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1.1.1.1.1. IntroduÁ„oIntroduÁ„oIntroduÁ„oIntroduÁ„oIntroduÁ„o ‡‡‡‡‡ micologiamicologiamicologiamicologiamicologia

micologiamicologiamicologiamicologiamicologia CapÌtulo 4 MicologiaMicologiaMicologiaMicologiaMicologia

CapÌtulo 4

MicologiaMicologiaMicologiaMicologiaMicologia

Aurea Maria Lage de Moraes Rodrigo de Almeida Paes VerÙnica Leite de Holanda

Os fungos s„o organismos que convivem conosco todos os dias. Estes organismos s„o encontrados praticamente em qualquer local do ambiente que nos cerca, inclusive no ar, onde estruturas reprodutivas, na forma de esporos ou conÌdios, est„o prontas para, ao cair em um substrato adequado, desenvol- ver novas estruturas vegetativas e reprodutivas.

Estes organismos, muitas vezes, nos s„o ˙teis, decompondo resÌdu- os org‚nicos, causando a decomposiÁ„o ou a degradaÁ„o de alimentos, ou mesmo atacando seres vivos, parasitando-os e, eventualmente, causando a sua morte.

Os fungos s„o importantes, tanto do ponto de vista ecolÛgico quanto econÙmico. Ecologicamente, s„o considerados os lixeiros do mundo, pois degradam todo tipo de restos org‚nicos, independente da origem, transfor- mando-os em elementos assimil·veis pelas plantas. J·, economicamente, tÍm implicaÁıes em v·rias ·reas: Medicina humana e veterin·ria, Farm·cia, Nutri- Á„o, Fitopatologia, Agricultura, Biotecnologia, entre outras.

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Os fungos tiveram seu grupo reconhecido como um reino a partir da descriÁ„o de cinco reinos por Whittaker em 1969. Esses organismos foram alocados em reinos com base na morfologia e no modo de nutriÁ„o dos seres vivos, sendo criado, ent„o, o reino Fungi. Em 1990, Carl Woese propÙs o agrupamento dos cinco reinos estabelecidos por Whittaker em trÍs domÌnios:

Archaea, Eubacteria e Eukaria, onde o reino Fungi faz parte do domÌnio Eukaria, que re˙ne todos os eucariontes.

A Micologia È, portanto, a ·rea da Biologia destinada ao estudo dos fungos.

1.1. Elementos fundamentais dos fungos e Citologia

Os fungos s„o organismos eucariontes, unicelulares (leveduriformes) ou multicelulares (filamentosos), haploides (homo ou heterocariÛticos), com pa- rede celular contendo quitina e a-glucano. N„o apresentam plastos ou pig- mentos fotossintÈticos.

Todos os fungos conhecidos, com poucas exceÁıes, tÍm origem nos esporos (reproduÁ„o sexuada) ou conÌdios (reproduÁ„o assexuada), corp˙s- culos que podem ser comparados ‡s sementes das plantas superiores, embora n„o sejam morfologicamente semelhantes a estas.

Os esporos ou conÌdios, para germinarem, necessitam de calor e umidade e o resultado desta germinaÁ„o È a formaÁ„o de um ou mais filamentos finos, conhecidos como tubos germinativos. Estes tubos se ramificam em todos os sentidos formando uma massa filamentosa, chamada micÈlio, que constitui o sistema vegetativo, respons·vel pelo desenvolvimento f˙ngico e pela absorÁ„o dos alimentos. Os filamentos simples ou ramificados que formam o micÈlio s„o denominados hifas. Na maioria dos casos, o sistema vegetativo encontra-se no interior dos tecidos parasitados, no solo ou na matÈria org‚nica em decomposiÁ„o.

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Com a formaÁ„o dos esporos ou conÌdios È necess·rio que estes tenham acesso livre ao ar, para assegurar sua disseminaÁ„o. Realiza-se, ent„o, uma diferenciaÁ„o das hifas vegetativas, geralmente levantadas verticalmente sobre o plano do micÈlio, conhecido como esporÛforo ou conidiÛforo, e sobre estes se originam os esporos ou conÌdios. As hifas, por sua vez, podem ser apocÌticas (com septo) ou cenocÌticas (sem septo).

O ciclo de vida dos fungos compreende duas fases. Uma som·tica, caracterizada por atividades alimentares, e outra reprodutiva, onde os fun- gos podem realizar reproduÁ„o sexuada ou assexuada. Em ambos os casos, um grande n˙mero de estruturas È formado, dependendo da espÈcie. As estruturas assexuadas, como tambÈm as sexuadas, podem ser formadas isoladamente ou em grupos, neste caso, formando corpos de frutificaÁ„o. Assim, conÌdios podem ser formados em conidiÛforos isolados ou agrupa- dos, constituindo ent„o os conidiomas. Os esporos podem ser formados em ascomas (onde s„o formados os ascos) ou basidiomas (onde s„o for- mados os basÌdios).

De acordo com tipo de reproduÁ„o realizada, os fungos podem ser divididos em trÍs grupos:

Holomorfo: aquele que no ciclo de vida realiza ambas as reprodu- Áıes, sexuada e assexuada.

Anamorfo: aquele que no ciclo de vida realiza apenas a reprodu- Á„o assexuada.

Teleomorfo: aquele que no ciclo de vida realiza apenas a reprodu- Á„o sexuada.

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Esquema do ciclo de vida geral do fungo.

de Sa˙de Esquema do ciclo de vida geral do fungo. 1.2. NutriÁ„o, metabolismo e habitat Os

1.2. NutriÁ„o, metabolismo e habitat

Os fungos s„o considerados seres heterotrÛficos, necessitando de materiais org‚nicos j· formados, que servem como fonte de energia e como constituintes celulares. Por causa da rigidez da parede celular, sua nutriÁ„o È por absorÁ„o de nutrientes sol˙veis simples. Realizam respiraÁ„o celular ou fermentaÁ„o para obten- Á„o de energia, e sua reserva energÈtica È sob a forma de glicogÍnio.

Devido ‡ ausÍncia de clorofila nos fungos, torna-se necess·rio que o substrato forneÁa as subst‚ncias j· elaboradas indispens·veis ‡ alimentaÁ„o, obrigando os fungos a viverem em estado de saprofitismo, parasitismo, simbiose (liquens, por exemplo) ou mutualismo. Eles podem ser subdivididos em:

SaprÛfitas obrigatÛrios ñ Fungos que vivem exclusivamente em matÈria org‚nica morta, n„o podendo parasitar organismos vivos.

Parasitas facultativos ou saprÛfitas facultativos ñ Fungos capazes de causar doenÁas ou de viver em restos org‚nicos, de acordo com as circunst‚ncias.

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Parasitas obrigatÛrios ñ Fungos que vivem exclusivamente atacando organismos vivos.

Os fungos s„o considerados seres cosmopolitas, pois est„o presentes

em qualquer parte do planeta. Sendo amplamente distribuÌdos pela natureza, s„o encontrados na ·gua, no ar atmosfÈrico, no solo, sobre os animais e vegetais vivos, na matÈria org‚nica em decomposiÁ„o, nos produtos alimentÌci- os e industriais.

A maioria dos fungos tÍm como necessidades nutricionais, os elemen-

tos C, O, H, N, P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Mo, Fe e Zn. Muitas espÈcies n„o necessitam de luz para seu desenvolvimento, j· outras necessitam para formar suas estruturas de reproduÁ„o, podendo ser consideradas fototrÛficas (que buscam a luz). A temperatura ideal para o crescimento dos fungos fica entre 0 a 35 0 C, mas o Ûtimo para a maioria fica entre 20 a 30 0 C e a umidade ideal fica em torno da saturaÁ„o.

1.3. PosiÁ„o sistem·tica dos fungos

O reino Fungi È dividido em sete filos, (Chytridiomycota,

Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, MicrosporÌdia, Glomeromycota, Ascomycota e Basidiomycota), e um grupo, os fungos anamÛrficos. Este grupo n„o possui valor taxonÙmico, sendo seus membros relacionados aos filos Ascomycota e Basidiomycota.

A taxonomia dos fungos È tradicionalmente baseada em caracteres

citolÛgicos e morfolÛgicos. Mas, atualmente, com o desenvolvimento de tÈc- nicas bioquÌmicas e moleculares, novos caracteres foram adicionados como auxÌlio na identificaÁ„o das espÈcies f˙ngicas. Tais como as tÈcnicas baseadas em PCR (RAPD, RFLP, AFLP), sequenciamento de DNA, isoenzimas e cromatografia (TLC, HPLC, CG, espectometria de massa).

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1.3.1. Filo Chytridiomycota

Os representantes do filo Chytridiomycota s„o considerados cosmo-

politas e saprÛfitos aqu·ticos. A maioria È de ·gua doce poucos s„o marinhos. A principal caracterÌstica do grupo È a formaÁ„o de zoÛsporo flagelado, estruturas de propagaÁ„o no ambiente aqu·tico, onde o flagelo ajuda na sua movimentaÁ„o.

Ex: Chytriomyces sp.

1.3.2. Filo Neocallimastigomycota

S„o encontrados no sistema digestivo dos grandes mamÌferos herbÌvoros e possivelmente em outros ambientes anaerÛbios terrestres e aqu·ticos. Tratam- se de zoÛsporos n„o flagelados.

Ex: Neocallimastix sp.

1.3.3. Filo Blastocladiomycota

Seus representantes apresentam reproduÁ„o assexuada com zoÛsporo de um ˙nico flagelo, e reproduÁ„o sexuada atravÈs da fus„o de planogametas. S„o habitantes restritos de ·gua e solo e parasitos de insetos.

Ex: Allomyces sp. e Coelomomyces sp.

1.3.4. Filo MicrosporÌdia

Organismos eucariontes sem mitocÙndria e flagelo desconhecido. S„o parasitas obrigatÛrios de animais, e comumente atacam peixes e insetos. Estes organismos foram incluÌdos no reino Fungi apÛs estudos filogenÈticos.

1.3.5. Filo Glomeromycota

O filo Glomeromycota È representado por fungos de micorrizas

arbusculares (FMA). Participam de uma associaÁ„o mutualÌstica com as raÌzes

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de algumas plantas, na qual a planta, atravÈs da fotossÌntese, fornece energia e carbono para a sobrevivÍncia e multiplicaÁ„o do fungo, enquanto este absorve nutrientes, minerais e ·gua do solo transferindo-os para as raÌzes da planta. TambÈm s„o considerados cosmopolitas. Foi incluÌdo neste grupo os represen- tantes do antigo filo Zygomycota, que tem como principais caracterÌsticas, hifas cenocÌticas e a formaÁ„o de zigospor‚nangio, por reproduÁ„o sexuada; e espor‚ngio, por reproduÁ„o assexuada. Os espor‚ngios s„o estruturas forma- doras de prop·gulos para dispers„o.

Ex: Mucor sp. e Glomus sp.

1.3.6. Filo Ascomycota

O filo Ascomycota compreende o maior grupo do reino Fungi, consti-

tuÌdo de aproximadamente 75% de todos os fungos descritos. Seus represen- tantes s„o considerados cosmopolitas e s„o encontrados na natureza como saprÛfitos, parasitas (especialmente de plantas), ou em associaÁ„o mutualÌstica

(com algas unicelulares) formando os liquens.

A principal caracterÌstica do grupo È a presenÁa de asco contendo

ascosporos, geralmente oito, que representam a estrutura de propagaÁ„o do

grupo. S„o produzidos por reproduÁ„o sexuada.

A reproduÁ„o assexuada tambÈm pode ser encontrada. O asco È for-

mado em uma estrutura denominada ascocarpo (corpo de frutificaÁ„o), que pode ser encontrado nas seguintes formas: apotÈcio (ascocarpo em forma de taÁa), cleistotÈcio (ascocarpo totalmente fechado, que se rompe com a matu- ridade), e peritÈcio (ascocarpo em forma de bal„o, com um poro na sua ponta). A ausÍncia da formaÁ„o de ascocarpo tambÈm È observada, sendo este considerado como ascos nus.

Ex: Eurotium sp. e Emericella sp.

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1.3.7. Filo Basidiomycota

Os representantes do filo Basidiomycota s„o considerados cosmopolitas e saprÛfitos. S„o comumente denominados ìcogumelosî. TÍm como principal caracterÌstica a presenÁa de basÌdio contendo basidiosporos, geralmente qua- tro, produzidos por reproduÁ„o sexuada.

A reproduÁ„o assexuada tambÈm pode ser encontrada. O basÌdio È

formado a partir de um basidiocarpo, sendo este constituÌdo, basicamente, por pÌleo (o chapÈu do cogumelo), lamela (estrutura pregueada abaixo do pÌleo, onde se encontram os basidios) e estirpe (estrutura que sustenta o pÌleo).

Ex: Agaricus sp. e Rhodotorula sp.

1.3.8. Fungos AnamÛrficos

Os Fungos AnamÛrficos formam um grupo de fungos onde a reprodu- Á„o assexuada È predominante, com a formaÁ„o de conÌdios como estrutura de propagaÁ„o.

A reproduÁ„o sexuada È ausente, desconhecida ou teve a capacidade

perdida. Esse grupo est· relacionado a gÍneros do filo Ascomycota e Basidiomycota por comparaÁ„o de sequÍncias gÍnicas. S„o considerados como cosmopolitas, saprÛfitos, e parasitas de animais e plantas.

Os conÌdios s„o formados por cÈlulas conidiogÍnicas, presentes nos conidiÛforos, que s„o prolongamentos de hifas modificadas, com funÁ„o reprodutiva. Os conÌdios podem ter diferentes formas, tamanhos e cores, podem possuir ou n„o a superfÌcie texturizada, ornamento ou septo.

Ex: Aspergillus sp e Penicillium sp.

2.2.2.2.2. PPPPPororororor quequequequeque estudamosestudamosestudamosestudamosestudamos ososososos fungosfungosfungosfungosfungos

Os fungos s„o conhecidos da humanidade h· v·rios sÈculos, tanto por seus benefÌcios quanto pelos problemas que causam. Muitas doenÁas huma-

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nas, de animais e plantas (micoses) s„o causadas por fungos. Em humanos e animais os fungos podem causar alergias respiratÛrias e cut‚neas leves ou inten- sas, dependendo da suscetibilidade e prÈ-disposiÁ„o do indivÌduo. Podem causar infecÁıes em mucosas e outros tecidos subcut‚neos, assim como infec- Áıes crÙnicas e letais envolvendo Ûrg„os inteiros. Cada tecido ou Ûrg„o do corpo humano pode ser afetado, com exceÁ„o dos dentes.

NÛs dependemos da agricultura para nos fornecer alimentos, principal- mente os gr„os de cereais (milho, trigo, aveia, amendoim, etc.) que alimentam tanto os humanos quanto os animais. DoenÁas f˙ngicas em cereais causam perdas significantes na agricultura, tanto para o consumo interno quanto para a exportaÁ„o de gr„os ñ atividade t„o importante em nossa economia. AlÈm disso, o ataque dos fungos n„o se restringe ao campo de produÁ„o, eles atacam tambÈm os gr„os estocados causando sua destruiÁ„o ou produzindo toxinas carcinogÍnicas potentes (micotoxinas) dentro destes gr„os.

Os fungos tÍm sido utilizados para os mais diferentes propÛsitos, desde a antiguidade. O uso mais antigo deles tem sido como alimento, propriamente dito, tendo sido utilizado mais tarde tambÈm na ind˙stria alimentÌcia para a produÁ„o de p„es, queijos, cervejas e vinhos. O sabor e a textura de muitos alimentos, como os queijos e o molho de soja, s„o dados pelos fungos usados em sua fabricaÁ„o. Posteriormente, foi descoberto o poder dos fungos na produÁ„o de metabÛlitos que poderiam ser ˙teis, como a Penicilina.

Estudos em Biotecnologia e Engenharia genÈtica propiciaram a pro- duÁ„o destes metabÛlitos em larga escala. Hoje produtos f˙ngicos usados comercialmente incluem ·cidos org‚nicos, etanol, alguns antibiÛticos (alÈm da Penicilina), pigmentos, vitaminas, enzimas e pesticidas biolÛgicos. AlÈm de se tornarem valiosos objetos de pesquisa, em particular, como modelos eucariontes, uma vez que s„o facilmente manipulados em laboratÛrio, for- necendo informaÁıes importantes sobre a bioquÌmica, a genÈtica e a biolo- gia molecular dos eucariontes.

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3.3.3.3.3. MicologiaMicologiaMicologiaMicologiaMicologia MÈdicaMÈdicaMÈdicaMÈdicaMÈdica

A Micologia mÈdica tem como principal objetivo estabelecer o diag-

nÛstico micolÛgico das infecÁıes por fungos, que por sua vez se baseia em correta coleta e processamento de espÈcimes clÌnicos. A observaÁ„o das nor- mas de preservaÁ„o, e transporte adequados dos materiais clÌnicos atÈ os locais de processamento, como laboratÛrio de Microbiologia/Micologia tambÈm tem enorme import‚ncia para a obtenÁ„o de resultados acurados.

3.1. ClassificaÁ„o das micoses

Didaticamente, podemos dividir as micoses em grupos, como demons- trado a seguir:

3.1.1. Micoses superficiais e cut‚neas

As MICOSES SUPERFICIAIS s„o infecÁıes causadas por fungos que invadem as camadas mais superficiais da capa cÛrnea da pele ou a haste livre dos pelos. As lesıes se manifestam como mancha pigmentar na pele, nÛdulo ou pelos. A forma invasiva do fungo È uma hifa, caracterÌstica de cada micose.

A piedra negra È uma micose causada pela Piedraia hortae. Esta micose

consiste em nÛdulos duros, de cor escura, localizados na haste dos pelos e bastante aderentes a eles. Em parasitismo, o fungo se apresenta como um emaranhado de hifas intimamente unidas. Essas hifas s„o de cor castanha e tÍm parede e septos espessos. Os nÛdulos constituem, na verdade, um ascostroma, pois em meio ao enovelado de hifas formam-se lÛculos ovalados contendo oito ascÛsporos. J· a piedra branca È causada por leveduras do gÍnero Trichosporon. Nesta infecÁ„o o fungo cresce sobre a haste dos pelos, forman- do nÛdulos de hifas hialinas septadas e ramificadas, facilmente destac·veis dos

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pelos, que podem se desarticular, resultando em artroconÌdios retangulares que se tornam esferÛides ou poliÈdricos.

