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Aislamiento y visualizacin de cidos nucleicos


Gabriel Dorado Prez
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba

RESUMEN

La informacin necesaria para la construccin de los seres vivos se encuentra almacenada en los cidos nucleicos. Existen dos variedades qumicas de cidos nucleicos: el DNA (cido desoxirribonucleico) y el RNA (cido ribonucleico). El cromosoma de las bacterias es de doble cadena (dsDNA), circular y superenrollado. Su tamao es de ~4.500 kilo pares de bases (kpb). Estas clulas pueden contener tambin molculas de dsDNA relativamente pequeas (~3 kpb), circulares y superenrolladas: plsmidos. El RNA generalmente se encuentra en forma de cadena sencilla, aunque suele formar estructuras secundarias de doble hlice, por autoapareamiento de regiones complementarias. Existen diversos tipos de RNA ribosmico (rRNA), nombrados de acuerdo con su coeficiente de sedimentacin Svedberg, que es una medida de su tamao (peso), conformacin y agregacin. As, los rRNA de procariontes tienen tamaos de 23S (~25 kilobases; kb) y 16S (~15 kb). Una cantidad menor de RNA aunque muy importante para la clula, es el RNA mensajero (mRNA), que existe en una amplia variedad de tamaos: de cientos a miles de bases (b). El mRNA representa la expresin de algunos de los genes contenidos en el DNA cromosmico. El mRNA es ledo en los ribosomas con la ayuda del RNA transferente (tRNA; ~80 b), traducindose a protenas, que son las biomolculas que sirven para construir los seres vivos. El objetivo de esta prctica es obtener una preparacin de todo el material gentico de bacterias, que pueda ser sometida a electroforesis. Palabras clave: agarosa, bromuro de etidio, congelacin, electroforesis, gel, luz ultravioleta. Abreviaturas empleadas (por orden alfabtico de abreviatura). ADN: acido desoxirribonucleico; BrEt: bromuro de etidio; LB: medio rico Luria-Bertani; Na2 EDTA: sal disdica del cido etiln diamino tetra-actico; PM: peso molecular; RNA: cido ribonucleico; SDS: dodecil sulfato de sodio; TAE: solucin amortiguadora Tris-Actico-EDTA; TBE: solucin amortiguadora Tris-BricoEDTA; Tris base o Trizma base: Tris (hidroximetil) aminometano.

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS La prctica se realizar en grupos de 24 alumnos, repartidos en ocho subgrupos de tres. Tendr una duracin aproximada de cuatro horas.

La informacin necesaria para la construccin de los seres vivos se encuentra almacenada en los cidos nucleicos. Su nombre deriva de su carcter cido y del hecho de que fueron descubiertos en el ncleo de las clulas eucariontes. Existen dos variedades qumicas de cidos nucleicos: el DNA (cido desoxirribonucleico) y el RNA (cido ribonucleico). Generalmente, la informacin gentica se almacena en forma de cromosomas de DNA y se expresa en forma de mRNA (RNA mensajero). Las bacterias son procariontes (sin ncleo celular); por tanto, todos sus cidos nucleicos se encuentran en el citoplasma. El cromosoma de las bacterias es de doble cadena (dsDNA), circular y superenrollado. Su tamao es de ~4.500 kilo pares de bases (kpb). Estas clulas pueden contener tambin molculas de dsDNA relativamente pequeas (~3 kpb), circulares y superenrolladas: plsmidos. stos confieren diferentes caractersticas a las clulas hospedadoras, como resistencia a antibiticos o prototrofa para determinados nutrientes. Los plsmidos son adems unas herramientas muy valiosas en ingeniera gentica y biologa molecular. El RNA generalmente se encuentra en forma de cadena sencilla, aunque suele formar estructuras secundarias de doble hlice, por autoapareamiento de regiones complementarias. La mayor parte del RNA forma parte (estructural y funcional) de los ribosomas. Existen diversos tipos de RNA ribosmico (rRNA), nombrados de acuerdo con su coeficiente de sedimentacin Svedberg, que es una medida de su tamao (peso), conformacin y agregacin. As, los rRNA de procariontes tienen tamaos de 23S (~25 kilobases; kb) y 16S (~15 kb). Una cantidad menor de RNA aunque muy importante para la clula, es el RNA mensajero (mRNA), que existe en una amplia variedad de tamaos: de cientos a miles de bases (b). El mRNA representa la expresin de algunos de los genes contenidos en el DNA cromosmico. El mRNA es ledo en los ribosomas con la ayuda del RNA transferente (tRNA; ~80 b), traducindose a protenas, que son las biomolculas que sirven para construir los diferentes seres vivos. El objetivo de esta prctica es obtener una preparacin de todo el material gentico de bacterias, que pueda ser sometida a electroforesis.

