Problema 25 (comparat)

1. EDTA es un quelante, y se usa para secuestrar el calcio. El calcio lo que hace es

mantener unido el ribosoma a la membrana del RE. Sin él, se consigue que se
desprendan.
2. Las dos proteínas están colocalizadas en el mismo lugar, a lo largo de las
diferentes densidades van disminuyendo pero siguen colocalizadas.
3. Por ejemplo, colocar anticuerpos contra los diferentes compartimentos, y
centrifugar. Si los vemos colocalizados, es que se han mezclado.
4. Las otras bandas corresponden a proteína menos glucosilada. Los anticuerpos
usados deben ser policlonales. Por este motivo, se trata con suero preimmune
(obtenido del mismo animal antes de immunizarlo) para ver si el antigeno tiene
algún clon de Ig que reconozca alguno de los componentes del protoplasto
5. Depende de la no presencia de ATP. BiP debe unir ATP en el mismo sitio de la
faseolina. Haría el mismo experimento en ausencia de ATP.

Problema 26

Respuesta UPR (Unfolded protein response): Trata de garantizar que solo las proteínas
bien plegadas salgan del RE.

BiP: Chaperona localizada en el lumen del RE.

Las proteínas chaperonas son un conjunto de proteínas presentes en todas las células,
muchas de las cuales son proteínas de choque térmico, cuya función es la de ayudar al
plegamiento de otras proteínas recién formadas en la síntesis de proteínas. Estas
chaperonas no forman parte de la estructura primaria de la proteína funcional, sino que
sólo se unen a ella para ayudar en su plegamiento, ensamblaje y transporte celular a otra
parte de la célula donde la proteína realiza su función. Los cambios de conformación
tridimensional de las proteínas pueden estar afectados por un conjunto de varias
chaperonas que trabajan coordinados, dependiendo de su propia estructura y de la
disponibilidad de las chaperonas.

1. Como vemos en las graficas, las células infectadas secretan mucho factor CHOP,
el cual no deja salir a las proteínas bien plegadas y se produce, como dice
Dimcheff, una acumulación en el RE de proteínas mal plegadas y sus
correspondientes chaperonas, las cuales también se acumulan ya que no dejan
salir a la proteína. En las células Mock (control) y las F43 (control negativo) se
produce una secreción basal de ambas, lo cual constituye lo normal ya que la
célula se ha de asegurar que todas las proteínas salgan bien plegadas.
2. Cuando en la primera immunoprecipitación se hace contra KDEL, se supone que
precipitan todas las proteínas que contienen esta secuencia y que están en el RE.
Pero cuando se revela el Western blotting, solo vemos en las células infectadas
con los retrovirus virulentos el precursor de salida del virus del RE. Cuando se
hace a la inversa, sólo precipitan las proteínas con la secuencia de salida del RE,
y éstas llevan el factor KDEL de residencia al RE. Además, una BiP está
interaccionando con la proteína. Eso quiere decir que si es cierto que el virus
resida en el RE, ya que allí se encuentra el factor de residencia y el de salida, y
además está plegado con BiP.
 3. La soca no virulenta tiene proteína pr85env, pero como vemos no es virulenta,
ya que la BiP no la secuestra tanto tiempo y no se produce la acumulación de
proteínas. La soca virulenta si que las acumula, lo que produce la toxicidad.
4. Cuando se inhibe la actividad proteasómica, las proteínas no se pueden destruir
y se acumulan aún más en el citoplasma. Si que corresponde al normal, ya que
en teoría cuando se acumulan las proteínas en el Re se sueltan de las chaperonas,
salen al citoplasma y el proteosoma las inhibe. Por lo tanto, seguimos de acuerdo
con la hipótesis inicial.
5. Primero, la proteína vírica entra al RE ya que tiene la señal KDEL. Dentro, es
reconocida por las chaperonas BiP, pero éstas no pueden hacerla plegar bien y se
acumulan en el RE. Además, hace sintetizar un factor que no permite que se
plieguen bien las proteínas. Ésto hace que se secreten aún más chaperonas y se
vayan acumulando aún más, lo que produciría la respuesta neurotóxica por
estrés en el RE.