Leveduras do gÍnero Malassezia s„o os agentes da pitirÌase versicolor. Esses fungos vivem normalmente sobre a pele do homem, na forma de levedura. Usualmente podem filamentar e invadir as cÈlulas queratinizadas das camadas superficiais da pele, determinando a micose. A doenÁa se manifesta como manchas descamativas distribuÌdas pelo tÛrax, abdome e membros superiores. Ao contr·rio do que muitos pensam, a micose n„o È adquirida na praia; o que ocorre È que quando o doente se bronzeia, os locais da pele onde o fungo est· em parasitismo n„o se queimam, permitindo que as lesıes possam ser visualizadas com maior facilidade. O diagnÛstico definitivo se d· somente pelo exame direto atravÈs da observaÁ„o de hifas curtas e curvas e elementos redon- dos. A Malassezia n„o cresce nos meios de cultura habituais usados na rotina porque necessita de suplemento lipÌdico para seu crescimento.

As MICOSES CUT¬NEAS se caracterizam por serem causadas por fungos que invadem toda a espessura da capa cÛrnea da pele ou a parte queratinizada intrafolicular dos pelos ou a l‚mina ungueal. Na pele, as lesıes se manifestam como mancha inflamatÛria, nos pelos como les„o de tonsura e na unha por destruiÁ„o da l‚mina ungueal. O cont·gio È feito atravÈs de animais, homens ou de solo infectado.

As dermatofitoses constituem manifestaÁıes clÌnicas muito variadas cau- sadas por um grupo de fungos, denominados dermatÛfitos, que produzem lesıes na pele, pelos ou unhas. Os fungos dermatÛfitos degradam queratina e

pertencem aos gÍneros Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton. H·

reconhecidamente 27 espÈcies patogÍnicas para o homem, dentre as quais 15 ocorrem no Brasil. Destas, as principais s„o: Trichophyton rubrum,

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Epidermophyton floccosum, T. mentagrophytes, Microsporum canis, M. gypseum e T. tonsurans.

As dermatofitoses podem ser classificadas nas seguintes modalidades clÌnicas: dermatofitose ou tinha do couro cabeludo, da pele glabra, da barba e da face, dos pÈs, das unhas e inguinal, dependendo da localizaÁ„o da les„o no paciente. J· nos cabelos, pela relaÁ„o com os fungos, podem ser diferenciados dois tipos de parasitismo: endotrix, onde os artroconÌdios se localizam somente no interior do pelo, esse causado, por exemplo, por T. tonsurans; e ectotrix, onde os artroconÌdios se dispıem no interior e ao redor do fio de cabelo. Podemos citar M. canis e T. mentagrophytes como agentes deste tipo de parasitismo pilar.

Em cultivo, os dermatÛfitos, em sua maioria, produzem dois tipos de conÌdios: macroconÌdios e microconÌdios que, juntamente com a caracterÌs- tica macroscÛpica da colÙnia, v„o permitir a identificaÁ„o das diferentes espÈcies dos dermatÛfitos. Os macroconÌdios s„o caracterÌsticos dos se- guintes gÍneros:

Microsporum ñ S„o fusiformes, grandes, multisseptados de pare- des rugosas.

Epidermophyton ñ S„o clavados, robustos bi ou trisseptados com paredes lisas e espessas.

Trichophyton ñ Quando existentes s„o delicados, clavados, multisseptados de paredes finas e lisas.

O quadro a seguir mostra as caracterÌsticas macro e micromorfolÛgicas que s„o observadas nas colÙnias dos principais fungos respons·veis por dermatofitoses.

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Fungo dermatÛfito

Macromorfologia

Micromorfologia

Trichophyton rubrum

ColÙnia branca, granular ou cotonosa, com pigmento vermelho no verso

MicroconÌdios em gota de l·grima dispostos ao longo da hifa e macroconÌdios, que quando existem, s„o comuns do gÍnero

T. mentagrophytes

ColÙnia branca, granular ou cotonosa, com pigmento que vai do amarelo ao marron no verso

MacroconÌdios do gÍnero, microconÌdios redondos numerosos

T. tonsurans

ColÙnia acastanhada com pigmento vermelho- ferruginoso no verso

MicroconÌdios numerosos e polimÛrficos, usualmente clavados ou alongados

Microsporum canis

ColÙnia branca, penugenta com pigmento amarelo alaranjado no verso

MacroconÌdios fusiformes, multisseptados de paredes rugosas e mais espessas que a dos septos, poucos microconÌdios

M. gypseum

ColÙnia pulverulenta de cor camurÁa, com pigmento pardo no verso

Numerosos macroconÌdios fusiformes, multissepados, de paredes rugosas e finais poucos microconÌdios

Epidermophyton flocosum

ColÙnia membranosa de cor verde-lim„o

MacroconÌdios em grupos de trÍs ou mais na extremi- dade de conidiÛforos, microconÌdios inexistentes

A candidÌase È micose causada por leveduras do gÍnero Candida, em especial pela espÈcie C. albicans. Elas s„o hÛspedes normais do trato gastrintestinal do homem e fazem parte da microbiota de determinadas regiıes do tegumento cut‚neo. PorÈm a Candida pode invadir a camada cÛrnea da pele ou a l‚mina ungueal de hospedeiros normais. As lesıes tÍm localizaÁ„o

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peculiar: nas unhas das m„os e nas ·reas intertriginosas da pele (regi„o inguinal, espaÁos interdigitais das m„os, regi„o submam·ria e axilar). TambÈm È possÌvel ocorrerem lesıes nas unhas dos pÈs.

H· ainda outras micoses de pele e de unha que n„o s„o causadas nem por fungos dermatÛfitos nem por fungos do gÍnero Candida. Dentre esses

fungos destacam-se: Fusarium sp., Scytalidium dimidiatum, e S. hyalinum

que podem causar lesıes principalmente em unhas e em espaÁos interdigitais dos pÈs. Em cultivo, S. dimidiatum se apresenta como colÙnia cotonosa, branca no inÌcio tornando-se cinza a negra em dez dias. Microscopicamente, se compıe de hifas dem·ceas e hialinas, com artroconÌdios septados e n„o septados. S. hyalinum È considerado um mutante de S. dimidiatum incapaz de sintetizar melanina e, com isso, as hifas e os conÌdios s„o sempre hialinos. As culturas de Fusarium sp. podem ser as mais variadas possÌveis, quanto ‡ macroscopia. Esta depender· da espÈcie que causa a les„o. PorÈm, micros- copicamente, o que caracteriza Fusarium sp. È a presenÁa de macroconÌdios em forma de lua, bi ou trisseptados.

3.1.2 . Micoses subcut‚neas

As MICOSES SUBCUT¬NEAS se caracterizam por resultar da inoculaÁ„o de um fungo patogÍnico por oca- si„o de um traumatismo, manifestando-se como tumefaÁ„o ou les„o supurada da pele ou do tecido subcut‚neo, produto da disseminaÁ„o do fungo por contiguidade ou por via linf·tica, porÈm limitada ao territÛrio aquÈm do linfonodo regional.

A esporotricose tem como agente Sporothrix schenckii. Esse È um fungo dimÛrfico, logo, muda entre as formas miceliana e leveduriforme, de acordo com a temperatura e as condiÁıes do ambiente onde se encontra. Assim sendo, S. schenckii, em parasitismo nos tecidos apresenta-se como

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elementos leveduriformes bem pequenos, com brotamento geralmente em forma de charuto. Na natureza, em associaÁ„o a vegetais e madeira, vive na

forma filamentosa. A transmiss„o cl·ssica da esporotricose se d· por traumatismo causado por vegetais onde o fungo se encontra ou pela forma zoofÌlica, ou seja, atravÈs de lesıes provocadas por animais infectados por S. schenckii, em especial gatos, como vÍm ocorrendo no estado do Rio de Janeiro, que

È uma ·rea endÍmica de esporotricose. A les„o inicial da esporotricose È

uma p·pula ou nÛdulo que surge no ponto da inoculaÁ„o, usualmente loca- lizado nos membros. Desse local o fungo pode propagar-se por contiguidade,

determinando uma les„o circunscrita ou por via linf·tica, ocasionando o apa- recimento de nÛdulos em n˙mero vari·vel sobre o trajeto de um linf·tico superficial. O diagnÛstico definitivo se d· com o isolamento em cultivo do fungo em amostras de pus ou biÛpsia das lesıes. Testes de detecÁ„o de IgG

e IgM em amostras de soro podem auxiliar no diagnÛstico e no acompanha- mento terapÍutico desta infecÁ„o.

A cromoblastomicose È uma infecÁ„o que se caracteriza pelo aspecto parasit·rio de seus agentes: o corpo muriforme. Esses s„o elementos globosos, com parede acastanhada espessa e septados em planos distintos. Podem ser visualizados tambÈm elementos n„o septados e outros com apenas um septo, porÈm o que caracteriza o corpo muriforme È a presenÁa de septos em planos diferentes. As principais espÈcies que podem causar cromoblastomicose no ser

humano s„o Fonsecaea pedrosoi, F. compacta, Cladophialophora carrionii, Phialophora verrucosa, e Rhinocladiella aquaspersa. No Brasil, normalmente,

os casos dessa micose s„o causados por F. pedrosoi, apÛs traumatismo com matÈria org‚nica vegetal.

Micetoma È o nome coletivo de micoses produzidas por algumas espÈ- cies de fungos ou de actinomicetos aerÛbios, os quais, nos tecidos, se organi- zam em um agregado de hifas ou filamentos bacterianos, denominados gr„os. Os agentes de micetoma possuem habitat na natureza associado a vegetais,

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nutrindo-se de outros vegetais em decomposiÁ„o ou como fitopatÛgenos. O micetoma eumicÛtico se distingue do actinomicÛtico por ser: causado por um fungo, enquanto o actinomicÛtico È causado por bactÈrias filamentosas. Os gr„os, de tamanho e forma variados, podem ter coloraÁ„o branco-amare- lado, vermelha ou negra. O que caracteriza a cor de um gr„o È somente o fungo ou actinomiceto agente da doenÁa. Por isso, a cor do gr„o obtido das lesıes do paciente j· fornece um indicativo de qual seja o agente do micetoma. O quadro a seguir o relata alguns desses agentes, com o respectivo tipo e coloraÁ„o dos gr„os:

Fungos causadores de micetoma

Fungos causadores de micetoma

Gr„o eumicÛtico negro

Madurella mycetomatis

M. grisea

Pyrenochaeta romeroi Exophiala jeanselmei

Gr„o eumicÛtico branco

Acremonium sp.

Pseudallescheria boydii (Scedosporium apiospermum)

Neotestudina rosatii Aspergillus nidulans (Emerciella nidulans)

Actinomicetos causadores de micetoma

Actinomicetos causadores de micetoma

Gr„o actinomicÛtico vermelho

Actinomadura pelletieri

Gr„o actinomicÛtico branco

Actinomadura madurae Nocardia brasiliensis N. asteroides, N. caviae Streptomyces somaliensis

H· outras micoses subcut‚neas de interesse, como a lobomicose e a entomoftoramicose. No entanto, a esporotricose, cromoblastomicose e micetomas s„o as mais comuns no Brasil.

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3.1.3. Micoses sistÍmicas e oportunÌsticas

As MICOSES SIST MICAS se caracterizam por serem adquiridas por inalaÁ„o de prop·gulos f˙ngicos, sendo, consequentemente a les„o prim·ria pulmonar, com ten- dÍncia ‡ regress„o espont‚nea. O fungo pode se disse- minar pelo corpo atravÈs do sangue, originando lesıes extrapulmonares nos indivÌduos. Os agentes de micoses sistÍmicas raramente s„o implantados traumaticamente; quan- do isso ocorre, determinam uma les„o granulomatosa cir- cunscrita, com ou sem linfangite regional, que regride espontaneamente.

Ao invadir os tecidos, os fungos desencadeiam resposta imunolÛgica no hospedeiro, que pode ser evidenciada por reaÁ„o intradÈrmica, na qual se verifica a resposta celular dada pelo hospedeiro, por reaÁıes de hipersensibilidade tardia e por provas de detecÁ„o de anticorpos em amostras de soro (imunodifus„o dupla e fixaÁ„o do complemento), onde È avaliada a resposta humoral. Uma reaÁ„o intradÈrmica positiva evidencia que o indivÌduo j· foi previamente sensibilizado pelo fungo e as provas sorolÛgicas indicam que h· anticorpos contra o fungo. PorÈm, as provas sorolÛgicas podem fornecer resultados falso-positivo e falso-negativo, visto que podem ocorrer reaÁıes cruzadas com outros anticorpos na prova aplicada. As provas sorolÛgicas auxi- liam no diagnÛstico de micoses sistÍmicas, mas o que realmente diagnostica a doenÁa È o isolamento do fungo em cultivo ou sua observaÁ„o no exame micolÛgico direto dos materiais adequados para o exame, tendo as provas imunolÛgicas valor diagnÛstico presuntivo. As provas imunolÛgicas s„o ˙teis para avaliaÁıes epidemiolÛgicas, para avaliaÁ„o prognÛstica e para a triagem de pacientes. As reaÁıes intradÈrmicas apresentam valor diagnÛstico baixo, uma vez que n„o discriminam entre infecÁıes passadas ou recentes. PorÈm s„o de grande valor nos estudos epidemiolÛgicos.

416 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

As micoses sistÍmicas s„o a coccidioidomicose, a blastomicose, a histoplasmose, e a paracoccidioidomicose. As duas primeiras n„o s„o co- muns no Brasil, embora sejam relatados casos de coccidioidomicose no semi- ·rido do Nordeste, em especial no PiauÌ em caÁadores de tatus, que revolve- ram o solo para desentocar a caÁa. H· tambÈm a esporotricose sistÍmica, que È resultado da inalaÁ„o de conÌdios de S. schenckii os quais v„o causar infecÁ„o pulmonar que pode sistematizar-se. Este tipo de apresentaÁ„o clÌni- ca da esporotricose È bastante raro. O aspecto macro e micromorfolÛgico do fungo È o mesmo do agente da esporotricose subcut‚nea.

A histoplasmose È uma infecÁ„o sistÍmica, causada por Histoplasma

capsulatum var. capsulatum ou H. capsulatum var. duboisii. Enquanto o primei-

ro agente tem distribuiÁ„o cosmopolita, o outro tem sua distribuiÁ„o geogr·fica restrita ao continente africano. O cultivo de H. capsulatum ‡ temperatura ambiente È constituÌdo de colÙnia branca que, quando muito velha, assume coloraÁ„o camurÁa. O crescimento do fungo È bem lento. Microscopicamente se observam hifas finas e delicadas e conÌdios de dois tipos. Os macroconÌdios esfÈricos e tuberculados s„o estruturas marcantes para a identificaÁ„o do fungo. PorÈm, a presenÁa de microconÌdios esfÈricos È necess·ria para a correta iden- tificaÁ„o do agente, pois h· alguns fungos saprÛfitas, pertencentes ao gÍnero Chrysosporium, que tambÈm produzem estruturas de propagaÁ„o semelhan- tes. Deve-se, para a correta identificaÁ„o do agente da histoplasmose, realizar a convers„o desse fungo para a fase leveduriforme em meios enriquecidos com incubaÁ„o a 37 C. Todavia, a convers„o de H. capsulatum n„o È facilmente obtida e depende tambÈm das caracterÌsticas fisiolÛgicas de cada isolado. Quando convertidos ‡ fase leveduriforme observam-se colÙnias glabras, lisas, branco-amarelada, e na microscopia notam-se leveduras ovais e unibrotantes.

A paracoccidioidomicose È uma micose sistÍmica causada por

Paracoccidioides brasiliensis, caracterizada pela forma parasit·ria do seu agente:

cÈlula leveduriforme mutibrotante com parede celular birrefringente. … a micose

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sistÍmica mais frequente na AmÈrica Latina. Afeta usualmente agricultores, que mantÍm contato direto com a natureza, em principal com o solo. A micose È endÍmica no Brasil. As manifestaÁıes clÌnicas da paracoccidioidomicose resul- tam da inalaÁ„o de elementos infectantes do fungo ou de uma reativaÁ„o de les„o prim·ria quiescente, ou seja, de uma les„o adquirida h· algum tempo, muitas vezes mais de trinta anos, e que n„o tinha ainda se desenvolvido. O fungo, alÈm de acometer o pulm„o, dissemina-se para outras partes do corpo, atingindo principalmente as mucosas do indivÌduo, sua pele e linfonodos. O aspecto macroscÛpico da cultura de leveduras desse fungo tem coloraÁ„o creme-clara, consistÍncia cremosa e È conseguido em meios especiais, como o meio de Fava-Neto, com incubaÁ„o a 37 C. O cultivo a 25 C d· origem a colÙnias de crescimento muito lento, filamentosas, algodoadas ou aveludadas, compostos de uma trama de hifas sem conÌdios.

As MICOSES OPORTUNÕSTICAS s„o causadas por fungos termotolerantes (que crescem a uma temperatura de 37 C), de baixa virulÍncia e que determinam doenÁas em hospedeiros com graves deficiÍncias do sistema imunodefensivo. Esses fungos tÍm porta de entrada vari·- vel, usualmente provocam reaÁ„o supurativa necrÛtica. Po- dem acometer os mais variados Ûrg„os, produzindo qua- dros polimÛrficos que se apresentam como manifestaÁ„o cut‚nea, subcut‚nea ou sistÍmica. Os fungos invadem os tecidos como uma hifa.

