) para cor amarela. A partir da glicose podemos observar tambm a produo ou no de gs (CO2, H2) no interior do tubo de Durham. A inoculao realizada a partir de cultura bacteriana overnight (+/- 18h) em Agar. Incubar por 24 horas a 37C. Leitura: cor amarelada = + (positivo) sem alterao = - (negativo) Fermentao de Carboidratos7

b. VM: Verifica a ocorrncia de fermentao cido-mista ( glicose cidos estveis). Meio: Clark & Lubs. Inoculao: idem ao item a. Aps incubao ( 48 h ), adicionar 3 5 gotas do reativo de VM ( vermelho de metila alcalino = amarelo plido / cido = vermelho). Leitura: Cor vermelha = + Cor amarela = c. VP ( Voges & Proskauer ): verifica a ocorrncia de fermentao acetonica (glicoseacetona).

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Meio: Clark & Lubs (meio glicosado e tamponado). Inoculao: idem ao item a. Aps inoculao (48 h), adicionar os reativos: VP I (Barrit I): alfa-naftol (0,6 mL) VP II ( Barrit II): KOH 40% (0,2 mL) Leitura (aps 10 15 minutos): *observar o aparecimento de anel vermelhos na superfcie do tubo (resultado positivo) *sem alterao: resultado negativo d. Citrato: verifica a utilizao do citrato como nica fonte de carbono. Meio: Citrato de Simmon. Inoculao: idem ao item a. Leitura: meio azulado = + meio sem crescimento = Utilizao do citrato como fonte de energia Meio Citrato de Simmon

e. Indol: verifica a produo de triptofane, que quebra triptofano, liberando indol, este revelado com o reativo de Kovacs, observa-se a formao de um anel escarlate na superfcie do meio. Meio: Caldo semi-slido (SIM). Inoculao: idem ao item a. aps a inoculao, adicionar 5 gotas do Reativo de Kovacs. Leitura: cor rosa = + sem alterao = -

Figura: Caldo SIM, verificao da liberao de Indol. f. Mobilidade: verifica se a bactria mvel ou imvel.

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meio: Agar semi-slido (SIM). Inoculao: utilizar agulha bacteriolgica, fazendo uma picada central at da profundidade do tubo. Leitura: crescimento fora do local da picada = + (mvel) crescimento somente ao redor da picada = - (imvel) g. Nitrato: verifica a capacidade de reduo do nitrato ( NO3) nitrito (NO2). Inoculao: idem ao item a. Aps incubao, adicionar 3 a 5 gotas dos reativos: Nitrato A: alfa naftilamina Nitrato B: cido sulfanlico Leitura: cor vermelha (violcea, escarlate) = + (liberao de NH3) sem alterao = h. Uria: meio contendo uria para verificar a produo da enzima urase. Inoculao : idem ao item a. Leitura: cor vermelha (violcea, escarlate) = + (liberao de NH3) sem alterao = RESULTADO ESPERADOS NOS TESTES BIOQUMICOS CARACTERSTICA E. coli Salmonella Klebsiella Proteus

EMB Lac + Lac Lac + Lac TSI c/c alc/c ac/ac lc/c ou ac/ac H2S + + Glicose + + + + Gs + + + + Lactose + + Sacarose V + V Manitol + + + V VM + + + + VP Citrato V + (5 dias) Indol + V Mobilidade V + + Nitrato + + + + Uria V + Tabela 1 Identificao bioqumica de alguns gneros de enterobactrias.

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ASSUNTO 10: - Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA) Mtodo de Kirby-Bauer