Problema 27 (comparado)

1. Yo diría la nº b, ya que con los anticuerpos monoclonales reconoceremos la

proteína G en su dominio extracelular, y con el secundario policlonal podemos
amplificar mucho la señal. Además, mejor los de dominio extracelular ya que si
se inserta en la membrana nos va a costar mucho más verlo, o el secundario no
se unirá a él.
2. Lo haría incubando manosa marcada radiactivamente con los virus. Después,
como un experimento de pulso y caza, haría una immunodetección con
anticuerpos contra VSV-G y lo pasaría a electroforesis. Entonces como tendrán
diferentes azúcares, habrá diferentes bandas correspondientes a diferentes pesos
moleculares.
3. Como es sensible a la endoglucosidasa H, está dentro la célula. Pero es resistente
a la proteasa, lo cual indica que no tiene proteína. Lo que sugiero es que se
encuentra en el AG glucosidandose.
4. Entre 13 y14, ya que vemos que con 12 no queda unido y con 14 si.
5. No, ya que cuando la proteína se encuentra en el citosol es degradada con
proteasa, y vemos que si no lo están es bastante resistente a la glucosidación.

Problema 28

1. A la figura 1 vemos que todos estos gránulos tienen VAMP, sintaxina y SNAP-
25. Como vemos en la figura 2, éstas tres proteínas están juntas formando el
complejo SNARE.
2. Una podría ser usar los tres anticuerpos juntos en una misma banda, y ver si da
señal junta de los tres. Otra sería hacer una cromatografía de afinidad con un
solo anticuerpo, y ver después en una electroforesis y después un Western
blotting si están las tres proteínas.
3. En presencia de calcio, se produce la fusión y desaparece el complejo SNARE.
Cuando hay NEM y calcio, como aún no ha podido empezar la fusión, aún está
presente el complejo. Cuando hay LPC ya ha desaparecido el complejo, por lo
tanto el complejo se ha disociado completamente.
4. Primero entran en contacto las diferentes proteínas del complejo SNARE.
Cuando hay una subida de calcio, las membranas empiezan a fusionarse. Aquí es
donde actúa el NEM. Desaparece el complejo SNARE como tal y las proteínas
 se disocian, por efecto del calcio. Al final, se completa la fusión de membranas,
que es donde el PLC actúa.
5. Rab7 regula la fusión heterotípica.

Problema 29 (Comparat)

1. Si, ya que cuando no podemos el cbl-b (vector) el ligando sigue allí. El cbl-b
después se destruye.
2. Cuando hay sustrato del ligando, el cbl-b activa la RTK para que destruya el
ligando y el cbl-b. Cuando solo hay el ligando y el cbl-b, no se activa la RTK y
no se destruye ni el uno ni el otro. Aunque no haya EGFR, si que hay cbl-b.
3. Cuando hay EGF, se destruye tanto EGFR como cbl-b. Cuando sólo hay
lactacystin, no se destruye nada. Cuando hay lactacystin y EGF sólo se destruye
EGFR. Por lo tanto, la actividad proteomica destruiria cbl-b, y con presencia de
EGF su receptor. Ésto sugiere que EGFR es degradado por un mecanismo
diferente del proteosoma.
4. Tanto cbl-b como EGFR son unidos a ubiquitina para ser degradados por el
proteosoma, pero dado que EGFR está ubiquitinizado y no se degrada sugiere
que no se degrada por actividad proteomica, pero si por otra que incluya
ubiquitinización.
5. EGFR es degradado al lisosoma cuando hay EGF.
6. En éstas células EGFR no es degradado tras recibir a su ligando ( unión con
EGF) ya que cbl-b no liga ubiquitinas a él. La célula estará así estimulada para
la proliferación, ya que los factores de crecimiento externo inducen a las células
a entrar en mitosis.

Problema 30

1. Usan el páncreas exocrino ya que es un tipo de célula que secreta muchísimas

proteínas a la luz del intestino. Si que hay un flujo masivo de proteínas en
vesículas, ya que se muestra una gran concentración en ellas y además contienen
el receptor de la señal KDEL.
2. No concuerda, ya que las COPII tendrían que ir hasta trans-golgi, y las COPI
hacia el RE. Las vesículas VTCs tienen mucho ya que son las que hacen el
transporta retrógrado y anterógrado.
3. Cuanto más cerca del RE, menos proteína hay (se debe perder) y más receptor
hay. Si que la refleja ya que debe ir hacia el RE.
4. Debe ser un receptor que sea reconocido en el RE.
5. Un modo de progresión cisternal de transporte intra-Golgi requiere que proteínas
residentes en el Golgi se reciclen por vesículas peri-Golgi, mientras que el
modelo alternativo de transporte vesicular predice proteínas de carga
anterógrada para estar presente en tales vesículas. Hemos usado Immuno-EM
cuantitativo sobre células NRK para distinguir vesículas peri-Golgi de otras
vesículas en la región Golgi. Encontramos niveles significativos de la enzima
mannosidase II y las proteínas de maquinaria de transporte G, el KDEL-
RECEPTOR, y rBet1 en la proteína coatomero I en las cisternas de Golgi y en
las vesículas peri-Golgi. Por el contrario, cuando las células expresaron la
proteína G del virus vesicular stomatitis este marcador anterogrado era en gran
parte ausente de las vesículas peri-Golgi. Estos datos sugieren un papel de
 vesículas peri-Golgi en el reciclaje de residentes Golgi, más bien que un papel
importante en el transporte de anterogrado.