2. UTILIDAD DE LA PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS El aislamiento y purificacin de cidos nucleicos puede ser analtico o preparativo y tiene diferentes objetivos. En el primer caso, slo nos interesa visualizar dicho material gentico; generalmente, para determinar su tamao y seleccionar el apropiado. As puede comprobarse, por ejemplo, si hemos clonado un inserto o DNA pasajero en un vector o plsmido. La purificacin preparativa se realiza generalmente como paso siguiente, cuando necesitamos dicho material gentico para realizar futuras manipulaciones con el mismo; por ejemplo, secuenciarlo o usarlo para transformar bacterias. El resultado de la purificacin analtica o preparativa se suele someter a electroforesis en gel de agarosa y se tie con bromuro de etidio. Estos anlisis
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son complementarios: puede realizarse uno, varios o todos; segn las necesidades y tiempo disponible.

3. PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS: PRINCIPIOS Existen diversos mtodos de purificacin de cidos nucleicos. stos varan segn se desee aislar DNA o RNA, as como del grado de pureza requerido. Otro aspecto importante a considerar es el uso de sustancias txicas o inocuas. Aunque hace unos aos era normal usar fenol y cloroformo para la purificacin de cidos nucleicos, actualmente existen metodologas tan eficientes o ms, que no emplean compuestos qumicos txicos. En esta prctica se realiza primero un aislamiento rpido por lisis celular. Despus se procede a la separacin electrofortica en gel de agarosa y visualizacin de dichos cidos nucleicos. Tambin se llevar a cabo un clculo aproximado de pesos moleculares (tamaos) del material gentico obtenido. Como se observa, se trata de un mtodo analtico; es decir, cuyo objetivo no es utilizar dichos cidos nucleicos en futuras manipulaciones, sino, simplemente, visualizar las diferentes formas moleculares de los mismos, as como determinar su tamao aproximado y posteriormente desecharlos. Existen varios protocolos de purificacin rpida de DNA (genmico, plsmidos, etc) y RNA (total, mRNA, etc). Por ejemplo, algunos protocolos de purificacin de plsmidos utilizan detergentes (como el SDS) para romper las clulas, lcali (como NaOH) para desnaturalizar el cromosoma bacteriano y las protenas y sal (como KCl) para favorecer la precipitacin de las protenas y cromosomas desnaturalizados. Ello arrastra tambin los restos de membrana y pared celular a los cuales se encuentra unido fsicamente el cromosoma, otros restos celulares y el propio SDS. De esta forma, los plsmidos quedan en solucin (detallado en Sambrook y Russell, 2001: Protocol 6. Preparation of plasmid DNA: toothpick minipreparations, pp. 1-511.54). En esta prctica se describe un protocolo algo menos eficiente para visualizar plsmidos. No obstante, es mucho ms eficiente para visualizar todo el material gentico de las bacterias (diferentes tipos de DNA y RNA), y claramente mucho ms rpido y cmodo.

4. VISUALIZACIN RPIDA DE CIDOS NUCLEICOS DE BACTERIAS Nota: como es habitual, la manipulacin del material biolgico se debe realizar bajo las oportunas condiciones de esterilidad, a fin de evitar contaminaciones y degradacin de las muestras. ATENCIN: el material biolgico de desecho deber ser destruido. Por ejemplo, mediante inmersin en un agente oxidante fuerte como leja (hipoclorito sdico) al 10%, agua oxigenada (perxido de hidrgeno) al 3%, esterilizacin hmeda en autoclave a 120 C y 1 bar (1 kg/cm2) durante 20 min, o esterilizacin seca en horno a 180C durante 4 h. Los dos primeros