OBJETIVOS: 1. Determinar a sensibilidade de uma bactria frente a antimicrobianos, para a escolha da droga mais adequada no tratamento de uma doena. 2. Interpretar um antibiograma. MATERIAL: - cultura recente do microorganismo em teste - discos com antimicrobianos - placas com Agar Mueller-Hinton - swabs estreis - pinas, rgua graduada PRTICA PARA EXECUTAR: 1. Inculo: Cultura pura, em fase log, padronizado, diluda at obteno de turvao semelhante ao tubo n 0,5 da escala de McFarlnd (1,0x108) 2. Meio Mueller-Hinton, recente, em camada de 4 5 mm, pH = 7,2 7,4, com umidade adequada. Em alguns casos pode ser enriquecido com 5% de sangue, etc. 3. Semeadura Inocular a cultura a ser testada na superfcie do agar, com o auxlio de um swab, para um crescimento confluente (1). 4. Antimicrobianos Com o auxlio de uma pina flambada, aplicar os discos com antimicrobianos sobre o meio recm-semeado de modo eqidistante (3). Identificar a placa e incubar a 37C por 18 24 horas em posio invertida. Ocorrer difuso das substncias e suas concentraes diminuem gradativamente a medida que se afastam do disco. A eficincia de uma droga demonstrada pelo aparecimento de um halo de inibio do crescimento do microorganismo. 5. Leitura Com o auxlio de uma rgua graduada, medir o dimetro dos halos de inibio, incluindo o dimetro do disco (4).

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Figura: Teste de sensibilidade a antimicrobianos2. 6. Interpretao Interpretar a sensibilidade aos antimicrobianos de acordo com o dimetro do halo de inibio encontrado em tabelas padronizadas que contm os valores em mm, para as drogas disponveis comercialmente. 7. Controle Usar como controles os seguintes microorganismos, de acordo com as drogas utilizadas: - Staphylococcus aureus ATCC 25923 - Escherichia coli ATCC 25922 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Antimicrobiano Ampicilina (AM) cido Nalidxico (NA) Cloranfenicol (C) Sulfa-Trimetropim (STX) Cefoxitina (CT) Eritromicina (ERI) Estreptomicina Potncia 0,01 mg 0,03 mg 0,03 mg 0,03 mg Dimetro do halo de inibio R I S 11 12 13 14 13 14 18 19 12 13 17 18 10 11 15 16 14 15 17 18 13 14 22 23 11 12 14 15
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Cefalotina Polimixina Sulfazotrim Notas:

14 8 10

15 17 09 11 11 15

18 12 16

1. leituras de 4 e 6 horas podero ser feitas em caso de emergncia, mas leituras definitivas devero ser feitas somente aps o tempo estipulado (18 24 horas) 2. No usar sinais para expressar os resultados. Usar as letras S para os microorganismos sensveis e R para os microorganismos resistentes. 3. Lembrar que um halo de inibio maior que outro no indica propriamente uma maior atividade do antibacteriano sobre o microorganismo em teste. Outros fatores, como carga antibitica, difusibilidade, etc., intervm na formao dos halos. Portanto, deve ser utilizada a tabela na interpretao dos resultados. 4. Atualmente, no intuito de minimizar erros de interpretao, considera-se a sensibilidade intermediria como resistente.

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ANEXO I TCNICAS DE COLORAO A utilizao de corantes em microbiologia atribuda a Goeppert e Cohn (1849). Os corantes empregados, geralmente derivados da anilina, tm frmula quimicamente complexa, e so obtidos por sntese; quase sempre so sais de potssio ou de sdio, sendo classificados em: naturais, entre os quais podemos citar o carmim e a hematoxilina, e artificiais, que se dividem em: bsicos ou nucleares, cidos ou citoplasmticos e neutros. As clulas bacterianas so ricas em cido nuclico, conduzindo cargas negativas sob a forma de grupamentos fosfato, e estes se combinam com os corantes bsicos, que so carregados positivamente. Os corantes cidos no coram as clulas bacterianas, e por isso podem ser utilizados para corar o material de fundo com uma cor contrastante. As solues corantes so classificadas quanto ao veculo nos seguintes grupos: solues aquosas, solues hidroalcolicas e solues hidroalcolicas mordentes. Utilizam-se as solues aquosas quando se quer preservar a vitalidade dos microorganismos. A adio de substncias mordentes tem a vantagem de preserv-las da contaminao mais ou menos estvel entre ambas, como exemplos de substncias que funcionam como mordentes citamos o fenol, iodo, formol e tanino. As coloraes podem ser simples, quando utilizamos um s corante, duplas e mistas. Assim podemos ter uma noo da morfologia dos germes utilizando uma colorao simples, e de outras informaes com o emprego de tcnicas especiais de colorao, como por exemplo para diferenciar flagelos, cpsulas, paredes celulares, membranas celulares, grnulos, ncleos e esporos.