A criptococose È causada por leveduras do gÍnero Cryptococcus, das quais destacam-se duas espÈcies: C.†neoformans, que acomete principalmen- te indivÌduos imunodeprimidos e C. gattii, que pode acometer indivÌduos imunocompetentes. A micose È de frequÍncia elevada nas grandes cidades, onde s„o diagnosticadas suas formas clÌnicas mais graves. As formas subclÌnicas ou as que se manifestam como infecÁ„o respiratÛria inespecÌfica devem ser

418 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

bastante frequentes. A doenÁa È endÍmica no Norte e no Nordeste do paÌs, acometendo crianÁas, jovens e adultos, de ambos os sexos e todas as faixas et·rias, com ou sem depress„o do sistema imunolÛgico. O fungo apresenta tropismo pelo sistema nervoso central e o lÌquor do paciente pode simular meningite viral, bacteriana e tambÈm tuberculose. As leveduras do gÍnero Cryptococcus possuem uma caracterÌstica especial, que È a presenÁa de uma c·psula polissacarÌdica que envolve todo o fungo. Essa c·psula pode ser evi- denciada em exames laboratoriais por contraste com tinta nanquim ou com a coloraÁ„o pelo Mucicarmin de Mayer. C. neoformans e C. gattii s„o capazes de produzir a enzima extracelelular fenol oxidase, que È extremamente ˙til para a identificaÁ„o do agente da criptococose, pois esta enzima faz com que a levedura se torne melanizada quando colocada em cultivo com compostos fenÛlicos. Esta enzima e a c·psula polissacarÌdica est„o relacionadas com a virulÍncia desse fungo ao organismo.

A aspergilose È causada por membros do gÍnero Aspergillus que se apresentam nos tecidos como hifas hialinas septadas e ramificadas dicotomicamente, ou seja, num ‚ngulo de 45 . A micose se manifesta em trÍs formas clÌnicas: a alÈrgica, de colonizaÁ„o e a forma invasiva. Poucos grupos de Aspergillus causam infecÁ„o no homem. EspÈcies de Aspergillus dos grupos fumigatus, niger e flavus s„o os patÛgenos mais comuns, porÈm tambÈm podem causar infecÁ„o fungos dos grupos nidulans, terreus, ustus e restrictus. O aspecto microscÛpico do conidiÛforo permite a distinÁ„o entre as diferentes espÈcies.

A candidÌase oportunista tem incidÍncia mundial e resulta da invas„o por espÈcies de Candida dos tecidos de hospedeiros com endocrinopatias, nos que recebem terapÍuticas imunodepressivas, nutriÁ„o parenteral e adminis- traÁ„o prolongada de antibiÛticos ou esteroides, e ainda em pacientes com complicaÁıes apÛs grandes cirurgias. Nos tecidos, as espÈcies de Candida se apresentam como hifas de aspecto peculiar, com exceÁ„o de C. glabrata (nun-

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ca filamenta, sempre se apresenta na forma de levedura). O agente mais comum È C. albicans, espÈcie que faz parte da microbiota do tubo digestivo do homem. Vive tambÈm em menor n˙mero na ·rvore brÙnquica e na cavidade vaginal. Os microrganismos respons·veis pela candidÌase s„o classificados em sua forma anamÛrfica, usando provas fisiolÛgicas de assimilaÁ„o e fermentaÁ„o de aÁ˙cares. ¿ medida que vÍm sendo descobertas as formas teleomÛrficas das espÈcies de Candida, as caracterÌsticas dos esporos demonstram que elas pertencem a v·rios gÍneros distintos.

3.2. Agentes antif˙ngicos

O n˙mero de f·rmacos disponÌveis para o tratamento de infecÁıes f˙ngicas sistÍmicas È limitado. Nos ˙ltimos anos, a anfotericina B e os azÛis ñ principal- mente cetoconazol, fluconazol e itraconazol ñ tÍm sido os f·rmacos de primeira escolha na terapia. Estas duas classes de medicamentos tÍm como alvo a membra- na celular dos fungos. Os polienos ligam-se a uma porÁ„o esterol, basicamente ergosterol, presente na membrana de fungos sensÌveis, formando poros ou ca- nais. O resultado È um aumento na permeabilidade da membrana que permite o extravasamento de diversas molÈculas pequenas, levando ‡ morte celular. A anfotericina B È um antibiÛtico fungicida de largo espectro e potente, mas seu uso È associado a efeitos adversos significantes, como nefrotoxicidade e febre com calafrios, como reaÁ„o aguda ‡ infus„o intravenosa, j· que a farmacocinÈtica deste f·rmaco n„o permite a administraÁ„o oral.

Os azÛis s„o compostos totalmente sintÈticos. O mecanismo de aÁ„o destes f·rmacos baseia-se na inibiÁ„o da esterol-14-a-desmetilase, um sistema enzim·tico microssomal dependente do citocromo P450, que prejudica a sÌntese do ergosterol na membrana citoplasm·tica e leva ao ac˙mulo de 14-a- metilesterÛis. Esses metil-esterÛis n„o possuem a mesma forma e propriedades fÌsicas que o ergosterol e levam ‡ formaÁ„o da membrana com propriedades alteradas, que n„o desempenha as funÁıes b·sicas necess·rias ao desenvolvi-

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mento do fungo. Os azÛis causam menos reaÁıes adversas que a anfotericina B, mas s„o menos potentes que ela. Podem ter aÁ„o fungist·tica ou fungicida. O uso excessivo dos azÛis levou ao aparecimento de resistÍncia em espÈcies suscetÌveis.

Um outro agente antif˙ngico sistÍmico utilizado È o prÛ-f·rmaco flucitosina. Todos os fungos sensÌveis s„o capazes de desaminar a flucitosina em 5- fluorouracila, um potente antimetabÛlito; como resultado final, a sÌntese de ·cido desoxirribonucleico dos fungos fica prejudicada. Embora as cÈlulas dos mamÌferos n„o convertam a flucitosina em fluorouracila, o que È crucial para aÁ„o seletiva do composto, alguns microrganismos da flora intestinal o fazem, causando certa toxicidade aos humanos.

A atividade antimicrobiana de um composto pode ser quantificada

com base na determinaÁ„o da concentraÁ„o mÌnima capaz de inibir o cresci- mento de um dado microrganismo, um valor chamado CIM (ConcentraÁ„o InibitÛria MÌnima), ou MIC (ìMinimum Inhibitory Concentrationî) em inglÍs. Este valor pode ser determinado atravÈs do mÈtodo das diluiÁıes sucessivas ou do mÈtodo da difus„o em ·gar, ou ainda atravÈs do uso de tiras contendo um gradiente de concentraÁ„o de antibiÛtico, conhecido como E-teste.

Do ponto de vista microbiolÛgico e clÌnico, o conceito de sensibilidade e resistÍncia È aplicado para classificar o isolado como sensivel ou resistente. No aspecto microbiolÛgico, uma cepa È considerada resistente a um antif˙ngico quando a concentraÁ„o inibitÛria mÌnima È mais elevada que a habitual do antif˙ngico frente a essa espÈcie.

Podemos observar trÍs diferentes tipos de resistÍncia aos agentes antif˙ngicos:

IntrÌnseca: È dita quando nenhum membro de uma espÈcie È sensÌvel

ao antif˙ngico, ou seja, todos s„o insensÌveis.

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Prim·ria: ocorre quando dentro de uma espÈcie, normalmente sensÌvel

a determinado antif˙ngico, encontra-se uma cepa com resistÍncia natural

a ele, sem necessidade de contato prÈvio com a droga.

Secund·ria: ocorre quando uma cepa, previamente sensÌvel, desen- volve resistÍncia ‡ droga apÛs ter sido exposta a ela.

3.3. DiagnÛstico imunolÛgico das micoses pulmonares

As provas imunolÛgicas prestam valiosos auxÌlios no diagnÛstico de uma infecÁ„o f˙ngica. Os dados obtidos atravÈs de tais provas, devem ser criteriosamente interpretados e correlacionados com os achados micolÛgicos, evidÍncias clÌnicas e circunst‚ncias epidemiolÛgicas.

Para seguranÁa e facilidade na interpretaÁ„o dos resultados, soros con- troles positivos devem ser incluÌdos nas provas sorolÛgicas para detecÁ„o de anticorpos em soro. Essas provas devem ser realizadas com uma bateria de antÌgenos. No caso especÌfico das micoses pulmonares, essa bateria deve

incluir, no mÌnimo, antÌgenos de Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum, Aspergillus fumigatus e Coccidioides immitis.

Para melhor avaliaÁ„o prognÛstica, as provas devem ser executadas com amostras seriadas do soro colhido em diferentes perÌodos, possibilitando assim a elaboraÁ„o da curva sorolÛgica.

… importante salientar que as provas imunolÛgicas tÍm valor presuntivo no diagnÛstico das infecÁıes f˙ngicas, sendo o exame de cultivo o padr„o-ouro para diagnÛs- tico definitivo das micoses.

422 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

3.4. InterpretaÁ„o das provas imunolÛgicas

3.4.1. Paracoccidioidomicose

Pacientes portadores de paracoccidioidomicose ativa sem tratamento

apresentam positividade nas provas sorolÛgicas acima de 90%. Os tÌtulos da reaÁ„o de fixaÁ„o de complemento s„o mais elevados nas formas graves e agudas da doenÁa, sofrendo quedas ‡ medida que ocorre melhora clÌnica. A reaÁ„o n„o tem muito valor diagnÛstico quando tomada como dado isolado.

A correlaÁ„o com os dados clÌnicos, epidemiolÛgicos e resultados fornecidos

por outras tÈcnicas faz com que a import‚ncia diagnÛstica aumente.

Na imunodifus„o dupla de Ouchterlony pode ocorrer a formaÁ„o de

v·rias bandas de precipitaÁ„o, sendo mais frequente a demonstraÁ„o de apenas uma delas. A reaÁ„o È dotada de alta especificidade. ReaÁıes cruzadas s„o mÌnimas e podem ocorrer principalmente com soros de pacientes portadores

de histoplasmose.

A contraimunoeletroforese È mais sensÌvel que a imunodifus„o dupla e permite que os resultados sejam conhecidos em tempo reduzido. Ao lado do

alto valor diagnÛstico, a reaÁ„o permite tambÈm acompanhar a evoluÁ„o sorolÛgica

do paciente, atravÈs da titulaÁ„o seriada de amostras do soro. O sorodiagnÛstico

especÌfico da paracoccidioidomicose pode ser obtido por intermÈdio da imunoeletroforese, atravÈs da demonstraÁ„o do arco de precipitaÁ„o corres- pondente ao antÌgeno E 2 ou gp43. O arco de precipitaÁ„o correspondente forma-se na regi„o catÛdica da l‚mina.

3.4.2. Histoplasmose

Anticorpos fixadores do complemento podem ser demonstrados na maioria dos pacientes, j· a partir da quarta semana apÛs a infecÁ„o. Preconiza-

se a utilizaÁ„o dos antÌgenos obtidos da fase leveduriforme do Histoplasma

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capsulatum bem como do antÌgeno obtido da sua fase filamentosa para aplica- Á„o no teste, uma vez que o antÌgeno leveduriforme apresenta uma maior especificidade e o antÌgeno filamentoso maior sensibilidade. Os resultados inespecÌficos est„o geralmente relacionados aos tÌtulos de 1:8 e 1:32. Consequentemente tÌtulos inferiores a 1:8 s„o considerados normais, e entre 1:8 e 1:32 s„o considerados de valor presuntivo. TÌtulos de 1:32 ou mais elevados s„o altamente sugestivos de histoplasmose em atividade. ApÛs a cura clÌnica, os tÌtulos caem rapidamente e normalmente desapare- cem apÛs nove meses. ReaÁıes cruzadas podem ocorrer com soros de portadores de paracoccidioidomicose.

Na imunodifus„o dupla podem ser verificadas duas faixas de precipi- taÁ„o de import‚ncia diagnÛstica, denominadas bandas H e M. A faixa M forma-se prÛxima do orifÌcio que recebe o antÌgeno e pode ser demonstra- da com soros de pacientes com formas agudas ou crÙnicas de histoplasmose, ou em indivÌduos sensÌveis a histoplasmina e que se submeteram a recente teste intradÈrmico com o antÌgeno. A precipitina H È demonstrada no soro de pacientes com a doenÁa ativa ou atÈ dois anos apÛs recuperaÁ„o clÌnica, raramente ocorre na ausÍncia de M.

A contraimunoeletroforese tem praticamente o mesmo valor da imunodifus„o dupla, permitindo ainda a titulaÁ„o dos anticorpos anti- H.

capsulatum.

A detecÁ„o de antÌgeno de H. capsulatum em espÈcimes de urina, sangue e fluido cÈrebroespinhal oferece um mÈtodo r·pido para o diag- nÛstico, para o monitoramento de terapia, assim como para a identificaÁ„o de recaÌdas na histoplasmose disseminada. Resultados falso-positivos tÍm sido observados somente em pacientes com blastomicose, paracoccidioidomicose e infecÁ„o por Penicillium marneffei, e menos fre- quentemente em pacientes com coccidioidomicose.

424 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

3.4.3. Aspergilose

Nos aspergilomas, os tÌtulos de anticorpos especÌficos demonstrados pela reaÁ„o de fixaÁ„o de complemento est„o geralmente elevados. As bandas de precipitaÁ„o reveladas pela imunodifus„o dupla e contraimunoeletroforese s„o geralmente m˙ltiplas, podendo ser acima de dez. ApÛs a remoÁ„o cir˙rgi- ca do aspergiloma ou tratamento adequado, estes anticorpos deixam de ser detectados em pouco tempo.

Na aspergilose brÙnquica alÈrgica os tÌtulos de anticorpos especÌficos s„o baixos, e na asma aspergilar raramente s„o demonstrados. AtravÈs de provas cut‚neas com aspergilina, pode-se demonstrar reaÁıes de hipersensibilidade do tipo I e III na aspergilose brÙnquica alÈrgica, e do tipo I na asma aspergilar.

Nas formas invasivas da doenÁa raramente se demonstram anticorpos atravÈs das provas usuais, necessitando-se o emprego de provas mais sensÌveis tais como radioimunoensaios e imunoenzim·ticas.

Na imunodifus„o dupla e contraimunoeletroforese, podem ocorrer rea- Áıes inespecÌficas devido ‡ proteÌna C-reativa do soro do paciente. A elimina- Á„o de tal reaÁ„o inespecÌfica se faz atravÈs da lavagem da l‚mina, em soluÁ„o de citrato de sÛdio a 5% durante trinta minutos.

3.4.4. Criptococose

O imunodiagnÛstico da criptococose se baseia principalmente na de- monstraÁ„o de antÌgeno sol˙vel de C. neoformans, (GLUCORONOXILOMANANA) atravÈs da reaÁ„o de soro ou lÌquor com partÌculas de l·tex sensibilizadas com gamaglobulina de coelho anti- polissac·ride capsular. Inter ferÍncias, tais como fator reumatoide e efeito prozona podem ser encontradas neste teste, e s„o facilmente eliminadas com tratamento das amostras com pronase.

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Os reagentes para demonstraÁ„o de antÌgeno sol˙vel s„o encontrados no comÈrcio, de procedÍncia norte-americana, na forma de KIT.

Anticorpos podem ser demonstrados na fase inicial e final da criptococose. As provas mais utilizadas para tal propÛsito, s„o as reaÁıes de imunofluorescÍncia indireta e aglutinaÁ„o de suspens„o de cÈlulas de C. neoformans, porÈm apresentam baixo rendimento.

4.4.4.4.4. MeiosMeiosMeiosMeiosMeios dedededede culturaculturaculturaculturacultura eeeee corantescorantescorantescorantescorantes

4.1. Meios de cultura

Os meios de cultura s„o preparaÁıes que contÍm as fontes nutricionais necess·rias para o crescimento e multiplicaÁ„o dos organismos.

O cultivo de microrganismos pode ter diferentes propÛsitos, mas em todos eles o meio de cultura deve suprir as necessidades mÌnimas para que in vitro se consiga um ambiente semelhante ao que se encontrava o organismo na natureza.

Levando em consideraÁ„o que os nutrientes s„o unidades estruturais e fontes de energia para a construÁ„o e manutenÁ„o da estrutura e organizaÁ„o dos microrganismos, o meio de cultura deve contÍ-los para que viabilize o seu crescimento.

S„o esses os principais constituintes do meio de cultura:

£gua: sempre deve ser usada ·gua destilada para o preparo de meios de cultura. A ·gua da torneira È de constituiÁ„o desconhecida, variando especialmente em Ìons e em pH.

Fonte de carbono: È necess·ria para a sÌntese de numerosos compos- tos org‚nicos que fazem parte do protoplasma. A glicose È a principal fonte de carbono utilizada pelos microrganismos.

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Fonte de nitrogÍnio: muitos componentes da cÈlula, principalmente as proteÌnas, contÍm nitrogÍnio.

Minerais: enxofre e fÛsforo.

Elementos de traÁo: s„o os minerais que s„o exigidos em quantidades mÌnimas. Exemplos: pot·ssio, magnÈsio, etc.

Fatores de crescimento: um fator de crescimento È um componente org‚nico que a cÈlula deve conter para crescer, mas È incapaz de sinte- tizar. Exemplos: amino·cidos, purinas, etc.

ObservaÁ„o: Para o preparo do meio de cultura, as drogas usadas devem ser de maior pureza. O pH, a temperatura e a aeraÁ„o devem ser cuidadosamente controlados. Sempre se deve observar o prazo de validade do produto.

Os meios de cultura podem ser classificados da seguinte forma:

Quanto ao estado fÌsico

SÛlido: contÈm ·gar (agente solidificante) na concentraÁ„o de 1,5g a 3,0g por litro.

SemissÛlido: 0,1g a 1,1g de ·gar.

LÌquidos (caldos): ausÍncia de ·gar.

Agentes solidificantes:

Gelatina: pode ser hidrolizada. … mais utilizada hoje em provas bioquÌmicas.

£gar: È uma subst‚ncia hidrocarbonada extraÌda de v·rias espÈcies de algas vermelhas, e È imune ao desdobramento pela maioria dos microrganismos.

SÌlica gel: usada quando se deseja cultivar microrganismos autotrÛficos.

Quanto ‡ composiÁ„o quÌmica

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Naturais ou Complexos: formados por subst‚ncias de composiÁ„o quÌmica n„o definida.