mtodos suelen emplearse para destruir cidos nucleicos; los dos ltimos para matar clulas. Cada subgrupo procesar una muestra, que ser finalmente cargada en el gel de electroforesis, junto con dos patrones de peso molecular. La fotografa del gel servir para realizar los correspondientes clculos de peso molecular (tamao). a).-Crecer la bacteria Escherichia coli DH5F hospedadora del plsmido recombinante pGEM5Zf(+) o pBluescript(SK+) en 1 a 5 ml de medio rico LuriaBertani (LB), en presencia del antibitico selectivo apropiado (ampicilina), hasta cultivo estacionario (p.ej., unas 12 a 16 h durante la noche) a 37C y en condiciones de agitacin vigorosa (p.ej., 200 rpm) para asegurar una buena aireacin y crecimiento. El cultivo puede repartirse en tubos de microfuga y guardarse a 4C durante varios das (una a dos semanas). Tambin puede guardarse durante meses a 20C o menos (aunque ello provocar la rotura de algunas clulas). b).-Centrifugar 0,5 ml del cultivo estacionario en un tubo de microfuga de 1,5 ml) a 12.000 g durante 30 segundos o a 16.000 g durante 15 segundos para precipitar las clulas. Eliminar el sobrenadante por decantacin. Dejar escurrir boca abajo sobre papel absorbente (higinico o de filtro) uno o varios minutos. Nota: en una microfuga estndar tipo Eppendorf 5415C o similar, 12.000 g son aproximadamente 12.000 rpm; 16.000 g son aproximadamente 14.000 rpm (mxima velocidad de dicha microfuga). c).-Aadir 50 l de agua destilada estril en la tapa del tubo (para no ensuciar la punta y as poder usar la misma punta con todos los tubos). Agitar vigorosamente con un agitador tipo vrtex para resuspender bien las clulas. Si se dispone de muchos tubos, puede emplearse un soporte multitubo para acelerar el proceso. Estas muestras pueden guardarse durante meses a 20C o menos hasta su posterior uso. En caso de no realizarse el paso siguiente (c opcional), pasar al e indicado ms adelante. d).-Opcional (para incrementar rendimiento unas 100 veces): congelar a 80C y descongelar a 100C una o dos veces las clulas para provocar la lisis celular. Tambin puede congelarse a 20C y descongelar a 100C, en cuyo caso se recomienda hacerlo dos veces. El proceso consiste en congelar, descongelar hirviendo un minuto, agitar vigorosamente en vrtex y en su caso repetir el proceso. ATENCIN: para que los tubos no se abran durante el hervido, deben usarse tubos especiales, como se indica a continuacin. e).-Opcional: fijar la apertura del tubo Eppendorf con un pico de pato para que el tubo no se abra (otra alternativa es usar tubos Eppendorf con cierre de seguridad), e incubar en un bao de agua a 95100C durante 1 min. Agitar vigorosamente mediante vrtex.

f).-Centrifugar a 12.000 g durante 5 min o a velocidad mxima (16.000 g) durante 2 minutos. Recoger el sobrenadante, que contendr parte de los cidos nucleicos. g).-Someter a electroforesis 9 l del sobrenadante + 1 l de solucin Ficoll de carga 10X, en gel de agarosa teido con bromuro de etidio. Se recomienda echar primero 1 l del solucin de carga en el fondo de cada tubo nuevo, usando la misma punta. El resultado esperado y obtenido puede apreciarse en la Fig. 1. Nota: como la solucin Ficoll de carga 10X es muy densa, se recomienda ajustar una pipeta tipo Gilson P20 a unos 3 l para coger 1 l. Si se ajusta a 1 l no se coge nada. En cualquier caso, estos volmenes son aproximados; y da igual coger 1 l que el doble o triple. Eso no va a alterar para nada el resultado de la electroforesis que se realice a continuacin.

Figura 1. Patrn electrofortico de cidos nucleicos de Escherichia coli DH5F. Se aprecia el DNA genmico (banda superior), el DNA plasmdico (banda tenue intermedia) y diversas formas de RNA como el ribosmico (mancha inferior). El tRNA se encontrara en la parte inferior (aunque no es apreciable), mientras que el mRNA se econtrara a lo largo del carril (fondo). Los carriles de los extremos contienen el marcador de peso molecular x Pst I (izquierda) y x Hind III (derecha).