I.

MTODO DE GRAM (DIFERENCIAL)

Esse mtodo de colorao importante em taxonomia bacteriana. Desde sua descoberta (1884) foi intensamente estudado e muitas modificaes propostas sem, contudo, modificar a idia original. A reao de Gram depende do estado fisiolgico da clula, enquanto que as culturas jovens respondem melhor a diferenciao tintorial, as culturas velhas tendem a perder a capacidade de reteno do corante, levando um Gram positivo a se apresentar como Gram varivel. A explicao do mecanismo de colorao de Gram baseia-se em diferenas existentes na composio da parede celular das bactrias Gram positivas e Gram negativas. As bactrias Gram positivas contm, na parede celular, glicopeptdeos e cido teicico, enquanto que as bactrias Gram negativas possuem glicopeptdeos e lipopolissacardeos, lipoprotenas e fosfolipdeos. A colorao de Gram inicia-se com a aplicao de cristal violeta, a seguir aplica-se lugol (soluo de iodo), que sendo um mordente, fixa o cristal violeta a clula formando com ele um complexo denominado iodopararosanilina. At esta etapa, todas as bactrias esto roxas.

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Ao lavarmos as clulas com a soluo de lcool-acetona, lcool-ter ou ainda lcool puro, as bactrias G- so descoradas, enquanto que as G+ retm o complexo iodopararosanilina, devido a sua parede celular funcionar como uma barreira a eluio do complexo corante pelo lcool. Aparentemente, o lcool dissolve os lipdeos da parede das bactrias G- aumentando a sua permeabilidade e facilitando a sada do complexo iodopararosanilina, enquanto que nas bactrias G+ o lcool age como desidratante, diminuindo a porosidade e a permeabilidade e, consequentemente, retendo o complexo. Essa explicao apoiada na observao de que protoplastos obtidos no tratamento de bactrias G+ por lisozima no retm o complexo corante. A menor espessura da parede celular das bactrias G- tambm pode facilitar; porm importante a observncia do tempo de uso do diferenciador neste mtodo, pois um descoramento de tempo superior a 15 segundos acarreta o descoramento, inclusive, das bactrias G+. Em geral, todos os cocos so G+, com exceo do gnero Neisseria e todos os bastonetes so G-, exceto o gnero Bacillus (aerbio, esporulado), Clostridium (anaerbio), Corynebacterium, Listeria e Lactobacillus. O gnero Mycobacteriaceae, embora sendo considerado G+ por alguns autotes, cora-se irregularmente. Os vibries so G- e as leveduras coram-se como as bactrias G+. O mtodo de Gram no se aplica as bactrias espiraladas. Este mtodo de grande importncia na sistemtica bacteriana, pois atravs dele podemos classificar as bactrias em dois grupos: bactrias Gram positivas (roxas) e bactrias Gram negativas (rosas).

OBJETIVOS 1. Avaliao da importncia taxonmica do mtodo de Gram; 2. Interpretao da ao e funo dos reagentes. Tcnica: A. Preparao do esfregao: Lmina nova ou estocada em lcool. Flambar no bico de Bunsen. Deixar esfriar. Cultivo em meio lquido Transferir assepticamente com ala os microorganismos, colocando o inoculo no centro da lmina e espalhar (aproximadamente 1,0 a 1,5 cm); Secar ao ar livre at evaporao total (ou na chama sem aquecer em demasia); Fixar a preparao passando a lmina na chama do bico de Bunsen 3 vezes (repetir esta etapa quantas vezes forem necessrias, sem aquecer a lmina em demasia); Deixar a lmina esfriar antes de iniciar a tcnica de colorao.

