AW-Val-02 WIEDERFINDUNGSVERSUCH -1-

ANWENDUNG DER KALIBRIERUNG AUF NATÜRLICHE PROBEN

Ein wesentliches Gütekriterium eines Analysenverfahrens ist die Anwendbarkeit auf natürliche Proben.
Das Verfahren muss auf zusätzliche Beeinflussungen durch
• einerseits eventuell notwendige zusätzliche Verfahrensschritte der Probenvorbereitung wie:
• Probenaufschluss
• Probenextraktion
• und andererseits durch Interferenzen oder Matrixeffekte hin untersucht werden.

Verfahrenschritte und Matrixeffekte können sich in einer Erhöhung der Unpräzision und/oder als konstant-
bzw. proportional systematische Abweichungen der Analysenergebnisse vom „wahren Wert“ äußern.
Sowohl zur Überprüfung einzelner Verfahrensschritte als auch zur Feststellung einer Matrixbeeinflussung
eignet sich die Berechnung der Wiederfindungsfunktion, die es erlaubt, systematische Abweichungen
aufzudecken.

Arten von systematischen Abweichungen:

1. Konstant-systematische Abweichung:
Die konstant systematische Abweichung ist unabhängig von der Konzentration der analysierten
Komponente, was sich in einer Parallelverschiebung der Kalibriergeraden zeigt. Mögliche Ursache
könnte das Miterfassen einer Matrixkomponente sein, d.h. das Verfahren ist nicht spezifisch genug.

2. Proportional-systematische Abweichung:
Die proportional systematische Abweichung ist dagegen abhängig von der Konzentration der
analysierten Komponente, was sich in einer Änderung der Steigung der Kalibriergeraden zeigt. Diese
Abweichung kann durch Matrixeinflüsse aber auch durch eventuelle Probenvorbereitungsschritte bedingt
sein.

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AW-Val-02 WIEDERFINDUNGSVERSUCH -2-

ERMITTLUNG VON SYSTEMATISCHEN ABWEICHUNGSKOMPONENTEN MITTELS

STANDARDADDITIONSVERFAHREN:
Die Beurteilung, ob systematische Abweichungskomponenten vorliegen, erfolgt durch die
Wiederfindungsfunktion. Ziel dieser Wiederfindungsexperimente ist die Ermittlung des Einflusses einer
Verfahrens- oder Probenmodifikation (auch Matrixeinfluss) auf das Analysenverfahren. Dabei wird
ermittelt, wie viel von einer vorgegebenen bekannten Probenkonzentration bei der Analyse
wiedergefunden wird.

Ermittlung der Wiederfindungsfunktion:

Die Untersuchung mit dem modifizierten Analysenverfahren (Matrixkalibration auf Basis des
Standardadditionsverfahrens) erfolgt im gleichen Arbeitsbereich wie die Grundkalibrierung (siehe auch
AW-Val-01)!
Hierbei werden wieder die gleichen statistischen Tests wie bei der Grundkalibrierung durchgeführt
(Linearität, Ausreißertest, ….).

Einer konstanten aliquotierten Probemenge werden steigende Mengen des Standards zugesetzt, sodass
der gesamte Arbeitsbereich (steigende Konzentrationen – aufgestockte Proben - Standardaddition)
abgedeckt wird. (In unserem Beispiel 5 Standards im Konzentrationsbereich 0,25 bis 1,25 mg/L, da
durch die Probenzugabe höhere Gesamtextinktionswerte erhalten wurden, NW = 5, und K = 2)
Diese „aufgestockten Proben“ und die aliquotierte Weinprobe ohne Standardzusatz werden dann
vermessen und die Auswertung durch Extrapolation auf das Nullsignal vorgenommen
( Matrixkalibration).

Die Ermittlung der Wiederfindungsfunktion erfolgt über die Kalibrierfunktion der Grundkalibrierung.

xf =
(y f − b0 )
[mg / L]
xf = gefKONZ, gefundene Konzentration der aufgestockten Proben
yf = addEXT, gemessene Extinktion der aufgestockten Proben
b1 b0, b1 aus der Grundkalibrierung

Von der gefundenen Konzentration der aufgestockten Proben wird der Mittelwert der aliquotierten
Probenkonzentration subtrahiert um die tatsächlich gefundene Konzentration (xf = gefSTD) gegen die
vorgegebene Konzentration (xc = addSTD) auftragen zu können:

Wiederfindungsfunktion

Wiederfindungsgerade:

x f = b 0,f + b1,f ∗ x c xc = xf

STDgef = b0, f (± sb 0 ) + b1, f (± sb1 ) ∗ STDadd

(STD gef = KONZ gef − xWein )

Idealfall:
Wesentlich ist, dass man sowohl auf der b0,f = 0
Abszisse als auch auf der Ordinate b1,f = 1
Konzentrationen aufträgt (mg/L), damit
man die vorgegebene Konzentration
direkt mit der gefundenen Konzentration
vergleichen kann.