h) Como marcadores de peso molecular pueden emplearse 0,5 g/10 l del vector pGEM5Zf(+) o pBluescript(SK+) superenrollado. Tambin pueden usarse otros patrones de peso molecular, como 0,5 g/10 l de xHind III
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(fragmento menor visible de ~2 kpb) y xPst I (fragmento menor visible de ~300 pb). Nota: los plsmidos son generalmente dsDNA superenrollado (I). No obstante, parte de los mismos puede encontrase en forma relajada (II; cuando una de las hebras est cortada) o incluso lineal (III; ambas hebras rotas en el mismo sitio). Las proporciones relativas suelen ser: I >>> II > III. Por otra parte, el bromuro de etidio se intercala entre las bases del DNA, reduciendo la densidad de ste. La movilidad de las molculas en una electroforesis en gel de agarosa depende no slo de su carga, tamao y densidad, sino tambin de su forma. As, en ausencia de bromuro de etidio, los plsmidos generan tres bandas que se distribuyen ctodo > nodo de la siguiente forma: tipo II -> III ----> I. En presencia de bromuro de etidio, la movilidad pasa a ser: tipo III -----> I -> II. i).-Visualizar el resultado de la electroforesis, capturar la imagen en disco e imprimirla. j).-Realizar el clculo aproximado del tamao del material gentico visualizado: DNA genmico, DNA plasmdico superenrollado y RNA. Este clculo puede realizarse de forma aproximada por comparacin de visu con el estndar conocido. Un clculo ms preciso implica construir una recta patrn, representando la distancia en mm desde el pocillo a la banda (ordenadas) frente al lg del tamao (kpb) de las bandas del patrn de pesos moleculares (abscisas). ATENCIN: a la hora de comparar tamaos, es importante no olvidar que slo el dsDNA lineal tiene movilidades equiparables a un estndar de pesos de dsDNA (que es lineal). Los plsmidos superenrollados slo podrn compararse con otros superenrollados. La razn estriba en que el dsDNA superenrollado de los plsmidos avanza ms rpidamente que ese mismo DNA lineal. Por tanto, no puede calcularse de forma precisa el tamao de un plsmido superenrollado, usando estndares de peso molecular de dsDNA lineal. Aunque siempre podr inferirse un tamao mayor que el correspondiente a dicha banda (si fuera dsDNA lineal). As, por ejemplo, un plsmido de 3 kb migrar como un DNA lineal de 1 kb. Por tanto, podremos decir que dicho plsmido es mayor que 1 kb. Otra opcin sera emplear estndares de peso molecular compuestos por dsDNA superenrollados, pero ello no suele realizarse por la dificultad tcnica que supone la obtencin de dicho material. Lo que s suele hacerse es incluir un plsmido de tamao conocido como referencia Corolario: el protocolo descrito previamente est diseado para visualizar todos los cidos nucleicos de las bacterias. As, aparecern dos manchas muy llamativas de RNA (tRNA y sobre todo rRNA 23S y 16S, respectivamente) de bajo peso molecular (de 100 a 500 kpb), que pueden aparecer fusionadas cuando existe gran cantidad de rRNA. La mayor intensidad de estas bandas es normal, ya que el RNA se encuentra fundamentalmente en forma de cadena sencilla (ssRNA), por lo que tiene expuestas sus bases nitrogenadas al exterior, provocando una mayor fluorescencia. Por otra parte, la agarosa no tiene suficiente poder resolutivo para diferenciar bien tamaos tan pequeos. Asimismo, debe apreciarse un
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fondo dbil de mRNA a todo lo largo de cada carril. El DNA plasmdico (en caso de que la bacteria porte dicho material gentico), suele aparecer de forma tenue en la zona de 1 a 2 kpb (para plsmidos superenrollados de 3 a 4 kpb). Finalmente, el DNA genmico (cromosoma bacteriano), aunque tiene 4.500 kpb, aparece como una banda intensa y definida en la regin de 10 kpb. Ello es as porque la agarosa no tiene suficiente poder resolutivo como para diferenciar tamaos tan grandes.