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 Cultivo em meio slido Colocar uma gota de gua destilada estril, soluo salina ou meio lquido estril no centro da lmina; Tocar, assepticamente, com agulha estril uma colnia. Homogeneizar o material colhido no lquido da lmina, espalhando a suspenso; Secar, fixar e esfriar como citado acima. B. Colorao Simples: 1. Fazer um esfregao com suspenso bacteriana; 2. Cobrir o esfregao com qualquer corante por 1 minuto (fucsina, azul de metileno, violeta de genciana e cristal violeta); 3. Lavar com gua; 4. Secar com papel de filtro (sem esfregar); 5. Observar ao microscpio ptico com objetiva de imerso e iluminao forte.

C. Colorao Dupla: Mtodo de Gram: 1. Fazer um esfregao fino como descrito anteriormente; 2. Fixar a lmina pelo calor o calor provoca a termocoagulao das protenas, com aderncia do material lmina e morte do microorganismo. Esfriar; 3. Corar cobrindo a lmina com soluo de cristal violeta ou violeta de genciana durante 1 minuto; 4. Desprezar o excesso de corante e adicionar lugol por 1 minuto (mordente); 5. Lavar com gua; 6. Diferenciar rapidamente com lcool-acetona por aproximadamente 10 a 15 segundos (diferenciador); 7. Lavar com gua imediatamente, para evitar que o diferenciador continue agindo; 8. Corar com fucsina diluda por 30 segundos (2 corante); 9. Lavar com gua; 10. Secar entre 2 folhas de papel de filtro (sem esfregar); 11. Examinar utilizando objetiva de imerso, leo de cedro e iluminao forte.

D. Interpretao de resultados: Microorganismos Gram positivos: azuis-arroxeados (com parede celular mais espessa e sem lipdeos). Microorganismos Gram negativos: vermelhos/rosas (com parede celular mais fina e com lipdeos).

Solues reagentes: 1. Cristal violeta: - Cristal violeta - lcool a 95 - gua

1,0g 10mL 100mL

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2. Lugol: - Iodo - Iodeto de potssio - gua 3. Fucsina: - Fucsina bsica - Fenol - lcool a 95 - gua

1,0g 10mL 300mL

0,3g 5,0g 10mL 100mL

Dever ser diluda 1:10 para ser utilizada no mtodo de Gram. Existem vrias modificaes introduzidas no mtodo visando melhora-lo, uma das utilizadas a de Kopeloff-Beermann. Com adio de bicarbonato de sdio soluo de cristal violeta e a substituio da soluo de fucsina por safranina. As principais vantagens deste mtodo modificado: no iro sofrer interferncia de pH (como a acidez do pus) e, preservar as bactrias G+ que se descoram facilmente (Gram lbeis). 4. lcool-acetona proporo 1:1. II. TCNICAS DE COLORAO ZIEHL-NEELSEN As micobactrias constituem um grupo que causa doenas no homem e nos animais superiores. No homem essas doenas variam de infeces superficiais at a tuberculose. Atualmente, constituem um dos maiores problemas em pases desenvolvidos, podendo causar, alm da tuberculose bovina, a Doena de Johne e doenas em roedores, rpteis, peixes e galinhas. As micobactrias so microorganismos encontrados com facilidade no meio ambiente, com exceo do Mycobacterium tuberculosis e M. leprae. Pertencem ao gnero Mycobacterium e se apresentam como bacilos longos, delgados, retos ou ligeiramente encurvados, imveis e aerbios. So bacilos lcool-cido resistentes (BAARs) apresentam crescimento lento e alto contedo lipdico na parede celular. Algumas espcies podem crescer em meios simples, mas em geral, os meios so complexos, como o de Lowenstein Jensen, apresentando crescimento macroscpico aps 3 a 4 semanas de incubao 37 C. Neste gnero, duas espcies produzem doenas importantes: Mycobacterium tuberculosis e M. leprae, as demais so denominadas atpicas e divididas em 4 grupos (grupos de Runyon I, II, III e IV). M. tuberculosis o agente etiolgico da tuberculose, esta pode se apresentar em diversas formas clnicas, sendo a mais comum a pulmonar (cerca de 80%), a nica forma clnica contagiosa. O teste confirmativo para diagnstico da tuberculose a demonstrao do M. tuberculosis em material clnico colhido do paciente suspeito, atravs de baciloscopia pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen ou cultura em meios apropriados (diagnstico bacteriolgico). M. leprae o agente etiolgico da hansenase, uma doena que se caracteriza por leses da pele, mucosas e nervos perifricos. So BAARs semelhantes ao M. tuberculosis e caracterizam-se pela disposio em feixes ou globias. At o momento no