Problema 31

1. Iría por endocitosis, ya que se requiere la formación de una vesícula.

2. Porque con ratas es más fácil recoger anticuerpos. Sería mejor hacer plásmidos
con bacterias, ya que sale más barato.
3. No, ya que aún así pueden ser las dos, y que se queden a la parte interna de la
membrana plasmática.
4. Porque lampII tampoco se encuentra en la membrana, al menos a la parte
externa.
5. Significa que el perro también secreta lampII, y que lo sitúa al mismo nivel que
el de rata.

Problema 32 (Comparat)

1. MPF es el Factor Promotor de la Maduracion. Cdc2 fosforila diferentes

proteinas activando o inhibiendo, directa o indirectamente, diferentes procesos.
En primer lugar, MPF desencadena un proceso de retroalimentación positiva
(cuando se activa, induce su propia activacióm). Se han de producir muchos
cambios en la celula para que se inicie la mitosis, entre ellos: condensación
cromosómica, rotura de la envoltura nuclear y formación del huso mitótico. El
MPF ha de inducir todos estos procesos, probablemente a partir de su actividad
quinasa. El MPF fosforila residuos clave de Ser en la lámina nuclear
(concretamente de laminina) haciendo que se sesensamblen las moléculas de
laminina. También fosforila la histona H1, que participa en el empaquetamiento
del DNA en los nucleosomas. El MPF además cambia el comportamiento de los
microtúbulos fosforilando sus proteinas asociadas. Se ha comprobado que el
MPF se encuentra fuertemente unido a los centrosomas durante la mitosis, y
probablemente influye en su diferente comportamiento respecto a la nucleación.
2. Cuando la célula está en interfase (G1/S i G2) se localiza en el citosol. Pero
cuando la célula entra en mitosis, concretamente en profase, la ciclina B va
entrando en el núcleo, aunque, también se encuentra en el citosol. Cuando está
en metafase, se encuentra mayoritariamente en el nucleo, aunque queda en el
citosol. Cuando está en anafase, ya acabando la mitosis, sale del núcleo.
3. Este experimento demuestra que la ciclina B1 usa el transportador CRM1 para
salir del nucleo en la fase G2, ya que cuando LMB lo inhibe, las ciclinas no
salen.
4. Si, ya que vemos que la ovoalbúmina, en ausencia de LMB, sale del núcleo
cuando la OVA está acomplejada con la ciclina B!. Cuando hay el inhibidor de la
exportina, ésta queda encerrada en el núcleo. La BSA no puede salir del núcleo,
aunque LMB esté ausente, ya que no tiene la señal NES de salida del núcleo.
5. En la fase G2, MPF se activa capacitando a la célula a entrar en mitosis. Durante
la profase probablemente sea importado al núcleo ( almenos lo es la ciclina B1),
y durante toda la mitosi está allá. Después es exportada con la señal NES cuando
se encierra otra vez el núcleo, y en G1 ya no se encuentra ya que es eliminada.

Problema 33 (Comparat)
 1. La curcumina puede tener dos efectos contra la ciclina D: o inhibir su expresión
o activar su degradación. En cualquier caso, a más concentración o a una
exposición prolongada la ciclina D se deja de observar. La βactina actúa como
control del experimento, es decir, que corrobora que el hecho de que no se vea
ciclina no sea porque la curcumina destruya su anticuerpo.
2. Los resultados obtenidos demuestran que la curcumina no afecta a la viabilidad
celular, ya que se observa sales de formazán, y ello quiere decir que sigue activa
la mitocondria. Éste experimento es necesario para ver si este factor antitumoral
afectaría a la actividad celular, y en caso que si, no se podría usar como
tratamiento.
3. Se trata de añadir un control positivo para la citotoxicidad, con un factor que
sepamos realmente que es tóxico. El WST es mejor experimento, ya que con el
método del azul de tripán el contaje es a través del microscopio, incluyendo así
el error humano en el experimento. Con el WST se valora a través del
espectrofotómetro, que evidentemente es más exacto que el ojo humano.
4. La curcumina activa el proteasoma para que degrade la ciclina D. Cuando hay
lactasinina, no se observa degradación de ciclina D ya que ha inhibido la
actividad proteasómica. En la pregunta 1 decíamos que podría actuar de dos
formas, y aquí nos aseguramos que destruye la ciclina D.
5. La curcumina, además de activar el proteasoma para degradar la ciclina D,
inhibe su expresión. Por lo tanto, usa un doble mecanismo.