5. BIBLIOGRAFA COMENTADA + Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (eds) (2005): Current Protocols in Molecular Biology. Vols 1 a 4. New York: Greene & John Wiley (New York). Manual de protocolos. La nueva Biblia del Bilogo Molecular actualizada trimestralmente. Clasificacin: PROTOCOLOS. Brown TA (ed) (1998): Molecular Biology LabFax. Vol I (Recombinant DNA) & II (Gene Analysis). 2nd ed. San Diego: Academic Press. Clasificacin: DATOS. + Sambrook J, Russell D (2001): Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd edition, Vols 13. New York: CSH Laboratory Press. Manual de protocolos. La Biblia clsica del Bilogo Molecular. Clasificacin: PROTOCOLOS. Watson JD, Gilman M, Witkowski J, Zoller M (1992): Recombinant DNA New York: Freeman and Company. Divulgativo y a la vez con nivel y rigor cientfico. Clsico sobre Ingeniera Gentica y sus aplicaciones. Claro, didctico y con numerosos esquemas e ilustraciones explicativas. Muy recomendable. Clasificacin: TEORA DIVULGATIVO. Nota: las referencias fundamentales para la preparacin de la prctica se indican con el smbolo +.

AGRADECIMIENTOS Proyecto PAFPU FORMAPROFE ('UCO-N-031') de Formacin del Profesorado Universitario, Junta de Andaluca.

ANEXO 1: MEDIOS, SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLGICO EMPLEADO Pesar o aadir las cantidades o volmenes que se indican en las tablas correspondientes, disolver en agua (en el caso de que se desee repartir en botes) y esterilizar en autoclave (autoclavar) a 120C y 1 bar (= 1 kg/cm2) de presin durante 20 minutos. Una vez esterilizados, los medios con agar pueden conservarse lquidos en una estufa a 63 C hasta su uso. Normas para el manejo del autoclave: Comprobar que el autoclave tiene suficiente agua. En caso contrario, aadir agua destilada hasta la rejilla del fondo de la mquina. Asimismo, comprobar que las salidas de agua y de aire se encuentran cerradas. Si no se toman estas precauciones podra quemarse el autoclave. Una vez haya terminado el autoclave hay que esperar que baje la presin y la temperatura para abrirlo sin peligro.
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ATENCIN: Como norma general, no se deben autoclavar soluciones concentradas de cidos (clorhdrico, sulfrico) o lcalis (NaOH). Como es obvio, estas soluciones son estriles per se. Adems, pueden daar la estructura de acero del autoclave. Tampoco se autoclavan soluciones concentradas de disolventes orgnicos (acetona, tolueno, ter, metanol, etanol, etc). Generalmente las soluciones se preparan en botes de vidrio tipo Pyrex. ATENCIN: Los lcalis como la sosa (NaOH) o la potasa (KOH) atacan al vidrio. En estos casos debern usarse botes de plstico para su almacenamiento. Medio rico LuriaBertani A continuacin se indica la composicin del medio rico de cultivo de Escherichia coli.
Tabla 1. Preparacin de medio rico LuriaBertani

Bacto triptona Extracto de levadura ClNa Agar Agua destilada

Medio lquido (g) 10 5 10 Hasta 1 litro

Medio slido (g) 10 5 10 15 Hasta 1 litro

El medio rico lquido puede prepararse en botes Pyrex o en matraces erlenmeyer para cultivos (10 ml de medio rico en matraz de 100 ml). El medio slido tambin se prepara en matraz de 100 ml, se deja enfriar un poco despus de la esterilizacin (~63 C) y se reparte a razn de 25 ml por caja de petri de 9 cm . Por lo tanto, cada alumno preparar 10 ml de medio lquido y 25 ml de medio slido. Las cajas de medio rico, una vez haya solidificado el medio, se dejan boca abajo en la estufa a 37C hasta el da siguiente (para secar el vapor condensado). El secado puede realizarse rpidamente colocando las cajas abiertas en una cabina estril de flujo laminar durante una hora. El medio rico lquido se almacena a temperatura ambiente. Las cajas de medio rico se guardan en bolsas cerradas a 4C hasta su uso. El medio rico permanece estable durante meses. Nota: No conviene aadir los agentes selectivos (en su caso) a las cajas con medio slido que vayan a ser conservadas en frigorfico. Es mejor prepararlas sin dichos agentes (p.ej., antibiticos), y aadirlos en la superficie con un asa de siembra triangular justo antes de usarse. As se asegura que el antibitico no ha sido degradado. Solucin amortiguadora TBE

A continuacin se indica la composicin de la solucin amortiguadora TBE para electroforesis.