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se obteve xito para o seu cultivo em laboratrio, sendo considerado parasita intracelular obrigatrio. A colorao de Ziehl-Neelsen uma tcnica de fcil execuo, muito til e importante para o diagnstico clnico das micobacterioses e se fundamenta na propriedade tintorial que tm as micobactrias de quando coradas resistirem ao descoramento por solues lcool-cido. A evidenciao direta de BAARs no material clnico suspeito (escarro, urina, lquor, fezes, leses de pele e lavado gstrico) apenas presuntiva, pois no identifica a espcie observada. OBJETIVOS: 1. Evidenciar as caractersticas morfotintoriais de M. tuberculosis e M. leprae e micobactrias em geral. 2. Diagnstico e avaliao do tratamento de tuberculose pulmonar. 3. Diagnstico e avaliao das formas multibacilares da hansenase. Tcnica: 1. No material suspeito, observar o aspecto, colorao e presena ou no de sangue. 2. Na lmina limpa e desengordurada, fazer o esfregao do material com bastante assepsia, retirando a alada da poro mais densa. 3. Flambar a ala. 4. Deixar o esfregao secar ao ar. 5. Fixar na chama do Bico de Bunsen. 6. Cobrir a lmina com fucsina de Ziehl concentrada, aquecendo a lmina at a emisso de vapores (5 minutos). 7. Escorrer o corante e lavar com a soluo lcool-cido clordrico 3% (diferenciador) tempo delicado. 8. Lavar com gua 9. Cobrir a lmina com soluo de azul de metileno (1 minuto) 10. Lavar, secar e observar ao microscpio com objetiva de imerso, leo de cedro e iluminao forte. As micobactrias se coram mal pelo mtodo de Gram. No mtodo de Ziehl-Neelsen elas permanecem coradas, por serem BAARs, com tonalidade vermelha, enquanto as outras estruturas e bactrias se mostram azuis. Pelas normas estabelecidas pela Campanha Nacional contra a Tuberculose, a interpretao da lmina pode ser: Negativo (-) Positivo (+) Positivo (++) Positivo (+++) ausncia de BAARs em 100 campos microscpicos menos de 1 bacilo/campo em 100 campos 1 a 10 bacilos/campo em 50 campos mais de 10 bacilos/campo em 20 campos

Colorao de Ziehl Neelsen para M. leprae a. Material de leso cutnea, lbulo da orelha e cotovelo, mesmo sem leses.

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b. Tcnica de colorao idntica a descrita anteriormente, com exceo do cido clordrico (1%) c. Observar ao microscpio o agrupamento tpico. Material necessrio: Escarro de pacientes com tuberculose pulmonar ou Lminas preparadas com M. leprae de linfa de leses coradas pelo ZiehlNeelsen Bateria de corantes de Ziehl-Neelsen 1. Azul de metileno Azul de metileno 1g lcool etlico 95 GL 100 ml gua q.s.p. 1000 ml Triturar o corante em um gral. Adicionar o lcool aos poucos. Homogeneizar, completar o volume com gua. Deixar em repouso por 24 horas. Filtra em papel ou algodo e estocar em frasco mbar com tampa de rosca esmerilhada. 2. Sol. lcool-cido Obs: deixar o cido escorrer lentamente pelas paredes do recipiente contendo lcool, agitar suavemente. III. TCNICA PARA EVIDENCIAO DE ESPIROQUETAS Os organismos espiralados de significado mdico, os Treponemataceae, incluem trs grupos patognicos para o homem e vrios outros animais: Leptospira, que causa a leptospirose humana; Borrelia, incluindo B. recurrentis e B. vicemii, que causam febre recorrente e a angina de Vicent, respectivamente e Treponema, responsvel pelas doenas conhecidas como treponematoses, destacando-se T. pallidum, T. pertenue e T. carateum, organismos que causam a sfilis, a bouba e a pinta, respectivamente e o T. cuniculi, que causa a sfilis em coelhos. Outros treponemas incluem espcies no patognicas encontradas na boca e genitais do homem. Nenhum dos quatro treponemas patognicos foi ainda cultivado in vitro e nenhuma diferena morfolgica, antignica ou metablica convincente foi observada entre eles. Os hospedeiros naturais so o homem, os macacos superiores e os coelhos, mas todos de sangue quente at agora testados podem ser infectados. Atualmente, quase todos os casos de sfilis so adquiridos por contato sexual com leses infecciosas. Meios incomuns de transmisso incluem o contato pessoal no sexual, com fmites contaminados, transfuses sanguneas ou a infeco em tero. Uma grande proporo das infeces extra genitais ocorre nas proximidades da boca, como resultado da disseminao dos microorganismos pela cavidade oral durante o beijo. At o momento, no h nenhum agente imunizante ativo como profilaxia para a infeco siflica. Leptospirose um termo aplicado doena causada por todas as leptospiras, sem considerar o sorotipo especfico. A doena ocorre em uma grande variedade de