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AW-Val-02 WIEDERFINDUNGSVERSUCH -3-

Prüfung auf systematische Abweichungskomponenten:

Eine wichtige Voraussetzung für die Interpretation der Wiederfindungsfunktion ist die Gleichwertigkeit
der Verfahrensstandardabweichungen der Grundkalibrierung sx0 und der Kalibrierfunktion für die
aufgestockte Matrix (Matrixkalibrierung). Der Einfluss der Matrix kann zu einer deutlich höheren
Unpräzision führen, wodurch eventuell vorliegende systematische Fehler verdeckt werden können. Um
das auszuschließen werden die Verfahrensstandardabweichung der Grundkalibrierung sx0 und die
Reststandardabweichung der Wiederfindungsfunktion syf durch einen F-Test auf signifikante Unterschiede
geprüft (nach Funk et al):

2
 s yf  Wenn PW > F(f1 = NwK-2; f2 = NcK-2, P = 99%) : signifikanter Unterschied
PW =  
 s xoc 

In diesem Fall kann keine Aussage über ein Nicht-Vorliegen von systematischen Abweichungen
gemacht werden. Es muss die Ursache für die hohe Unpräzision gefunden werden, diese eliminiert und
die Wiederfindungsfunktion erneut bestimmt werden. (Anmerkung: Hier ist der Vergleich von syf und sxoc
zulässig, da beide Standardabweichungen in Konzentrationseinheiten berechnet werden!)

Berechnung der Vertrauensbereiche (VB):

Die Vertrauensbereiche (VB) für den Achsabstand (b0) und die Steigung (b1) werden berechnet und
geprüft, ob der VB für den Achsabstand 0 einschließt bzw. ob der VB für die Steigung 1 einschließt.

VB für b0,f schließt 0 ein: es konnten keine konstant systematische Abweichung festgestellt werden
VB für b1,f schließt 1 ein: es konnten keine proportional systematische Abweichung festgestellt werden

Um eventuelle Abweichungen von der normalen Zufallsstreuung besser darstellen zu können,

veranschaulicht man sich folgende Darstellungsform. Unter Betrachtung der Wiederfindungsgerade von
schräg oben und Projektion der Differenzen (gefSTD – addSTD) gegen addSTD, lassen sich unter
waagrechter Betrachtung Trends besser erkennen.

Wiederfindungsgerade:
x f = b 0,f + b1,f ∗ x c

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AW-Val-02 WIEDERFINDUNGSVERSUCH -4-

Darstellung der Differenzen d = STDgef – STDadd:

a, normale Zufallsstreuung b, Trend (proportional systematische Abweichung)

Die Differenzen d = STDgef - STDadd werden gegen die vorgegebene Konzentration addSTD aufgetragen:
d = gefSTD - addSTD = xf – xc idealerweise ist: xf - xc = 0 und xf = xc

In dieser grafischen Darstellung der Differenzen werden systematische Abweichungen gut erkennbar.

Wurden bei der Überprüfung konstant- oder proportional-systematische Abweichungen festgestellt, so sollte
nach Möglichkeit die Ursache für diese Abweichungen gesucht werden. Daraufhin ist das
Analysenverfahren entsprechend zu optimieren und eine Wiederholung der Messungen zur Ermittlung
der Wiederfindungsfunktion durchzuführen.

Lassen sich die systematischen Abweichungen nicht eliminieren, so ist bei der Beschreibung des
Analysenverfahrens deutlich darauf hinzuweisen (Warnvermerk!).

Bei einer ausschließlich proportional-systematischen Abweichung kann das Analysenergebnis (auf Basis
der Grundkalibrierung) folgendermaßen korrigiert werden: Der Korrekturfaktur kann z.B. in Form einer
Wiederfindungsrate (WFR) angegeben werden, mit welcher das Analysenergebnis abgeglichen werden
muss.

Bsp: ermittelte Wiederfindungsfunktion: xf = 0,001 + 0,78.xc

Es wurde eine proportional systematische Abweichung über den VB der Steigung festgestellt (der
VB für die Steigung schließt 1 nicht ein).
In diesem Beispiel liegt eine WFR von 78% vor, das bedeutet, mit dieser Analysenmethode können
78% der vorgegebenen Substanz wiedergefunden werden. Man kann dann das Analysenergebnis um
diesen Wert entsprechend korrigieren, solange nicht gleichzeitig ein konstant systematischer Fehler
vorliegt!

Anmerkung:
Sollte trotz erfolgter Ursachenanalyse und Optimierung des Verfahrens immer noch konstante und
proportional systematischen Abweichungen gleichzeitig auftreten, wird eine Ergebnisauswertung auf Basis
der Matrixkalibrierung empfohlen. Es muss aber unbedingt beachtet werden, dass die verwendete Matrix die
Probenmatrix in der Zusammensetzung repräsentiert. Zusätzlich ist bei jeglicher Änderung des
Untersuchungsmaterials (= bedingen auch eventuelle Veränderungen der Matrix), die Methode neu zu
validieren.

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