SintÈticos: quando a composiÁ„o quÌmica È conhecida e seus com- ponentes servem para suprir as fontes necess·rias de carbono, nitro- gÍnio, vitaminas, etc.

Quanto ao emprego

Meios de enriquecimento: s„o meios enriquecidos com determina- dos nutrientes que favorecer„o o desenvolvimento de determinado microrganismo, entre v·rios outros.

Meio de manutenÁ„o: garante a viabilidade do microrganismo, por longos perÌodos, de modo a torn·-los disponÌveis em qualquer ex- perimentaÁ„o.

Meio diferencial: permite ao microrganismo produzir estruturas ou reaÁıes que podem ser usadas na sua diferenciaÁ„o entre gÍneros ou espÈcies.

Meio seletivo: permite o crescimento de um determinado grupo ou gÍnero de microrganismo, em detrimento de outros.

Os meios de cultura devem ser preparados e esterilizados cuidadosa- mente, de acordo com o protocolo a seguir:

a) Pesagem dos ingredientes

Se o meio È preparado a partir de seus ingredientes b·sicos, suas massas corretas para o volume desejado devem ser pesadas isoladamente.

428 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

Para meios desidratados, pesar a massa correspondente ao volume desejado.

b) DissoluÁ„o dos ingredientes

Nunca usar recipientes de cobre ou zinco para dissoluÁ„o dos ingredientes do meio de cultura, usar preferencialmente o bal„o de vidro, quimicamente limpo.

Adicionar ao recipiente contendo os ingredientes uma quantidade de ·gua destilada, aproximadamente a metade do volume desejado, agitando constantemente com bast„o de vidro, e evitando a forma- Á„o de bolhas; aquecer brandamente.

Usar ·gua destilada ‡ temperatura ambiente, no preparo de meios lÌquidos.

Completar o volume do meio com a ·gua apÛs a formaÁ„o de suspens„o homogÍnea. Isso È essencial, principalmente em meios contendo agentes solidificantes.

O aquecimento para uma efetiva dissoluÁ„o dos ingredientes e esterilizaÁ„o do meio deve ser feito no menor tempo possÌvel. Os meios que contÍm ·gar devem ser aquecidos atÈ o seu ponto de ebuliÁ„o para uma completa dissoluÁ„o.

Resfriar os meios contendo ·gar ‡ temperatura aproximada de 50 C, reajustar o volume de ·gua destilada aquecida de 45 a 50 C, se houver perda significativa de ·gua durante o aquecimento.

c) DeterminaÁ„o e ajuste de pH

Determinar o pH de meios formulados antes de adicionar o ·gar.

Quando se tratar de meios formulados, se deve aferir 0,2 unida- des de pH acima do desejado, haja visto que o pH abaixa aproxima-

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damente este valor apÛs a autoclavaÁ„o. Nos meios desidratados, n„o È necess·rio o ajuste do pH, pois os meios j· vÍm tamponados.

Determinar o pH atravÈs de um potenciÙmetro ou por papel indi- cador de pH.

Ajustar o pH com soluÁ„o de ·cido clorÌdrico (HCl) 0,1N ou soluÁ„o de hidrÛxido de sÛdio (NaOH) 0,1N.

d) DistribuiÁ„o dos meios

Distribuir os meios em recipientes, quimicamente limpos e no caso de meios que n„o suportem nova autoclavaÁ„o, usar recipientes estÈreis.

Ao distribuir em frascos de Erlenmeyers ou balıes de fundo chato, evitar ultrapassar 50% do volume total do frasco.

A distribuiÁ„o em placas deve ser de aproximadamente 15mL; 6ml em tubos para meio inclinado, 5ml para camada alta e 6ml para caldos em geral.

A distribuiÁ„o nos tubos deve ser feita com pipetas;

Codificar os meios conforme padr„o ou convenÁ„o do laboratÛrio;

e) EsterilizaÁ„o dos meios

Com algumas exceÁıes, esterilizar os meios em autoclave a 121 C durante 15 minutos.

f) Preparo de ·gar inclinado em tubos

Ao retirar os tubos contendo meio sÛlido da autoclave, inclin·-los apoiando-os num suporte de madeira, permanecendo os mesmos com aproximadamente 1cm de meio na base. Deixar solidificar ‡ temperatura ambiente.

430 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

g) Plaqueamento de meio de cultivo

Fundir o meio sÛlido em banho-maria, resfri·-lo em banho dí·gua, de modo a evitar ou diminuir a umidade que se condensa na tampa da placa de Petri, quando o ·gar se solidifica.

Flambar a boca do recipiente que contÈm o meio, antes de distribuÌ-lo na placa.

PrÛximo ‡ chama do bico de Bunsen, verter o meio, levantando parte da tampa da placa de Petri estÈril, o suficiente para permitir a introduÁ„o da boca do tubo ou outro recipiente que contÈm o meio, sem tocar as bordas da placa. Pode-se usar uma pipeta para a distribuiÁ„o.

Fechar a placa, moviment·-la levemente sobre a bancada para permitir uma distribuiÁ„o uniforme, e deixar solidificar ‡ temperatu- ra ambiente.

h) Armazenamento e conservaÁ„o dos meios de cultura:

Para perÌodos de tempo prolongados, recomenda-se guardar os tubos e frascos de Erlenmeyers contendo meio em temperatura de 12 a 15 C. Os meios contendo ·gar n„o devem ser guardados abaixo de 0 C para n„o alterar seu gel.

Geralmente È possÌvel sua conservaÁ„o durante um ou dois meses ‡ temperatura ambiente em locais secos, limpos e abrigados da luz;

Identificar todos os tubos, placas ou frascos que contenham meios de cultura.

Para que n„o haja perda de ·gua do meio para o ambiente, os recipientes devem ser bem vedados. No caso de placas de Petri, seus bordos poder„o ser lacrados com parafilme.

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Lista de meios de cultura mais utilizados em laboratÛrio de Micologia

£gar extrato de arroz (Rice extract agar)

Meio desidratado

15g

£gar

30g

£gua destilada

1000mL

Suspender o pÛ na ·gua e deixar embeber o ·gar durante trinta minutos, fundir, distribuir e esterilizar em autoclave por quinze minutos a 121 C.

£gar Sabouraud glicosado (Sabouraud glycose agar)

Dextrose

30g

Peptona

10g

£gar

30g

£gua destilada

1000mL

Misturar todos os elementos em bal„o, deixar embeber o ·gar por trinta minutos, levar ‡ autoclave e aquecer lentamente ‡ 120 C. Agitar e ajustar o pH para 6,5. Esterilizar por quinze minu- tos a 121 C.

Batata dextrose ·gar (Potato dextrose agar ñ BDA)

Meio desidratado

39g

£gar

5g

£gua destilada

1000mL

Suspender em ·gua e deixar embeber o ·gar por quinze minutos. Aquecer atÈ a dissoluÁ„o completa. Esterilizar em autoclave por quinze minutos a 121 C.

432 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

Mycosel (Mycobiotic) agar

Farinha de soja digerida

10 g

Dextrose

10 g

Cicloheximida

0,4 g

Cloranfenicol

0,05 g

Agar

15 g

£gua destilada

1000 mL

Misturar os reagentes. Esquentar agitando frequentemente atÈ dissolver todos os ingredientes. Autoclavar a 118 C por quinze minutos. N„o aquecer de forma excessiva. Para o meio desidrata- do seguir o mesmo procedimento sem adiÁ„o do ·gar.

Czapeck dox ·gar (CZ)

Sacarose

30 g

Nitrato de sÛdio

3 g

Fosfato di-pot·ssico

1 g

Sulfato de magnÈsio

0,5 g

Cloreto de pot·ssio

0,5 g

Sulfato ferroso

0,01g

£gar

30 g

£gua destilada

1000mL

Misturar e dissolver os reagentes. Juntar o ·gar e deixar embe- ber durante trinta minutos. Ajustar o pH para 7,3 antes de esterilizar. Fundir o ·gar e esterilizar em autoclave por quinze minutos a 121 C. Para o meio desidratado, seguir o mesmo procedimento sem adiÁ„o do ·gar.

£gar infus„o de cÈrebro e coraÁ„o (Brain Heart Infusion agar ñ BHI)

Infus„o de 200g de cÈrebro de bezerro

7,7 g

Infus„o de 250g de coraÁ„o de vaca

9,8 g

Proteose Peptona

10 g

Micologia

| 433

Dextrose

2 g

Cloreto de sÛdio

5 g

Fosfato dissÛdico

2,5 g

£gar

20 g

Misturar e dissolver os reagentes. Juntar o ·gar e deixar embe- ber durante trinta minutos. Ajustar o pH para 7,4 antes de esterilizar. Fundir o ·gar e esterilizar em autoclave por quinze minutos a 121 C. Para o meio desidratado seguir o mesmo procedimento sem adiÁ„o do ·gar.

£gar dextrose farinha de milho (Corn meal agar ñ CMA)

Farinha de milho

40 g

Dextrose

20 g

£gar

20 g

£gua destilada

1000 mL

Colocar a farinha em Becker com ·gua e aquecer em banho-maria a 60 C por uma hora. Em seguida, filtrar em gaze dobrada duas vezes. Restabelecer o volume inicial com ·gua destilada. Transferir para bal„o que j· contenha o ·gar e a dextrose pesados. Esterili- zar em autoclave a 121 C por vinte minutos. Para o meio desidratado usar o mesmo procedimento usado no BDA, porÈm esterilizar a 121 C por vinte minutos. OBS: Quando este meio È utilizado para Mucoracea, trocar a dextrose por glicose.

Extrato de malte ·gar (Malt extract agar ñ MEA)

Extrato de malte

30 g

£gar

30 g

£gua destilada

1000 mL

Usar o mesmo procedimento do meio BDA, e ajustar o pH para

7,0.

434 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

Sabouraud

Glicose

30 g

Peptona

10 g

£gar

20 g

£gua destilada

1000 mL

Usar o mesmo procedimento do meio Sabouraud glicosado.

Meio seletivo para fungos entomopatogÍnicos

Farinha de aveia

10 g

£gar

10 g

Sulfato de estreptomicina

0,50 g

Dodine

0,45 g

Penicilina G

0,20 g

Cristal violeta

2,5 mg

£gua destilada

500 mL

* SoluÁ„o estoque de cristal violeta: 0,1g de cristal violeta em

200 ml de ·gua destilada.

*SoluÁ„o estoque de antibiÛticos: 4g de penicilina G e 10 g de

sulfato de estreptomicina em 40 mL de ·gua destilada.

Mistura-se aveia e ·gar em 490 mL de ·gua destilada; agita- se vigorosamente aquecendo atÈ a fervura, adiciona-se Dodine e 5 mL da soluÁ„o estoque de cristal violeta enquanto estiver quente, e autoclava-se por vinte minutos. Quando estiver na temperatura de 50 a 55 C, adicionam-se 2 mL de soluÁ„o estoque de antibiÛticos; agita-se bem e distribui-se imediata- mente o meio em placas de Petri.

Micologia

| 435

Farinha de aveia ·gar (Oatmeal ·gar ñ OM)

Farinha de aveia

60 g

£gar

12,5 g

£gua destilada

1000 mL

Bater a farinha no liquidificador com um pouco da ·gua por um minuto. Depois adicionar o ·gar e a ·gua e homogeneizar. Esteri- lizar em autoclave a 121 C por vinte minutos. OBS: N„o utilizar o frasco de Erlenmeyer na medida exata do meio, pois durante a autoclavaÁ„o, o meio ferve e pode molhar a rolha ou transbordar.

Extrato de levedura-peptona-glicose-·gar (Yeast extract-peptone-

glucose-agar ñ PYGA)

Peptona

5 g

Extrato de levedura

5 g

Glicose

20 g

£gar

13 g

£gua destilada

1000 mL

Seguir os mesmos procedimentos usados para Sabouraud glicosado.

MP-5 (meio seletivo para fungos aqu·ticos)

Peptona

Maltose

£gar

£gua destilada

1

4 g

g

20 g

1000 mL

Seguir os mesmos procedimentos usados para o Sabouraud glicosado

ObservaÁ„o:Todos os meios utilizados no laboratÛrio de Micologia podem ser acrescidos com antibiÛticos (cloranfenicol, estreptomicina, etc.) para evitar o crescimento de outros microrganismos.

436 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

Meio de cultura ñ Fava Netto (para antÌgeno de P. brasiliensis)

Proteose peptona n 0 3 (Difco)

3 g

Peptona

10 g

Extrato de carne

5 g

Cloreto de sÛdio

5 g

Extrato de levedura

5 g

Dextrose

40 g

£gar

18 g

£gua destilada qsp

1000 mL

Fundir o meio em banho maria fervente. Ajustar o pH entre 7,2 e 7,4. Autoclavar a 120 0 C durante vinte minutos.

Meio de cultura - Smith-Asparagina ( para histoplasmina)

L-Asparagina

7 g

Cloreto de amÙnio

7 g

Fosfato mono·cido de pot·ssio

1,31 g

Citrato de sÛdio

0,9 g

Sulfato de magnÈsio heptahidratado

1,5 g

Citrato fÈrrico

0,3 g

Glicose

10 g

Glicerina

25 g

£gua destilada qsp

1000 mL

Dissolver a asparagina em cerca de 300 mL de ·gua destilada aquecida a 50 0 C. Dissolver os sais separadamente em 25 mL de ·gua destilada, sendo que o citrato fÈrrico dever· ser dissolvido em ·gua quente. Misturar as soluÁıes dos sais com a soluÁ„o de asparagina. Homogeneizar. Acrescentar a glicose e a glicerina. Completar o volume com ·gua destilada. Homogeneizar. Distri- buir o meio, porÁıes de 200 mL, em balıes de 500 mL. Autoclavar a 120 0 C durante vinte minutos

Micologia

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Meio de Cultura ñ Negroni (Filtrado de cultura de P. brasiliensis)

Dissolver 60 g de neopeptona em 120 mL de ·gua destilada aquecida a 45 C.

Colocar a soluÁ„o de neopeptona em tubos para di·lise (mem- branas de celofane) e dialisar contra ·gua destilada (cerca de 2 litros) durante cinco horas a 70 C, e por uma noite em geladeira a 4 C.

Retirar o conte˙do do tubo de di·lise e completar o volume com ·gua destilada para 1.800 mL. Adicionar 36g de glicose, 0,18 g de tiamina e 0,36 g de asparagina.

Homogeneizar e acertar o pH, que deve ser entre 6.8 e 7.0;

Distribuir o meio, porÁıes de 150 mL em frascos Erlenmeyer

ou balıes de 300 mL de capacidade.

Autoclavar a 120 C durante 15 minutos.

ObservaÁ„o: Todos os meios utilizados no laboratÛrio de Micologia podem ser acrescidos com antibiÛticos (cloranfenicol, estreptomicina, etc), para evitar o crescimento de outros microrganismos.

4.2. Corantes

A coloraÁ„o È um meio utilizado em laboratÛrios de Micologia com o

objetivo de visualizar estruturas vegetativas e reprodutivas dos fungos, as for- mas de leveduras, e realizar testes de viabilidade. As soluÁıes utilizadas s„o:

a) SoluÁ„o de hidrÛxido de pot·ssio ñ KOH (soluÁ„o clarificante)

ConcentraÁıes:

40% - unhas (f‚neros). 30% - pelos e pele. 10% - pele tenra de crianÁa. 6% - para exame de escarro. 5% - para estudo de Basiodiomycotina e outros fungos.

438 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

FÛrmula (para soluÁ„o 30%):

KOH em lentilhas

30 g

£gua destilada

70 mL

Preparo:

Dissolver os dois ingredientes em movimentos giratÛrios, atÈ a total dissoluÁ„o dos componentes. A soluÁ„o deve ficar transparente. Armazenar em vidro escuro.

b) Lactofenol de Amann com azul de algod„o

Usado para tornar mais distintas as estruturas hialinas dos fungos (corante citoplasm·tico)

FÛrmula:

£cido fÍnico

20 g

£cido l·tico

20 g

Glicerina

40 g

£gua destilada

20 mL

Azul de Poirrierblau

0,05 g

Preparo:

Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor. Depois adicionar 0,05g de azul de Poirrierblau. Esperar 24 horas e filtrar.

ObservaÁ„o: Para estudar as estruturas de fungos dem·ceos (negros) pode-se utilizar Lactofenol de Amann sem adiÁ„o de azul de algod„o.

Micologia

| 439

c) Acridine Orange

Corante vital usado para teste de viabilidade que distingue cÈlulas vivas e mortas, onde as cÈlulas vivas adquirem coloraÁ„o laranja, e as cÈlulas mortas, coloraÁ„o verde.

FÛrmula:

Acridine orange

0,02 g

PBS pH 7,7

100 mL

Preparo:

Dissolver os dois ingredientes e agitar.

d) Verde janus B

Usado na diferenciaÁ„o de cÈlulas vivas e mortas. As cÈlulas vivas per- manecem incolor, enquanto as cÈlulas mortas adquirem coloraÁ„o azul.

FÛrmula:

Verde-janus B

0,05 g

£gua destilada

100 mL

Preparo:

Dissolver os dois ingredientes e agitar.

e) Reagente de Melzer

Usado para detecÁ„o de reaÁ„o amiloide ou dextrinoide de esporos, ascas e tecidos himeniais de Ascomycotina e Basidiomycotina, na qual uma coloraÁ„o azulada determina uma reaÁ„o amiloide e uma marrom determina uma reaÁ„o dextrinoide.

440 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

FÛrmula:

Iodo

0,5 g

Pot·ssio iodado

1,5 g

Hidrato de cloro

20 g

£gua destilada

20 mL

Preparo:

Dissolver os ingredientes e agitar.

f) Floxina B

Usada para o estudo do citoplasma de Basiodiomycotina.

FÛrmula:

Floxina B

10 g

Glicerina

75 mL

£gua destilada

175 mL

Preparo:

Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor.

g) Glicerina 10% Preserva a coloraÁ„o original do fungo estudado.

FÛrmula:

Glicerina

10 mL

£gua

90 mL

Preparo:

Misturar os ingredientes com leve agitaÁ„o.