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hospedeiros animais, domsticos e selvagens e nos seres humanos uma ocorrncia acidental. Por febre recorrente, entende-se um grupo de doenas infecciosas agudas clinicamente caracterizadas por perodos de febre e aperexia. Estas doenas so causadas por espiroquetas do gnero Borrelia e ocorrem em duas variedades epidemiolgicas, uma transmitida pelo piolho (urbana) e outra pelo carrapato (rural). As borrelias so tambm importantes como agentes de doenas periodontais. A famlia Spirochaetaceae compreende bactrias de formas espiraladas, espessas ou delgadas, tamanho varivel, rgidas ou flexveis, possuindo cinco gneros. A intensidade de colorao varia quando so empregadas a colorao simples ou o mtodo de Gram; sendo assim utilizadas, para a sua visualizao, tcnicas especiais de impregnao, imunofluorescncia e campo escuro. T. pallidum o agente causal da sfilis. No doente, pode ser observado no sangue durante o perodo de incubao da doena, nas secrees de cancro no estgio primrio e no material de leses de pele e membranas mucosas no estgio secundrio. O diagnstico laboratorial da sfilis pode ser feito por pesquisa Direta do treponema por testes sorolgicos e pesquisa de anticorpos especficos, mas o nico exame que tem valor absoluto para os diagnsticos da sfilis a pesquisa direta do treponema em leses sinfilticas. A colheita deve ser feita em leses midas, e o material observado preferencialmente em microscopia de campo escuro, ou na impossibilidade, atravs do mtodo de impregnao pela prata, devendo ser lembrado, no entanto, que nem sempre possvel evidenciar a espiro que ta nas leses. Para as leptospiroses e infeces por Borrelia esses mtodos no devem ser feitos, atravs do mtodo em campo escuro, para as leptospiroses e, no sangue, durante um episdio febril, para as espiroquetas do gnero Borrelia. OBJETIVO: Evidenciao de espiroquetas atravs da microscopia de campo escuro e/ou impregnao pela prata. 3.1 Microscopia em campo escuro Partculas cujas dimenses so inferiores a 0,2mm ou objetos cujos ndices de refrao so muito prximos daquele do meio em que esto suspensos no so visveis ao microscpio ptico, ao exame em campo claro. Para v-los, recorre-se ao artifcio do campo escuro, que consiste em adaptar ao microscpio ptico comum um dispositivo que impede a penetrao dos raios diretos provenientes de uma fonte luminosa intensa, de tal maneira que s penetram na objetiva os raios refratados e refletidos pelo objeto observado. Utilizam-se com esta finalidade condensadores especiais, sendo o mais usado o condensador cardiide. Soluo impregnadora (nitrato de prata amoniacal): Dissolver 5 g de nitrato de prata em 100 ml de gua Retira alguns mL