Tabla 2. Solucin amortiguadora 5X TBE

Tris base cido brico Na EDTA Agua destilada


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3,8 litros (g) 212 160 18,6 Hasta 3,8 litros

1 litro (g) 55,8 42,1 4,9 Hasta 1 litro

ATENCIN: La solucin amortiguadora 10X TBE puede prepararse tambin, pero con el tiempo y las bajas temperaturas acaba por precipitar, siendo luego imposible volver a disolverlo. Por ello se recomienda preparar la mxima concentracin como 5X TBE. Solucin amortiguadora TAE A continuacin se indica la composicin de la solucin amortiguadora TAE para electroforesis.
Tabla 3. Solucin amortiguadora TAE

Tris base cido actico glacial Na EDTA (05 M, pH 80) Agua destilada
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50X 242 g 57,1 ml 100 ml Hasta 1 litro

1X 484 g 1,14 ml 2 ml Hasta 1 litro

Solucin 20X Bromuro de etidio A continuacin se indica la composicin de la solucin de bromuro de etidio.
Tabla 4. Solucin 20X Bromuro de etidio (10 mg/ml)

Bromuro de etidio Agua destilada

10 ml 100 mg Hasta 10 ml

1 ml 10 mg Hasta 1 ml

ATENCIN: El BrEt es un mutgeno potente. NO es necesario esterilizarlo. NO se debe autoclavar por precaucin. Deben seguirse escrupulosamente medidas estrictas de seguridad (guantes, mascarilla, campana extractora) en su preparacin a fin de evitar la inhalacin del polvo o su contacto con la piel. Una vez en solucin es ms fcil de manipular. ATENCIN: El BrEt es sensible a la luz. Proteger la solucin en bote envuelto por papel aluminio o mejor en bote con cristal mbar. Soluciones Ficoll de carga A continuacin se indica la composicin de la solucin Ficoll de carga.
Tabla 5. Soluciones 10X Ficoll (I y II)

Tipo I
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Tipo II

(g) (g) 17,5 17,5 ([Final]: 17,5%) ([Final]: 17,5%) Azul de bromofenol 0,06 ([Final]: 0,06 %) Xileno Cianol FF 0,12 (final: 0,12 %) Na EDTA (0,5 M, pH 8,0) 10 ml 10 ml ([Final]: 50 mM) ([Final]: 50 mM) Agua destilada milli-Q Hasta 100 ml Hasta 100 ml Esterilizar en autoclave Guardar a temperatura ambiente Ficoll (PM ~400)
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Estndar de peso molecular ( x Pst I) Realizar las mezclas e incubaciones que se indican a continuacin. ATENCIN: El DNA del fago lambda generalmente se recibe liofilizado. Debe tenerse un cuidado especial en su manipulacin, ya que este fago es capaz de infectar a E. coli y otras bacterias generalmente usadas en biologa molecular. Lo ideal es comprar el preparado de Sigma e inyectar en el bote original los reactivos necesarios para digerir dicho DNA.
Tabla 6. Estndar de peso molecular ( x Pst I) a [500 ng DNA/10 l]

Con solucin Ficoll de carga Con solucin Ficoll de carga (I) (II) Para 10 ml Para 1 ml Para 10 ml Para 1 ml DNA del fago lambda sin metilar 500 g 50 g 500 g 50 g Restrictasa Pst I 500 U 50 U 500 U 50 U 10X amortiguador de Pst I 2 l 2 l 2 l 2 l Agua destilada milli-Q Hasta 20 l Hasta 20 l Hasta 20 l Hasta 20 l Mezclar bien Incubar a 37C 1 hora (o ms) 10X Solucin Ficoll (I) 1 ml 100 l 10X Solucin Ficoll (II) 1 ml 100 l Agua destilada milli-Q Hasta 10 ml Hasta 1 ml Hasta 10 ml Hasta 1 ml Guardar stock a 4C y tubo en uso a temperatura ambiente Nota: Pueden emplearse cantidades menores de Pst I en la digestin arriba indicada. En tal caso, debe incrementarse el tiempo de incubacin varias horas (incluso un fin de semana completo no produce efectos negativo, ya que Pst I no tiene actividad star; es decir, no corta en sitios inespecficos). Estndar de peso molecular ( x Hind III) Realizar las mezclas e incubaciones que se indican para x Pst I (Tabla 6), pero empleando la restrictasa Hind III en vez de Pst I. Material biolgico (Escherichia coli)

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Bacteria Escherichia coli DH5F hospedadora del plsmido recombinante pGEM5Zf(+) o pBluescript(SK+).

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