5.5.5.5.5. TÈcnicasTÈcnicasTÈcnicasTÈcnicasTÈcnicas micolÛgicasmicolÛgicasmicolÛgicasmicolÛgicasmicolÛgicas

Micologia

| 441

5.1. DiluiÁ„o seriada

A diluiÁ„o seriada È uma tÈcnica simples que pode ser usada para v·rios

propÛsitos, como: separaÁ„o de duas cepas f˙ngicas que estejam misturadas em um tubo ou placa (contaminaÁ„o no tubo ou na placa), contagem de colÙnias em amostras, isolamento de fungos de substratos lÌquidos (an·lise de ·gua, leite, etc) e de solo, alÈm da determinaÁ„o da quantidade e qualidade

de um inÛculo para processos fermentativos ou inÛculos lÌquidos.

a) Preparo da amostra

SeparaÁ„o de duas cepas de fungos

ï Fazer uma raspagem com a alÁa em L na placa ou no tubo onde se

encontram as duas cepas a serem separadas ñ no caso de separaÁ„o de duas cepas de fungos.

ï Este raspado deve ser colocado em um tubo com 10mL de soluÁ„o salina a 0,85% e homogeneizar.

Isolamento de fungos de substratos lÌquidos

ï Colocar 2 mL da amostra lÌquida (·gua, leite, etc) em um tubo com 10 mL de soluÁ„o salina a 0,85% e homogeneizar.

Isolamento de fungos de solo

ï Colocar 1g do solo a ser analisado em um tubo com 10 mL de soluÁ„o salina a 0,85% e homogeneizar.

b) DiluiÁ„o da amostra

ï Utilizando uma sÈrie de dez tubos com 9 mL de salina, colocar no

primeiro tubo 1ml da suspens„o homogeinizada do primeiro tubo (deve-

se usar uma pipeta para cada transferÍncia); homogeneizar e transferir

442 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

1mL para o segundo tubo; homogeneizar novamente e transferir 1mL para o terceiro tubo. Repetir este procedimento atÈ o ˙ltimo tubo

c) Semeadura nos meios de cultura

ï Preparar uma placa de Petri com o meio de cultura escolhido para

cada tubo de diluiÁ„o.

ï Todas as placas devem ser marcadas com as respectivas diluiÁıes.

ï Retirar 0,1mL ou 1mL (‡ escolha) de cada uma das diluiÁıes e

transferir para a placa de Petri com a pipeta (deve-se usar uma pipeta

para cada diluiÁ„o) e espalhar na placa com o auxilio da alÁa de Drigalski.

ï Incubar as placas por, no mÌnimo, sete dias na estufa a 25 0 C.

ï ApÛs o perÌodo de incubaÁ„o, observar as placas e fazer a contagem

das colÙnias ou no caso de separaÁ„o das cepas f˙ngicas, observar as

placas e retirar a colÙnia desejada com a alÁa em L.

d) ObservaÁ„o dos resultados ñ Contagem

A contagem de colÙnias È feita a partir da observaÁ„o das placas e

contagem manual das colÙnias crescidas e quantificaÁ„o da diluiÁ„o origi- nal, ou seja, quantos conÌdios ou esporos haviam na sua suspens„o original. O n˙mero de conÌdios presentes na suspens„o original ser· igual ao n˙mero de colÙnias multiplicado pelo fator de diluiÁ„o.

Ex: Se na diluiÁ„o 10 -4 obtivemos cinquenta colÙnias com inÛculo de 1mL, a concentraÁ„o original ser· de 50 x 10 4 = 5 x 10 5 conÌdios/mL.

Se na diluiÁ„o 10 -6 obtivermos 135 colÙnias com um inÛculo de 0,1ml,

a concentraÁ„o original ser· de 135 x 10 6 x 10 = 135 x 10 7 = 1,35 x 10 9 conÌdios/mL.

ObservaÁ„o: Para a contagem de conÌdios ou esporos em uma soluÁ„o tambÈm podemos usar a C‚mara de Neubauer

Micologia

| 443

5.2. TÈcnicas de semeadura e microscopia

5.2.1.Semeadura de fungos

InoculaÁ„o em placas

As tÈcnicas usadas para inocular fungos em placas s„o fundamental- mente efetuadas para obter culturas axÍnicas (culturas puras) e s„o bem desen- volvidas, j· que a identificaÁ„o de fungos filamentosos baseia-se principalmente nas caracterÌsticas morfolÛgicas.

Procedimento:

Flambar a alÁa ao rubro e esfriar.

No caso de a amostra estar em tubo:

remover a tampa de rosca ou tamp„o de algod„o do tubo que contÈm a cepa, com o dedo mÌnimo da m„o direita, segurando o tubo com a m„o esquerda;

flambar a boca do tubo, imediatamente antes e depois da inoculaÁ„o;

No caso de a amostra tambÈm estar em placa:

tomar a placa com a m„o esquerda, de modo que a base da placa fique segura e a tampa possa ser manipulada num movi- mento de abrir e fechar, com os dedos polegar e indicador;

proceder a uma r·pida flambagem na placa toda vez que esta tenha que ser aberta;

manipular a placa na altura da chama do bico de Bunsen;

444 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

introduzir a alÁa ou agulha no tubo ou placa de Petri com amostra, e retirar uma quantidade suficiente do inÛculo;

tomar uma placa, abrir conforme exposto anteriormente e inocular no centro da placa ou conforme especificaÁıes em trÍs pontos eq¸idistantes.

IncubaÁ„o das placas:

incubar as placas, invertidas em estufa ou ‡ temperatura ambiente, para evitar que, durante a incubaÁ„o, a ·gua de condensaÁ„o da superfÌcie do ·gar, provoque crescimento confluente do organismo, impedindo a formaÁ„o de colÙnias isoladas.

obedecer aos requisitos fisiolÛgicos de crescimento do mi- crorganismo, tais como temperatura ideal de incubaÁ„o, ilumi- naÁ„o, tempo de incubaÁ„o, etc.

InoculaÁ„o em tubos ou frascos de Erlenmeyers

A inoculaÁ„o em tubos ou frascos de Erlenmeyers pode ser feita em meios sÛlidos e lÌquidos. Apresentam in˙meras finalidades de uso. Em todos os casos, tomam-se medidas assÈpticas durante a inoculaÁ„o.

a) Meio lÌquido para meio lÌquido

Quando a cultura estiver em meio lÌquido e se pretende repic·-la para um tubo contendo meio lÌquido, deve-se usar uma alÁa de platina ou nÌquel-cromo em forma de gota, observando-se as condiÁıes de assepsia.

b) Meio lÌquido para meio sÛlido

Micologia

| 445

Tomar com uma alÁa em forma de gota um inÛculo da amostra em meio lÌquido.

Introduzir a alÁa sobre a superfÌcie do ·gar inclinado, atÈ a base do mesmo.

Fazer estrias ou um esfregaÁo em direÁ„o ‡ boca do tubo, sobre a superfÌcie inclinada atÈ æ da sua extens„o. A superfÌcie inclinada do ·gar deve ficar voltada para cima, com a m„o do operador por baixo do tubo, de modo que a superfÌcie inclinada possa ser vista sem obst·culo.

c) Meio sÛlido para meio lÌquido

Introduzir a agulha ou alÁa em forma de L estÈril no tubo que contÈm a cultura em ·gar inclinado e tomar uma pequena quantidade do inÛculo. Evite carrear pedaÁos ou fragmentos do meio com o inÛculo.

Imergir o inÛculo no meio lÌquido, agitar a agulha suavemente contra a parede do tubo para ressuspender o inÛculo.

Homogeneizar o meio sob leve agitaÁ„o.

d) Meio sÛlido para meio sÛlido

Tomar com uma agulha ou alÁa em forma de L o inÛculo no meio sÛlido.

Introduzir a agulha sobre a superfÌcie do ·gar inclinado, atÈ a sua base.

Fazer estrias ou um esfregaÁo em direÁ„o ‡ boca do tubo, sobre a superfÌcie inclinada, atÈ aproximadamente æ da sua extens„o. O proce- dimento È o mesmo da inoculaÁ„o de meio lÌquido para o meio sÛlido.

446 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

ï IncubaÁ„o dos tubos:

preferencialmente todos os tubos com meio sÛlido devem ficar em posiÁ„o vertical em estantes ou outros tipos de suporte.

6.2.2. Microscopia

Exame direto de um pedaÁo da colÙnia

Com a alÁa de platina em forma de L ou agulha esterilizada, cortar um pedaÁo da colÙnia e coloc·-lo sobre uma l‚mina. N„o se deve raspar a superfÌcie da colÙnia, porque apenas os conÌdios ser„o retirados. Desta forma, em muitos casos È possÌvel identificar o fungo.

Colocar uma gota do corante lactofenol de Amann com azul de algod„o ou outro corante desejado sobre o pedaÁo da colÙnia. Se o fungo for muito escuro, substituir o corante por uma soluÁ„o clarificante ou uma gota de ·gua.

Cobrir a preparaÁ„o com uma lamÌnula, comprimindo-a com o cabo do bisturi ou do estilete. Examinar ao microscÛpio, com objetivas de 10X, 40X e 100X.

TÈcnica de cultivo em l‚mina

Na maioria das vezes, È necess·rio obter preparaÁıes onde as estruturas do fungo s„o observadas por inteiro. Isto porque h· muitos gÍneros cujos esporos ou conÌdios por si sÛ n„o s„o caracterÌsticos. Neste caso, as estruturas respons·veis pela formaÁ„o e sustentaÁ„o dos conÌdios ou esporos necessitam ser observadas por completo. Isto nem sempre È possÌvel com a tÈcnica de exame direto, havendo necessidade de se fazer o cultivo na prÛpria l‚mina. Com isto, obtÍm-se os fungos com suas estruturas intactas.

Micologia

| 447

Procedimento:

Vazar em placa de Petri uma camada fina do meio de cultura adequado para cada gÍnero ou espÈcie de fungos a ser examinado.

ApÛs a solidificaÁ„o do meio, com o auxÌlio de um bisturi, cortar fragmentos de 0,5 cm 2 .

Montar uma placa de 15 cm de di‚metro e cobrir o fundo com papel de filtro e colocar sobre este um bast„o em forma de ìUî, duas l‚minas e duas lamÌnulas.

ApÛs a esterilizaÁ„o, colocar o quadrado de meio sobre cada l‚mina;

Inocular nos quatro lados do quadrado do meio de cultura, fragmentos miceliais e/ou esporos.

Colocar sobre o meio de cultura a lamÌnula.

Molhar o papel de filtro com ·gua destilada estÈril formando uma c‚mara ˙mida.

Deixar em temperatura ambiente, por aproximadamente uma semana ou mais dependendo do fungo estudado.

Observar crescimento e esporulaÁ„o.

Fixar pelo formol por 24 horas.

Montar l‚minas e lamÌnulas com corante e observar em microscÛpio Ûtico com objetivas de 10x, 40x e 100x.

TÈcnica da fita adesiva

Esta tÈcnica d· excelentes resultados quando o fungo est· sendo cultiva- do em placa de Petri. Na maioria das vezes, suas estruturas aparecer„o inteiras, como no cultivo em l‚mina.

448 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

Procedimento:

Cortar um pedaÁo de fita adesiva um pouco menor do que a l‚mina e coloc·-lo sobre a colÙnia, com a cola para baixo.

Comprimir com a alÁa de platina em forma de L para que o fungo cole

na fita.

Colar a fita sobre o corante na l‚mina.

Observar ao microscÛpio Ûtico com objetivas de 10X, 40X e 100X.

Cultivo sob lamÌnula

O objetivo desta tÈcnica È a observaÁ„o das microestruturas vegetativas

e reprodutivas do fungo mais intactas.

Procedimento:

Inocular em uma placa de Petri, contendo 20 mL de meio de cultura especÌfico para o gÍnero a ser identificado, fragmentos do fungo em trÍs pontos equidistantes entre si, e sobre cada um destes colocar uma lamÌnula de 24x32mm, previamente flambadas em bico de Bunsen.

ApÛs sete dias de crescimento, as lamÌnulas sobre os pontos de inÛculo devem ser retiradas do interior da placa, com auxÌlio de uma pinÁa, previamente flambada. As lamÌnulas devem ser colocadas inverti- das sobre l‚minas contendo uma gota de Lactofenol de Amann com azul de algod„o.

Observar ao microscÛpio Ûptico com objetivas de 10X, 40X e 100X.

Micologia

| 449

TÈcnicas para estudo de Ascomycotina

Procedimento:

O uso de um microscÛpio estereoscÛpico (lupa) È indispens·vel para

o

exame do material.

SecÁıes verticais no corpo frutÌfero do fungo estudado poder„o ser feitas com auxÌlio de uma gilete ou bisturi.

A maioria das l‚minas para posterior observaÁ„o ao microscÛpio Ûptico

È montada normalmente em ·gua para mediÁ„o dos ascosporos e obser- vaÁ„o de sua coloraÁ„o, o reagente de Melzer ís tambÈm devendo ser usado para o estudo dos anÈis apicais das ascas.

O estudo destes fungos em meio de cultura tambÈm deve ser feito para que se conheÁa o seu anamorfo. Isto poder· ser feito atravÈs da tÈcnica de isolamento de ascoporos (single ascospore isolation).

TÈcnica para estudo de Basidiomycotina

O material È montado em KOH a 5%.

O reagente de Melzers tambÈm È usado para os esporos de fungos Agaric·ceos.

Impress„o de esporos:

Uma das mais importantes caracterÌsticas que permite o agrupamento dos gÍneros em seÁıes È a coloraÁ„o dos basidiÛsporos em massa, ou seja, a impress„o de esporos.

Procedimento:

Selecionar um corpo frutÌfero fresco e maduro e cortar sua haste junto ao pÌleo.

450 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

Colocar o pÌleo sobre uma folha de papel de duas cores (preta e branca) com as l‚minas ou poros para baixo.

Cobrir o pÌleo e o papel com papel encerado, cristalizador ou com uma camp‚nula. Se o corpo frutÌfero do fungo estiver em boas condi- Áıes, a impress„o de seus esporos poder· ser obtida em uma hora.

5.3. Coleta e isolamento de fungos ambientais

ObservaÁıes quanto ao complexo fungo-substrato s„o de grande valia por ocasi„o de qualquer coleta. Deve-se notar que as estruturas mais visÌveis de um fungo n„o representam, necessariamente, o seu todo. AlÈm disso, grande parte de seus ciclos ou remanescentes estruturais poder„o estar perdidos no interior do substrato. Desta forma, conclui-se que a amostra que se coleta de um fungo, na verdade n„o passa de um momento do seu ciclo biolÛgico.

As partes mais evidentes, nos fungos, representam em geral, aquelas que mais resistem ao manuseio e ao tratamento para secagem. As condiÁıes ideais para o estudo dos fungos residem no isolamento dos organismos a partir de diferentes substratos, e nos diversos ambientes em que os fungos ocorrem:

solo, ar, ·gua ou mesmo na vegetaÁ„o.

Independente do espÈcime a ser coletado, alguns materiais gerais de- vem ser providenciados para as coletas:

* altÌmetro

* fÛsforo ou isqueiro

* jornal

* caderneta de campo

* lupa de m„o

* l·pis

* mochila ou cesta

* m·quina fotogr·fica

* canivete ou esp·tula

* papel indicador de pH

* faca afiada

* saco pl·stico

* fita crepe

* saco de papel

* fita mÈtrica ou trena

A. Solo

Micologia

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Considera-se o solo um mosaico de micro-habitats devido a sua grande complexidade, longe de ser um simples amontoado de matÈria inorg‚nica sem vida. Ao contr·rio, o solo costuma ser rico em microbiota e mesofauna, o que forÁa o pesquisador a usar tÈcnica ou subst‚ncias especiais quando pretende isolar um grupo definido.

O mÈtodo de diluiÁ„o È o mais usado para se estudar a incidÍncia de

fungos em solos. O material, ao ser coletado, deve ser colocado em latas esterilizadas ou em sacos pl·sticos. As amostras destinadas ‡ an·lise devem ser manipuladas com o auxÌlio de uma esp·tula ou colher, parcialmente esterilizadas com algod„o embebidos em ·lcool ou com auxÌlio de uma lamparina. De preferÍncia, o perÌodo entre a coleta de material e as diluiÁıes, n„o deve

ultrapassar quatro horas.

Procedimento:

Tomam-se 10g de cada amostra de solo e coloca-se em frascos de Erlenmeyer contendo 90 mL de soluÁ„o salina esterilizada. Agitar vigorosamente (soluÁ„o 1:10 - mesmo princÌpio da diluiÁ„o seriada porÈm em maiores proporÁıes).

Desta suspens„o, pipeta-se 1mL e adiciona-se a tubo contendo 9 mL

de soluÁ„o salina esterilizada, apÛs agitaÁ„o (soluÁ„o 1:100).

Retira-se ent„o outro 1mL desta ˙ltima soluÁ„o e coloca-se em um novo tubo contendo tambÈm 9 mL de soluÁ„o salina esterilizada, sem- pre apÛs agitaÁ„o (soluÁ„o 1:1000).

Por fim, se necess·rio, a mesma operaÁ„o anterior pode ser repetida, e uma alÌquota de 1 ou 0,1mL plaqueada em um meio de cultura apropriado. Em geral, usa-se ·gar Sabouraud acrescido de antibiÛtico (cloranfenicol, estreptomicina ou penicilina).

452 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

ApÛs sete dias, faz-se o isolamento dos fungos, repicando-se as colÙnias para tubos de ensaio contendo meio sÛlido.

ApÛs o desenvolvimento das colÙnias, procede-se ‡ identificaÁ„o genÈrica-especÌfica dos fungos.

A coleta de substratos org‚nicos, como folhas, frutos, raÌzes e troncos

em diferentes est·dios de decomposiÁ„o tambÈm È interessante. Estercos de herbÌvoros devem ser coletados frescos, com uma esp·tula grande e acondici-

onados em sacos pl·sticos.

Importante lembrar que as regras de assepsia parcial e etiquetagem (local de coleta, data, condiÁıes ambientais e substrato) s„o idÍnticas para qualquer coleta, e devem receber atenÁ„o especial.