Problema 34 (Comparado)

1. Se puede haber cuantificado la cantidad de DNA presente en las células

mediante su marcaje con bromodeoxiuridina (análogo artificial de la timidina), y
posterior marcaje con anticuerpos a bromodeoxiuridina fluorescentes. El
recuento se efectúa mediante un citofluotómetro de flujo. Las células en la fase
G2 y M tendrán una cantidad de DNA 2n. Las células en la fase G1 tendrán una
cantidad n marcada. Finalmente, en la fase S tendrán una cantidad de DNA
marcado entre n y 2n.
2. El suero contiene factores de crecimiento y los nutrientes necesarios para que se
produzca la proliferación celular. En ausencia de éste, las células tienden a entrar
en fase G0, donde está fuera de ciclo, y solo entraran en él cuando reciban estos
factores.
3. La Cav1 parece que se expresa mucho en la fase G1 y la S.
4. La expresión de Cav1 inhibe el paso de G1 a S, ya que cuando se expresa Cav1
constitutivamente, muy pocas células consiguen pasar de fase G1.
5. La Cav1 efectivamente podría actuar como proteína supresora de tumores, dado
que su degradación es necesaria para poder entrar en ciclo celular. La Cav1
podría: 1. Inducir la entrada en G0. 2. Bloquear el paso por el punto de control
de G1. Los resultados, aún y así, no son concluyentes, ya que el método usado
para valorar el estadio del ciclo celular donde se encuentran las células, no nos
permite deducir si las células se encuentran en fase G0 o G1.

Problema 35 (Comparado)

Quiescente: Se aplica a la célula cuando está fuera de ciclo, en la fase G0.

 1. Las quiescentes están en su mayoría en la fase G0 o G1. Las que tienen auxina
están mayoritariamente en las fases G2 o M, ya que han doblado la cantidad de
material genético. Las que tienen citoquininas hay igual frecuencia en las fases
G0/G1 que en la G2/S.
2. Tanto la auxina como la citoquinina inducen a las células a proliferarse, aunque
las auxinas con más eficacia dados los resultados.
3. En el primer tratamiento tarda 20h, y en el segundo 40h.
4. La refuerzan, ya que vemos que aun así las células se duplican, aunque con las
citoquininas tarde más.
5. Quiescentes, ya que no crece más la población.

Problema 36

1. Para que no tenga más nutrientes ni más factores de crecimiento. Se el marcaje

de DNA con Timidina autoradiactiva y mediante citometria de flujo saber en qué
estadio se encuentra la célula.
2. TAM67 hace que la célula no replique el DNA y, por lo tanto, no entre en fase M
ni G2.
3. Añadirlo en unas células, y otras hacerlas servir de control, y mirar si hay
proliferación.
4. AP1 CDK4
+ CDK6
- Proliferación celular
+ + +
Rb-P E2F Cic D
Cic E

5. Si, ya que inhibe la proliferación celular. La única laguna es que se pueda

transfectar en las células diana.

Problema 37 (Comparado)

1. p53 empieza a aparecer cuando lleva un rato de radiación, y un poco más tarde
HDM. O sea que la lesión en el DNA hace que se exprese p53, y la expresión de
éste hace que después se exprese HDM.
2. Que HDM se une a p53 para inhibirlo.
3. La fosforilación de la serina 15, que en su estado nativo no está fosforilada pero
sí tras la lesión en el DNA.
4. Sí, dado que los lisados celulares se hicieron tras 3h de cada tratamiento, y p53
no empieza a ser degradado hasta después de la lesión.
5. HDM debe inducir la degradación de p53 cuando éste es inactivo, ya que hasta
las 4h tras el tratamiento no empieza a ser degradado, y a las 3h tras el
tratamiento p53 aún está fosforilado.
6. Inhibir la calpaina.
7. La fosforilación de p53 activa esta proteína, impidiendo que sea degradada, ya
que WT sin DNA-PK se degrada p53, pero con DNA-PK no se degrada. El
mutante siempre es degradado, ya que no es fosforilable.