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Ao restante, adicionar gota a gota soluo concentrada de amnia ata que o precipitado castanho que se forma dissolva-se totalmente Adicionar gota a gota a soluo de nitrato que foi retirada at que aparea uma fraca turvao persistente. MATERIAL: a. b. c. d. e. f. g. h. i. j. Microscpio ptico(M.O.) M.O. + condensador Lminas Reagentes Fontana-Tribondeau SWAB lcool leo de cedro Soluo salina Culturas em meios lquidos e slidos Exsudato positivo Resultado: num campo escuro as espiroquetas aparecem claras. 3.2. Mtodo de Fontana-Tribondeau (Impregnao pela Prata) a. e. f. g. h. Preparar o esfregao numa lmina limpa e desengordurada Secar ao ar Fixar o esfregao com lquido de Ruge durante 1 minuto Lavar com gua destilada Cobrir a preparao com cido tnico(mordente) e com chama de um swab embebido em lcool, aquecer a lmina com soluo de nitrato de prata amoniacal aquec-la at a emisso de vapores (30 segundos) i. Lavrar com gua destilada j. Cobrir a lmina com soluo de nitrato de prata amoniacal e aquec-la at a emisso de vapore (30 segundos) k. Lavar com gua destilada l. Secar ao ar m. Examinar ao microscpio com objetiva de imerso. Resultado: As formas espiraladas aparecem em marrom escuro em um campo marrom claro. Os espiralados possuem uma parede delgada que no evidenciada pelos mtodos habituais, o nitrato de prata impregna na parede. Reagentes de Fontana-Tribondeau: 1. Lquido de Ruge - cido actico - Formalina - gua 2. Mordente - fenol - cido tnico

1,0 mL 2,0 mL 100 mL

1,0 g 5,0 g

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- gua

100 ml

IV. MTODO DE ALBERT-LAYBOURN O mtodo de Albert-Laybourn baseia-se no fato de algumas bactrias apresentarem corpsculos citoplasmticos localizados nas regies polares (corpsculos metacromticos ou corpsculos de Babes Emst) da clula bacilar, que se coram pelo Lugol forte (de cor marrom), se evidenciando em contraste com o corpo bacilar, que se cora em verde-azulado pela soluo de Laybourn. Tais caractersticas encontramos nas corinebactrias e difterides, e tal metodologia descria, associada aos sintomas clnicos caractersticos da difteria, possibilita um diagnstico presuntivo da doena pela microscopia tica.

TCNICA: 1. Preparao do esfregao a. n. o. p. q. r. Preparar um esfregao homogneo, delgado e fixado. Cobrir o esfregao por + ou 5 minutos com a soluo de Albert-Laybourn Escorrer (sem lavar) Cobrir com soluo de Lugol forte por + ou 2 minutos Lavar e secar Observar em objetiva de imerso (100x)

Solues reagentes: 1. Soluo de Albert-Laybourn - azul de toluidina - verde malaquita - cido actico glacial - lcool 95% - gua destilada 2. Soluo de lugol Forte - iodo metlico - iodeto de potssio - gua destilada

0,15g 0,20g 1,00ml 2,00ml 100ml

2,0g 3,0g 300ml

Obs: guardar em frasco mbar ao abrigo da luz.

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Referncias Bibliogrficas:
1. Bazzo, G. C., Pezzini, P. R., Ztola, M.Nunes G. C., Peters, E. A importncia da avaliao da qualidade microbiolgica de matrias-primas utilizadas em farmcias magistrais. Disponvel em www.anfarmag.org.br, Seo: Encarte Tcnico. Acessado em 20/11/2007. 2. Brown, A. E. Benson. Microbiological Applications Laboratory Manual in General Microbiology. 8th Edition. The McGrawHillCompanies, 2001. 3. Sebenta das aulas prticas de microbiologia e parasitologia. Faculdade de Medicina. Coimbra, 2005-2006. 4. Lerner, K L., Lerner, B. W. World of Microbiology and Immunology. Volumes 1 e 2. Gale, 2003. 5. Harley, J. P. Prescott, L. M. Laboratory Exercises in Microbiology 5th Edition. The McGrawHillCompanies, 2002. 6. http://www.mc.maricopa.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/emb.html, acessado em 22/11/2007. 7. http://biology.fullerton.edu/biol302/302labf99/biochem.html, acessado em 22/11/2007.

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