O mÈtodo da placa de solo consiste em se colocar, com uma esp·tula,

quantidades pequenas de solo em uma placa esterilizada, evitando os tor- rıes de terra. Verter ent„o o meio de cultura com antibiÛtico (sugere-se a utilizaÁ„o do meio de MARTIN, com rosa-bengala e sulfato de streptomicina) e deixar solidificar.

Para o isolamento de fungos de substratos org‚nicos pode-se utilizar o mÈtodo de press„o de folhas. Este consiste em se pressionar com uma pinÁa uma folha sobre a superfÌcie do meio de cultura com antibiÛtico, retirando-a em seguida. A placa, ent„o, È deixada ‡ temperatura ambiente, observando-se diariamente o crescimento das colÙnias.

Outra opÁ„o seria plaquear amostras de substratos (folhas, galhos, inse- tos, etc), cortadas com bisturi em pequenos pedaÁos. Deposita-se de uma a trÍs amostras equidistantes sobre o ·gar, umedecendo-as levemente com ·gua esterilizada. Se a amostra for de insetos muito pequenos, coloc·-los intactos.

B. Fungos macroscÛpicos

Micologia

| 453

Existe uma variaÁ„o muito grande de fungos macroscÛpicos, de con- sistÍncia diferente. Alguns se decompıem logo apÛs serem coletados, outros s„o mais resistentes. De qualquer modo, cuidado e bomsenso tor- nam-se necess·rios para o sucesso de uma coleta. Os materiais comumente usados s„o:

Cristalizador.

Folha de papel dupla face (branca/preta), para coleta de esporos.

Frascos de vidro escuros com fixador ·lcool a 5%.

Papel de filtro ou algod„o.

No caso de o substrato ser esterco de herbÌvoros, preparar um cristalizador contendo papel de filtro embebido em ·gua e glicerina (para n„o ressecar rapidamente), antes de introduzi-lo no recipiente. Tampar, ent„o, deixando o conjunto ‡ temperatura ambiente e ao abrigo do sol, porÈm com iluminaÁ„o. Impedir o ataque de inseto ou outros artrÛpodes e observar o crescimento macroscÛpico dos fungos.

Nas coletas, deve-se retirar o material por inteiro com o auxÌlio de uma faca ou esp·tula, cuidadosamente, para evitar quebra ou esfarelamento. Se possÌvel, trazer parte do substrato junto. Aconselha-se n„o misturar materiais diferentes em um mesmo saco a fim de evitar a mistura de esporos. Ao transport·-los para outro lugar, acomod·-los na mochila ou cesta, protegendo- as com folhas de jornal. Amostras delicadas podem ser coladas no fundo de uma caixa de fÛsforos. Durante as coletas, anotaÁıes sobre cor, textura e tamanho do material coletado devem ser feitas, pois na maioria dos casos os fungos tÍm suas caracterÌsticas alteradas depois de secos.

454 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

C. Ar atmosfÈrico

O ar representa um repositÛrio natural, sob a forma de esporos, dos

mais diversos tipos e grupos de fungos. O isolamento depende do local, do tempo de exposiÁ„o e do substrato empregado. A coleta de ar pode ser realizada de duas formas:

1. Com um amostrador de ar por impactaÁ„o - Nestes amostradores

h· um compartimento onde È colocada uma placa de Petri com o meio de cultura escolhido e quando o amostrador È ligado, a placa recebe todo o ar puxado em um volume determinado por dez minu- tos. Ao tÈrmino, essas placas s„o incubadas a 25 0 C por sete dias. As colÙnias s„o contadas e repicadas para tubo de ensaio e deve-se ent„o proceder ‡ identificaÁ„o dos fungos isolados.

2. Expondo as placas de Petri com meio de cultura escolhido, por

cinco, dez ou quinze minutos ao ar atmosfÈrico no ambiente selecio-

nado, incubando em seguida a 25 0 C por sete dias. Repicar as colÙnias para tubo de ensaio e proceder ‡ identificaÁ„o dos fungos isolados.

D. £gua

Fungos aqu·ticos

Em ambientes aqu·ticos, encontramos tanto fungos zoospÛricos como

tetraradiados (n„o zoospÛricos). Os primeiros s„o realmente adaptados ao ambiente aqu·tico, pois possuem esporos flagelados mÛveis. O segundo grupo, sem flagelos, apresenta esporos de forma radiada, com trÍs ou qua- tro braÁos partindo de um mesmo ponto, ou ainda sigmÛides ou ovalados. Esta morfologia concede maior facilidade de flutuaÁ„o, dispers„o e aderÍncia ao substrato.

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Os fungos aqu·ticos podem tambÈm ser encontrados no solo, graÁas ‡ formaÁ„o de estruturas de resistÍncia que lhe permitem sobreviver atÈ que condiÁıes de umidade favor·veis se estabeleÁam. Para observaÁ„o destes fun- gos, torna-se necess·ria a coleta de amostras de ·gua e solo, ‡s quais adicio- nam-se iscas especiais. Assim, o material para a iscagem È:

£cido clorÌdrico a 1%.

Frasco de 100ml, de boca larga e tampa.

HidrÛxido de pot·ssio a 2%.

Hipoclorito de sÛdio a 10%.

Iscas como: asa de insetos, celofane, ecdise de cobra, exoesqueleto de camar„o, folha de gramÌnea descorada ou fervida, frutos (maÁ„, jabuticaba, etc), gr„o de pÛlen do Pinus, gravetos e sementes (c‚nha-

mo, Crotalaria sp.).

Papel alumÌnio.

Papel encerado.

Saco de tela de n·ilon ou lata.

A iscagem pode ser realizada no campo ou no laboratÛrio. … importante salientar que a transparÍncia do material ir· determinar sua eficiÍncia como isca. De preferÍncia, os frascos devem ser esterilizados. Para fins taxionÙmicos, este requisito passa a ser obrigatÛrio.

No momento da coleta da ·gua, juntar ao pote gravetos ou folhas que estiverem nas proximidades. Uma vez no laboratÛrio, transferir uma parte do coletado para placas de Petri esterilizadas, adicionar as iscas e deixar ‡ tempe- ratura ambiente. Com o desenvolvimento das colÙnias, entre 48 e 72 horas, procede-se ao isolamento da cultura pura, utilizando o meio MP-5.

ApÛs o crescimento em meio sÛlido, retirar um pequeno quadrado de 1x1cm da parte mais perifÈrica da colÙnia, colocando-o em uma placa esterili-

456 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

zada com ·gua destilada estÈril e duas a trÍs metades de sementes de c‚nha- mo. Decorridas 48 horas, o material deve estar pronto para ser observado diretamente ou montado em l‚mina.

Todos os substratos que portarem crescimento micelial devem ser sepa- rados, lavados em ·gua destilada e recolocados em placas contendo novas amostras do mesmo substrato com ·gua destilada esterilizada renovada. Em l‚mina, pode-se observar os flagelos colocando-se uma a duas gotas de Karo na montagem, a fim de diminuir a mobilidade dos zoÛsporos.

Para as espÈcies que dificilmente ocorrem neste tipo de iscagem, reco- menda-se a submers„o de frutos, gravetos ou folhas dentro de latas perfuradas ou bolsas de n·ilon. Estas devem ser amarradas com fio pl·stico e, de prefe- rÍncia, protegidas da observaÁ„o p˙blica. ApÛs duas ou trÍs semanas, este material deve ser retirado e lavado em ·gua corrente por cerca de trinta minu- tos, para a remoÁ„o de detritos, bactÈrias, protozo·rios e pequenos invertebrados. Se os fungos estiverem presentes, p˙stulas esbranquiÁadas apa- recer„o na epiderme do fruto, as quais dever„o ser observadas.

5.4. PreservaÁ„o de fungos

Culturas microbianas s„o extremamente vulner·veis e podem se contami- nar, mutar ou morrer. Muitas vezes, culturas s„o insubstituÌveis, e sua perda pode ser muito grave. Outras vezes ela pode ser reisolada ou adquirida de uma coleÁ„o de culturas. Em qualquer um dos casos, tempo, informaÁ„o e dinheiro s„o desperdiÁados, mas isto pode ser evitado ou minimizado com um sistema eficiente de preservaÁ„o de linhagens. Esta È uma das funÁıes mais importantes de uma coleÁ„o de culturas. A preocupaÁ„o central È a preserva- Á„o de linhagens com suas caracterÌsticas originais durante um longo perÌodo de tempo. Novas espÈcies, mutantes, organismos portadores de plasmÌdeos e linhagens produzidas por engenharia genÈtica devem ser preservadas, de forma

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a manter as suas propriedades. Assim, È essencial que coleÁıes de culturas

executem pesquisas no intuito de definir tÈcnicas de preservaÁ„o apropriadas.

… importante frisar que n„o existe nenhum mÈtodo universal para uma preserva-

Á„o adequada a todos os microrganismos. Grupos taxonÙmicos de microrga- nismos, e atÈ linhagens dentro da mesma espÈcie, variam quanto a sua resposta

aos diferentes mÈtodos de preservaÁ„o.

MÈtodos de preservaÁ„o

Estes mÈtodos tÍm como objetivo manter as culturas num estado vi·vel sem mudanÁa morfolÛgica, fisiolÛgica ou genÈtica. Para se obter um bom resultado na aplicaÁ„o de um mÈtodo de preservaÁ„o, a cultura deve estar em Ûtimas condiÁıes, deve-se respeitar as condiÁıes Ûtimas de crescimento, tem- peratura, umidade, aeraÁ„o, iluminaÁ„o e meio de cultivo.

A. Repique

£gar

O mÈtodo mais tradicional de preservaÁ„o de culturas È atravÈs da transferÍncia periÛdica da cultura (repique) para um novo meio de cultivo sÛlido ou lÌquido. O intervalo entre cada transferÍncia varia com o microrganis- mo, o meio de cultivo empregado e as condiÁıes ambientais.

A maioria dos fungos pode crescer em BDA ou EM, contudo, alguns tÍm requerimentos especiais de crescimento. O perÌodo de tempo entre as transferÍncias varia de fungo para fungo. Para alguns, a cada duas ou quatro semanas, a maioria a cada dois a quatro meses, enquanto outros podem sobreviver 12 meses sem transferÍncia. TrÍs condiÁıes devem ser determinadas quando se usa este mÈtodo para preservaÁ„o de microrganismos:

458 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

ï Meio adequado para manter as culturas.

ï Temperatura ideal de estocagem.

ï FrequÍncia entre as transferÍncias.

PreservaÁ„o sob Ûleo mineral

Muitas espÈcies de fungos podem ser preservadas por meses ou anos atravÈs de um mÈtodo relativamente f·cil e simples, que È o de imers„o em Ûleo mineral. O Ûleo deve ser esterilizado por aquecimento em um forno Pasteur a 170 C por uma ou duas horas ou autoclavagem dupla por quinze minutos a 121 C.

Deixar crescer a cultura em meio apropriado. O repique pode ser feito em ·gar inclinado ou n„o.

ApÛs um crescimento adequado, colocar assepticamente o Ûleo mineral estÈril sobre a superfÌcie da cultura a uma altura aproximada de 1 a 2cm (quando a cultura estiver em ·gar inclinado, cobre-se completamente a super- fÌcie). Isto impede a desidrataÁ„o e reduz a atividade metabÛlica, assim como a velocidade de crescimento do microrganismo, devido ‡ reduÁ„o da tens„o do oxigÍnio.

Guardar as culturas com Ûleo mineral na posiÁ„o vertical. Fazer testes de viabilidade periodicamente para determinar se a cultura est· deteriorando.

Blocos de ·gar em ·gua

O mÈtodo consiste em cultivar o microrganismo em uma placa de Petri contendo um meio de ·gar apropriado. ApÛs o crescimento vigoroso o ·gar È cortado com uma l‚mina estÈril em blocos de aproximadamente 4 a 6 mm. No caso de fungos, a partir do final do crescimento das colÙnias, um n˙mero apropriado de cubos È transferido assepticamente para tubos ou frascos con-

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tendo 10 a 15 mL de ·gua destilada estÈril. Para reativaÁ„o, basta retirar assepticamente um dos cubos e deposit·-los sobre um meio adequado, a sua aplicaÁ„o fica restrita a microrganismos que tenham grande aderÍncia ao ·gar, como no caso de fungos filamentosos e algumas leveduras.

B. Secagem

Secagem em areia, solo e sÌlica-gel

TambÈm È considerada como um bom mÈtodo de conservaÁ„o de microrganismos. Pode ser uma simples secagem de esporos ou secagem sob v·rias condiÁıes, como, por exemplo, em secador com ou sem v·cuo.

Para tanto, emprega-se a seguinte linha de trabalho: Preparar o tubo para estocagem (pode ser de tampa rosqui·vel ou frascos de penicilina), enchendo-o atÈ æ com gel (sÌlica-gel purificada, sem indicador, 6-22 mesh), depois esterilizar no mÌnimo durante trÍs horas a 180 C (calor seco), e colocar em atmosfera seca para seguir em banho de gelo overnight. Fazer uma suspens„o de esporos em leite frio desnatado (5%). Derramar a suspens„o fria sobre a sÌlica gelada e depois levar para um banho de gelo, pelo menos durante quinze minutos.

Deixar os gÈis ‡ temperatura ambiente (25 a 30 C) dentro de dessecadores atÈ que, com a agitaÁ„o, os cristais sejam separados (cerca de uma a duas semanas ou dois a trÍs dias para fungos de crescimento r·pido). Armazenar os tubos em dissecadores em sala fria ou recipientes com sÌlica em geladeira (4 C), embora bons resultados possam ser obtidos ‡ temperatura ambiente.

460 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

Armazenamento em solo estÈril

A preservaÁ„o de fungos em solo estÈril, pode ser feita de duas maneiras:

pela inoculaÁ„o de uma suspens„o de esporos;

pela inoculaÁ„o de esporos secos em solo seco ou em substrato similar, com subseq¸ente estocagem do material seco.

O mÈtodo de estocagem em solo empregado consiste em inocular 5g de solo (20% de umidade e esterilizado pelo menos duas vezes a 121 C por quinze minutos) com 1mL de suspens„o de esporos em ·gua, com subsequente crescimento durante cerca de dez dias ‡ temperatura ambiente. O armazenamento dever· ser feito de preferÍncia em refrigerador a 5 C.

C. LiofilizaÁ„o (freeze-drying)

A liofilizaÁ„o, ou freeze-drying È um dos mÈtodos mais econÙmicos e

eficientes de preservaÁ„o a longo prazo. O mÈtodo permite a produÁ„o de grande n˙mero de liofilizado porque o uso de ampolas pequenas facilitam a estocagem. Enquanto o procedimento da liofilizaÁ„o È relativamente simples, o aspecto teÛrico È bastante complexo, pois a liofilizaÁ„o envolve a remoÁ„o de ·gua de uma suspens„o de microrganismos congelados por sublimaÁ„o sob press„o reduzida, isto È, a ·gua È evaporada sem passar pela fase lÌquida (passagem do estado sÛlido para o estado gasoso).

As cÈlulas secas podem ser estocadas por longo perÌodo, se mantidas longe de oxigÍnio, umidade e luz. Elas podem a qualquer hora ser facilmente re-hidratadas e ativadas.

A liofilizaÁ„o pode ser realizada de v·rias maneiras, pois v·rios tipos de

aparelhos foram desenvolvidos para este fim.

No caso dos fungos, È importante lembrar que o sucesso da liofilizaÁ„o varia entre linhagens de mesma espÈcie; em geral, aqueles que crescem e

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esporulam bem em cultura sobrevivem ao processo, enquanto que isolados em estado deteriorado ou debilitado n„o resistem ‡ liofilizaÁ„o.

Requisitos b·sicos para liofilizaÁ„o

Meio de suspens„o externo para congelamento (·lcool metÌlico ou etÌlico + gelo seco).

Gerador e mantenedor de v·cuo (bomba).

Absorvente do vapor de ·gua (dissecante - condensador - lÌquido refrigerante).

Par‚metros de liofilizaÁ„o Tipo de cÈlula; crescimento e idade da cultura; concentraÁ„o celular; meio de suspens„o (crioprotetores); velocidade de resfriamento; mÈtodo de seca- gem; condiÁ„o de estocagem; mÈtodo de constituiÁ„o e mÈtodos de an·lise (medidas de viabilidade, inj˙ria, morte e outros par‚metros).

Crioprotetores Materiais proteicos, carboidratos; amino·cidos; leite desnatado e outros.

Meios de suspens„o:

Leite desnatado 10%; leite desnatado 10% + inositol 5%.

Sacarose 7% + peptona 7%; inositol 5% em soro de sangue de cavalo e outros.

MÈtodo de liofilizaÁ„o:

PrÈ-congelamento + v·cuo (umidade residual 1% a 2%);

CentrifugaÁ„o + v·cuo Secagem prim·ria: umidade residual 5% a 10%. Secagem secund·ria: umidade residual 1% a 2%.

462 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

Congelamento:

A preservaÁ„o das caracterÌsticas de microrganismos armazenados em um

freezer com faixa de temperatura de 0 a -20 C produz resultados diversos, sendo que seu sucesso depende da espÈcie de fungo.

Par‚metro de congelamento:

Escolha do tipo de refrigerador, escolha de ampolas e frascos, agentes crioprotetores, culturas e preparaÁ„o de suspens„o, velocidade de resfriamento, estocagem e velocidade de descongelamento.

PrÈ-resfriamento para congelamento:

Freezer (velocidade de resfriamento, vr = 1 C/min.).

Gelo seco (vr = 7 C/min).

Fase vapor de nitrogÍnio (vr = 18 o C/min).

Congelamento direto:

Fase lÌquida de nitrogÍnio (vr = 200 C).

D. Armazenamento em nitrogÍnio lÌquido

Utiliza-se o nitrogÍnio lÌquido para se conseguir temperaturas ìultrabaixasî. Isso tem sido satisfatÛrio para grande n˙mero de cÈlulas vivas.

O mÈtodo apresenta certas desvantagens: a aparelhagem requerida È mais cara que a usada para secagem ou congelamento; h· necessidade de condiÁıes bem controladas de congelamento e degelo, e ainda h· o risco de explos„o de ampolas. TambÈm È um mÈtodo menos interessante que a seca- gem, quando se usa o armazenamento para distribuiÁ„o de culturas.

A estocagem a temperaturas ìultrabaixasî reduz as trocas fÌsicas e

quÌmicas e È um bom mÈtodo para ser usado quando as culturas s„o de

difÌcil liofilizaÁ„o.

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Nos fungos, faz-se uma suspens„o de esporos em glicerol 10% e alÌquotas de 0,5mL s„o distribuÌdas em ampolas de vidro-borosilicato ou criotubos de 1mLe marcadas com o n˙mero da cultura usando tinta perma- nente. As ampolas s„o seladas com maÁarico (quando criotubos, as tampas

s„o bem fechadas) e colocadas num banho com corante em refrigerador de 4

a 8 C por trinta minutos para prÈ-resfriamento. Este procedimento permite

que o glicerol penetre e envolva o organismo. O corante indica qualquer falha no selamento das ampolas ou criotubos, caso o conte˙do fique colorido.

Tal procedimento È seguido pelo congelamento das ampolas a -35 C por quarenta a sessenta minutos, e as ampolas s„o ent„o colocadas no nitrogÍ- nio lÌquido e congeladas rapidamente a -196 C. A reativaÁ„o È feita colocan- do-se as ampolas rapidamente em banho de ·gua a 37 C atÈ os cristais de gelo derreterem. As ampolas ent„o s„o abertas e o conte˙do È dispensado em meio de cultura adequado ao crescimento.

Para se fazer o controle da viabilidade e pureza das culturas congeladas,

a reativaÁ„o deve ser feita apÛs trÍs a quatro dias de estocagem no nitrogÍnio lÌquido.

E. MÈtodo do papel de filtro (preservaÁ„o de fungos entomopatogÍnicos)

Procedimento:

ï Tiras de papel de filtro previamente esterilizadas (estufa 105 C por 24h), s„o distribuÌdas sobre o meio BDA (batata dextrose ·gar), em placas de Petri, pouco antes de endurecer.

ï Culturas f˙ngicas s„o transferidas para estas placas e incubadas por

oito dias (dependendo do isolado) a 28 C.

ï As tiras de papel apresentando estruturas f˙ngicas s„o retiradas das

placas e transferidas para placas de Petri, para ent„o serem mantidas em dessecador contendo sÌlica gel, onde dever„o permanecer por 48 horas ‡ temperatura ambiente.

464 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

ï ApÛs este perÌodo de incubaÁ„o, as tiras s„o acondicionadas em

saquinhos de papel-manteiga, previamente esterilizados, e armazenadas

em dessecador ‡ temperatura ambiente.

F. MÈtodo da sÌlica gel

Procedimento:

ï Preparar recipientes (vidrinhos com tampa ou tubos Eppendorfs)

parcialmente cheios com sÌlica gel (6 a 22 meshs) sem indicador, seca e

esterilizada com calor seco (180 C/90 min).

ï Cultivar os isolados em meio de cultura atÈ a fase de esporulaÁ„o.

ï Preparar suspens„o de esporos em leite em pÛ desnatado (10%), esterilizado e esfriado a 4 C.

ï Adicionar a suspens„o de esporos ‡ sÌlica, resfriada a 4 C, sendo 0,5 mL da suspens„o para 4 g de sÌlica.

ï Incubar a 4 C por trinta minutos.

ï Armazenar ‡ temperatura ambiente por duas semanas e depois vedar

as tampas. ï Transferir para geladeira (4 C) para longo perÌodo de armazenamento.

6.6.6.6.6. TÈcnicasTÈcnicasTÈcnicasTÈcnicasTÈcnicas utilizadasutilizadasutilizadasutilizadasutilizadas ememememem MicologiaMicologiaMicologiaMicologiaMicologia mÈdicamÈdicamÈdicamÈdicamÈdica

O

diagnÛstico laboratorial das infecÁıes f˙ngicas requer a coleta

de

amostras apropriadas e procedimentos laboratoriais adequa-

dos, segundo indicaÁ„o clÌnica do paciente. A qualidade da amostra disponÌvel para an·lise laboratorial È de fundamental import‚ncia. Coleta, estocagem e processamento de espÈcimes inadequados podem levar a um diagnÛstico errÙneo.

Dependendo da micose do paciente, uma sÈrie de materiais podem ser enviados ao laboratÛrio para exame, como relacionado no quadro a seguir.

Micologia

| 465

Tipos de micose

Tipos de material usualmente enviado ao laboratÛrio para exame

Superficiais e cut‚neas

Pele, pelos, unhas, exsudatos

Subcut‚neas

Pus, tecidos (biÛpisas), exsudatos

SistÍmicas e oportunistas

Escarro, pus, tecidos (biÛpsias), exsudatos lÌquor,materiais brÙnquicos, medula Ûssea, sangue, urina

6.1. Coleta e processamento de espÈcimes clÌnicos

6.1.1. Pele

A. Coleta

ï Limpar com ·lcool etÌlico ou Èter (Em alguns casos nenhuma antissepsia

pode ser feita). Se a les„o for ˙mida, limpar com ·gua destilada ou soluÁ„o salina estÈril. L‚mpada de Wood pode ser usada para orientar a coleta e o diagnÛstico.

ï Raspar com l‚mina de bisturÌ estÈril ou cureta dermatolÛgica a borda das lesıes, evitar colher o material do centro da les„o. ï Colocar o material em placa de Petri entre duas l‚minas ou em envelope (estÈreis).

B. Processamento

ï Exame microscÛpico direto - KOH 10% ou NaOH 4%.

ï Cultivo.

466 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

Meios

Sabouraud-·gar com cloranfenicol Mycosel £gar (contÈm cicloheximida e cloranfenicol)*

Semeadura

Semear trÍs a cinco escamas de pele em cada tubo

IncubaÁ„o

Incubar ‡ temperatura ambiente

ObservaÁ„o

Observar o crescimento de fungos por atÈ trÍs semanas

IdentificaÁ„o

Identificar os fungos isolados em geral pela morfologia

6.1.2. Pelos

A. Coleta

ï Com pinÁa estÈril coletar o m·ximo de pelos afetados. A l‚mpada de Wood pode ajudar na seleÁ„o.

ï Colocar em placa de Petri, entre duas l‚minas ou em envelope

(estÈreis). ï Procurar sempre colher, por raspagem, amostra de pele onde se implantam os pelos afetados, mesmo se tiverem aparÍncia sadia.

B. Processamento

… realizado da mesma maneira que para amostras de pele.

6.1.3. Unhas

A. Coleta

ï Limpar com ·lcool etÌlico ou Èter.

ï Raspar com l‚mina de bisturi estÈril ou com tesoura cir˙rgica de ponta

reta grande quantidade da parte lesada da unha. Desprezar as primeiras raspagens. Excelente para exame e cultivo È a parte da unha aparente-

mente s„o na borda da les„o ungueal.

ï Raspar o material sob a unha, em caso de les„o na parte proximal e periungueal.

Micologia

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ï Colocar o material em placa de Petri, entre duas l‚minas ou envelope (estÈreis).

B. Processamento

… realizado da mesma maneira que para amostras de pele.

6.1.4. Escarro

A. Coleta

ï Quantidade: 5 a 10 mL s„o suficientes.

ï Coletar, de preferÍncia em jejum, o primeiro da manh„, apÛs escovar os dentes e bochechar com soluÁ„o antissÈptica.

ï

Colher em recipiente estÈril.

ï

Processar atÈ duas horas apÛs a coleta.

B.

Processamento

ï

FluidificaÁ„o e concentraÁ„o de escarro:

ï Adicionar ao escarro 10 mL de soluÁ„o de citrato de sÛdio 0,10 mol/L e 0,10g de N-acetil L-cisteÌna. ï Agitar bastante, centrifugar e desprezar o sobrenadante.

ï

Exame microscÛpico direto: KOH 10% ou NaOH 4%.

ï

Cultivo:

Meios

Sabouraud-·gar com cloranfenicol e Mycosel £gar

Semeadura

Espalhar o material em pelo menos dois tubos de cada meio

IncubaÁ„o

Incubar ‡ temperatura ambiente e a 37 C

ObservaÁ„o

Observar o crescimento de fungos atÈ quatro a seis semanas

IdentificaÁ„o

Identificar os fungos isolados*

* Em geral È realizada atravÈs de observaÁ„o ao microscÛpio das colÙnias isoladas, em preparaÁıes com lactofenol-azul de algod„o, cultivo em l‚minas, demonstraÁ„o de termotoler‚ncia e demonstraÁ„o do dimorfismo entre outras tÈcnicas.

468 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

7.1.5. Pus

A. Coleta

ï Colher assepticamente, de preferÍncia atravÈs de punÁ„o (nesse caso o procedimento È realizado por um mÈdico).

ï Colocar em recipiente estÈril ou processar imediatamente.

ï Processar o mais r·pido possÌvel, caso o processamento n„o tenha sido realizado no momento da coleta.

B. Processamento

ï Exame microscÛpico direto: KOH 10% ou NaOH 4%.

ï Cultivo:

Meios

Sabouraud-·gar com cloranfenicol e Mycosel £gar

Semeadura

Pelo menos dois tubos de cada, se houver material suficiente. Caso contr·rio, semear em quantos tubos forem possÌveis

IncubaÁ„o

Incubar ‡ temperatura ambiente e a 37 C

ObservaÁ„o

Observar o crescimento de fungos atÈ quatro semanas

IdentificaÁ„o

Identificar os fungos isolados

ObservaÁ„o: Caso se observe gr„os no pus, deve-se limpar a les„o com salina estÈril, cobri-la com gaze estÈril e, comprimir a regi„o ao redor da les„o, a fim de que os gr„os fiquem retidos na gaze. Se houver dificuldade de se obter material, deixar a gaze sobre a les„o do paciente atÈ o dia seguinte. Obser- vamos este material ao microscÛpio estereoscÛpico ìpescandoî os gr„os, com auxilio de uma agulha ìalÁa de platinaî e, colocando-os em uma placa com salina estÈril para lav·-los.

ApÛs a lavagem, processar:

1. Exame direto: NaOH 4% ou KOH 10%.

2. Cultivo:

Micologia

| 469

Gr„os actinomicÛticos ñ Semear em Caldo Tioglicolato e Sabouraud sem antibiÛtico.

Gr„os eumicÛticos ñ Semear em Sabouraud com cloranfenicol, observar de trÍs a quatro semanas e identificar os isolados.

6.1.6. Aspirado de medula Ûssea

A. Coleta

ï O mÈdico deve coletar por punÁ„o.

ï Colocar em frasco estÈril com heparina. Evitar heparina de reuso, pois esta deve ser rigorosamente estÈril. Nunca colher em frascos com EDTA, pois esta subst‚ncia se combina com elementos da parede do fungo, diminuindo a sensibilidade do exame.

ï Processar atÈ duas horas apÛs a coleta.

B. Processamento

ï Exame direto geralmente n„o È realizado. Mas se necess·rio, corar l‚minas com Giemsa ou Gram.

ï Cultivo:

Meios

Sabouraud-·gar com cloranfenicol Mycosel £gar BHI £gar (se possÌvel com sangue de carneiro 5%)

IncubaÁ„o

Incubar ‡ temperatura ambiente e a 37 C

ObservaÁ„o

Observar o crescimento de fungos atÈ seis semanas

IdentificaÁ„o

Identificar os fungos isolados

470 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

6.1.7. Tecidos (biÛpsia)

A. Coleta

ï O procedimento de coleta È realizado pelo mÈdico

ï Colocar, preferencialmente em tubo estÈril, contendo 2 a 3 mL de

soro fisiolÛgico tambÈm estÈril. Na ausÍncia de frascos estÈreis com salina, colocar entre duas gazes estÈreis umedecidas com soro fisiolÛgi- co, acondicionando em recipiente estÈril para transporte.

ï Processar rapidamente, no m·ximo em duas a quatro horas.

B. Processamento

ï PinÁando firmemente o tecido, cortar pequenos fragmentos e em seguida macerar (em gral, homogeneizador ou com tesoura cir˙rgica estÈril).

ï Exame microscÛpico direto: KOH 10% ou NaOH 4%.

ï Cultivo:

Meios

Sabouraud-·gar com cloranfenicol e Mycosel £gar

IncubaÁ„o

Incubar ‡ temperatura ambiente e a 37 C

ObservaÁ„o

Observar o crescimento de fungos atÈ quatro semanas

IdentificaÁ„o

Identificar os fungos isolados

* Para isolar Zigomicetos (Mucor, Rhizopus, Absidia etc) usar o meio:

P„o umedecido esterilizado em tubo ou placa. Acrescentar cloranfenicol na concentraÁ„o de 300mg/l no processamento. Fragmento de tecido deve ser cortado com bisturi em pequenos pedaÁos com cuidado, evitando a maceraÁ„o.

6.1.8. LÌquor

A. Coleta (sempre realizada por um mÈdico).

ï Quantidade ideal: 1,0 mL em tubo estÈril (‡s vezes vÍm menos material).

Micologia

| 471

ï Processar rapidamente;

ï Se for preciso conservar: guardar sob refrigeraÁ„o (4 C).

ObservaÁ„o: Cryptococcus tolera bem a refrigeraÁ„o.

B. Processamento

ï Centrifugar o lÌquor;

ï Exame microscÛpio direto do sedimento com tinta nanquim (OBRIGAT”RIO) e esfregaÁos corados com Gram e Giemsa (caso necess·rio).

ï Cultivo:

Meios

Sabouraud-·gar com cloranfenicol e BHI - NUNCA Mycosel

Semeadura

Semear o sedimento em pelo menos dois tubos de cada meio

IncubaÁ„o

Incubar ‡ temperatura ambiente e a 37 C

ObservaÁ„o

Observar o crescimento de fungos atÈ quatro a seis semanas

IdentificaÁ„o

Identificar todos os fungos isolados

6.1.9. Exsudatos (Pleura, peric·rdio, peritÙnio, articulaÁıes, etc)

A. Coleta

ï Colher em tubo estÈril com heparina estÈril. O ideal È j· ter heparina na seringa.

ï

Processar rapidamente.

B.

Processamento

ï

Centrifugar e desprezar o sobrenadante.

ï

Exame microscÛpico direto do sedimento com KOH 10% ou NaOH

4% e tinta nanquim.

ï Cultivo: È realizado da mesma forma que escarro (item 6.1.4 deste capÌtulo)

472 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

6.1.10. Material brÙnquico (aspirado, escovado, lavado e outros)

A ñ Colheita (sempre realizada pelo mÈdico do paciente)

ï

Colher em frasco estÈril.

B.

Processamento

… Centrifugar e desprezar o sobrenadante. Realizar exame microscÛpico do sedimento com KOH 10% e tinta nanquim. Cultivo do sedimento damesma forma que para amostra de escarro.

6.1.11. Urina

A. Coleta

ï

Quantidade ñ 25 a 50 mL em frasco estÈril;

ï

Recomendar:

ï Primeira urina da manh„.

ï Cuidados de higiene local.

ï Desprezar o primeiro jato.

ï

Processar no m·ximo em duas a quatro horas.

ï

Conservar sob refrigeraÁ„o (4 C), excepcionalmente.

B.

Processamento

ï Exame microscÛpico direto do sedimento com KOH 10% ou NaOH 4% e tinta nanquim.

ï Cultivo:

Meios

Sabouraud-·gar com cloranfenicol e Mycosel £gar

Semeadura

Semear o sedimento em pelo menos dois tubos de cada meio de cultura

IncubaÁ„o

Incubar ‡ temperatura ambiente e a 37 C

ObservaÁ„o

Observar o crescimento de fungos atÈ seis semanas

IdentificaÁ„o

Identificar os fungos isolados*

Micologia

| 473

Nota: Para investigaÁ„o da etiologia f˙ngica, recomenda-se coleta de uma amostra matinal di·ria, por trÍs dias consecutivos. * A ANVISA tambÈm recomenda que seja realizada cultura quantitativa da urina para contagem de unidades formadoras de colÙnia, atravÈs da semeadura da urina n„o centrifugada em uma placa de Sabouraud ·gar com alÁa calibrada.

6.1.12 Sangue (para hemocultura)

A. Coleta

ï Fazer assepsia local com ·lcool iodado.

ï Quantidade: 4 a 5 mL de sangue (utilizando escalpe e seringa descart·vel).

ï Colocar diretamente em frasco de hemocultura contendo meio de BHI lÌquido ou liquoid.

ï Manter o frasco (j· inoculado) em temperatura ambiente, invertido em estantes apropriadas.

ï Processar em 48 horas apÛs a colheita; dez dias apÛs a primeira

semeadura e dez dias apÛs a segunda semeadura.

ï Se forem utilizados frascos de sistemas automatizados, seguir instru- Áıes do fabricante.

B. Processamento

ï Exame direto em geral n„o È realizado, se necess·rio, corar l‚minas pelo Gram ou Giemsa.

ï Cultivo:

Meios

BHI ·gar com cloranfenicol

Semeadura

Retirar o hemocultivo (com seringa descart·vel) e inocular cerca de 1 mL em cada tubo de cultura, espalhando o sangue por toda superfÌcie do meio

ObservaÁ„o

Observar as subculturas (tubos) por atÈ seis semanas

IncubaÁ„o

Incubar ‡ temperatura ambiente e observar de quatro a seis semanas

IdentificaÁ„o

Identificar todos os fungos isolados

474 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

6.2. Coleta de sangue: separaÁ„o, conservaÁ„o e

estocagem do soro

Cerca de 10 mL de sangue dever„o ser colhidos atravÈs de punÁ„o venosa, em tubo de ensaio estÈril sem adiÁ„o de anticoagulantes. O soro È separado apÛs retraÁ„o do co·gulo, segundo os preceitos tÈcnicos, a fim de evitar hemÛlise. Adicionar ao soro, mertiolato na concentraÁ„o final de 1:10.000, a partir de soluÁ„o estoque 1:100.

Distribuir em alÌquotas de 1 mL em pequenos tubos e ensaio ou frascos, identific·-los corretamente e armazenar em congelador atÈ o momento do uso ou envio ao laboratÛrio de referÍncia.

6.3. Preparo e padronizaÁ„o dos antÌgenos utilizados nas

provas sorolÛgicas e reaÁıes intradÈrmicas

6.3.1. Polissac·ride de Paracoccidioides brasiliensis

O antÌgeno obtido a partir de cÈlulas de Paracoccidioides

brasiliensis em sua fase leveduriforme, segundo tÈcnica de FAVA NETTO, È de natureza quÌmica quase que exclusi-

vamente polissacarÌdica. O antÌgeno È utilizado nas reaÁıes

de fixaÁ„o de complemento, precipitaÁ„o em meio lÌquido

e nas provas intradÈrmicas de leitura tardia.

a) Preparar o meio de cultura - Fava Netto;

b) No preparo do antÌgeno, utilizar no mÌnimo trÍs amostras diferentes de

P. brasiliensis, que s„o mantidas em sua forma leveduriforme em estufa a

35 C , no meio acima descrito e, com repiques a cada vinte dias.

c) Preparar suspens„o em soluÁ„o fisiolÛgica estÈril das cÈlulas leveduriformes do fungo.

Micologia

| 475

d) Com auxÌlio de pipeta estÈril, espalhar a suspens„o sobre a superfÌcie

do meio de cultura contido em garrafas de Roux.

e) Incubar a 35 C durante vinte dias.

f) Decorrido o prazo estipulado, colher as cÈlulas do fungo, com auxÌlio

de esp·tula e fazer suspens„o em soluÁ„o tamp„o Veronal, contida em frascos apropriados para centrifugaÁ„o.

g) Homogeneizar a suspens„o com auxÌlio de bast„o de vidro e centrifugar

a 2.000 rpm durante dez minutos.

Desprezar o sobrenadante (… conveniente, antes, autoclavar o

sobrenadante, pois ele pode conter cÈlulas vi·veis, ou adicionar formalina).

i) Fazer suspens„o do sedimento em aproximadamente cinco volumes de acetona. Homogeneizar a suspens„o com auxÌlio de bast„o de vidro (estÈril).

Desprezar o

sobrenadante.

k) Repetir as operaÁıes ìiî e ìjî por mais duas vezes.

l) Repetir as operaÁıes ìiî, ìjî e ìkî, com Èter sulf˙rico.

j) Centrifugar a 2.000 rpm durante dez minutos.

h)

m) Anotar o volume do sedimento e deix·-lo em frasco aberto em

geladeira atÈ o dia seguinte, quando as cÈlulas estar„o secas.

n) Fazer suspens„o a 15% em soluÁ„o tamp„o veronal, levando em

consideraÁ„o o volume das cÈlulas anotado no item ìmî.

o) Autoclavar a suspens„o a 115 C durante quinze minutos.

476 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

p) Centrifugar a 2.000 rpm, durante trinta minutos, tendo o cuidado

em manter condiÁıes de esterilidade.

q) Deixar o frasco em geladeira atÈ o dia seguinte.

r) Repetir a operaÁ„o ìpî.

s) Separar cuidadosamente o sobrenadante e adicionar mertiolato na

concentraÁ„o final de 1:10.000.

t) Distribuir o antÌgeno em alÌquotas de 1 a 5ml, em frascos ou tubos estÈreis. Identificar e datar.

u) Realizar controle de esterilidade.

v) A estabilidade do antÌgeno È superior a dois anos, quando esto-

cado a 4 C.

A padronizaÁ„o do antÌgeno polissacarÌdico para emprego na reaÁ„o de fixaÁ„o de complemento se faz atravÈs da titulaÁ„o desse antÌgeno ante o soro de paciente portador de paracoccidioidomicose e, que reconhecidamente seja positivo em tal reaÁ„o diante do antÌgeno padr„o.

Nas reaÁıes intradÈrmicas, o antÌgeno deve ser padronizado em pacien- tes portadores de paracoccidioidomicose, ou em animais experimentalmente infectados. AtravÈs da utilizaÁ„o de antÌgeno padr„o, chega-se ‡ diluiÁ„o Ûtima que dever· ser utilizada para o novo antÌgeno. Fava Netto, atravÈs de sua experiÍncia pessoal, verificou que a diluiÁ„o do antÌgeno a ser utilizado nas provas intradÈrmicas corresponde a 1/10 daquela que representa a dose Ûtima de antÌgeno para fixar unidades de complemento 50% de hemÛlise, na prova de fixaÁ„o de complemento. Geralmente a diluiÁ„o Ûtima do antÌgeno para utilizaÁ„o nas reaÁıes intradÈrmicas est· em torno de 1:10.

Micologia

| 477

6.3.2. Filtrado de cultura de Paracoccidioides brasiliensis

O antÌgeno obtido por essa tÈcnica, constitui-se em excelente reagente para ser utilizado nas reaÁıes de fixaÁ„o do complemento e precipitaÁ„o em gel. Sua natureza quÌmica È glicoproteica.

Preparar o meio de cultura - Negroni (item 4.1 deste capÌtulo)

Inocular os frascos com pelo menos trÍs amostras diferentes de P. brasiliensis, a partir de cultivos mantidos a 35 C.

Incubar a 35 C durante quatro semanas sob agitaÁ„o constante.

ObservaÁ„o: Se n„o houver disponibilidade de manter os cultivos sob agita- Á„o constante, os mesmos poder„o ser mantidos est·ticos a 35 C durante 12 semanas.

Decorrido o tempo de cultivo, adicionar mertiolato na concentraÁ„o final de 1:10.000, agitar e incubar a 35 C durante uma semana.

Realizar controle de esterilidade.

Filtrar as culturas em papel de filtro.

Colocar o filtrado em placas de Petri limpas e deixar em estufa a 37 C, atÈ que o volume seja reduzido a 1/20 do volume original, ou utilizar polietilenoglicol (concentrando vinte vezes).

Centrifugar a 2.500 rpm por trinta minutos.

Distribuir o filtrado, que constitui o antÌgeno em alÌquotas de 1 a 5 mL em frascos tipo penicilina, identificar, datar e estocar a 4 C.

6.3.3. Filtrado de cultura de Histoplasma capsulatum

(HISTOPLASMINA)

Preparar o meio de cultura - Smith-Asparagina (item 4.1 deste capÌtulo).

Semear de trÍs a cinco amostras diferentes de Histoplasma capsulatum nos balıes contendo o meio de cultura.

478 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

Deixar as culturas ‡ temperatura ambiente e no escuro, durante quatro a seis semanas, sob agitaÁ„o.

Decorrido o prazo estabelecido, adicionar mertiolato na concentraÁ„o final de 1:10.000. Agitar para submergir os filamentos e deixar ‡ temperatura ambiente durante uma semana.

Realizar controle de esterilidade.

Filtrar em papel de filtro.

Dependendo do emprego da histoplasmina, temos dois caminhos a seguir:

UtilizaÁ„o em reaÁıes sorolÛgicas (ReaÁıes de fixaÁ„o de com- plemento e precipitaÁ„o em gel de ·gar)

Colocar o antÌgeno em placas de Petri limpas, deixar a 37 C atÈ que o volume seja reduzido para 1/20 do volume original.

Centrifugar a 2.500 rpm durante trinta minutos.

Distribuir o antÌgeno em frascos tipo penicilina.

Identificar, datar e conservar a 4 C.

Para padronizaÁ„o nas provas sorolÛgicas, consultar o item 6.5 deste capÌtulo.

UtilizaÁ„o em provas intradÈrmicas

ApÛs filtrar em papel de filtro a histoplasmina È filtrada em membrana esterilizante (poro de 0,22 mm).

Distribuir em frascos tipo penicilina e estocar a 4 C.

Realizar controle de esterilidade.

Micologia

| 479

A histoplasmina a ser utilizada nas reaÁıes intradÈrmicas È geralmente diluÌda a 1:1000, em soluÁ„o fisiolÛgica estÈril. Dever„o ser realizadas provas em indivÌduos sensÌveis ao antÌgeno, ou animais previamente sensibilizados, diante de H.†capsulatum, utilizando-se histoplasmina padr„o para fins de comparaÁ„o.

6.3.4. Filtrado de cultura de Aspergillus fumigatus

Cultivar A. fumigatus (mÌnimo de trÍs amostras diferentes) em caldo Sabouraud por quatro semanas ‡ temperatura ambiente.

Decorrido o prazo estipulado, adicionar mertiolato na concentraÁ„o final de 1:5.000. Agitar para submergir os filamentos.

Deixar as culturas ‡ temperatura ambiente durante uma semana.

Realizar controle de esterilidade.

Filtrar em papel de filtro.

Colocar o filtrado em placas de Petri limpas e deixar em estufa a 37 C, atÈ que o volume seja reduzido para 1/20 do volume origi- nal, ou utilizar polietilenoglicol para concentrar.

Centrifugar a 2.500 rpm durante trinta minutos.

Distribuir o antÌgeno em alÌquotas de 1-5 mL, em frascos tipo penicilina., Identificar, datar e conservar a 4 C.

O

filtrado de cultura de A. fumigatus È utilizado nas reaÁıes

de

fixaÁ„o de complemento e precipitaÁ„o em gel de ·gar. …

conveniente preparar pela mesma tÈcnica, filtrados de cultu-

ras

de A. flavus, A. terreus e A. niger. Para a padronizaÁ„o

do

antÌgeno, consultar o item 6.5 deste capÌtulo.

480 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

6.5. TÈcnicas de padronizaÁ„o dos antÌgenos utilizados nas provas sorolÛgicas

a) ReaÁ„o de fixaÁ„o de complemento

Os antÌgenos utilizados nas reaÁıes de fixaÁ„o de complemento s„o padronizados atravÈs da titulaÁ„o cruzada perante soro positivo para o antÌgeno em estudo. Utiliza-se, para tal propÛsito, antÌgeno padronizado com finalida- des de controle da reaÁ„o. A diluiÁ„o Ûtima do antÌgeno n„o dever· demons- trar atividade anticomplementar.

b) Imunodifus„o dupla de Ouchterlony

S„o feitas diluiÁıes do antÌgeno (1:2, 1:4, 1:8 etc), as quais s„o colocadas para difundir no gel, contra soro reconhecidamente positivo para o antÌgeno em quest„o.

Decorrido o tempo necess·rio para formaÁ„o dos precipitados, proce- de-se ‡ leitura da reaÁ„o.

O tÌtulo do antÌgeno ser· aquele correspondente ‡ sua mais alta diluiÁ„o que se dÍ positividade nÌtida com o soro e o mesmo n˙mero de bandas de precipitaÁ„o, quando comparado ao antÌgeno padr„o.

6.6. TÈcnica de imunodifus„o radial dupla em gel de ·gar (Ouchterlony)

REAGENTESREAGENTESREAGENTESREAGENTESREAGENTES

Reagente 1

£gar noble

0,5

g

£gua destilada

100

mL

(Estocar em erlermayer a 4 C)

Reagente 2

£gar noble

1,0

g

Azida sÛdica

0,1

g

PBS 7.2

100

mL

Micologia

| 481

*Aquecer em banho-maria atÈ o ·gar dissolver

* Colocar 3,5 mL em tubo de ensaio e estocar a 4 C

Reagente 3

PBS (Tamp„o fosfato 0,01 mol/L , NaCl 0,15 mol/L) pH 7.2-7.4

SoluÁ„o A: NaH 2 PO 4 óó0,2 M (Fosfato de sÛdio monob·sico)

SoluÁ„o B: Na 2 HPO 4 óó0,2 M (Fosfato de sÛdio dib·sico)

*Tamp„o fosfato 0,01mol/L

Adicionar 280 mL da soluÁ„o A a 720 mL da soluÁ„o B

PBS: 50 mL do tamp„o fosfato + 50 mL de NaCl 3 mol/L. Completar para 1000 mL com ·gua destilada.

Reagente 4

Citrato de sÛdio 5 g

100 mL de ·gua destilada

482 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

Reagente 5

SOLU« O CORANTE

Coomassie brilliant blue

0,5

g

£cido acÈtico

10

mL

Etanol

45

mL

£gua destilada

45

mL

Reagente 6

SOLU« O DESCORANTE

Metanol

400

mL

£cido acÈtico

100

mL

£gua destilada

500

mL

1™ Etapa (filmagem das l‚minas):

Mergulhar as l‚minas de microscia, devidamente limpas, no reagente 1; com auxÌlio de uma pinÁa, retir·-las em seguida, deixando o tempo suficiente para umedecÍ-las.

Sec·-las em estufa de aproximadamente 60 C.

ApÛs a secagem, estoc·-las em caixas para posterior utilizaÁ„o.

2™ Etapa:

Utilizando uma mesa nivelada, colocar a l‚mina previamente ìfilma- daî com o reagente 1.

Micologia

| 483

Colocar em banho-maria os tubos com 3,5 mL de ·gar (reagente 2) estocados, esperar liquifazer.

Verter sobre a l‚mina o reagente 2 liquefeito, deixando solidificar por cinco minutos.

Coloc·-las em c‚mara ˙mida na geladeira.

ObservaÁ„o: Pode permanecer em geladeira na c‚mara ˙mida atÈ sete dias (margem de seguranÁa).

ApÛs dez minutos em geladeira, a l‚mina j· pode ser perfurada segundo esquema a seguir.

a l‚mina j· pode ser perfurada segundo esquema a seguir. 3™ Etapa • Colocar o soro
a l‚mina j· pode ser perfurada segundo esquema a seguir. 3™ Etapa • Colocar o soro

3™ Etapa

Colocar o soro - 10 mL em cada orifÌcio - respeitando o esquema acima. Nas extremidades superiores e inferiores adicionar soro pa- dr„o. Nos poÁos 1, 2, 3 e 4, adicionar os soros a serem testados.

ApÛs a colocaÁ„o dos soros, aguardar uma hora para adicionar os antÌgenos nos orifÌcios centrais.

4™ Etapa

Difus„o em estufa a 37 C ou ‡ temperatura ambiente, por 48 horas.

484 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

5™ Etapa

Iniciar os banhos ñ Colocar as l‚minas (apÛs 48 horas) em uma cuba e verter sobre elas citrato de sÛdio 5 % (reagente 4) por duas horas, com objetivo de retirar precipitados inespecÌficos.

ApÛs o banho de citrato ñ Adicionar soluÁ„o salina 0,9 % por 48 horas, trocando v·rias vezes.

6™ Etapa

Usando o papel de filtro (umedecÍ-lo previamente em ·gua desti- lada), embrulhar as l‚minas e coloc·-las em estufa de secagem a 60 C, atÈ atingir completa secagem.

Mergulhar as l‚minas em ·gua destilada, e retirar o papel cuidado- samente. Lavar em ·gua corrente para retirar resÌduos de papel de filtro e sec·-las em estufa.

7™ etapa

Corar por dez minutos utilizando o reagente 5.

Colocar em cuba de coloraÁ„o v·rias l‚minas e verter o corante. ApÛs dez minutos, retirar as l‚minas e estocar novamente o corante (È possÌvel reaproveit·-lo). Periodicamente deve-se filtr·-lo novamente.

8™ Etapa

ApÛs o processo de coloraÁ„o, retirar o excesso de corante com soluÁ„o descorante (reagente 6) atÈ que as linhas de precipitaÁ„o fiquem bem nÌtidas.

ObservaÁ„o: Se descorar muito ou totalmente pode corar novamente.

9™ Etapa

Micologia

| 485

Leitura: considera-se reaÁ„o positiva (soro reagente) quando hou- ver a presenÁa de linhas de precipitaÁ„o apresentando identidade total com o soro padr„o. Exemplo:

apresentando identidade total com o soro padr„o. Exemplo: 6.7. IdentificaÁ„o de leveduras de import‚ncia clÌnica

6.7. IdentificaÁ„o de leveduras de import‚ncia clÌnica

As leveduras s„o um grupo de fungos heterogÍneos que superficialmen- te aparentam ser homogÍneas. A identificaÁ„o desses fungos È baseada nas caracterÌsticas morfofisiolÛgicas e bioquÌmicas. A morfologia È primariamente usada para estabelecer o gÍnero, entretanto, as provas bioquÌmicas (Teste de reduÁ„o do nitrato e hidrolise da ureia), e de assimilaÁ„o e fermentaÁ„o de aÁ˙cares s„o usadas para diferenciar v·rias espÈcies.

6.7.1. Provas morfolÛgicas

Dentre as provas morfolÛgicas disponÌveis para identificar espÈcies do gÍnero Candida temos a tÈcnica de Dalmau e o tubo germinativo.

A tÈcnica de Dalmau È baseada no fato de que C. albicans, quando cultivada em meio de cultura pobre em nutrientes, como o ·gar arroz ou ·gar fub·, produz uma estrutura de resistÍncia denominada clamidoconÌdio. Dentre todas as espÈcies do gÍnero Candida, somente C. albicans e C. dubliniensis s„o capazes de formar clamidoconÌdios, sendo que esta ˙ltima forma clamidoconÌdios em cachos, apresentando trÍs ou mais clamidoconÌdios por hifa. AlÈm disso, esta È uma espÈcie rara e altamente relacionada a C. albicans.

486 | Conceitos e MÈtodos para a FormaÁ„o de Profissionais em LaboratÛrios de Sa˙de

O teste do tubo germinativo baseia-se no fato de que C. albicans, quando incubada a 37 C por duas a trÍs horas, em soro bovino ou de coelho, forma, a partir de suas leveduras, uma estrutura denominada tubo germinativo que dar· origem ‡s hifas e pseudo-hifas caracterÌsticas desta espÈcie.

Teste do tubo germinativo

Rotular os tubos testes com o n˙mero da amostra.

Usando uma pipeta, dispensar 0,5 mL de soro bovino ou de coelho em cada tubo.

Com uma alÁa flambada, tocar levemente a colÙnia de levedura e coloc·-la no soro dentro do tubo.

Agitar para homogeneizar as cÈlulas leveduriformes no soro. Incu- bar os tubos a 37 C por duas a trÍs horas.